LUCRAREA PRACTICA NR.

METABOLISMUL GLUCIDIC.
Determinarea hemoglobinei glicozilate (HbA1c)
Introducere
În încercările de monitorizare cât mai eficientă a echilibrului metabolismului
glucidic, cu posibilitatea aprecierii cât mai corecte a scăderii toleranței la glucoză, un
rol important revine determinării hemoglobinei glicozilate.
HbA1c rezultă printr-o reacţie de glicozilare (glicare) lentă, neenzimatică între
glucoza care pătrunde cu uşurinţă în eritrocit şi aminoacidul valină de la capătul N-
terminal al lanţurilor β ale hemoglobinei. Procesul de glicare decurge in doua faze.
Prima faza este rapida, reversibila si depinde de concentratia de glucoza din mediu
si are ca produs final o baza Schiff labila (aldimina). In timp, aldimina este supusa
unei rearanjari de tipul Amadori si este transformată in ketoamina stabilă, respectiv
hemoglobina glicozilată.

Majoritatea metodelor pentru dozarea HbA1c determina acest produs si nu si

baza labila, care este influențată de variațiile de dietă. Exista mai multe subfractii de
hemoglobină glicozilată in funcție de sediul glicozilării si partenerii de reactie.
Hemoglobina nativa (neglicata) este HbA0 (2α2β). Variantele HbA1a1, HbA1a2,
HbA1b si HbA1c sunt produse prin glicozilarea cu monozaharide diferite (fructozo 1,6
bis fosfat, glucozo 6 fosfat sau D glucoză) a grupului amino liber al valinei N-
terminale din lanțului β al hemoglobinei. În afara valinei N-terminale a lantului β,
exista si alte grupări amino libere ce se pot glica (valina α – N – terminală sau lizina).
La adultul sănătos, pe lângă hemoglobina HbA0 se mai găsesc si cantități mici
de hemoglobina fetala HbF (2α2γ) si HbA2 (2α2δ); valina din capatul N – terminal al
lantului δ poate fi de asemenea glicată prin mecanisme chimice similare cu glicarea

1
valinei N – terminale a lantului β. HbA1c (varianta rezultată prin glicare cu D-glucoză)
reprezintă 75 – 80% din totalul hemoglobinelor glicate.
Nivelul HbA1c din sânge se corelează atât cu timpul de înjumătățire al
hemoglobinei, cât şi cu nivelul mediu al glucozei sangvine pe perioada duratei de
viață a eritrocitului. Astfel, creșterea HbA1c este proporțională cu nivelul mediu al
glucozei sangvine (glicemia medie) în cursul ultimelor 2-3 luni anterioare testării
(corespunzătoare duratei medii de viață a eritrocitelor).

eAG = estimated average glucose = glicemia medie estimată

eAG (mg/dL) = 28.7 x HbA1c – 46,7

În evaluarea nivelului mediu al glicemiei pe o perioada de 2-3 luni, se
efectuează determinarea HbA1c şi pe baza relaţiei de mai sus se calculează valoarea
medie a glicemiei pe perioada respectivă. În acest mod se stabileşte gradul de
compensare al hiperglicemiei în perioada urmărită.

HbA1c eAG
% mg/dL mmol/L
6 126 7
6,5 140 7,8
7 154 8,6
7,5 169 9,4
8 183 10,1
8,5 197 10,9
9 212 11,8
9,5 226 12,6
10 240 13,4
11 269 14,9
12 298 16,5

Determinarea HbA1c constituie un test de evaluare şi monitorizare pe termen

lung a controlului glicemic la pacienţii cu diabet zaharat. Are un rol predictiv în ceea
ce priveşte riscul complicaţiilor diabetului: cetoacidoza, nefropatia, retinopatia.
Frecvenţa testării HbA1c depinde de tipul de diabet si de stabilitatea controlului
glicemic:
- la 3-4 luni, pentru pacienţii cu diabet zaharat tip I sub tratament convenţional;
- la 1-2 luni, pentru pacienţii cu diabet zaharat tip I sub tratament intensiv;
- la 6 luni, pentru pacienţii cu diabet zaharat de tip II cu un control glicemic
stabil;
- la fiecare 1-2 luni pentru gravidele cu diabet zaharat;
- la fiecare 1-2 luni pentru pacientele cu diabet gestaţional.
În stabilirea acestei decizii au fost luate in considerare avantajele pe care le
prezintă determinarea HbA1c fata de glicemie:
- Nu sunt necesare condiţiile “a jeun”;
- Stabilitate preanalitică mai mare;
- Variaţie biologică individuală ↓ in comparaţie cu glicemia;
- Variaţii ↓ în condiţii de stres si afecţiuni intercurente.
Pe de altă parte, există şi unele dezavantaje ale HbA1c:
- Cost mai ridicat/analiză;
2
 - Lipsa de disponibilitate a testului în unele laboratoare;
- Lipsa de corelaţie a HbA1c cu glicemia medie la unele persoane (cu obezitate,
hipotiroidism, anemie hemolitica, neoplasme, etc);
- HbA1c nu este relevantă la pacienţii cu turn-over eritrocitar anormal (anemii
hemolitice, anemii feriprive); în aceste situaţii diagnosticul diabetului trebuie sa
se bazeze exclusiv pe valorile glicemiei.

Interpretarea rezultatelor
 creşterea HbA1c indică prezenţa unei hiperglicemii în ultimele 2-3 luni;
 valorile sunt crescute la persoanele cu diabet zaharat controlat deficitar
sau nou diagnosticat;
 diabetul zaharat este controlat adecvat când se obţin valori sub 7%;
 nivelul Hb A1c poate creste pana la 20% in cazul unui control glicemic
deficitar;
 scăderea HbA1c are loc treptat, pe durata mai multor luni, pe măsură
ce hematiile cu hemoglobină glicozilată normală le înlocuiesc pe cele
cu niveluri crescute.

Există mai multe metode de determinare a concentrației hemoglobinei

glicozilate: cromatografia pe coloană cu rășini schimbătoare de ioni, cromatografia
de lichide de înaltă presiune (HPLC), cromatografia de afinitate, metode
electroforetice, metode fotometrice bazate pe reacţia de culoare cu acidul
tiobarbituric, metode enzimatice şi metode imunologice.

Aplicaţie practică
Determinarea HbA1c – Metoda enzimatică

Principiul testului
Proteazele prezente în reactivul R1 realizează hidroliza proteinelor din proba de
sânge lizată și eliberează aminoacizi de tipul valinei glicozilate din lanțurile beta de
globină ale hemoglobinei. Enzima fructozil-valină oxidaza (enzimă recombinantă) va
acționa asupra valinelor glicozilate la nivelul capetelor N-terminale și va produce
peroxid de hidrogen care va fi apoi determinat printr-o reacție catalizată de
peroxidaza din hrean cu o substanță cromogenă

Reactivi:

1. R1 (Tampon) = Soluție tampon cu pH =7, proteaze, Triton X-100 (detergent),

agenți redox;
2. R2 (Reactiv redox) = Soluție tampon cu pH=6.3, agenți redox;
3. R3 (Enzimă/Cromogen) = Peroxidaza din hrean (POD), fructozil-valină
oxidaza (FVO) și substanța cromogenă;
4. R4 (Reactiv de hemoliză) = reactiv care conține acid ciclohexan 2-aminoetan
sulfonic.
5. apă distilată

3
 6. sânge recoltat pe EDTA (vacutainer pentru hemoleucograma cu dopul de
culoare mov)

La punctul de lucru se găsesc:

 sânge hemolizat (proba=hemolizatul) într-un tub Eppendorf;
 reactivii necesari în tuburi Eppendorf: RL și R3;
 tub Eppendorf pentru realizarea determinării;
 apă distilată;
 pipete automate, vârfuri pentru pipete.

Tehnica de lucru:
1. Prepararea hemolizatului: 20 μl sânge + 250 μl R4
În sală este gata preparat!
2. Prepararea reactivului de lucru (RL): se amestecă R1 cu R2 în raport 7:3.
Amestecul este stabil 30 zile la frigider.
În sală este gata preparat!
3. Prepararea probei de analizat:
Se lucrează într-un tub Eppendorf fixat în suport pentru a nu se vărsa
conținutul.
În tub se pipetează:

300 μl RL + 100 μl hemolizat

Se amestecă prin pipetare “up and down”. Se lasă în repaus la

temperatura laboratorului 10 minute după care se adaugă:

100 μl R3 + 300 μl apa distilata

Se amestecă prin pipetare “up and down”, apoi se citește imediat

absorbția inițială (A1) la  = 700 nm. Calibrarea spectrofotometrului se
face față de aer.
După 10 minute se va citi absorbția finală (A2).

CALCUL:

Se calculează A = A2 – (A1 x 0.725)

Valoarea obținută va fi folosită pentru a calcula procentul de HbA1c (%)
utilizând ecuația curbei de calibrare trasată în prealabil.

Ecuatia curbei de calibrare: y = 0,0106 x – 0,0332

HbA1c (%) = (ΔA + 0,0332):0,0106

4
5
 Rezultatele obţinute prin metoda prezentă pot fi echivalate cu cele obţinute
printr-o metoda standardizată certificată (NGSP). Valorile IFCC (International
Federation of Clinical Chemistry) pot fi calculate cu formula:

%HbA1c (NGSP) = (0.915 x %HbA1c(IFCC)) + 2.15

Valori normale

NGSP(National IFCC (International

Glycohemoglobin Federation of Clinical
Standardization Program) % Chemistry) %
Normal (sănătoși, non- 4-6 2 – 4.2
diabetici)
Diabetici fără tratament 6 – 6.5 4.2 – 4.8
(scăderea toleranței la
glucoză)
Diabetici echilibrați cu 6.5 – 8 4.8 – 6.4
tratament eficient
Diabetici neechilibrați cu >8 > 6.4
tratament ineficient

6
 INVESTIGAREA REGLĂRII METABOLISMULUI GLUCIDIC

Introducere
Glucidele reprezintă principala sursă de energie a celulelor organismului. În
sistemul nervos central şi hematii ele reprezintă unica resursă energetică.
Organismul îşi acoperă necesarul de aproximativ 250 grame de glucoză pe
zi prin:
 preluarea glucozei din alimentaţie (majoritar);
 liza glicogenului hepatic şi muscular (în perioadele mai îndelungate de lipsă
de aport alimentar);
 gluconeogeneză din: piruvat, lactat, oxalacetat, malat, aminoacizi
glucoplastici, glicerol.

Pătrunderea glucozei în ţesutul muscular, adipos şi miocard se realizează

numai în prezenţa insulinei (ţesuturi insulino-dependente). Ficatul, rinichiul, creierul,
eritrocitele, insulele Langerhans şi mucoasa intestinală nu necesită prezenţa insulinei
(ţesuturi insulino-independente).
Menţinerea glicemiei (nivelul plasmatic al glucozei) în limite normale se
realizează prin mecanisme complexe de natură fiziologică şi biochimică.

Rolul hormonilor în reglarea glicemiei

La menţinerea unui nivel fiziologic al glicemiei participă:

 insulina, cu efect hipoglicemiant;
 glucagonul, adrenalina, glucocorticoizii, tiroxina, hormonul de creştere,
cu efect hiperglicemiant.

Insulina favorizează pătrunderea glucozei în celulele ţesuturilor insulino-

dependente şi induce sinteza de enzime implicate în utilizarea glucozei (glucokinaza,
fosfofructokinaza, piruvatkinaza, piruvat dehidrogenaza, glucozo-6-fosfat
dehidrogenaza) sau în formarea de glicogen (glicogen sintetaza). În acelaşi timp,
insulina reprimă sinteza enzimelor cu rol în gluconeogeneză (piruvat carboxilaza,
fosfoenolpiruvat carboxikinaza, fructozo-1,6-bisfosfat fosfataza) sau cu rol în
eliberarea glucozei din ţesuturi (glucozo-6-fosfat fosfataza).
Glucagonul determină hiperglicemie prin stimularea glicogenolizei şi a
gluconeogenezei; inhibă sinteza glicogenului şi determină creşterea lipolizei în
ţesutul adipos.
Adrenalina stimulează glicogenoliza şi lipoliza.
Glucocorticoizii acţionează prin stimularea gluconeogenezei.
În funcţie de aportul alimentar reglarea glicemiei comportă două etape:
 Postprandial precoce: glicemia este crescută, iar readucerea ei la nivel fiziologic
se face prin:
- utilizarea glucozei ca substrat energetic;
- glicogenogeneză;
- lipidogeneză (sinteză de triacilgliceroli).
 Postprandial tardiv (starea de foame): apare o tendinţă de scădere a glicemiei
cu activarea mecanismelor de menţinere a acesteia în limite normale. Acest lucru
se face pe mai multe căi:

7
- activarea glicogenolizei şi gluconeogenezei hepatice şi musculare; spre
deosebire de ficat, muşchiul nu are glucoză-6-fosfat fosfatază, deci nu poate
elibera glucoza în sânge, utilizând-o pentru nevoile proprii;
- producerea de energie alternativă prin lipoliză, cu cetogeneză consecutivă.
Cea mai frecventă dereglare ce apare în metabolismul glucidic este diabetul
zaharat (prin deficitul relativ sau absolut de insulină). Acesta se caracterizează prin:
- hiperglicemie (prin insuficienta metabolizare a glucozei) şi glicozurie (când
glicemia depăşeşte pragul renal de 180 mg/100 ml);
- intensificarea gluconeogenezei, lipolizei şi proteolizei în ţesuturile insulino-
dependente;
- cetoacidoză (lipoliza generează acetil-CoA în exces, care este orientată spre
sinteza de corpi cetonici).

Investigarea echilibrului metabolismului glucidic în diabetul zaharat

cuprinde: evidenţierea glicozuriei (se discută la examenul sumar de urină),
determinarea glicemiei à jeun, determinarea hemoglobinei glicozilate şi a proteinelor
serice glicozilate, determinarea nivelului seric al insulinei şi eventual a peptidului C,
indicele HOMA.

Indicele HOMA

Indicele HOMA (“Homeostasis Model Assessment”) sau HOMA-IR (Homeostasis

Model Assessment of Insulin Resistance) este o metodă de diagnosticare precoce a
rezistenţei la insulină. Indicele HOMA a fost descris în anul 1985 de către Matthews
et al. ca un model matematic, pornind de la premiza că nivelele glicemiei și
insulinemiei à jeun ale unui individ, având sau nu o toleranță normală la glucoză,
sunt setate la un nivel caracteristic individual. De asemenea s-a considerat că
subiecţii sub 35 de ani, normoponderali au rezistenţa la insulină, exprimată prin
indicele HOMA-IR, egală cu 1 și funcţia secretorie a celulelor β pancreatice de 100%.
Astfel, în condiții bazale indicele HOMA-IR reflectă echilibrul între gluconeogeneza
hepatică și secreția de insulină a celulelor β pancreatice, care este menținut printr-un
mecanism de feed-back hepato-pancreatic.
Indicele HOMA-IR se calculează utilizând valorile glicemiei și insulinemiei à jeun
după următoarea formulă:

HOMA-IR = (insulină (µU/mL) x glicemie (mg/dL))/405

Determinarea Indicelui HOMA-IR este recomandată în următoarele situaţii:

 obezitate (este cea mai frecventă cauză a rezistenţei la insulină şi a diabetului
de tip 2); evaluarea pacienţilor cu un indice de masă corporală IMC>28 kg/m2;
 sindrom metabolic - acesta reuneşte mai multe condiţii patologice: obezitate
abdominală, hipertensiune arterială, trigliceride serice crescute peste150
mg/dl, colesterol HDL seric sub 40 mg/dl şi glicemie peste110mg/dl;
 diabet zaharat de tip 2;
 sindromul ovarelor polichistice;
 amenoree, infertilitate.

8
Valorile Indicelui HOMA pot fi interpretate astfel:

Valori indice HOMA- IR Interpretare

<2 normal
2-2.5 posibil rezistență la insulină
2.5-5 probabilitate crescută de rezistență la
insulină
>5 valoarea medie la persoane diabetice

Semnificaţie clinică:
Valori crescute: diabet tip 2, sindrom metabolic, steatoză hepatică, sindromul
ovarului polichistic, anumite tipuri de cancer, obezitate, sedentarism, stres,
hipotiroidism şi hipertiroidism, sarcină, antecedente de diabet tip 2 în familie.
Valori scăzute sunt considerate normale şi nu au semnificaţie patologică.