n Grecia mslinul este legendar. Potrivit lui Homer, mslinul crete pe pmntul Greciei de mai bine de 10.000 de ani.

De-a lungul timpului, mslinul i-a druit frunzele pentru ca din ele s-i fac lauri victorioii din ntrecerile sportive dar i cei din sngeroasele rzboaie, iar uleiul din fructul s-au uns cele mai nobile capete ale istoriei. Coroanele i ramurile de mslin, emblemele binecuvntrii i ale puritii, erau oferite zeitilor i mprailor: cteva au fost gsite i n mormntul lui Tutankhamon. Pomul era considerat sacru iar potrivit legii regelui Solon, oricine ar fi ncercat s distrug un mslin era aruncat n exil sau ucis pe loc.

Uleiul de msline conine polifenoli, vitamina E i ali antioxidanti, substane care constituie conservanii naturali ai uleiului. Antioxidanii diminueaz apariia peroxizilor. Astfel se ncetinete procesul natural de oxidare i rncezire a uleiului. Polifenolii au un rol foarte important n compoziia uleiului de msline. Mslinele conin peste 30 de tipuri de polifenoli, ns nivelul acestora scade odat cu "mbtrnirea" fructului i apoi odat cu trecerea timpului.

80% din uleiul de masline este compus din acizi grai monosaturai care rezist la oxidare. Acetia determin creterea colesterolului "bun"(HDL) i scderea colesterolului "ru" (LDL), rspunztor pentru "ntrirea arterelor" i creterea riscului accidentelor vasculare.

Uleiul de msline se poate clasifica n: uleiul de msline extra-virgin provine din prima presare a mslinelor. Are o aciditate nu mai mare de 0.8% i este considerat a avea un gust superior. Cele mai multe uleiuri de msline sunt extravirgine doar pe etichet. uleiul virgin este produs prin folosirea metodelor fizice i fr nici un fel de tratament chimic. Aciditatea este mai mic de 2% i are un gust bun. Rafinat nseamn c uleiul a fost tratat chimic pentru neutralizarea gustului puternic (caracterizat ca fiind un defect) i a coninutului de acizi. uleiul rafinat este considerat ca fiind de o calitatea mai slab dect cel virgin.

Steridele sunt lipide simple care se gsesc n cantitate mic n toate organismele vegetale i animale. Ele sunt esterii naturali ai acizilor grai cu sterolii, Dintre acizii grai cel mai des ntlnii fac parte acidul palmitic, acidul stearic i acidul oleic.

Structur chimic

Sterolii sunt monoalcooli secundari ciclici, care deriv de la o hidrocarbur policiclica, numit steran, nucleul de baza fiind de natural ciclopentanperhidrofentrenic.

Sterolii naturali sunt n majoritate lor de tip trans optic activi, levogiri cu excepia coprosterolului care este dextrogir, fiind izomer cis. Sterolii sunt substane cristalizate care au puncte de topire mai ridicate decit ale gliceridelor variind ntre 102 1700 C. Sunt solubili n solveni organici i greu solubili n ap. Acei steroli care au n molecul o legatur dubl dau reacii de adiie cu hidrogenul i halogenii. Sterolii se pot recunoate prin reacii de culoare cu acidul sulfuric concentrat, anhidrd acetic, peroxizi n soluie cloroformic. Clasificare Se clasific dup provenien n : Fitosteroli caracteristici plantelor superioare i celor inferioare; Micosteroli caracteristici ciupercilor; Zoosteroli caracteristici organismelor animale

Fitosterolii se gsesc n cantitate mai mare n plantele superioare, n seminele plantelor oleaginoase, leguminoase i n boabele cerealelor. Cel mai rspndit este sitosterolul care uneori este nsoit de un procent mai mic de stigmasterol. Ei se gsesc n natur sub form liber dar i sub form de fitosteride, glicozide. Ei au importan n biosinteza hormonilor steroidici dar i a vitaminelor D. Fitosterolii se gsesc n numeroase plante dar i n seminele unor plante. Se pare c au un rol important n organism prin meninerea nivelului colesterolului la un nivel ct mai mic, mai ales atunci cnd sunt consumai n cadrul unei alimentaii fr colesterol. Inhib absorbia intestinal a colesterolului; esterii liposolubili (stanoli derivai 5 alfa saturai) au fost introdui pentru scderea nivelului seric la colesterolului din anii 1990.

S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis. Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante.

n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie,. Cromatografia ionic (de schimb ionic) Cromatografia de excluziune sferic Cromatografia lichid-lichid (LLC) Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC) Cromatogafia pe hrtie Cromatografia pe strat subire (TLC Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate,

accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.

Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) acoper azi, n proporie aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecular ridicat (naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc pe cea din GC, prin faptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza mobil, cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul timp, aceast metod n principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijin chimia sintetic actual i pe care s-a dezvoltat biochimia i biotehnologia modern.

Solvent Pomp Injector Coloan Detector nregistrator

Schema bloc a unui cromatograf HPLC

Cromatografia planar (PC) ntlnit adesea sub denumirea de cromatografie n strat subire este cea mai simpl i ieftin dintre toate metodele cromatografice cunoscute. n literatura de specialitate se utilizeaz mai multe denumiri (cu prescurtrile associate acestora). Pe lng termenul consacrat - cromatografia planar (planar chromatography PC) se mai ntlnesc denumiri ca cromatografia n strat subire de nalt performan (high performance thin layer chromatography - HPTLC) sau cromatografia de lichide planar (planar liquid chromatography - PLC).

Cromatografia metoda oarb achiziie simultan att a timpilor de retenie, ct i a maselor moleculare ale componenilor din amestec ; Polimeri sintetici cu indice de polidispersitate crescut eficien de ionizare inegal pentru componenii probei necesar separarea prealabil LC sau GPC Nu exist degradare termic Analiz rapid Cantiti foarte mici de prob, sensibilitate nalt Informaii structurale prin LC/MS/MS Mas molecular medie sau indicii de polidispersitate pot fi utilizate pentru a verifica procedurile de sintez, n studiul mecanismelor de degradare, determinarea aditivilor i a impuritilor, etc. Determinarea masei moleculare absolute a lanurilor macromoleculare spre deosebire de tehnicile cromatografice precum SEC care furnizeaz valori relative.

Acest studiu prezint prima metod lichid cromatografic pentru identificarea i cuantificarea a apte fitosteroli din uleiul de msline. Sterolii au fost identificai i cuantificai prin cromatografie de lichid cu detectare spectrometric de mas n mod ACPI (atmospheric pressure chemical ionisation)pozitiv. Probele erau saponificate prin reflux cu KOH 2N etanolic, iar partea nesaponificabil a fost extras cu dietil-eter. Aceast parte a fost supus cromatografiei cu strat subire (TLC thin layer cromatography) pe plci de silica-gel i apoi banda de steroli a fost izolat i extras cu metanol. Sterolii au fost cuantificai cu LC MS, pe o coloan Waters Atlantis 5 lm dC182,1 150 mm cu un gradient de aceto-nitril/ap (acid acetic0.01%) la o raie de 0.5 mL min_1; temperatura coloanei 30 C. Metoda prezint valori ntre 123 i 677 ng mL_1 pentru limita de detecie, cu abateri standard relative ntre 4.0% i 5.4% la concetraie de 5 mg L_1 pentru fiecare sterol n parte. Coninutul sterolilor au fost determinate din uleiul de msline virgin, uleiul de msline rafinat, un ulei de msline din smburi i un ulei de msline din smburi brut.

Metodele determinare a compuilor simpli de obicei necesit izolare i cteva proceduri de separare, identificare i cuntificare. Analizele sunt bazate de obicei pe metodele oficiale de determinare a numrului total de steroli din grsimi i uleiuri. Metodele oficiale pentru izolarea sterolilor din uleiul de msline implic saponifocarea lipidelor, extragerea materiei nesaponificabile cu eter dietilic i splarea extractului cu ap, separarea cu cromatografie pe strat subire (TLC- thin layer chromatography) pe plac subire de silica gel, derivarea sterolilor i analiz cromatografic secvenial. Metoda convenional pentru cuantificarea sterolilor i alcoolilor triterpenici implic analiz GC cu FID, a prilor isolate de TLC, ca derivai trimetilsilil. Gas chromatografia (GC) cu diferii detectori i spectrometria de mas (MS), sunt cele mai uzuale tehnici de determinare a sterilor. HPLC cu diferite sisteme de detectare sunt folosii de asemenea ca s se determine i s se cuantifice compui sterolici compleci din alimente. Cteva publicaii exist privind identificarea a anumitor steroli din uleiul de soia i alge comestibile prin LC-MS, dar nu exist publicaii privind analiza sterolilor din uleiul de msline prin HPLC-MS. Prin urmare, n acest studiu aplicabilitatea LC-MS cu APCI a fost evaluat pentru caracterizarea fraciunilor sterolice din proba de ulei de msline. Obiectivul acestui studiu este s reueasc separarea complet a amestecului complex de steroli prin LC i identificare lor prin MS. O separare reuit a colesterolului, strigmasterolului, b-sitosterol, sitostanol, fucosterol, erittodiol i uvaol a fost ndeplinit.

Sistemul LC folosit a fost Alliance 2695 echipat cu un autosampler, degazor, i o coloan de nclzit achiziionat de la Waters (Milford, MA, USA). Sistemul spectrometric de mas a fost ZQ 2000 unic cuadrupolar cumprat de la Waters Micromass (Manchester, UK) i a folosit mpreun cu o interfa APCI. Informaiile au fost colectate cu softul MassLynk 4.0, pe un calculator personal. Compuii au fost separai de 5-lm Atlantis dC18 150 2.1-mm i.d. din Waters cu un gradient de acetonitril / ap (acid acetic 0.01%) la un flux de 0.5 mL min_1.

Patru probe de ulei de msline simplu i din smburi din regiuni geografice diferite au fost obinute n martie 2005. Probele (5g de ulei de msline) au fost saponificate prin refularea cu 50mL de soluie etanolic de KOH 2M timp de 1 or. Dup rcirea la temperature camerei, 100mL de ap au fost adugate. Dup faza de separare din plnia de separare, faza apoas const n splarea de 3 ori cu dietil eter. n final, fraciunile dietilice au fost colectate i splate cu ap i uscate cu sulfat de sodiu anhidru, filtrate i apoi evaporate la sec utilizndun evaporator rotatoriu la presiune redus, iar residuul (materialul nesaponificabil) a fost dizolvat n chloroform (1mL). Extractul (300IL) a fost supus TLC cu plci de silicagel producnd benzi separate diferite potrivite a mai multor clase de compui simpli. Apoi, banda de steroli a fost izolat i extras cu methanol (25mL) i ulterior analizat cu cromatografie cu lichid.

ESI i APCI au fost folosite ca i surse de ionizare, att n modul negativ ct i pozitiv, schimbnd voltajul conului ntre 20 i 60V, ntr-o arie de m/z ntre 70 i 1000, dar rezultate eficace au fost obinute doar n modul pozitiv. Aa cum se observ i n tabelul 1, sursa ESI nu este aplicabil pentru determinarea sterolilor deoarece nu se realizeaz o suficient fragmentare a compuilor n condiiile impuse. Tabelul 1 arat fragmentele majore observate pentru fiecare surs n modul pozitiv.

Coninutul sterolilor de fraciuni nesaponificabile a probelor de ulei de msline virgin, ulei de msline rafinat, ulei de msline din smburi simplu i brut a fost determinat prin HPLC MS. Urmtorii compui au fost izolai i cuntificai : cholesterol, stigmasterol, b-sitosterol, sitosterol, fucosterol, eritrosterol i uvaol. Cromatogramele celor patru probe se afl n fig. 2. Rezultatele coninutului de sterol exprimat n mg/kg de ulei de msline pentru fiecare sterol sunt prezentate n tabelul 4. Erythrodiol and uvaol m/z 425.30 (A), cholesterol m/z 369.20 and fucosterol m/z 395.30 (B), stigmasterol m/z 395.30 (C), b-sitosterol m/z 397.30 (D), sitostanol m/z 397.30 (E).

LC-MS cu ACPI a fost evaluat pentru prima dat s identifice i caracterizeze prile sterolice din probe de ulei de msline. S-a reuit o separare suficient a colesterolului, stigmasterolului, bsitosterolului, sitosterolului, fucosterolului, eritrosterolului i uvaolului i metoda s-a dovedit satisfctor aplicat pe diferite probe reale.