Determinarea trigliceridelor totale prin

metoda enzimatic-colorimetrică
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică
• Lipidele, constau dintr-o familie heterogenă de biomolecule care includ:
trigliceride, digliceride, monogliceride, acizi grași liberi, fosfolipide, steroli,
steroli esterificați, pigmenți (carotenoizi, clorofile), tocoferoli etc.
• Lipidele sunt complexe moleculare care conțin acizi grași saturați sau acizi
grași nesaturați. Sunt prezente în țesut sau în sânge sub forma de
lipoproteine care conțin acizi grași esterificați.
• Trigliceridele sunt esteri ai glicerinei cu trei acizi grași și sunt cele mai
abundente lipide naturale.
H2C O CO
HC O CO
H2C O CO
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică

Trigliceridele sunt transportate în plasmă legate de apolipoproteine

formând lipoproteine cu densitate foarte mică (VLDL) și chilomicroni.
Măsurarea trigliceridelor este utilizată în screeningul stării de hiperlipidemie
pentru a detecta riscurile aparitiei aterosclerozei și în monitorizarea
profilului lipidelor.
Studiile au arătat că in cazul concentrațiile crescute de trigliceride
combinate cu concentrații crescute de lipoproteine cu densitate scăzută
(LDL) constituie un risc deosebit de ridicat pentru bolile coronariene.
Niveluri ridicate de trigliceride apar și în diferite boli ale ficatului, rinichilor și
pancreasului.
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică

• Trigliceridele sunt cei mai abundenți constituenți ai țesutului adipos și

reprezintă o rezervă de energie pentru organism.
• De asemenea, transportă în sânge vitaminele liposolubile (A, D, E și K).
• Trigliceridele pot fi de origine exogenă și se pot forma în intestinul
subțire din alimentele consumate, dar pot fi produse și în ficat din
excesul de zahăr din dietă.
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică

Trigliceridele nu circulă liber în sânge; acestea sunt transportate de către

alte molecule în complexe numite lipoproteine.
Diferitele tipuri de lipoproteine pot fi clasificate pe baza densității în:
- Chilomicronii
- IDL = lipoproteinele cu densitate intermediară joasă
- VLDL = Lipoproteinele cu densitate foarte mică
- LDL = lipoproteine cu densitate redusă
- HDL = Hight lipoproteinele cu densitate
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică

Fiecare tip de lipoproteină are o funcție și caracteristici specifice.

Chilomicronii transportă lipidele absorbite în intestin după masă.
VLDL și LDL transportă trigliceridele din ficat în țesuturile periferice pe stomacul gol.
Determinarea nivelului sanguin al trigliceridelor este utilă pentru diagnosticul
hiperlipoproteinemiei.
De asemenea, dozarea trigliceridelor se realizeaza pentru a urmari evoluția diabetului
zaharat, a nefrozei, a obstrucției biliare și a diferitelor anomalii metabolice datorate
tulburărilor endocrine.
În majoritatea cazurilor, hipertrigliceridemia este secundară unei alte boli (o tulburare
metabolică sau endocrină). Poate fi și consecința obezității sau a unei diete prea
bogate în grăsimi.
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică

Creșterea trigliceridelor circulante poate genera dureri și distensie

abdominală, diaree, vărsături, pancreatită, mărirea ficatului, probleme
oculare, boli cardiovasculare.
Primul semn al hipertrigliceridemiei este turbiditatea serului. După
prelevarea unei probe de sânge, tubul este centrifugat, celulele sunt la
baza tubului și supernatantul este serul. În mod normal, este limpede și
devine tulbure în prezența lipidelor.
Principiul metodei
1. Trigliceride din proba de ser sunt hidrolizate enzimatic de lipoprotein lipază
(LPL) în glicerol și acizi grași liberi.

2. Glicerolul eliberat este mai întâi fosforilat de glicerol kinază (GK) în glicerol-3-
fosfat.

3. Glicerol-3-fosfatul rezultat este apoi oxidat de glicerol-3-fosfat oxidază (GPO),

eliberând peroxid de hidrogen (H2O2).
Cantitatea H2O2 formată este echivalentă cu cantitatea de trigliceride din probă.
Concentrația H2O2 este determinată prin reacția Trinder: în prezența fenolului,
H2O2 și peroxidazei (POD), 4-amino-antipirina, formeaza un produs colorat în
roz, chinoneimina, care prezintă o absorbție la 500 nm.
Intensitatea culorii formate este proporțională cu concentrația de trigliceride
din probă, care este exprimată în g / L. Chinoneimina este cuantificată citind
absorbanța la lungimea de undă 500 nm.

4-amino-antipirina 4-clorfenol quinoneimina (pink)

Reactivi de lucru
- Tampon Good pH 7,2 ………..........................................50 mmol/L
- 4-Clorfenol ………………………….…………………………………...4 mmol/L
- ATP………………………………..………………………………………….2 mmol/L
- Lipoprotein lipaza(LPL) ……….…………………………..……….4000 U/L
- Glicerol kinaza (GK) …………….………………………………..….400 U/L
Reactivi Peroxidaza (POD) ……………….……………………………………2000 U/L
-
- Glicerol-3-fosfat-oxidaza (GPO) ………………………………1500 U/L
- 4-Amino-antipirina ……………………………….……………….0,5 mmol/L

- Trigliceride ………………………………..…………..…0,2 g/L (2,3 mmol/L)

Standard

Probe - Set/ plasma colectate pe heparina sau EDTA

Modul de lucru
Blank Standard Proba

Apa distilata (µL) 10 - -

Standard (µL) - 10 -

Proba (µL) - - 10

Reactiv (µL) 1000 1000 1000

Se amestecă, se incubează 20 de minute la 20 ° C - 25 ° C sau 10 minute la 37

° C. Citiți absorbanța împotriva martorului de reactiv în 60 de minute.

Absorbanta (500 nm) - AStandard AProba

Calcul
Trigliceride [g/L] = AProba /Astd x CStd [g/L]

Factori de conversie
Trigliceride [g / L] x 1.126 = Trigliceride [mmol / L]
Trigliceride [g / L] x 100 = Trigliceride [mg / dL]
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică
Valori crescute
Sinteza crescuta: sindrom hiperlipemic ecvin, anorexie, obezitate, gestație,
lactație, endotoxemie, postprandial.
Metabolism anormal (lipoliză anormală): hipotiroidism primar, sindrom
nefrotic (în special hipercolesterolemie), deficit de lipoproteină-lipază (foarte
rar)
Altele: dietă bogată în lipide, hiperlipidemie „rasială” (Schnauzer miniatural,
Beagle), pancreatită acută, hiperadrenocorticism (tratament cu
glucocorticoizi)
 Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică
Valori scăzute
- abetalipoproteinemie
- malnutriție și malabsorbție
- hipertiroidism, hiperparatiroidism
- boala pulmonară obstructivă cronică.
Determinarea trigliceridelor totale prin metoda enzimatic-
colorimetrică
Trigliceride [g/L] = AProba /Astd x CStd [g/L]

Absorbanta Probe/Standard Concentratie (g/L)

S1 = 1.103 0,15

S2 = 1.147 0,155

S3 = 1.138 0,154

S4 = 1.051 0,142

Std = 1.471 0,2 g/L

Dozarea colesterolului total
din ser
 Dozarea colesterolului total din ser
Colesterolul este principalul sterol din corpul animal.
Este un sterol insolubil in apa, deosebit de stabil și, prin urmare, dificil de
degradat.
Colesterolul este o componentă a membranelor celulare.
Este implicat in biosinteza hormonilor steroizi, acizilor biliari si a vitaminei D.
 Dozarea colesterolului total din ser
Provine în mică parte din alimente de origine animala, în cea mai mare parte este de
origine endogenă sintetizat prin două căi:
1. sinteza din acetilcoenzima A, 90% din producția întregului organism
2. de origine intestinală.
Colesterolul este un marker al dezechilibrelor metabolice din organism. Este produs în
principal de ficat din acetil-CoA și țesuturile periferice într-o măsură mult mai mica.
Celulele intestinale sintetizează colesterolul pe care il impacheteaza in chilomicroni.
Glandele suprarenale și gonadele pot produce, de asemenea, colesterol.
Colesterolul este implicat în fluiditatea membranelor celulare. Cu cât este mai prezent
într-o membrană, cu atât este mai rigid.
 Dozarea colesterolului total din ser
Serul sanguin conține aproximativ 7 g/L de lipide. Acestea sunt în principal colesterol
liber și esterificat, trigliceride, fosfolipide și acizi grași liberi. Majoritatea colesterolului
nu circulă liber în sânge; este transportat de lipoproteine, complexe formate între
lipide și apolipoproteine.
Se asociază în principal cu lipoproteine ​cu densitate mică LDL (“colesterol rau”)
(transporta colestrolul de la ficat la țesuturile periferice) sau cu lipoproteine ​cu
densitate ridicată HDL (“colestrol bun”) (transportă colesterolul în exces din
țesuturile periferice la ficat) pentru ca acesta să fie eliminat sau redistribuit.
Fiecare specie are proporții diferite ale acestor lipoproteine. Spre deosebire de
medicina umană, unde aceste fracții sunt frecvent măsurate (pentru a distinge între
colesterolul bun și cel rău), acest lucru nu se face în medicina veterinară. Colesterolul
este un constituent important al lipoproteinelor plasmatice și poate fi determinat
printr-un număr mare de metode colorimetrice, enzimatice sau cromatografice.
Dozarea colesterolului
total din ser
 Dozarea colesterolului total din ser
Principiul metodei
1. Colesterolul esterificat prezent în ser este hidrolizat enzimatic de catre
colesterol esterază (CHE) în colesterol liber și acizi grași.
2. Colesterolul liber produs și cel preexistent este oxidat de colesterol oxidaza
(CHO) formand colesterol-3-ona si peroxid de hidrogen (H2O2).
3. Peroxidul de hidrogen, în prezența peroxidazei (POD) și a fenolului, oxidează
un cromogen incolor (4-amino-antipirină) într-un complex de culoare roșie/roz
chinoneimină.
Absorbanța complexului de culoare roz este măsurată la o lungime de undă de
500 nm, iar intensitatea culorii este direct proporțională cu concentrația de
colesterol a probei, care este exprimată în g/L. Schema de reacții este
următoarea:
 Dozarea colesterolului total din ser

cholesterol esterificat cholesterol liber cholesterol-3-ona

peroxid de hidrogen 4-amino-antipirina fenol quinonenimina (roz)

 Dozarea colesterolului total din ser

- Tampon Good pH 6,7 ………..........................................50 mmol/L

- Fenol ……………………………………………………………….……….5 mmol/L
- Colesterol esteraza (CHE) ………….………………………………200 U/L
Reactivi Cholesterol oxidaza (CHO) ………………..……………….……..50 U/L
-
- Peroxidaza (POD)……………………………………………….……..2000 U/L
- 4-amino-antipirina…………………………..………….………….0,3 mmol/L
Standard - Colesterol …………….……………………………………………………2,0 g/L (5,2 mmol/L)

Proba - Ser sau plasma colectat pe heparina sau EDTA

 Dozarea colesterolului total din ser
Reactiv Blank (Martor) Standard Proba

Apa distilata (µL) 10 - -

Standard (µL) - 10 -

Proba (µL) - - 10

Reactiv (µL) 1000 1000 1000

Omogenizare, incubare 20 de minute la 20°C - 25°C sau 10 minute la 37°C. Se citeste

absorbanța fata de martor în decurs de 60 de minute.

Absorbanta (500 nm) - AStandard AProna

 Dozarea colesterolului total din ser

Factor de conversie
• Colesterol [g/L] ∙ 2,586 = Colesterol [mmol/L]
• Colesterol [g/L] ∙ 100 = Colesterol [mg/dL]
 Dozarea colesterolului total din ser
Hiperlipidemia este definită de o creștere a trigliceridelor circulante și/sau a
colesterolului.
Simptomele hiperlipidemiei includ convulsii, dureri abdominale, disfuncții ale
sistemului nervos, plăci cutanate și xantome ale pielii, umplute cu lipide galben-
portocalii.
Cauzele hiperlipidemiei:
- absorbția crescută a trigliceridelor/colesterolului: după masă
- producție crescută de trigliceride/colesterol: sindrom nefrotic (boală degenerativă a
rinichilor)
- scăderea clearance-ului trigliceridelor/colesterolului: hipotiroidism, glanda
suprarenală hiperactivă, diabetul zaharat, inflamația pancreasului, obstrucția căilor
biliare (colestază), gestație, defecte ale enzimelor pentru eliminarea lipidelor sau a
lipoproteinelor
 Dozarea colesterolului total din ser
𝐀 𝑷𝒓𝒐𝒃𝒆𝒊
𝐂𝐨𝐥𝐞𝐬𝐭 𝐞𝐫𝐨𝐥 [ 𝑔 / 𝐿 ] = × 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚𝐭𝐢 𝒂 𝐒𝐭𝐚𝐧𝐝𝐚𝐫𝐝 [ 𝑔/ 𝐿 ]
𝐀 𝐒𝐭𝐚𝐧𝐝𝐚𝐫𝐝

Absorbanta Probe/Standard Concentratie (g/L)