ANALIZE FIZICO-CHIMICE

Tema 4. Lipidele. Metode de dozare

 Lipidele
Importanţa lipidelor
• Lipidele confera rezistenta membranelor
celulare, permeabilitate selectivă faţă de
interacţiunea cu substanţele.
• Pe langă rolul structural (acela de a participa
la alcătuirea membranelor celulare) lipidele
mai indeplinesc şi un rol de rezervă
energetică.
• Lipidele posedă cea mai mare densitate
calorică, în comparaţie cu celelalte
componenţii nutritivi.
 Lipide. Informaţii generale
• Alimentele bogate în grăsimi au în mod
natural o densitate calorică ridicată.
Alimentele bogate în grăsimi conțin mai
multe calorii decât alimentele bogate în
proteine sau carbohidrați. Drept urmare,
alimentele bogate în grăsimi sunt o sursă
convenabilă de energie.
• De exemplu, 1 gram de grăsime sau ulei
furnizează 9 kilocalorii de energie, comparativ
cu 4 kilocalorii găsite în 1 gram de
carbohidrați sau proteine.
• În funcție de nivelul de activitate fizică și de
necesităţile nutriționale, necesarul de grăsimi
variază foarte mult de la o persoană la alta.
• Când necesităţile de energie sunt mari,
organismul salută densitatea calorică ridicată
a grăsimilor.
• De exemplu, sugarii și copiii în creștere
necesită cantități adecvate de grăsime
pentru a sprijini creșterea și dezvoltarea
normală. Dacă unui sugar sau unui copil i se
administrează o dietă cu conținut scăzut de
grăsimi pentru o perioadă îndelungată,
creșterea și dezvoltarea nu vor progresa
normal.
• Alte persoane cu nevoi mari de energie sunt
sportivii, oamenii care solicită fizic locuri de
muncă și cei care se recuperează de boală.
 Omega 3/ Omega 6
• Omega-3, ca şi Omega-6 pătrund în organism
împreună cu alimentele. Sinteza lor este imposibilă,
din acest motiv în cazul insuficienţei acizilor graşi
creşte probabilitatea dezvoltării diferitor boli.
• Omega-6 sunt necesare din câteva motive. În primul
rând prin intermediul lor se menţine un nivel adecvat
de colesterol în sânge, fapt ce preîntâmpină apariţia
aterosclerozei. Acizii graşi ai clasei de acest tip
îmbunătăţesc ascpectul exterior al pielii şi părului.
Omega-6 participă la regenerarea ţesuturilor,
accelerează metabolismul.
• Acizii graşi Omega-3 lichifiază sângele, reglează
activitatea inimii, creerului, ochilor.
• Molecule Omega-6 posedă o acţiune opusă – sângele
devine mai dens, frânează procesele metabolice, în
cazul excesului cauzează dezvoltarea proceselor
inflamatorii şi tumorilor.
• Majoritatea savanţilor consideră că raportul Omega-
6:Omega-3 este de 2:1 sau 4:1.
 Conţinutul Omega 3/ Omega 6 în unele produse alimentare

PRODUSUL Conţinut OMEGA-3, Conţinut OMEGA-6,

mg mg
Ulei de in (1 lingură) 7196 1715
Ulei de floarea-soarelui (1 lingură) 5 3905
Ulei de porumb (1 lingură) 157 7224
Ulei olive (1 lingură) 103 1318
Seminţe in (30 g) 6388 1655
Seminţe floarea-soarelui (1 cană) 34 10602
Seminţe bostan (1 cană) 250 28571
Nuci greşti (1 cană) 10623 44567
Nuci migdale 5,7 11462
 Importanţa lipidelor
Lipidele prezintă o fracţie uşor
alterabilă a alimentelor, ca urmare
durata şi condiţiile de păstrare
depind de conţinutul şi
componenţa lor.
Importanţa lipidelor
Conţinutul materiei grase
în alimente constituie
obiectul legislaţiei în
vigoare a fiecărei ţări şi
ca urmare necesită
etichetare.
 Necesitatea analizei fracţiilor lipidice este
argumentată de:

• determinarea valorii energetice a produselor;

• determinarea conţinutului total de lipide;
• necesitatea etichetării nutriţionale (determinarea
fracţiilor lipidice);
• determinarea perioadei de păstrare a
alimentelor;
• necesitatea controlului calităţii produselor
alimentare.
În alimente lipidele sunt prezente în fond sub formă de trigliceride
Lipids
Lipids
Conţinutul lipidelor în unele alimente
Alimente Conţinutul, %
Ulei 100
Unt 50-82
Nuci 45-75
Gălbenuş 32-36
Ou integral 10-12
Ciocolată 35
Lapte praf 27
Îngheţată 12
Carne de vită 16-25
Carne de găină 5-10
Carne de porc 23-30
Cartofi fri 7-9
Lapte 2-5
Făină de grâu 1-1,5
Pâine 0,8-1
 Schema generală de analiză a fracţiilor lipidice în alimente

ALIMENTE

Tratare prealabilă Extragere cu solvent Determinarea directă

Cromatografia în strat subţire Cromatografia gazoasă HPLC

Dozare Separarea fracţiilor Separarea fracţiei insaponabile

 Indicii de refracţiei a diferitor grăsimi (20 C)
Metoda refractometrică Tipul grăsimii Coeficientul de
refracţie
Metoda se utilizează pentru determinarea cacao 1,4647
grăsimii în semifabricatele vegetale, produsele cocos 1,4567
de cofetărie. grăsime de patiseri 1,4674
unt de vacă 1,4674
Grăsimea se extrage din proba analizată cu ulei de porumb 1,4745
solvent (cu un coeficient de refracţie cunoscut) grăsime de culinarie 1,4724
şi conţinutul de grăsime se detrmină ca cunjut 1,4730
difirenţa dintre valoarea coeficientului de margarină 1,4690
refracţiei a soluţiei de grăsime şi valoarea arahis 1,4704
coeficientului de refracţie a solventului. keşiu 1,4692
migdale 1,4707
Drept solvent se utilizează α-clornaftalinei cu funduc 1,4706
coeficientul de refracţie 1,63 sau α- ulei floarea-soarelui 1,4736
bromnaftalinei cu coeficientul de refracţie untura de porc 1,4712
1,65. Coeficienţii de refracţie a grăsimilor se soie 1,4756
află în diapazonul 1,46-1,48.
 Metoda refractometrică
•  Metodica de determinare (http://docs.cntd.ru/document/1200022354)
Într-o ceaşcă de porţelan se plasează proba cu masa 0.5-2 g în funcţie de conţinutul
grăsimii în produs:
• peste 30% - 0.5 g;
• 20-30% - 0.75 g;
• 10-20% - 1 g; Vsolv. – volumul solventului
D – densitatea grăsimii
• 5-10% - 1.5 g; M – masa probei
Ksolv. – coeficientul de refracţie a solventului
• <5% - 2 g. Ksol. – coeficientul de refracţie a soluţiei de grăsime
Kg. – coeficientul de refracţie a grăsimii
Apoi proba se usucă pe baia de nisip P – masa pentru micşorarea umidităţii. Aluatul de
probei analizate
drojdii se usucă în cuptorul cu microunde, probele din produsele de patiserie nu se
usucă suplimentar.
Proba se omogenizează cu pistilul până la o masă omogenă, se adaogă solvent (α-
clornaftalina sau α-bromnaftalina) în raport 1cm3 la 1 g produs şi minuţios se
amestecă timp de 3 min, se filtrează şi se determină coeficientul de refracţie.
 Metoda turbidimetrică

• Metoda este simplă, rapidă, sensibilă și

precisă. Procedura se bazează pe
extragerea lipidelor în acetonă urmată de
reacția lor turbidimetrică cu o soluție de
1,5% de acid sulfosalicilic și măsurarea
turbidimetrică.
• Măsurarea spectrală se realizează la 440
nm. Curba standard se construieşte
folosind grăsimi brute extrase din speciile
analizate.
• Pentru analiza unui număr mare de
solvenți, standardizarea metodei
turbidimetrice poate fi realizată folosind
valorile Soxhlet pentru câteva probe
reprezentative.
 Spectroscopia IR

• Spectroscopia IR este o veche tehnică

analitică care a fost utilizată pe scară
largă ca instrument de rutină de
industria grăsimilor și a uleiurilor.
• Primele spectre infraroșii a acizilor
grași și uleiuri vegetale au fost
publicate de Coblentz în 1905.
• Din acest moment există o
recunoaștere evidenţiată de către
cercetători și industria alimentară a
valorii spectroscopiei vibraționale în
analiza lipidelor.
 Spectroscopia IR

• Pe lângă rolul fundamental al spectroscopiei

medii IR în cercetarea lipidelor, cea mai
notabilă aplicație pentru producătorii și
procesatorii de grăsimi și uleiuri a fost
determinarea totală a trans- grăsimilor.
• Spectrele regiunea IR medie (400-4000 cm-1)
oferă informații despre modurile
vibraționale fundamentale ale căror poziții
ale benzii în spectre observate pot fi
corelate cu frecvențele caracteristice ale
grupului și oferă „amprente” care sunt
utilizate pentru identificarea și cuantificarea
elementelor constitutive ale grăsimilor și
uleiurilor.
 Spectroscopia IR

• Determinarea conţinutului total

de trans- grăsimi se bazează pe
măsurarea liniei specifice de
deformare C-H detectate la 966
cm-1, caracteristică pentru
legăturile duble izolate cu
configuraţia trans.
 RMN

• Esterii de triacilglicerol sunt esterii cei

mai obișnuiți în care acizii grași apar în
mod natural.
• În natură, triacilglicerolii există rar sub
forma unui triester glicerol dintr-un
singur acid gras, ci mai degrabă sunt
specii mixte, adică glicerolul esterificat
cu mai mult de un acid gras.
• Figura prezintă spectre 1H-RMN ale
diferitor esteri glicerolici ai acidului
stearic.
Figure 1a. 1H-NMR spectrum of tristearin.
Figure 2. 1H-NMR spectrum of 1,3-distearin.

Figure 3. 1H-NMR spectrum of 1-monostearin.

 Cromatogrfaia în strat subţire

• Metoda se aplică pentru

separarea individuală a lipidelor
sau obţinerea unor amestecuri
simpli, analiza cărora oferă nişte
rezultate relativ sigure.
• Rezultate bune se obţin la
separarea trigliceridelor prin CSC
în prezenţa ionilor de argint. Pot
fi analazaţi cerurile, mono şi di
gliceridele, fosfogliceridele.
 Cromatogrfaia în strat subţire

Cromatografia pe silicagelul
impregnat cu nitrat de argint oferă
posibilitatea separării compuşilor
după gradul lor de saturabilitate –
posibilă separarea trigliceridelor
de digliceride.

Schematic separation of simple lipids and phospholipids of plasma by

high-performance TLC; two developments as far as "X" with
chloroform-methanol-water (60:30:5 by volume), and a third
development to "Y" with hexane-diethyl ether-acetic acid (80:20:1.5 by
volume). Abbreviations: CE, cholesterol esters; TG, triacylglycerols; FFA,
free fatty acids; C, cholesterol; PE, phosphatidylethanolamine; PC,
phosphatidylcholine; SPH, sphingomyelin; LPC,
lysophosphatidylcholine.
 Cromatogrfaia în strat subţire

• Faza mobilă conține hexan, eter dietilic şi acid

acetic (sau formic) în diferite proporții.
• Exemplu de amestec de aceşti solvenți în raportul
80:20:2 (după vol.), separarea ilustratăschematic
în figură din dreapta.
• Majoritatea lipidelor simpli sau separat
(deplasându-se în sus), fosfolipidele rămânând în
poziţia iniţială.
• În scopuri preparative 20 mg de amestec de lipide
pot fi aplicate pe o placă 20 × 20 cm, acoperită cu
un strat de 0,5 mm grosime de silicagel.
Cromatogrfaia în strat subţire
 Cromatografia gazoasă

• Cromatografia cu gaze poate fi utilizată pentru • Deși există o gamă largă de faze
analiza fosfolipidelor. Cu toate acestea, aceasta
nu este o alegere optimă, având în vedere că staționare disponibile pentru CG,
separarea depinde de volatilitatea analitelor sunt utilizate de obicei coloane
(Axelsen și Murphy, 2010). Pentru această
tehnică, fosfolipidele pot fi hidrolizate la de metil-fenil șipentru detecţie
diacliceroli cu fosfolipază C și derivatizate servesc detectoarele de ionizare
pentruanaliza GC (Tserng și Griffin, 2003).
a flăcării (Dunn și colab., 2011).
• Un alt dezavantaj al acestei analize – necesitatea
în temperaturi ridicate ale coloanelor care pot
duce la degradarea probelor, sensibilitatea
compromisă și calitatea datelor obţinute. Sunt
utilizate frecvent coloanele capilare ce oferă
rezoluție înaltă, precum și timpi de retenție
reproductibili (Dunn et al., 2011)
 HPLC

• Trebuie menționat că metodele HPLC pentru

analiza claselor lipide simple nu a găsit o
utilizare pe scară largă de către analiști din
cauza problemelor de detectare.
• Cantități apreciabile de lipide complexe pot fi
acumulate în cloană și în cele din urmă bloca
coloana HPLC.
• Pentru separarea lipidelor simpli au fost
utilizate o varietate de umpluturi pentru
coloane, eluenţi, detectori.
• Ca exemplu de separare practică, Foglia și Jones
au demonstrat o separare eficientă a esterilor
colesterolului, esteri metilici, tri-, di- și
monoacilgliceroli, colesterol și acizi grași liberi.
 Indicii de calitate a lipidelor

Modul de lucru
Indicele de saponificare caracterizează masa
moleculară a acizilor graşi componenţi ai grăsimii.
• 
Se exprimă prin mg de KOH necesare pentru
saponificarea a 1g de ulei.
Acest indice se testează în conformitate cu metode
standarde. S-au cântărit 2-3g de grăsime în
recipient conic. unde: a - volumul HCl de 0,5N, utilizat la titrarea probei de
Recipientul, unit cu un refrigerent, a fost introdus control, ml;
în baia de apă, unde a fost supus fierberii timp de b – volumul HCl de 0,5N necesar pentru neutralizare
1 oră, agitând din când în când proba analizată. după saponificare, ml;
Concomitent s-a pregătit şi proba de control. m - masa probei de grăsime, g
Conţinutul răcit a fost titrat cu 0,5N HCl în prezenţa
fenolftaleinei. Indicele de saponificare se
determină prin relaţia:
Indice de săpunificare
 Indicii de calitate a lipidelor

• Indicele de aciditate exprimă cantitatea de mg

KOH, necesare pentru neutralizarea acizilor graşi
liberi care se conţin în 1g grăsime. • 
• Acest indice atestă durata şi condiţiile de
depozitare. Grăsimile proaspete de obicei au un unde: 5,611 este titrul KOH 0,1N, în mg;
conţinut minim de acizi, la cele vegetale V – volumul de 0,1N KOH în ml, consumat la titrare;
conţinutul este mai mare comparativ cu cel al m – masa probei de grăsime, g.
grăsimilor animaliere.
• Indicele de aciditate al grăsimilor alimentare nu
trebuie să depăşească valoarea 3,5. Uneori indicele de aciditate se exprimă şi în grade
de aciditate T (gradul de aciditate reprezintă
• S-au cântărit 3-5g ulei vegetal, care a fost numărul de ml 1N soluţie alcalină, necesară pentru
dizolvat în 50 ml eter şi alcool etilic (raport 2:1). neutralizarea acizilor din 100g grăsime).
Neutralizarea amestecului s-a realizat prin titrare
cu KOH de 0,1N în prezenţa fenolftaleinei.
Formula de calcul fiind:
Indicele de aciditate
 Indicii de calitate a lipidelor
•Indicele de iod caracterizează cantitatea de acizi
graşi nesaturaţi din compoziţia grăsimii.
•Acest indice exprimă cantitatea de iod (g)
necesară pentru saturarea acizilor graşi
nesaturaţi din 100g ulei.
•Indicele de iod al uleiului de floarea soarelui nu
se deosebeşte considerabil de alte uleiuri
vegetale.
•Pentru aprecierea acestui indicator a fost utilizată
metoda standardizată Hanus.
•Principiul metodei constă în titrarea probei de
analizat cu tiosulfat de sodiu 0,1N până la
culoarea galben-pai. Apoi se adaugă soluţie de
amidon şi se continuă titrarea până la dispariţia
completă a culorii albastre. Formula de calcul a
indicelui de iod:
• 
•unde: 0,1269 - concentraţia de iod
corespunzătoare la 1cm3 tiosulfat de
sodiu Na2S2O3, soluţie 0,1N; V - volumul
soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1N
(Na2S2O3), utilizat la titrarea probei fără
grăsime, ml, (proba martor);
•V1 - volumul tiosulfatului de sodiu
Na2S2O3 utilizat la titrarea probei de
analizat (mostra cu grăsime), cm3 ;
•n - normalitatea soluţiei de tiosulfat de
sodiu folosită la titrare; m - masa probei
luate pentru analiză, g.
Indicele de iod
 Indicii de calitate a lipidelor
Indicele de peroxid
• Hidroperoxidul este produsul principal al auto-
oxidării lipidelor nesaturate. Indicele peroxizilor
măsoară direct concentrația hidroperoxizilor
formați în etapa de inițiere a procesului de
oxidare a lipidelor.
• Această metodă de titrare iodometrică este
utilizată în general pentru măsurarea
hidroperoxizilor fiind recomandată de American
Oil Chemist’s Society ca metodă oficială.
• Principiul acestei metode este că tiosulfatul de
sodiu titrează iodul eliberat în urma oxidării
iodurii de potasiu de către peroxizii prezenți în
ulei.
• Această metodă standardizată de
analiză necesită o cantitate relativ
mare de lipide, iar oxigenul din aer,
prezența luminii și absorbția iodului
de către acizii polinesaturați pot
influenta negativ dozarea.
• Avantajul metodei constă în faptul că
acesta este simplă și facilă, iar
conținutul de peroxid poate fi
calculat direct și rapid prin titrarea
iodului eliberat. Ecuațiile reacțiilor
pot fi prezentată după cum urmează:
Indicele de peroxid