Tehnici speciale de microscopie

Aceast lucrare urmrete studierea metodelor de observare a preparatelor ce nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului n transmisie sau n reflexie. I. Noiuni teoretice Metodele clasice de microscopie nu pot pune n eviden detaliile preparatelor atunci cnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m) sau nu prezint un contrast bun (detaliile au aceeai culoare ca i restul preparatului). n aceast situaie, la dispoziia observatorului stau metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale de microscopie. Tehnicile de colorare (ce se vor studia n cadrul disciplinei de Histologie) prezint n anumite situaii cteva dezavantaje: necesit o cantitate mare de timp, manopera i substane chimice; nu pot fi observate celule sau organisme vii; imaginea obinut difer mai mult sau mai puin de structura real. Pentru nlturarea acestor deficiene pot fi utilizate tehnicile speciale de microscopie. Dintre acestea amintim: - Microscopia de imersie - Microscopia n ultraviolet (UV) - Microscopia de cmp ntunecat - Microscopia de polarizare - Microscopia de fluorescen - Microscopia de contrast de faz - Microscopia electronic 1. Microscopia de imersie Cele dou tehnici de microscopie prezentate (transmisie i reflexie) nu permit o mrire mai mare de 1000 de ori deoarece apare fenomenul de difracie a luminii pe detaliile preparatului. Pentru a permite observarea unor detalii mai fine una din soluii este introducerea ntre obiect i obiectiv a unui lichid omogen, transparent i izotrop cu indice de refracie ct mai mare, numit lichid de imersie. De obicei, se utilizeaz ulei de

cedru (n=1.3-1.5) sau compui sintetici (n=1.3-1.6). n acest mod se poate crete mrirea pn la cca. 2000 de ori fr s apar fenomenul de difracie. Un alt avantaj al folosirii imersiei este mrirea luminozitatii imaginii:
E E0 (1 2h ) d h n2 1

unde: E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie E0 - iluminarea imaginii n absena lichidului h - distana obiectiv-obiect d - diametrul obiectivului n - indicele de refracie al lichidului de imersie E=(1.2-4)E0 n cazul utilizrii tehnicii de imersie este necesar ca preparatul s fie acoperit cu o lamel pentru ca lichidul de imersie s nu modifice structura acestuia. De asemenea, se utilizeaz obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripionate Apo caracterizate prin distan focal mic, avnd totodat posibilitatea de a culisa, n scopul evitrii contactului brutal dintre obiectiv i lamel. Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii. Performanele microscoapelor cu lumin vizibil merg pana la mrimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =0.25 m). 2. Microscopia de ultraviolet O alt modalitate de a crete puterea separatoare este micorarea lungimii de und a radiaiei folosite pn n domeniul ultraviolet UV (610 -10, 3.810-7)m. n acest mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0,15 m, atingndu-se o mrire de 6000-7000 de ori. n cazul folosirii radiaiei UV este necesar ca toate componentele optice ale microscopului s fie realizate din cuartz deoarece sticla comun este opac la acest tip de radiaii. Imaginea final va fi obinut pe un ecran de proiecie acoperit cu o substana fluorescent. n cazul folosirii radiaiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor i a

ecranelor de protecie deoarece retina este foarte sensibil n acest domeniu de lungimi de und. 3. Microscopia de cmp ntunecat Tehnica de cmp ntunecat este utilizat pentru observarea preparatelor transparente i se bazeaz pe mprtierea luminii pe detaliile preparatului. Orice neomogenitate din preparat va determina o modificare a direciei razelor de lumin. Din punct de vedere constructiv se utilizeaz un condensor special alctuit dintr-o oglind concav i una convex (figura 3.1) astfel nct doar razele de lumina mprtiate pe neomogenitile preparatului s ajung n obiectiv.

Figura 3.1. Microscopia de cmp ntunecat. Condensoarele de cmp ntunecat ofer nclinri diferite razelor de lumina trimise spre preparat. Cnd se dorete observarea detaliilor foarte fine, se folosesc condensoare ce produc nclinri mari fascicolului incident, fiind necesar n acelai timp mrirea intensitii luminoase, deoarece fluxul de lumin ce ptrunde n obiectiv este foarte mic. Ataate la microscop, condensoarele de cmp ntunecat trebuiesc centrate foarte bine pe axul optic al microscopului, n caz contrar obinndu-se imagini cu umbre. 4. Microscopia de polarizare Microscopia de polarizare se utilizeaz n evidenierea i observarea substanelor optic active ce se gsesc n preparat. Substanele optic active au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.

Figura 3.2. Microscopia de polarizare. Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar s se ataeze la microscop un polarizor i un analizor, ambele confecionate din Spat de Islanda, ce au proprietatea de a lsa s treac doar razele de lumin ce au un anumit unghi de polarizare. Aceasta tehnic se utilizeaz att n microscopia de transmisie ct i n microscopia de reflexie. n cazul montrii corecte a polarizorului i a analizorului doar razele de lumina ce strbat zonele din preparat ce conin substane optic active vor ajunge la observator. 5. Microscopia de fluorescen Fluorescena este proprietatea anumitor substane de a emite lumin (radiaie vizibil) atunci cnd sunt excitate cu radiaie UV. Deoarece multe substane de interes medical prezint fluorescen (acizi nucleici, proteine) aceast tehnic este foarte utilizat n practica de laborator i de cercetare medical. Fiecare substan ce prezint fluorescen este caracterizat de o lungime de und de excitaie (n UV) i de o lungime de und de emisie (n vizibil), astfel nct tehnica poate nu doar pune n evident dar i identifica substanele respective. n acest scop, se utilizeaz filtre optice i de UV pentru selectarea radiaiei de excitaie i de emisie a substanei ce urmeaz a fi observat. Filtrele se dispun ca n figura 3.3.

Figura 3.3. Microscopia de fluorescen. n cadrul acestei tehnici, pentru observarea substanelor ce nu prezint fluorescen n mod direct, se utilizeaz markeri de fluore-scen, substane ce au urmtoarele proprieti: - fluorescen intrinsec - aditivitate foarte mare - deterioreaz minim structura (substana) de care se fixeaz Cele mai utilizate sunt substanele din clasa flavinelor. 6. Microscopia de contrast de faz Este o tehnic ce se utilizeaz n special pentru observarea celulelor i organismelor vii atunci cnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite. Metoda pune n eviden diferena de drum optic pe care o face lumina trecnd prin diferite zone ale preparatului (reamintim c drumul optic este produsul dintre drumul geometric i indicele de refracie al mediului pe care l parcurge raza de lumin). Deci aceast tehnic pune n eviden att diferene de grosime ntre diferitele zone ale preparatului ct i diferene de indice de refracie ntre acestea. Sunt utilizate obiective speciale (inscripionate Cf) care au dispuse n planul focal o placa de faz, ce defazeaz lumina cu o semilungime de unda (n + se numete contrast de faz pozitiv sau n contrast de faz negativ), i un inel parial absorbant. De asemenea, condensorul prezint o fanta inelar ce este specific fiecrui obiectiv folosit. Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul cruia se pot observa simultan att inelul parial absorbant ct i fanta inelar n scopul suprapunerii acestor dou imagini. II. Parte experimental Materiale necesare: 1. Microscop de cercetare MC9 2. Microscop Biorom 3. Condensoare de cmp ntunecat 4. Polarizor, analizor 5. Obiective de imersie 6. Obiective de contrast de faz 7. Lame cu diferite preparate

Modul de lucru: A. Observarea nucleilor celulelor -se aeaz lama cu preparat pe masua microscopului i se fixeaz cu ajutorul clreilor; -se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) i se localizeaz zona cu preparat; -se coboar msua microscopului fr a deplasa preparatul; -se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00; -se aplic o pictur de lichid de imersie pe preparat (n dreptul obiectivului); -cu foarte mare atenie se coboar obiectivul pna ce se imer-seaz n lichid; -privind prin ocular se pune la punct imaginea. B. Determinarea depozitelor glucidice -se monteaz la microscopul MC9 polarizorul i analizorul; -se fixeaz preparatul pe msu; -se pune la punct imaginea; -se deplaseaz n plan orizontal preparatul pe msu pn cnd se gsete o zona liber;

-se rotete ncet polarizorul pn n momentul n care imaginea este maxim de ntunecat; -se aduce din nou preparatul n cmpul vizual; zonele luminoase reprezint zonele n care se gsesc substane optic active. C. Determinarea ncrcturii biologice a apei -se monteaz la microscopul Biorom condensorul i obiectivele de contrast de faz; -se nlocuiete un ocular cu ocularul de punere la punct; -din uruburile de punere la punct se centreaz sistemul astfel nct inelul parial absorbant din obiectiv s corespund cu fanta inelar a condensorului; -se monteaz din nou ocularul microscopului; -pe o lam curat se pune o pictur de ap sttut (24h); -se fixeaz lama la microscop i se caut observarea germenilor existeni n ap att prin tehnica de microscopie clasic ct i prin cea de contrast de faz.