ENZIME IMOBILIZATE

Biocatalizatori cu aplicatii in procese industriale

Justificarea utilizarii catalizatorilor enzimatici
Utilizarea sistemelor biologice drept catalizatori eficienti si specifici pentru
transformarea unor compusi organici n substante biologic active = una din cele mai
importante directii ale dezvoltarii nregistrate n ultimii ani n biotehnologie
O mare varietate de reactii organice poate fi catalizata de sisteme biologice (enzime,
organite celulare, celule)
Problema cheie rezida in alegerea catalizatorului adecvat pentru efectuarea reactiei
dorite.
Transformarea compusilor organici cu ajutorul unor biocatalizatori specifici poate
constitui o alternativa care, fata de sinteza chimica clasica si catalizatori traditionali, prezinta
ca avantaje esentiale:
1. simplificarea procedeelor ca urmare a specificitatii de actiune a biocatalizatorilor
2.cresterea remarcabila a vitezelor de reactie ca urmare a activitatii catalitice foarte
ridicate a enzimelor.
3. conditii blnde de reactie (temperatura, presiune ambianta, pH apropiat de cel
fiziologic) , fara a necesita prezenta unor substante cu toxicitate deosebita n mediul de
reactie
Acestea avantaje se traduc la nivel economic n mbunatatirea randamentelor de
transformare, precum si a calitatii produselor.
Totusi, aceste avantaje sunt mult diminuate de costurile suplimentare necesare
proceselor de izolare a enzimelor, ca si de stabilitatea relativ scazuta a preparatelor enzimatice
solubile.
Avantaje ale utilizarii enzimelor imobilizate
Obtinerea enzimelor imobilizate = una din realizarile remarcabile ale biotehnologiei
moderne, cu aplicatii multiple si deosebit de importante att pentru cercetarea fundamentala
ct si mai ales n domeniul industrial,
Prin imobilizare, enzimele dobndesc o serie de proprietati noi, avantajoase n
comparatie cu cele ale enzimelor native, neimobilizate:
enzimele devin mai stabile n solutii apoase si mai putin sensibile la temperaturi
crescute si la variatii de pH ale mediului de reactie.
ele dobndesc, de regula, o rezistenta sporita la actiunea inhibitoare a metalelor grele
si a inhibitorilor lor naturali si de sinteza.
principalul avantaj al enzimelor imobilizate consta n posibilitatea utilizrii lor
repetate.
Implicatii tehnologice ale utilizarii enzimelor imobilizate
In finalul reactiei catalitice, enzimele imobilizate pot fi usor si complet separate din
mediul de reactie prin simpla filtrare sau centrifugare si folosite din nou, dupa o prealabila
spalare.
n plus, prin utilizarea drept catalizator a enzimelor imobilizate se evita impurificarea
produsului de reactie cu proteina enzimatica inactivata, ceea ce permite n ultima instanta
izolarea produsului de reactie cu randamente superioare.

 Importanta practica a enzimelor imobilizate mai rezida si n faptul ca ele pot fi

adaugate si ndepartate n orice moment din amestecul de reactie, ceea ce permite dirijarea si
automatizarea completa a reactiei biocatalitice.
n ultima perioada s-au dezvoltat procese biocatalitice eficiente bazate pe utilizarea
celulelor microbiene imobilizate.
Acest tip de biocatalizator afecteaza nesemnificativ costurile procesului biocatalitic n
care este implicat, ntruct sunt eliminate cheltuielile legate de izolarea enzimei.
Asemenea procedee se aplica la ora actuala cu succes n industria alimentara,
farmaceutica si chimica.
Concluzii privind utilizarea catalizatorilor enzimatici
Folosirea enzimelor ca biocatalizatori in sinteza chimica, a constituit un succes al
ultimelor decenii.
Avantajele sintezei chimice n cataliz enzimatic sunt:
gradul ridicat de conversie al substratului,
randamentele mari
Aceste avantaje sunt estompate de dezavantajele provenite din costurile suplimentare
datorate izolarii enzimei, ca si din stabilitatea redusa a enzimei native purificat.
Perfecionarea procedeelor de izolare a enzimelor a permis reducerea parial a
costurilor implicate de aceast etap a obinerii catalizatorilor enzimatici.
In acelasi timp, dezvoltarea tehnicilor de imobilizare a enzimelor a creat premizele
obinerii unor biocatalizatori cu performane superioare, rezultate din stabilitatea lor crescuta
si din posibilitatea de a fi reutilizate.
METODE DE IMOBILIZARE A ENZIMELOR
In solutie, enzimele solubile se comporta ca orice substanta, adica se disperseaza in
solvent, avand libertate completa de miscare.
Imobilizarea enzimelor poate fi considerata ca o tehnica speciala avand ca scop
restrangerea libertatii de miscare a enzimelor.
Putem defini enzimele imobilizate ca fiind enzime localizate intr-o anumita regiune
din spatiu, bine delimitata, care isi mentin activitatea catalitica si care se pot folosi in mod
repetat sau continuu
Se cunosc trei metode generale de imobilizare a enzimelor
legarea de suport
reticularea
entraparea
Legare de suport
Adsorbtie fizica
Legare ionica
Legare covalenta

Reticulare

Entrapare
Tip retea
Tip microcapsula

Imobilizarea prin legare de suport si prin entrapare

a,b: legare de suport;
c,d entrapare.

Imobilizarea prin reticulare

Sisteme de operare a reactoarelor cu enzime

Sistem omogen: enzima solubila

Sistem eterogen (bifazic): enzima imobilizata

I. IMOBILIZAREA ENZIMELOR PE SUPORTURI INSOLUBILE

1. Adsorbtia si legarea ionica
Este cea mai simpla metoda de imobilizare.
Enzima se ataseaza de suport prin legaturi necovalente, fara nici o etapa de preactivare.
Legatura sau legaturile formate in cazul adsorbtiei, implic in mod obisnuit
interactiuni ionice, hidrofobe sau legaturi de hidrogen care se formeaz ntre suprafaa
proteinei enzimatice i suprafaa de contact a materialului adsorbant.
Suportul adsorbant sau schimbator de ioni trebuie s prezinte o serie de proprieti
adecvate pentru ncrcarea suprafeei de contact cu macromolecule proteice:
densitatea situsurilor de legare accesibile enzimei din punct de vedere steric;
distribuia sarcinilor electrostatice ;
polaritatea suprafeei (echilibrul hidrofob-hidrofil);
densitatea,
porozitatea,
distribuia porilor,
3

stabilitatea i distribuia macromoleculeor pe suport sunt importante i pentru c

influeneaz configuraia reactoarelor folosite pentru procesele enzimatice.

Suporturi utilizate pentru imobilizarea enzimelor prin adsorbtie sau legare ionica
Suportul ideal este:
- ieftin,
- inert din punct de vedere chimic,
- rezistent mecanic
Printre suporturile utilizate pentru adsorbia sau legarea ionic a enzimelor se numr:
alumina, carbunele activ, kaolinul, bentonita, sticla poroasa, rasini sintetice, adsorbante,
schimbatori de ioni naturali sau sintetici (anionii ca DEAE- Sephadex) sau cationii (ca
CM-Celuloza).
Particularitati ale proceselor catalitice cu enzime imobilizate
Utilizarea unui catalizator enzimatic n form imobilizat presupune realizarea
procesului catalitic ntr-un sistem bifazic heterogen i permite separarea biocatalizatorului din
mediul de reactie.
Astfel, produsul final al reaciei enzimatice nu va fi impurificat cu enzima, iar
biocatalizatorul recuperat poate fi refolosit.
Folosirea unui preparat enzimatic imobilizat face posibila asigurarea unui control mai
riguros al vitezei de reactie, n funcie de cantitatea de biocatalizator din mediul de reacie
n concluzie, prin imobilizare se imbunatateste stabilitatea enzimelor in comparatie cu
formele libere, marindu-se astfel aplicabilitatea lor ca biocatalizatori ai unor procese cu
aplicaii practice.
Tehnica de imobilizare prin adsorbtie sau legare ionica
Procedeul implica un control strict al pH-ului si tariei ionice, acestia fiind parametrii
care pot modifica incarcarea suportului cu enzim si astfel pot afecta nivelul adsorbtiei.
O simpla modificare de pH poate anula interactiunile ionice ducand la eliberarea
enzimei de pe suport.
Prin urmare, se alege un pH de lucru si o tarie ionica adecvate particularitatilor fizicochimice si biochimice ale enzimei si ale suportului
Fazele de realizare a imobilizarii sunt:
1. amestecare soluie de enzim in tampon de pH si molaritate adecvbate cu
materialul adsorbant,
2. incubare
3. ndeprtarea prin splare, a enzimei nelegate sau slab legate.
Principalele avantaje ale acestei metode de imobilizare sunt urmtoarele :
1. este un procedeu simplu din punct de vedere tehnologic, accesibil din punct de
vedere al costurilor
2. permite regenerarea activitatii catalitice dayorita eventualei inactivari a enzimei
pe parcurs, prin adaugarea de enzima libera.
Principalul dezavantaj al acestei metode se datoreaz faptului c, legaturile create intre
enzima si suport fiind slabe, exista riscul desprinderii permanente a unei cantitati de enzima
din preparatul imobilizat.
2. Legarea covalenta

 Aceasta metoda de imobilizare implica formarea unei legaturi covalente ntre enzima
si matricea suportului.
In mod normal, legatura este formata intre o grupare functionala aflata pe suprafata
matricei si o grup functionala terminal sau apartinand catenei laterale a unui aminoacid din
lanul polipeptidic de la suprafata macromoleculei de enzim.
Legtura covalent fiind puternic, este puin probabil desprinderea enzimei de
suport.
n realizarea legaturii covalente enzim-suport sunt implicate grupele amino (-NH2)
ale lizinei sau argininei, grupele carboxil (-COOH ) ale acidului aspartic sau glutamic, grupele
hidroxil (-OH) ale serinei sau treoninei, grupa fenol a tirozinei, grupa imidazol a histidinei si
grupa tiol (-SH) a cisteinei.
Utilitatea acestor grupe active ale enzimei pentru formarea legturilor covalente
depinde de accesibilitatea i reactivitatea lor, care influeneaz stabilitatea legturii covalente
odat format (tabelul 1).
Reactivitatea proteinei coninnd catene laterale nucleofile este determinat de gradul
lor de protonare: -S->-SH->-O->-NH2>-COO->-OH>>-NH3+ i poate fi estimat prin
cunoaterea pKa, a grupelor ionizabile i a pH-ului soluiei.
Resturile de lizin sunt cele mai utile pentru legarea covalent a enzimei de suporturi
insolubile, datorit suprafeei mari i a reactivitii lor crescute, n special n soluii slab
bazice. De asemenea, se pare c acestea sunt foarte rar implicate n situsurile active ale
enzimei.
Etapele procedeului de imobilizare prin legare covalenta de support

Pentru a putea reaciona cu macromoleculele enzimatice, suporturile trebuie activate,

n sensul grefrii unor grupe reactive care pot fi implicate n reacii cu grupele
funcionale de pe suprafaa proteinei enzimatice.
Prin urmare, imobilizarea enzimelor prin legare covalent se realizeaz practic printr-o
succesiune de dou etape:
in prima etapa, grupe functionale ale suportului sunt activate de catre un reactiv
specific;
n a doua etap are loc cuplarea proprizis.
Medoda legarii covalente are avantajul ca enzima imobilizat este stabil n timp, att
pe durata stocrii, ct i pe parcursul utilizrilor repetate sau n mod continuu. In
schimb conditiile de reactie sunt complicate si nu intotdeauna blande iar legatura
covalenta poate afecta conformatia structurala si centrul activ al enzimei, ducand la
pierderi de activitate si/sau schimbari ale specifitatii de substrat a enzimei.
Particularitati ale suporturilor utilizate pentru legarea covalenta a enzimelor
n general suporturile folosite pentru cuplarea covalent a enzimelor sunt activate sub
form de:
- derivai de diazoniu,
- azide,
- halogenuri,
- izocianai sau
- imidocarbamai.
n principiu nu exist un support ideal pentru imobilizarea oricrei enzime.
Alegerea suportului este influenat de numeroi factori:
Pretul si accesibilitatea matricii pot constitui factori limitativi, in special pentru
aplicaile industriale care necesit cantitati mari de material.
5

 Capacitatea de legare a suportului se exprim prin cantitatea de enzima legata pe

unitatea de greutate a materialului, iar legarea covalenta se asociaza in mod normal cu
o capacitate scazuta de legare;
Caracterul hidrofil confer materialului suport uurina de a incorpora apa si este un
factor important, deoarece enzima are nevoie de un invelis apos pentru a-si manifesta
maximum de activitate si/sau stabilitate n condiiile n care ea este fixat pe suport.
Complexitatea procedeului de imobilizare poate fi semnificativa, avand in vedere
faptul ca unele metode implica activri preliminare cu reactivi si/sau conditii care pot
fi scumpe sau periculoase.
Stabilitatea suportului poate fi adesea un factor cheie:
- n unele cazuri, stabilitatea chimica este esentiala pentru rezistenta suportului la
actiunea distructiva a reactiilor sau la degradarea provocata de microorganisme,
- alteori este necesara o anumit rigiditate structurala a suportului care s-i asigure
durabilitatea i s nu permit dezintegrarea mecanic a acestuia in cursul operatiunilor
tehnologice.
Tipuri de suporturi utilizate pentru legarea covalenta a enzimelor

Organice sintetice
Polistiren
Acrilati
Nylon
Poliacrilamida
Organice naturale
Celuloza + derivati
Dextran + derivati
Agaroza + derivati
Amidon + derivati
Alginat
Suporturi polizaharidice

Structurile polimerice de tipul polizaharidelor, care sunt foarte hidrofile, sunt suporturi
frecvent utilizate pentru imobilizarea enzimelor.
Celuloza, dextranul (cu denumirea comerciala de Sephadex ), amidonul si agaroza (cu
denumirea comerciala de Sepharose ) sunt des folosite.
Resturile de molecule de glucide din acesti polimeri contin grupe hidroxil, care sunt
ideale pentru activare n vederea cuplrii cu proteinele enzimatice.
Grupa hidroxil formeaza de asemenea legaturi de hidrogen cu moleculele de apa,
creand astfel un invelis apos in jurul suportului.
In solutie, lanturile lungi de polizaharide formeaza o structura tridimensionala tip
retea, care poate retine cantitati importante de apa.
Suporturile polizaharidice, sunt sensibile la degradarea microbiana sau fungica, iar
solventii organici pot provoca micorarea gelurilor.
Aceste suporturi se folosesc de obicei in forma de granule.
Imobilizarea prin legare covalenta de Sepharoza
Cea mai utilizat metod de imobilizare a enzimelor prin legare covalent implic
folosirea sefarozei, activat cu bromcian
6

 Sefaroza este un polimer accesibil din punct de vedere comercial, puternic hidrofil i
n general rezistent la atacul microorganismelor.
Din punct de vedere chimic este un gel de agaroz (poli-{-1,3-D-galactoz--1,4(3,6-anhidro)-L-galactoz}).
Gruprile hidroxil ale polizaharidului se combin cu bromcianul pentru a forma un
imidocarbonat ciclic activat.
Imidocarbonatul ciclic activat reacioneaz n condiii bazice (pH 9-11,5) cu grupele
amino primare ale enzimei (n principal din resturile de lizin;
La activarea sefarozei cu bromcian trebuie evitate condiiile de formare a carbamatului
inert.

O
CNBr +
bromcian

OH

OH

OH

sefaroza

NH2

OH

ester cianat
foarte reactiv

carbamat inert

NH
O

O
H
N

Enz H2N

Enz.

OH

derivat de izouree

NH

H2N

Enz.

H
N

Enz

OH

imido-carbamat
ciclic activat

carbamat N-substituit

Schema imobilizarii prin legare covalenta de Sepharoza

Alte tipuri de activari ale suporturilor polizaharidice
Toxicitatea mare a bromcianului a condus la comercializarea sefarozei activate i la
cercetarea unor metode alternative pentru obinerea unor intermediari similari
Un astfel de exemplu consta in folosirea cloroformiailor pentru obinerea unor
intermediari similari celor obinui cu bromcian, dar lipsii de toxicitate
O

ClCO2C2H5 +
cloroformiat
de etil

OH

OH

celuloza

H2N

Enz.

H
N

Enz

OH

intermediar
carbamat ciclic

Activarea cu carbodiimide a suporturilor carboxilice

Carbodiimidele sunt reactivi bifuncionali foarte utili, ce permit legarea aminelor de

acizi carboxilici. Controlul atent al condiiilor de reacie i alegerea carbodiimidei
confer un grad nalt de selectivitate acestei reacii.
7

Condiiile de reacie trebuie alese astfel nct s se evite formarea compuilor nedorii
(ureea).
R1

O
N C N R2 +
carbodiimida

R1

OH

matrice

NH

H2N Enz.

H
N

N
R2
O-acil izouree

R1 O

Enz

H
N

R2

compus inert

Imobilizarea prin legare covalenta de suporturi anorganice activate

Folosirea trialcoxisilanilor permite chiar i materialelor inerte, ca sticla, s lege
covalent enzime.
O

Si

OH

O
Si

C2H5

Si

C2H5

O
(CH2)3

NH2

Si

O
C2H5
3-aminopropiltrioxisilan

OH

Si

Si

(CH2)3

NH2

(CH2)3

NH2

O
O

sticla

Si

CCl2

tiofosgen

O
O
O
O

Si

O
O

O
O

Si

Si

(CH2)3

H
N

(CH2)3

H
N

O
O

Si

H2N

S
C

H
N

Enz

H
N

Enz

Si

O
O

Enz.

Si

Si

(CH2)3

NCS

(CH2)3

NCS

O
O

Si

S
C

Imobilizarea enzimelor pe sticla activata

Protejarea enzimei in timpul imobilizarii prin legare covalenta de suport
Obiectivul cel mai important al acestor tehnici de imobilizare este ca enzimele
imobilizate s-i menin o ct mai mare parte din activitate catalitic i dup terminarea
reaciei de cuplare cu suportul.
Acest obiectiv poate fi realizat n cazul n care cantitatea de enzim legat n
conformaii inactive este ct mai mic.
8

 Aceast condiie se poate realiza prin imobilizarea enzimelor n condiii de saturare cu

substrat, produs sau inhibitor competitiv, n care caz situsul activ nu este implicat n legarea
covalent de suport.
Activitatea enzimelor imobilizate poate fi apoi uor restabilit prin splare, pentru
ndeprtarea acestor molecule.
Obinerea formelor inactive poate fi prevenit i prin folosirea unor cantiti mari de
molecule legate reversibil la situsul activ sau n imediata vecintate a acestuia.
Protejarea situsului activ se poate realiza i prin legarea unor molecule care rmn
ataate de acesta n timpul procesului de imobilizare sau prin folosirea unei metode de cuplare
uor reversibil, prin care este favorizat legarea celor mai stabile forme din punct de vedere
energetic ale enzimei.
Situaiile (c) i (d) pot fi mpiedicate folosind grupri ce distaneaz enzima de suport
(spacer), protejnd-o astfel de influenele sterice ale suprafeei suportului.

Efectul legrii covalente asupra exprimrii activitii catalitice a enzimelor imobilizate

a) Enzima imobilizat are situsul activ
c) Enzima este legat ntr-o form inactiv
nemodificat pregtit pentru reacie.
datorit inaccesibilitii situsului activ.
b) Cuplarea moleculei de substrat la situsul
d) Distorsionarea situsului activ conduce la
catalitic al enzimei.
obinerea unui preparat imobilizat inactiv.
II. IMOBILIZAREA PRIN RETICULARE
Metoda reticularii se bazeaza pe formarea de legaturi chimice, dar fara a se folosi
suporturi insolubile in apa.
Imobilizarea enzimelor se realizeaza prin formarea de legaturi incrucisate
intermoleculare intre moleculele de enzima prin intermediul unor reactivi bi sau
multifunctionali (ageni de reticulare).
Ca agenti de reticulare literatura citeaza:
glutaraldehida, prin intermediul careia se realizeaza compusi de tipul bazelor
Schiff;
derivatii de izocianat, prin intermediul crora se realizeaza legaturi peptidice;
bisdiazobenzidina, prin care se realizeaza cuplari diazo;
N, N polimetilen bisiodoacetamida, care favorizeaza formarea de compusi
alchilati.
9

 Reticularea cu agenti bifunctionali se realizeaza prin implicarea urmatoarelor grupe

ale proteinei enzimatice:
- amino si amino terminala,
- amino (din lizina),
hidroxil (din tirozina).
Reactia de reticulare are loc in conditii relativ severe, asemanatoare cu cele necesare
formarii legaturi covalente, putand afecta conformatia centrului activ al enzimei si nivelului
activitatii enzimatice.
Cel mai utilizat agent de reticulare este glutaraldehida.

Imobilizarea enzimelor prin legare covalenta de glutaraldehida

Glutaraldehida este utilizat pentru legarea enzimelor prin reticulare sau pentru
legarea acestora de suporturi.
De obicei glutaraldehida se folosete sub forma unui amestec echilibrat de monomeri
i oligomeri.
Disocierea produsului de condensare dintre enzim i glutaraldehid poate fi
mpiedicat prin reducere cu borohidrur de sodiu.
Aceast metod este utilizat n special pentru obinerea membranelor cu enzime
imobilizate folosite la fabricarea biosenzorilor i implic legarea unor molecule de enzime
reticulate n prealabil cu moleculele unor proteine inactive diluante, de anumite tipuri de
memebrane celulozice sau din nylon.
HC

CH2

HC
H
C

CH2

O
H2
C

H
C

O
H2
C

O
H2
C

H2
C

H
N
Enz
HC
H2 H2 H
C
C
C C

O
H2
C

H2
C

HC
H2
C

H
C

oligoglutaraldehida

CH2
HC

HC
H2
C

H2N

glutaraldehida
HC
H
C
HN

O
H2
C

HC
H2
C

H
C

Enz.

Enz

Chimismul procesului de imobilizare a enzimelor prin reticulare cu glutaraldehida

III. IMOBILIZAREA PRIN ENTRAPARE
Imobilizarea prin entrapare de tip reea sau microcapsule difera de celelalte metode de
imobilizare prin faptul ca moleculele de enzima sunt libere in solutie, dar miscarea acestora
este limitat ntr-un spaiu bine definit, reprezentat de ochiurile unei reele sau de pictura de
ap din interiorul unei microcapsule care este separat de mediul exterior printr-o membran
semipermeabil.
1. Entraparea tip reea
10

 Entraparea enzimelor n geluri formate din polimeri reticulai transversal se practic n

cadrul proceselor ce implic folosirea de substraturi sau produi cu mase moleculare mici.
Se poate imobiliza prin aceast metod 1 g enzim/g gel.
Datorit dificultii cu care moleculele mari pot ajunge la situsul catalitic al enzimei
imobilizate, se recomand ca entraparea s se aplice numai n cazul enzimelor ce au
substraturi cu mase moleculare mici.
Acest tip de entrapare este utilizat i n cazul imobilizrii celulelor microbiene,
animale i vegetale.[
Entraparea tip reea se poate realiza prin amestecarea enzimei cu un polimer pentru a
forma o structura tip retea care prinde enzima in interior.
O alta modalitate este aceea de a amesteca enzima cu monomeri care polimerizeaza in
situ pentru a forma un polimer reticulat care cuprinde enzima in spatiile interstitiale ale
retelei.
Intre polimerii naturali utilizati, cele mai bune rezultate s-au obtinut in ultimii ani cu
K-carrageenan [i cu alginatul de calciu, polizaharide extrase din algele rosii.
Polimerii sintetici utilizati in mod curent pentru entraparea enzimelor sunt
poliacrilamida, polivinilalcoolul, acidul poliacrilic, polietilenglicol dimetacrilatul. Intre
acestia insa, gelul de poliacrilamida are cele mai multe aplicatii.
Entraparea in gel de poliacrilamida
Entraparea n gel de poliacrilamid se realizeaza prin copolimerizarea monomerului
aflat n soluie apoas cu N,Nmetilenbisacrilamida ca agent de reticulare, n prezenta
enzimei.
Reactia de polimerizare este initiata de persulfatul de potasiu (K2S2O8) si accelerata
de N, N, N tetrametilendiamina (TEMED) sau de - dimetilaminopropionitril (DMAPN).
Dimensiunile porilor gelului si proprietatile sale mecanice sunt determinate de
cantitatile relative ale monomerului si agentului de reticulare. Astfel este posibila influenarea
structurii retelei prin modificarea acestor concentratii

Schema entraparii in gel de poliacrilamida

2. Microncapsularea
nglobarea enzimelor n microcapsule delimitate de membrane se poate realiza printr-o
serie de tehnici care depind de natura polimerului care formeaz membrana.
11

 Membrana polimeric trebuie s fie semipermeabil, n sensul c trebuie s menin

enzima nchis n interior, dar s permit n acelai timp trecerea substratului i a produsului
de reacie.
Exemple de imobilizari prin microincapsulare
Un exemplu practic de imobilizare prin microncapsulare este urmtorul:
Enzima se dizolv ntr-o soluie apoas de 1,6-diaminohexan.
Aceast soluie este apoi dispersat ntr-o soluie cloroformic de acid hexandioic,
nemiscibil cu apa.
Pe parcursul emusionrii, la interfaa celor dou faze, se produce copolimerizarea 1,6diaminohexanului cu acidul hexandioic, cu formarea unui strat polimeric subire (nylon-6,6)
care nglobeaz picturile apoase ce conin enzima.
Lipozomii sunt exemple de microcapsule constnd n sfere concentrice alcatuite din
membrane lipidice ce pot nconjura enzima.
Acetia se pot obine prin adugarea de fosfolipide n soluia apoas de enzim.
Microcapsulele i lipozomii sunt separate prin filtrare din mediul n care au fost
obinute, apoi sunt splate pentru ndeprtarea enzimelor nenglobate i sunt pstrate n mediu
apos, pn la utilizare
n general, preparatele enzimatice obtinute prin microncapsulare au activitate mare
deoarece enzima nu este denaturat, nefiind legat de support, iar membrana microcapsulei
este semipermeabil att pentru substrat, ct i pentru produsul de reacie, dac acestea au
molecule de dimensiuni mici.
Caracterizarea comparativ a diferitelor metode de imobilizare a enzimelor
Caracteristici
Adsorbtie si Legare covalenta Entrapare tip retea Microincapsulare
legare ionica
Realizare practica
simpla
dificila
dificila
simpla
Pret
scazut
mare
moderat
mare
Grad de fixare a enz.
variabil
ridicat
slab
ridicat
Risc de desprindere
da
nu
da
nu
Aplicabilitate
larga
selectiva
larga
f. larga
Dificult. la utiliz.
mari
mici
mari
mari
Efecte asupra matricii
da
da
da
nu
Bariere de difuzie
mici
mici
mari
mari
Protectie microbiana
nu
nu
da
da

12

13