Licenta Finala Cais Horticultura

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN
VETERINAR
FACULTATEA DE HORTICULTUR
LUCRARE DE DIPLOM
ndrumtor tiinific:
Prof. Dr. ION Ligia
Absolvent:
STAVRE Ioana
BUCURETI
2015
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN

VETERINAR
FACULTATEA DE HORTICULTUR
Tema:
Cercetri privind studii de fenotipaj pentru screeningul unor
descendente hibride n urma infeciilor cu Plum-Pox Virus (PPV)
la cais
CUPRINS
CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL TEMEI ABORDATE....3

1.1
Caisul caracterizare general...................................................................................................3
1.1.1
Importana economic i valoarea alimentar a caiselor .......................................................4
1.1.2.
Originea si aria de raspandire a caisului................................................................................6
1.1.3.
Particulariti de cretere i fructificare................................................................................8
1.2.
Descrierea principalelor boli virotice ale caisului.....................................................................10
1.2.1.
Apoplexia smburoas........................................................................................................10
1.2.2.
Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila)...........................................................................11
1.3
Originea i rspndirea virusului...............................................................................................12
1.4.
Principalele trsturi ale plum pox-ului......................................................................................14
1.4.1
Gazde naturale ale virusului................................................................................................14
1.4.2
Patologia virusului Plum pox..............................................................................................15
1.4.3
Simptomele provocate de virusul Plum pox........................................................................16
1.5.
Identificarea i caracterizarea principalelor virusuri la cais.....................................................17
1.5.1.
Metode de identificare a virusurilor....................................................................................17
1.5.1.1. Testul de floculare...............................................................................................................18

1.5.1.2. Testul ELISA.......................................................................................................................19
1.5.2.
PCR (Polymerase chain reaction).......................................................................................20
1.5.3.
Alte virusuri ale caisului......................................................................................................21
CAPITOLUL II CONTRIBUII PROPRII..........................................................................................24

2.1
Justificarea temei.........................................................................................................................24
2.2.
Obiectivele cercetrilor...............................................................................................................25
2.3
Material i metod.......................................................................................................................25
2.3.1.
Materialul biologic folosit pentru specia cais (Armeniaca vulgaris)...................................25

1
2.3.2.
Material viral......................................................................................................................28
2.3.3.
Metodele de cercetare abordate pentru specia cais..............................................................28
2.3.3.1
Testul imunoenzimatic ELISA...........................................................................................30
2.3.3.2
Determinri moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetic)............................33
2.4
Rezultate obinute.......................................................................................................................36
2.5
Concluzii i recomandri............................................................................................................48
BIBLIOGRAFIE......................................................................................................................................50
CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL

TEMEI ABORDATE
1.1
Caisul caracterizare general

Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole
smburoase. Acest fapt se datoreaz scderii calitii fructelor i pierderilor cauzate de cderile
premature ale acestora (Nemeth, 1994). Virusul este prezent n livezile din Europa, fiind semnalat
cu 20-30 ani n urm. Pierderi importante s-au semnalat n special n estul i sud-estul Europei.
Boala s-a semnalat i n Turcia, Cipru i Siria. n Polonia i Grecia pierderile nregistrate de acest
virus sunt de peste 7o%, n Jugoslavia de 15 milioane de pomi, n Bulgaria peste 80%. n rile
unde viroza este rspndit, exportul de ramuri altoi i portaltoi este interzis.
n Romnia, acest virus este rspndit n toate arealele de cultur ale fructelor samburoase
i provoac pierderi masive de producie. Motivaia alegerii acestei teme s-a datorat faptului c n
ara noastr la momentul nceperii cerecetrilor nu era cunoscut distribuia tulpinilor virusului
Plum pox n Romnia, ara noastr fiind printre puinele ri europene care nu avea o strategie de
eradicare sau limitare a impactului acestui virus. O astfel de strategie nu poate fi realizat fr a
cunoate gradul de rspndire a PPV-ului i distribuia tulpinilor acestuia.1
Plum pox, cunoscuta si sub denumirea de Sharka, este cea mai devastatoare boala virala a
fructelor samburoase din genul Prunus. Boala este cauzata de virusul Plum Pox ( PPV ), cat si de
tulpini derivate ale acestuia, care pot infecta o mare varietate de specii de fructe samburoase, cum
ar fi : caisul, piersicul, prunul, nectarinul, cat si ciresul. Speciile ornamentale si salbatice ale
genului Prunus pot fi, deasemenea, infectate de tulpinile acestui virus.
Pn n prezent au fost identificate i caracterizate serologic i molecular apte tulpini de PPV:
Sua D (dideron) izolat pentru prima dat la cais n sud-estul Franei; Sua M (marcus)
identificat la piersic n nordul Greciei (Kerlan i Dunez, 1979; Myrta i colab., 1998); Sua Ea
(el amar) descris n Egipt la cais (Wetzel i colab., 1991a); Sua SoC (sour cherry) detectat n
Republica Moldova (Kalashyan i colab., 1993); Sua SwC (sweet cherry) identificat n Italia
(Crescenzi i colab., 1996); Sua PPV-Rec rezultat din recombinarea celor dou tulpini majore
1 Myrta A, Di Terlizzi B, Boscia D, Caglayan K, Gavriel I, Ghanem G, Varveri C, Savino V 1998,
Detection and serotyping of Mediterranean plum pox virus isolates by means of strainspecific monoclonal antibodies. ActaVirologica. English Ed. 42, 251254.
(M i D), fiind descoperit n Albania, Bulgaria, Cehia, Germania i Slovacia (Glasa i colab.,
2004).Sua PPV-W(Winona) a fost identificat n Canada (James i Varga, 2004a). Recombinarea
joac un rol important n evoluia ribovirusurilor, determinnd apariia unor sue noi cu efecte
nepredictibile asupra patogenitii (Worobey i Holmes,1999). Recombinarea natural dintre
tulpinile PPV-D i PPV-M a constituit apariia unei noi tulpini virale, numit PPV-Rec, ce a fost
raportat prima dat de Glasa i colab. (2002 ).
Primele cercetri din Romnia privind identificarea i diferenierea tulpinilor virusului
Plum pox, prin tehnici moleculare i serologice au fost realizate la Staiunea de Cercetare
Dezvoltare Pomicol Bistria (SCDP Bistria) (Zagrai i colab., 2005a).
Caracterizrile serologice i moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de
ctre cercettorii din Europa Occidental au permis stabilirea apartenenei acestora la diferite
tulpini virale, dar i la identificatea unor forme recombinate.
Sursa:www.pomifructiferi.com
Fig.11. , fig. 1.2 Caise atacate de Plum Pox
1.1.1
Importana economic i valoarea alimentar a caiselor

Insusirile calitative si tehnologice ale fructelor situeaza caisul printre speciile pomicole
foarte mult apreciate de catre consumatori.
Fig.1.3. , fig. 1.4 Caise

Caisele sunt foarte cutate de consumatori, att ca fructe de desert ct i prelucrate n
diverse moduri. Cererea mare de fructe este determinat de nsuirile lor calitative i tehnologice,
compoziia biochimic complex i gustul foarte plcut, aroma specific, etc.2
Este recomandat consumul de fruct proaspat datorita continutului ridicat in zaharuri,
saruri minerale (Mg, P, Fe, Ca, K, S, Na, Mn, Fl, Co, Br), vitamine si acizi, compozitie care le
confera o mare valoare alimentara.
Compozitia chimica a fructelor difera in functie de soi, iar limitele de variatie determinate
sunt prezentate in Tabelul 1.a.
Dup cum reiese din datele de mai jos, prin compoziia biochimic caisele asigur organismului
uman toate componentele de care are nevoie pentru efectul lor favorabil n digestie, datorat
reaciei alcaline, n producerea hemoglobinei, n anemie, etc. Valoarea alimentar ridicat a
caiselor i a produselor finite pe baz de caise, au determinat specialiti din domeniul cercetrii
tiinifice s diversifice mult sortimentul, prin cearea sau introducerea n cultur a unor soiuri
care s se comporte bine n condiiile climatice din Romnia.
Tabel 1.a.
Limitele de variatie ale unor componente chimice din fructele de cais
Elementul determinat
Limitele de variatie
78,3 89,4 g %
10,60-21,71 g %
6,00-15,68 g %
0,34-2,61 g %
0,55-1,10 g %
1,09-1,64 g %
0,017-0,303 g %
0,60-0,86 g %
75,4-112,0 mg %
21,3-32,0 mg %
6,6-16,4 mg %
0,41-3,20 mg %
0,8-27,0 mg %
35,0-38,0 mg %
0,72-1,80 mg %
Apa
Substanta uscata
Zahar total
Aciditate totala
Pectine
Proteina bruta
Substante tanoide
Substante minerale din care:
Potasiu
Fosfor
Calciu
Vitamina A
Vitamina C
Vitamina P
Vitamina E
2 Mircetich S., 1982, Phytophtora root and crown of apricot trees. Acta Horticulturae
5
Finetea pulpei, aroma specifica, raportul armonios intre continutul in zahar si aciditate
precum si continutul bogat in substante pectice sunt cateva insusiri care fac din caise, fructe
foarte apreciate pentru industrializare.
Caisele sunt prelucrate sub forma de compot, gem, dulceata, peltea, marmelada, sucuri
sau nectar. Pot fi prelucrate de asemenea sub forma de bauturi nealcoolizate, ca suc sau nectar,
sau alcoolizate sub forma de distilat si lichior.
Sunt foarte apreciate atat pe piata interna,cat si la export sub forma de fructe uscate, iar
pentru multe popoare din zonele cu climat rece fructele de cais sunt considerate delicatese.
Samburii de caise sunt foarte bogati in substante nutritive, continand 29,5-57,7% grasimi;
28% substante pectice si 3,1% saruri minerale si se folosesc in cofetarie, alaturi de migdale sau in
industrie, ca materie prima pentru extragerea unor uleiuri industriale.
Din punct de vedere tehnologic, caisul este apreciat de cultivatori deoarece pomii intr
repede pe rod i au o mare capacitate de producie.
Capacitatea de adaptare redus la anumite condiii de mediu, diferite de cele n care s-au
format soiurile i mai ales slaba rezisten la ngheul de revenire, mpiedic extinderea n mas a
acestei specii. Prin alegerea judicioas a soiurilor i a zonei de cultur, caisul se poate cultiva cu
succes n partea de sud i vest a rii.
Caisul este o specie de mare valoare pentru zonele n care se poate cultiva, dar n ultimii
ani a nregistrat un regres datorat instabilitii recoltelor, afectate sever de condiiile anormale din
timpul iernii i mai ales de gerul de revenire.Endocarpul este utilizat in industria chimica pentru
prepararea tusului si a carbunelui active, iar lemnul de cais se foloseste pentru confectionarea
obiectelor de artizanat.Astfel, caisul este o specie cu largi utilizari in industrie si alimentatie.
1.1.2. Originea si aria de raspandire a caisului
Fig.1.5. , fig.1. 6 Cais Prunus armeniaca L.

6
Caisul comun (Prunus armeniaca L., Armeniaca vulgaris Lam, Prunus armeniaca var.
typica Max) apartine familiei Rosaceae Juss, subfamilia Prunoideae Focke, genul Armeniaca
Juss. Dovezi certe privind timpul si locul unde caisul a fost luat in cultura nu exista, dar dupa
Bretschneider, caisul era cultivat in China in jurul anului 3000 i.e.n., iar in anul 2000 i.e.n. pe
vremea imparatului Shi-iu, caisele erau fructele cele mai apreciate.
In urma sapaturilor arheologice din valea Fergana s-au gasit samburi cu o vechime de
7000 8000 ani, fapt ce l-a determinat pe N.V. Kovalev (1963) sa afirme ca aceasta specie este
luata in cultura din timpuri stravechi.
n prezent, caisul se cultiv mult n emisfera nordic, unde se i produce peste 90% din
producia mondial de caise. Cele mai mari producii de caise se obin n Europa, Asia, America
Central i de Nord i mai puin n Africa, Oceania i America de Sud (Tabelul 1.b).Dintre marile
ri productoare de caise se pot aminti: Ex. U.R.S.S., Italia, Spania, Grecia, Frana, Maroc, etc.
(Tabelul 1.c)
Buletin FAO, 1999
ara
1997
1998
1999
SUA
549000
393000
627000
Spania
388851
202600
272800
Italia
104678
87958
87958
Maroc
86800
65700
40000
Tunisia
51000
58700
60000
Iran
74396
111992
111992
Grecia
43224
34763
34763
Sursa: www.faostat.com
Dupa datele FAO, in 2000 productia de caise pe plan mondial a fost de 2511000 tone; in
Europa producandu-se 45% din aceasta, urmata de Asia cu 32%. Cea mai mare productie de caise
provine din Turcia cu 427000 tone, Italia cu 161000 tone, Spania cu 148000 tone, Franta cu
142000 tone, S.U.A cu 86000 tone, Grecia cu 62000 tone.
n Romnia, cultura caisului este zonat n principal n partea de sud a rii. Producia de
caise a nivelul anului 1997 a fost de circa 27,6 mii tone, din care peste 77% (21.384 t) a fost
7
obinut din sectorul particular. Judeele cu producie mai mare de caise sunt: Constana, Galai,
Clrai, Teleorman, Prahova, Giurgiu, Ialomia (Tabelul 1.d).
Pierderea mugurilor de rod sau de flori din cauza inghetului de revenire, face ca productia
de caise sa fie foarte instabila in timp. Dac n anul 1986, producia era de 60 mii tone i n 1987
de 54 mii tone, aceasta scade continuu pn n anul 1990 cnd se realizeaz numai 28 mii tone.
Alte motive care au afectat productia dupa anii 1990, au fost reprezentate de desfrisarea
unor suprafete de teren, cat si de agrotehnica deficitara in unele livezi. Astfel ca in present se
realizeaza o medie de circa 25-27 mii tone anual.
Tabel 1.d
Producia de caise i defalcarea pe principalele judee (t)
Judeul
Total d.c.:
Galai
Constana
Clrai
Ialomia
Olt
Teleorman
Dolj
Dmbovia
Brila
Tulcea
Ilfov
Producia total d.c.:

t
%
27623
100
2524
9,1
2304
8,3
2229
8,0
1834
6,6
1363
4,9
1377
4,9
1289
4,6
1291
4,6
1260
4,5
1260
4,5
1129
4,0
n sectorul particular
t
%
21384
100
2143
10
824
3,8
1964
9,1
1536
7,1
801
3,7
961
4,9
897
4,2
1149
5,4
909
4,2
539
2,5
719
3,3
Sursa: Anuarul Statistic al Romniei, 1998
1.1.3. Particulariti de cretere i fructificare

Creterea i ramificarea sistemului radicular este dependent de portaltoi. Altoit pe zarzr
(caisul slbatic), i dezvolt un sistem radicular foarte ramificat i bine ancorat; pe prun
rdcinile sunt mai puin ramificate dar mai profunde, iar pe corcodu, sistemul radicular este mai
superficial.
Partea aerian are un ritm intens de cretere n tineree, formnd ramuri de peste un metru,
cu 2-3 valuri pe perioada de vegetaie. Dup intrarea pe rod, ritmul de cretere se reduce,
ajungnd ca n peroiada de maxim producie, coroanele s rmn la aceleai dimensiuni. Din
perioada de maxim producie, ncepe procesul de uscare a ramurilor de rod i uneori a
8
semischeletului, din partea inferioar a coroanei, proces care, dac nu este bine controlat prin
tieri, duce la degarnisirea coroanei i scderea potenialului de producie.
Caracteristice caisului, sunt arcadele care apar pe ramurile de schelet i chiar semischelet
sub greutatea rodului, formnd creteri viguroase n punctele de maxim curbur. Aceste arcade
se ntinereasc prin transferarea creerii pe ramurile tinere din zona curburii, meninnd astfel
potenialul ridicat de producie a ramurii respective. Ramurile de rod caracteristice sunt cele
lungi, mijlocii ramificate i anticipate, n special la pomii tineri, ceva mai trziu, fructificarea se
mut pe ramurile mijlocii i pe buchete. n funcie de cantitatea de lumin de care dispun pomii,
ramurile anuale au o via mai mare sau mai mic. De obicei, buchetele triesc puin, 2-4 ani, n
lipsa luminii, uneori se usuc n anul formrii. Ramurile mijloci ramificate de vigoare slab, se
usuc destul de repede dac, nu se coreleaz distana dintre pomi cu vigoarea acestora sau dac
orientarea rndurilor nu se face pe direcia nord-sud. Printr-o agrotehnic corespunztoare, caisul
poate fructifica 20-25 de ani.
Caisul este o specie cu o mare fertilitate, n sensul c, difereniaz un numr foarte mare
de muguri de rod, att pe ramurile lungi, ct i pe cele scurte i anticipate. Formarea ealonat a
mugurilor pe aceste ramuri determin i o difereniere ealonat a lor, ceea ce are avantaje pentru
cultivator n primverile mai dificile, cnd apar ngheuri de revenire.
Un alt aspect cu implicaii negative asupra produciei l constituie lungimea perioadei
repausului profund. n urma cercetrilor, s-a constatat c, repausul profund la cais se ncheie la
sfritul lunii decembrie, i dup aceast dat, dac condiiile climatice permit, caisul este apt de
a porni n vegetaie. Aa se ntmpl n ferestrele de iarn, (perioad cu temperature peste pragul
biologic) cnd dup 7-8 zile calde caisul ncepe s-i hidrateze mugurii, rezistena la iernare
scade foarte mult i la revenirea frigului deger mugurii de rod. De obicei, umflarea mugurilor de
rod are loc dup acumularea a 40C peste pragul biologic (6C) i calendaristic, n anii normali
procesul se realizeaz n a doua i a treia decad a lunii martie.
nflorirea caisului are loc dup acumularea a circa 170-200C temperatur activ.
Majoritatea soiurilor existente n cultur, sunt autofertile, deci nu exist probleme legate de
asigurarea polenizrii. Plantatea mai multor soiuri n parcel are drept scop ealonarea recoltrii
fructelor, care sunt perisabile i se matureaz simultan. Dac se planteaz suprafee mari cu un
soi, este greu de recoltat n 5-7 zile, zeci sau sute de tone, iar fructele mature cad din pom i se
depreciaz.
9
Capacitatea de producie a caisului este mare, ncepe s fructifice din anul 3-4 de la
plantare i recolte economice se realizeaz din anul 5-6. Longevitatea plantaiilor este de 20-25
de ani din care 15-20 de producie. Altoit pe prun i amplasat n zone foarte favorabile, produce
economic chiar pn la 30 de ani.
1.2.
Descrierea principalelor boli virotice ale caisului
1.2.1. Apoplexia smburoas

Raspandire. Este o boala destul de frecventa la cais si alte samburoase, care produce
pagube de importanta economica foarte mare.
Simptome. Frunzele de cais de la baza lastarilor se rasucesc in forma de linura si se
clorozeaza. Celelalte Frunze aparute mai tarziu sunt deformate, cu marginile zdrentuite, groase
casante, asemanatoare cu frunzele de salcie. Pomi atacati au lastari scurti, subtiri, ramificati
anormal. Liberul se necrozeaza si ramurile ingheata in timpul iernii. Temperaturile ridicate din
timpul verii duc la mascarea simptomelor de atac. Uscarea brusca, apoplexia, survine in cateva
zile si are loc de regula in iulie-august pet imp secetos si foarte calduros. Pomii atacati drajoneaza
puternic. Cei mai atacati sunt pomii de 5-12 ani. Cauzele care duc la pieirea premature a caisului
sunt de natura parazitara si neparazitara.
Agentul fitopatogen si biologia acestuia. Principalii agesti fitopatogeni implicate in
pieirea prematura a caisului : mycoplasma, virusurile, B. spongiosus, Fusarium sp., Verticillium
dahliae. Agentii patogeni de predispozitie la apoplexie sunt : Minilinia cinerea, Coryneum
beijerinchii, Xanthomonas pruni. Factorii de natura neparazitara : temperaturile prea scazute din
timpul iernii si oscilatiile de temperature dintre zi si noapte care debiliteaza pomii, ingheturile
tarzii de primavera si timpurii de toamna, verile reci si ploioase, altoirea caisului pe portaltoi
nepotriviti (incompatibili), sunt altecauze care condul la aceasta pieire premature a caisului.
Combaterea. Se recomanda cultivarea caisului in zone cu climat mai dulce, ierni mai
blande, soare mult, fara oscilatii mari de temperatura. Terenurile sa fie scurse, drenate, usoare.
Caisul se va altoi pe portaltoi compatibili, rezistenti la intemperii. Se va evita supraproductia care
epuizeaza pomii si ii predispun atacului parazitilor. Se mai recomanda combaterea agentilor
10
fitopatogeni de predispozitie, infiintarea plantatilor cu pomii liberi de viroze si mycoplasma,

combaterea insectelor si a buruienilor gazda pentru unii agenti fitopatogeni. 3
Sursa:www.hortaltoi.ro
Fig.1.7Apoplexia smburoas
1.2.2. Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila)
Raspandire. Boala prezinta importanta economica deosebita prin faptul ca ataca puternic
fructele, reduce productia, ciuruieste frunzele si slabeste pomii.
Simptome. Ciuperca ataca frunzele si fructele si in mai mica masura lastarii si ramurile.
Pe Frunze apar numeroase pete circulare, brune cu margini violacee, cu diametrul de 3-5 mm,
care se ususca si cu timpul se desprind si cad, frunzele ramanand ciuruite. Pomii atacati se
desfrunzesc timpuriu si se debiliteaza. Fructele sunt atacate foarte de timpuriu, de cand au
marimea unei alune. Pe suprafata lor apar la inceput pete punctiforme, brun-roscate care se
maresc cu timpul, contopindu-se, pielita prezinta denivelari, apoi crapa. Fructele se deformeaza,
sunt fade la gust, au concentratia in zahar redusa si cad in masa de timpuriu.
Atacul pe ramurile tinere se manifesta prin aparitia unor pete ceroase, brun-roscate, putin
cufundate in tesut. In urma atacului seva este brusc oprita din circulatie, ceea ce duce la vestejirea
varfurilor la lastarii tineri, iar buchetele florale se usuca. Scoarta moarta este acoperita de gome
cleioase. Daca uscarea nu se produce in cursul perioadei de vegetatie, aceasta se va face cu
siguranta in timpul iernii datorita diminuarii rezistentei la ger.
Agentul patogen si biologia acestuia. Boala este produsa de ciuperca Ascospora
beijerinckii. Ciuperca ierneaza sub forma de miceliu si conidia in ramurile atacate. Miceliul este
3 Ioan Roca, Rada Istrate, 2001, Prognoz, avertizare i carantin fitoasanitar a
duntorilor din agricultur. Bucureti.
11
format din hife cilindrice, brune, articulare, cufundate in tesuturile atacate. Pe hifele de sub
epiderna scoartei se formeaza conidioforii cu conidiile care sunt puse in libertate prin ruperea
epidermei. Conidioforii sunt simpli, incolori sau bruni, filamentosi, septati. Conidiile sunt ovoidal
cilindrice, incolore, neseptate la inceput,apoi galben-brune.
Combatere. Pentru combaterea bolii sunt obligatorii operatiunile de igiena culturala, de
indepartare a organelor afectate, precum si tratamente fitosanitare cu produse de protectie a
plantelor omologate in urmatoarele faze de vegetatie : in perioada de repaus vegetative, la
umflarea mugurilor, etc.
Fig.1.8 Stigmina carpophila

1.3
Originea i rspndirea virusului

Virusul Plum Pox Potyvirus (PPV), face parte din familia Potyviridae, fiind considerat
pentru mult timp ca singurul virus din aceasta familie care infecteaza speciile pomicole
samburoase.
Denumit i Sharka, simptomele bolii au fost pentru prima dat evideniate n Bulgaria
ntre anii 1915-1918, la sfritul Primului Rzboi Mondial (Atanasoff,1932). ns au existat unele
rapoarte ce indicau prezena simptomelor bolii n Macedonia, n anul 1910. Acest virus distruge
fructele pomilor infectati in asa masura, incat acestea nu mai pot fi folosite nici in consumul
current, nici in industria prelucrarii fructelor.
Virusul Plum pox este cel mai distuctiv agent patogen viral al speciilor pomicole
smburoase, producnd grave pierderi de producie mai ales soiurilor sensibile, care pot fi
calamitate n proporie de 100%.
Este de retinut faptul ca primul articol despre descrierea acestui virus a aparut abia in anul
1932 numit de catre Atanosoff,,Sarka po slivite, adica ,,Pox of Plum.
Christoff a observant Sharka afectand caisele in Bulgaria in 1933, iar la inceputul anilor
1960 s-a raportat prezenta virusului in Ungaria. Se constata ca intre perioada anilor 1932-1960
12
boala s-a mutat la nord si la est de Bulgaria in : Iugoslavia, ungaria, Romania, Albania,
Cehoslovacia, Germania si Rusia. Boala a fost observata mai ales in prune si caise.
n ultimii 10 ani virusul s-a rspndit n rile mediteranene, cum ar fi: Spania (Llacer i
colab., 1985), Portugalia (Lourno i Monte Corvo, 1986) i Egipt (Wetzel i colab., 1991a). De
asemenea prezena virusului a fost raportat n India (Thakur i colab., 1994), Chile (Roy i
Smith, 1994), SUA (Levy i colab, 2000) i Canada (James i colab, 2003).
Dup cel de-al Doilea Rzboi Mondial Sharka a progresat spre vestul Europei, ajungnd
n Germania i Austria n anul 1950. La mijlocul anilor60 prezena virusului a fost semnalat n
Olanda, Elveia, Grecia, Anglia i Turcia; mijlocul anilor70 n Frana, Italia i Belgia; mijlocul
anilor80 n Spania i Portugalia; sfritul anilor80 n Egipt, Siria, Cipru. Levy i colab (2000)
ne prezint un tablou al rspndirii plum pox-ului ce arat astfel:
rspndire limitat: Albania, Austria, Cipru, Cehia, Frana, Luxembourg, Italia,
Moldova, Norvegia, Slovenia, Spania, Turcia, Ucraina, Anglia, SUA.
rspndire larg: Germania, Grecia, Bulgaria, Ungaria, Polonia, Romnia,
Slovacia, ex-Iugoslavia
prezent, probabil eradicat: Suedia, Olanda, Belgia
prezent, dar neextins: Lituania, India, Egipt, Bosnia-Heregovina
statutul recent necunoscut: Danemarca i Chile
Cele mai noi date globale n ceea ce privete diferenirea i distrubuia izolatelor din
Romnia (regiunile Transilvania, Moldova i Muntenia) arat o rspndire foarte larg a tulpinii
PPV-D, cu o rat medie de 74% pe cele trei regiuni. Cu o frecven medie sunt tulpinile PPVREC (12,6%), urmat de infeciile mixte (PPV-D+ rec), cu 13,3%.
Raspandirea acestui virus a dus la infintarea in 1970 a unei Grup Internationat de
Cercetare, care impreuna cu Organizatia Europeana si Mediteraneana Pentru Protectia Plantelor
(OEPP/EPPO) coordoneaza cercetarea si schimbul de informatii intre tari.
Plum pox este o problem serioas la nivel mondial, cu un impact sever asupra
productivitii i calitii fructelor din specia Prunus (PPV), un virus mpotriva cruia nu este
disponibil nici un fel de tratament curativ chimic sau biologic. Soluia actual pe termen scurt
este de eradicare a pomilor infectai i plantarea de material liber de viroze.
13
Intre anii 2007-2013 a debutat un proiect cofinantat de UE numit SharCo pentru

cercetarea epidemiologiei PPV. La acest proiect au luat parte 17 institute de cercetare si
universitati din 12 tari europene, dintre care si Statiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru
Pomicultura Bistrita (SCDP Bistrita) din tara noastra.
SCDP Bistrita este una dintre cele mai importante staiuni de cercetare implicate n
investigarea virusului Plum pox n Romnia. Activitatea sa se concretizeaz pe impactul PPV
asupra productivitii i calitii fructelor, caracterizarea tulpinilor i epidemiologie. Misiunea
global a parteneriatului ntre SCDP Bistria i SharCo este de a obine informaii suplimentare
despre epidemiologia PPV n Romnia i dezvoltarea unor noi modaliti de limitare a rspndirii
PPV.
1.4. Principalele trsturi ale plum pox-ului
1.4.1
Gazde naturale ale virusului

Speciile afectate de acest virus sunt cele din genul Prunus, cum ar fi: caisul
(P.armeniaca), piersicul (P.persica), prunul (P. Domestica i P. Salicina). Migdalul i ciresul pot
fi infectate cu acest virus, dar simptomele nu sunt foarte evidente (Festic, 1978; Kalashyan i
colab, 1994).
Virusul a fost transmis artificial i la cirei i viini, dar infeciile au rmas locale,
neexistnd dovezi c s-ar fi rspndit (Dosba i colab, 1987). Infecii naturale la specia P.Cerasus
au fost raportate de Kalashyan i colab. (1994), dar infecia cu PPV a cireelor este considerat
extrem de neobinuit, fiind practic neintlnit n cea mai mare parte a Europei.
Specii slbatice i ornamentale aparinnd genului Prunus pot servi ca a doua gazd a
PPV i pot avea impact asupra epidemiologiei i controlului acestui virus (Polak, 1997). Astfel c
multe din speciile slbatice ale genului Prunus sunt susceptibile: P.bessey, P.cerasifera, P.insititia,
P.tomentosa, P.spinosa, P.mahaleb, P.pumila, P.davidana, P.nigra, P.maritime, P.americana .
Rezultatele obinute n Iugoslavia infirm faptul c speciile menionate mai sus ar fi gazde
naturale ale virusului, dar s-a descoperit alt virus, virusul necrotic ring spot (Rankovic i DulicMarkovic,1992). Practic toate speciile din genul Prunus cultivate n scop comercial n Europa
sunt afectate mai mult sau mai puin de acest virus. Multe specii ce nu aparin genului Prunus, ce
fac parte din noua familie de plante au fost infectate artificial cu una sau mai multe tulpini ale
virusului sau n unele cazuri s-au gsit plante infectate n mod natural. Multe dintre acestea sunt
14
plante ierboase anuale, cteva fiind perene sau lemnoase i pot servi ca i gazd: Campanula
rapunculoides, Chenopodium quinoa, C. Species, Lamium album, L. Amplexicaule, L.
Purpureum, Lupinus albus, Lycium barbarum, L.Halimifolium, Medicago lupulina, Trifolium
dulcamara, T. pratense, T. repens, Zinnia elegans.
1.4.2
Patologia virusului Plum pox
Vrsatul prunului este produs de Prunus virus 7 Christoff i aparine grupei potyvirus,
avnd ca i reprezentant virusul Y al cartofului. Criptograma virusului a fost stabilit de Kerlan i
Dunez (1976) i se prezint astfel: R/1; 3,5/5,2; E/E; S/Ap. Din descifrarea criptogramei rezult
c genomul viral este alctuit din acid ribonucleic cu o singur spiral de nucleotide.
Dimensiunea genomului este de 10 kb iar la captul 3` se afl o regiune poly(A). n captul 5` se
leag cu legtur covalent o protein specific.
Proteina rspunztoare pentru proprietile serologice este proteina CP (Coat protein), ce
este implicat i n rspndirea virusului prin afide. Greutatea molecular a acidului nucleic este
de 3,5 x 106 daltoni i constituie 5,2% din particula viral. Particulele virale se prezint sub
form alungit , cu lungime de 750nm i diametru 15nm. Temperatura de inactivare a virusului
este de 550 C, diluia limit este de 10-3, iar longevitatea n suc de 35 de ore la temperatura de
200 C i de 5-7 zile la temperatura de 40 C.
Perioada de incubaie n livad dureaz 9-10 luni la plantele lemnoase i 1-2 luni n ser la
puiei, iar la plantele ierboase 1-3 sptmni. Viteza de rspndire n esuturi depinde de vrsta
pomilor, sensibilitatea esuturilor i viteza de propagare n ntreg pomul.
15
Fig.1.9 Plum pox

Spre exemplu, la soiul Vnt de Italia n vrst de 4 ani prin inoculare cu muguri infectai,
virusul a cuprins ntreg pomul dup 4-5 ani, iar la soiul Bistria n 1-2 ani.
Viteza de rspndire a virusului n livad depinde de marimea sursei de infecie i de
prezena sa n interiorul su n afara plantaiei.
1.4.3
Simptomele provocate de virusul Plum pox
Fig.1.10 Frunze de cais atacate de virusul Plum pox

Plum pox este o boal foarte grav deoarece produce simptome severe pe fructe, frunze,
smburi, uneori pe trunchi i pe ramurile de schelet (Minoiu, 1997). Simptomele de PPV sunt
foarte evidente pe frunzele de primvar ce se manifest sub forma unor decolorri de culoare
verde deschis, pete clorotice, cercuri concentrice, deformri ale frunzelor. n unele cazuri se
constat o cdere prematur a fructelor bolnave.
16
Prezena sau intensitatea simptomelor variaz n funcie de specie i soi, tulpina viral,
starea fitosanitar a gazdei cu privire la ali virui, sezon i locaie. PPV influeneaz ntr-o mic
msur vigoarea i longevitatea longevitatea i pomilor infectai.
Nemeth (1986) descrie simptomele la unele soiuri de prun, chiar i moartea unor pomi,
dar nu s-a putut confirma c simptomele au fost induse de PPV. Atanassoff (1932,1935) a descris
simptomele plum pox-ului la diferite specii ale genului Prunus.
OEPP/EPPO (1983), Nemeth (1986) au descris simptomele PPV la prunul european, cais
i piersic. Llacer i colab (1985), Llacer i Cambra (1986) descriu simptomele PPV la prunul
japonez. Simptomele virusului prezent la viin i cire au fost descrise de Crescenzi i colab
(1997), Nemchinov i colab (1998).
Infectarea cu acest virus poate duce la pierderi considerabile. Aproximativ 100 de
milioane de pomi aparinnd speciilor smburoase din Europa sunt infectate , la unele soiuri
sensibile pierderile pot fi de 80-100% (Kegler, 1998). n estul i centrul Europei soiurile sensibile
de prune pot prezenta cderi premature ale fructelor i fisuri pe suprafaa lor.
Nemchinov i colab (1998) descriu simptomele la cire i le prezint astfel: pete circulare
de natur clorotic sau necrotic, cderi premature ale fructelor.
1.5.
Identificarea i caracterizarea principalelor virusuri la cais

Identificarea virusurilor ghidandu-ne numai dupa simptome poate fi dificila pentru ca
unele virusuri sunt complexe avand smptopme similar, iar in alte cazuri infectiile nu produc
simptome evidente.
In cele mai multe cazuri, plantele sunt infectate cu doua sau mai multe virusuri, astfel ca
simptomele induse de un virus pot fi mascate de simptomele celorlalte virusuri. De aceea,
semnalarea prezenei bolilor virale, identificarea i caracterizarea virusurilor sau a anumitor
tulpini virale, depind n mare msur nu numai de simptomatologia produs, dar i de aplicarea
unor tehnici adecvate.
1.5.1. Metode de identificare a virusurilor
Identificarea infeciilor cu virusuri la plante prezint importan teoretic, dar mai ales
practic. Pentru identificarea infeciilor virotice se folosesc diferite metode din care amintesc :
17
Inoculari mecanice
Indexari pe plante lemnoase si ierboase
Microscopia electronica
Analiza serologica
Analize ale acizilor nucleici.
Utilizarea indicatorilor erbacei si lemnosi pentru determinarea virusurilor, furnizeaza
informaii importante cu privire la cele mai bune plante gazd pentru multiplicarea virusului,
meninerea unor izolate noi, purificarea virusului i producerea de antiseruri. Dintre indicatorii
erbacei si lemnosi folositi mentionam :
Indicatori erbacei:
- Chenopodium quinoa - pentru PNRSV;
- Cucumis sativus - pentru PNRSV i PDV.
Indicatori lemnoi:
- Prunus persica (puiei de GF 305 sau Elberta) - pentru PNRSV i PDV;
- Prunus tomentosa (hibridul IR473xIR474) - pentru PNRSV, PDV i PPV;
-Prunus serrulata (Shirofugen, Kwanzan)-pentru PNRSV i PDV.
Datorit apariiei a numeroase soiuri, ct i diversificrii tulpinilor din interiorul agenilor
patogeni de tip viral, se impune abordarea de noi tehnici (ELISA, PCR, culturi in vitro), care s
permit att identificarea rapid a acestora, ct i eliberarea de acest tip de ageni infecioi.
Tehnicile serologice sunt foarte precise, dau rezultate rapide, sunt laborioase i permit
efectuarea unui numr foarte mare de teste. Cele mai multe dintre ele au fost preluate din
medicina uman i au fost adaptate pentru studiul virusurilor fitopatogene. Reacia serologic are
la baz contactul dintre suspensia viral i antiserul specific. Evidenierea reaciei specific dintre
antigen i antiser se realizeaz prin diferite teste, precum testul de floculare, testul de difuzie n
gel, testul ELISA etc.
1.5.1.1. Testul de floculare
Cnd particulele virale interacioneaz cu anticorpii specifici, n mediu lichid, formeaz
combinaii care precipit. Aceste precipitate pot fi observate n tuburi (testul tub) sau n picturi
18
plasate pe suprafee netede (testul de microprecipitare). Testul de microprecipitare se utilizeaz,

n principal, pentru diagnoza virusurilor alungite. De obicei, se folosete sucul plantei purificat
prin centrifugare i aezat n vase Petri, sub form de picturi.
1.5.1.2. Testul ELISA
Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este un test imunologic foarte
sensibil al crui principiu se bazeaz pe interaciunea antigen-anticorp. Aceast tehnic a fost
introdus n virologia vegetal n anul 1976 (Clark i Adams, 1977).
Spre deosebire de testele de difuzie n gel i de floculare, ELISA permite detectarea
virusurilor care se gsesc n concentraie foarte mic n plante i chiar direct din vectorii lor.
Datorit sensibilitii ridicate a testului, virusurile se pot evidenia naintea manifestrii
simptomelor.
Testul ELISA utilizeaz o metod de dozare imunoenzimatic de tip double antibody
sandwich(DAS), n care anticorpi specifici sunt cuplai direct cu o enzim (fosfataz alcalin).
Antigenul (A) este capturat pe faza solid, de ctre anticorpii (IgG) fixai anterior. n urmtoarea
etap, 24 anticorpii cuplai cu fosfataza alcalin vin i se leag pe antigen. n final, hidroliza
substratului (p-nitrofenilfosfat) de ctre enzim duce la obinerea unei coloraii galbene a crei
intensitate poate fi msurat fotometric prin citirea densitii optice la 405 nm (valoarea
absorbiei). Testul ELISA este folosit pentru detectarea a numeroase virusuri la plante (Clark i
Adams, 1977; Flegg i Clark, 1979 etc.).
Avantajele metodei ELISA sunt urmtoarele:
sensibilitate pentru detectarea unei cantiti foarte mici de virus (o concentraie a

antigenului de 1 -10 mg/ml);
vitez de reacie mare (rezultate n 6-24 ore);

testare la scar mare a probelor (pot fi manipulate cteva sute de probe individual sau n
grup);
specificitate pentru diferenierea serotipurilor;
este potrivit att pentru virioni intaci
mrimi diferite;
ofer posibilitatea de a face msurtori cantitative;
posibilitatea automatizrii i standardizrii testelor prin producerea de kit-uri comerciale
specifice fiecrui agent patogen;

costuri sczute i o durat de via relativ lung a reactivilor;
testul poate fi efectuat att n suc crud ct i n suspensie viral purificat;
19
ct i fragmentai
cu morfologie sau
tehnic economic cu un minim de dotare de baz.

Exist cteva variante ale tehnicii, n funcie de modul n care antigenul este morfologic
fixat. Pentru indexarea la scar larg a virusurilor, cea mai utilizat metod i cu bune rezultate,
este DAS - ELISA standard (direct) - sandwich dublu de anticorpi. Cteodat specificitatea
ridicat a metodei DAS - ELISA direct ridic probleme de aceea, este preferat ELISA indirect
care se mai folosete i pentru a stabili relaiile serologice dintre virusuri (acelai conjugat poate
fi folosit pentru diferite virusuri sau tulpini virale).
1. DAS-ELISA direct
2. BiotinDAS-ELISA
3. DAS - ELISA indirect
4. DIBA
5. Imunofluorescen IFA
Dintre numeroasele variante ELISA utilizate pentru identificarea virusurilor la plante, cea
mai folosit metod este double antibody sandwich (Clark i Adams, 1977).
Tehnica ELISA a fost folosit de muli cercettori pentru detectarea a numeroase virusuri
la pomii fructiferi: Plum pox virus (Clark i Adams, 1976, .a.), Prunus necrotic ring spot (Tresh
i colab., 1977, .a.), prune dwarf (Casper, 1977, .a.).
n prezent, la noi n ar, tehnica ELISA este utilizat pentru majoritatea virusurilor la
pomii fructiferi, n laboratoarele de la I.C.D.P. Piteti-Mrcineni i la S.C.D.P. Vlcea, Bistria i
Bneasa.
Att organele i esuturile ce pot fi utilizate ca surs de antigen, ct i momentele optime
de prelevare a probelor difer de la un virus la altul, n limite foarte largi (Maxim, Isac i colab.,
2002).
1.5.2. PCR (Polymerase chain reaction)
O alt tehnic abordat pe plan mondial, iar n ultimul timp i n ara noastr, o constituie
utilizarea metodelor moleculare de evideniere a bolilor virotice i a tulpinilor acestora la speciile
pomicole (RT-PCR, IC-RT-PCR).
Efectuarea testrilor moleculare pentru punerea n eviden a tulpinilor virale, necesit un
protocol special de lucru. PCR (Polymerase chain reaction) este o tehnic de foarte mare precizie
dar i foarte costisitoare.
20
Aceast metod a biologiei moleculare de identificare a ADN-ului sau ARN-ului este cea
mai precis n identificarea tipului de tulpin viral.
Amplificarea unei scurte i bine definite pri a acidului nucleic, trebuie foarte bine
condus pe baza unor primeri specifici care sunt reprezentai de secvene de nucleotide care
conin bazele azotate specifice pentru tulpina viral respectiv.
Tehnica de amplificare genic sau PCR este o metod extrem de sensibil de evideniere a
acidului nucleic specific din prob. Secvena int din acidul nucleic, care urmeaz a fi detectat,
se amplific exponenial prin reacii n lan catalizate de ADN-polimeraza.4 Tehnica are trei etape:
denaturarea dublului helix, care va servi ca matri;
cuplarea primerului (primerannealing);
extensia lanului catalizat de ADN-polimeraza (Maxim, Isac i colab.,2002).

Cele trei etape se desfoar ntr-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclic a fiecrei etape. Temperaturile la care se desfoar cele trei etape sunt diferite:
denaturarea la 90 - 95C, cuplarea la 40 - 60C, iar extensia la 70 - 75C. Dup 20-30 de cicluri,
n care se amplific secvena vizat, aceasta poate fi decelat prin una dintre metodele de
hibridare a acizilor nucleici (Maxim, Isac i colab., 2002).
1.5.3. Alte virusuri ale caisului
Pe langa virusului Plum Pox descris intr-un capitol anterior, mai exista alte doua virusuri
cu incidenta economica majora care fac parte din grupa ILAR virus, si anume :
Prunus Necrotic Ring Spot Virus (PNRSV) - face parte din grupa virusurilor ILAR
(Izometric Labil Ring Spot). Aceast grup este caracterizat de particule izometrice cu
dimensiuni cuprinse ntre 22-24 mm. PNRSV a fost descris pentru prima dat n anul 1931. Este
ntlnit n special la prun i este rspndit n ntreaga lume.
Este prezent i la piersic i cais. Se manifest n special pe frunze sub forma unor pete
glbui-clorotice, sub form de inele, cu centrul necrotic. esuturile necrozate se desprind i cad,
frunzele rmnnd ciuruite i cu aspect clorotic. Creterea pomilor poate s nu fie afectat, ns
producia poate s scad cu 15-45% la soiurile sensibile.
4 Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., Maule, A.J., 1999, New advances in understanding the
molecular biology of plant-potyvirus interactions.Mol.Plant-Microbe Interact. 12, 367376.
21
La acest virus se ntlnesc dou tulpini care pot produce ptarea inelar sau declinul
pomilor. Poate fi transmis prin inoculri mecanice, prin smn sau prin polen.
Sursa:
http://en.wikipedia.org/wiki/Prunus_necrotic_ringspot_vir
Fig.1.11 Clasificarea virusului

Prune Dwarf Virus (PDV) - face parte, de asemenea, din grupa virusurilor ILAR
(Izometric Labil Ring Spot). Aceast grup este caracterizat de particule izometrice cu
dimensiuni cuprinse ntre 22-24 nm. Este larg rspndit n lume iar la noi n ar se ntlnete
frecvent n plantaii i pepiniere.
Sursa: http://en.wikipedia.org/wiki/Prune_dwarf_virus
Fig.1.12.Clasificarea virusului
Simptomele produse pe frunze sunt urmtoarele: pomul infectat are frunze nguste, mici,
cu limbul foliar ngroat, uneori cu numeroase pete galbene dispuse neregulat. De asemenea,
creterea pomilor i a lstarilor infectai este redus, n pepiniere pomii infectai avnd jumtate
din nlimea normal. Poate fi transmis prin inoculri mecanice, prin smn sau prin polen.
22
CAPITOLUL II
CONTRIBUII PROPRII
2.1 Justificarea temei
n prezent, cnd sortimentul este n continu schimbare, studierea modului de comportare
a unor soiuri valoroase din sortimentul mondial i naional este de foarte mare actualitate.
Pentru a pstra linia obiectivului general al prezentei lucrri i anume rezisten a genetic
natural la boli, unde n cazul de fa se refer la rezistena la Plum pox virus, la specia mr neam propus obinerea de descendene hibride prin folosirea n procesul de polenizare a unor
genotipuri cu rezisten genetic natural la shanka i evaluarea acestora prin tehnici moleculare.
Studiile n condiii de infecie artificial a acestor hibrizi rezisteni la boli i corelarea acestor
manifestri fenotipice cu rezultatele genotipice constituie un prim pas n acest nou program de
ameliorare bazat pe selecia asistat cu Markeri moleculari (MAS).
Pe plan mondial tot mai muli cercettori i ndreapt atenia ctre studiul diferitelor
soiuri rezistente n combinaie cu diferii portaltoi.
Avalana de soiuri strine i apariia a numeroase soiuri autohtone au cerut eforturi din
partea cercettorilor pentru verificarea rapid i valorificarea n producie a celor mai bune dintre
ele. Pentru toate combinaiile soi-portaltoi s-au efectuat i sunt n continu desfurare cercetri
privind stabilirea sortimentului la nivel zonal i agrotehnicii difereniate n funcie de soiurile
folosite.Comportarea bun a soiurilor de mr cu rezisten genetic la boli, chiar n condiii de
netratare cu fungicide i, ca urmare cu o reducere important a consumului de pesticide i a
polurii mediului, ndreptete necesitatea studiului implicarii acestor soiuri n procesele de
ameliorare in vederea obtinerii de genotipuri din ce n ce mai competente pentru noua viziune a
unei agriculturi biologice competitive pe piaa mondial.
Pentru realizarea acestui obiectiv major ne-am stabilit o serie de obiective sintetice, dintre
care:
identificarea de genotipuri rezistente la Sharka;
folosirea acestora n hibridri ncruciate;
obinerea generaiei F1;
evaluarea acestor descendene hibride n ce privete rezistena la PPV;
23
folosirea seleciei cu markeri moleculari pentru evaluarea genotipic a acestor hibrizi.

Implementarea tehnicilor noi de biologie molecular i folosirea selecie asistate cu markeri
moleculari constituie o etap important n scurtarea perioadei de obinere de noi soiuri
performante pentru piaa national i internaional. De asemenea, valorificarea judicioas a
fondului romnesc de germoplasm permite deschiderea de noi perspective n ameliorarea
speciilor pomicole romneti.
2.2. Obiectivele cercetrilor
Referitor la genotipurile de cais studiate acestea sunt reprezentative in ceea ce privete
atat sensibilitatea cat i rezistena la PPV. Suele alese pentru studiu i anume sua D (Dideron) i
sua M (Marcus) sunt cele mai vechi cunoscute (comparativ cu sua Sour Cherry-(SoC)
descoperit destul de recent) dar i cele cu cel mai mare impact negativ asupra plantaiilor
pomicole i totodat cele mai bine cunoscute i studiate.
La specia de cais, obiectivele propuse se refera la :
identificarea de genotipuri rezistente la Sharka;
folosirea acestora in hibridri incrucisate;
obinerea generaiei F1;
evaluarea acestor descendene hibride in ce privete rezistena la PPV prin infectii artificiale
cu PPV;
fenotipajul descendentelor hibride prin teste serologice si moleculare.
Implementarea tehnicilor noi de biologie molecular i folosirea Selecie Asistate cu Markeri
Moleculari constituie o etap important in scurtarea perioadei de obinere de noi soiuri
performante pentru piaa national i internaional. Pentru aceasta fenotipajul descendentelor
hibride este o etapa extreme de importanta in cadrul pasilor ce trebuiesc parcursi De asemenea,
valorificarea judicioas a fondului romanesc de germoplasm permite deschiderea de noi
perspective in ameliorarea speciilor pomicole romaeti.
2.3 Material i metod
2.3.1. Materialul biologic folosit pentru specia cais (Armeniaca vulgaris)
Materialul biologic folosit pentru aceast spectie este constituit din diferite combinaii hibride F1
. Hibrizii de cais luai in studiu au fost obinui la USAMV Bucureti i S.C.D.P Valul lui Traian,
24
Constana. Acetia au fost testai in condiii de infecie artificial la USAMV Bucureti in condiii
de izolare fiind vorba de un virus de carantin i in laboratorul de biologie molecular din catedra
de Pomicultur. Pentru o evaluare concret a rezistenei genetice la PPV in studiu au fost fcute
infecii artificiale in condiii controlate (ser pentru limitarea rspandirii PPV-ului). Soiurile i
hibrizii luai in studiu au fost altoii pe portaltoii: piersic GF 305, piersicul GF 305 fiind indicator
PPV.
Sursa: fotografii proprii
Fig. 2.3.1., fig. 2.3.2.
Indexarea genotipurilor de cais pe portaltoii de piersic GF 305
Evaluarea in ce privete rezistena la PPV a unor combinaii hibride de cais ameliorate la

SCDP Constana Valul lui Traian, i cele de la USAMV Bucureti in condiii naturale de
infectie dar i in condiii de infecie artificial cu PPV este un prim pas in implementarea Selecie
Asistate cu Markari moleculari (MAS) la aceste genotipuri.
Interesant pentru noi este faptul c in aceste hibridri au fost folosite soiuri rezistente cum
sunt NJA 2 i Stark Early Orange (SEO) ca genitori purttori ai genelor de rezisten la PPV.
Aceti hibrizi au fost testai serologic la infecia cu PPV in condiii de presiune viral normala in
camp.
Plum pox virus (PPV) este agentul responsabil al bolii Sharka, principala boal viral a
arborilor fructiferi din genul Prunus, gen care cuprinde mai multe specii importante din punct de
vedere economic cum ar fi piersicul, caisul sau cireul. Acest maladie afecteaz si samburoasele
din tot bazinul mediteranean i din majoritatea rilor europene. Situaia este in continuare critic
in rile din Europa de Est unde boala este endemic cu o rat de contaminare cuprins intre 1570%. In general lupta contra maladiei virale a plantelor este dificil datorit lipsei mijloacelor
25
curative. In momentul actual viruii patogeni nu pot fi combtui decat prin metode profilactice.
Drept urmare lupta contra bolii Sharka se bazeaz in principal pe plantaiile certificate i pe
campanii de eredicare sistematic a pomilor atacai. 5
Din 1980 centrele INRA din Bordeaux i Avignon au lansat un program de ameliorare
pentru rezistena la PPV a caisului, piersicului i prunului. Acest program a fost dezvoltat pe baza
hibridrii intraspecifice pentru cais, pentru care exista un numr restrans de specii rezistente i pe
baza hibridrii interspecifice pentru prun i cire pentru care nu se cunoate nici o varietate
rezistent printre speciile cultivate.
Efectul infectrii virale la plantele erbacee a fost deja abordat. Whitham i colaboratorii
au identificat la Arabidopsis thaliana, plant cu o sensibilitate crescut, genei indus de 5 virusuri
diferite printer care i Potato Virus X (virusul X al cartofului). Aceste virusuri provoac
modificri de expresie la genele plantelor cu sensibilitate ridicat..
Factori ai gazdei se presupune c intervin in ciclul de infectare al virusului pe mai multe nivele
(replicare, propagare, micare i suprimarea rspunsurilor de aprare ale gazdei). In acest timp,
pn in prezent, nici o lucrare similar nu a fost realizat plecand de la o plant parial rezistent.
In aceast lucrare este vorba de studierea interaciunii unor genotipuri din genul Prunus
cu virusul PPV, planta gazd fiind deci o plant lemnoas.
Tehnica cDNA-AFLP a permis punerea in eviden la Prunus Armeniaca, a unor gene a
cror exprimare este modulat, in continuarea inoculrii cu PPV. Acest studiu are ca scop
validarea implicrii a acestor gene prin interaciune compatibil sau incompatibil a PPV-ului cu
planta sa gazd lemnoas. Genele reprimate pot fi implicate fie in mecanismul de aprare a
gazdei, fie in procesul de infectare a virusului.
Dintr-un punct de vedere fundamental - Sistemul Prunus/PPV care constituie un model
interesant de cercetare a interaciunilor plant-potyvirus, inand cont de specificaiile plantelor
perene, varieti altoite, inmuliri vegetative i un ciclu lung de selectare. Pe de alt parte, acest
studiu prezint un obiectiv aplicat: o mai bun inelegere a bazelor genetice de rezistena la
Sharka va permite dezvoltarea unor marcatori genetici de rezisten i de punere in practic a
unor tehnici, ca de exemplu selectarea asistat prin marcatori (SAM) ai varietailor (soiurilor)
5 Roy AS & Smith I.M. 1994, Plum pox situation in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin24,
515523.
26
rezistente la PPV. Materialul viral a fost constituit din sursee locale de PPV (Marcus si Dideron)
provenite de la SCDP Bistria Romania.
2.3.2. Material viral
Materialul viral a fost constituit din sue locale de PPV < Marcus i Dideron ?provenite
de la SCDP Bistria Romania.
Fig. 2.3.3., fig. 2.3.4 Atac de PPV pe frunze si fructe i schema genomului PPV-ului
2.3.3. Metodele de cercetare abordate pentru specia cais
Metoda altoirii
-
in ochi dormind
cu ramura detasata
Metoda fenotipajului
Testul serologic Elisa
Testul molecular RT-PCR
La plante sunt numeroase metode de diagnosticare a bolilor produse de virusuri, dintre
care: inoculri mecanice, indexri pe plante lemnoase i ierboase, microscopie electronic,
analiz serologic, analize ale acizilor nucleici. Utilizarea indicatorilor biologici ierbosi i
lemnoi poate ajuta doar la identificarea unor virusuri, deoarece simptomele care apar pot fi
specifice unei anumite tulpini virale. Prin studiul indicatorilor erbacei pot fi furnizate informaii
importante cu privire la cele mai bune plante gazd pentru multiplicarea virusului, meninerea
27
unor izolate noi, purificarea virusului i producerea de antiseruri. Ca indicatori biologici ierbosi i
lemnoi pentru cteva virusuri ale speciilor smburoase (PPV, PDV, PNRSV), recomandai de
ctre Grupul Internaional de Lucru pentru Virusurile Pomilor Fructiferi din cadrul Societii
Internaionale de tiine Horticole (ISHS) n anul 2000 pot fi enumerai:
Indicatori erbacei:
- Chenopodium quinoa - pentru PNRSV;
- Cucumis sativus - pentru PNRSV i PDV.
Indicatori lemnoi:
- Prunus persica (puiei de GF 305 sau Elberta) - pentru PNRSViPDV;
- Prunus tomentosa (hibridul IR473xIR474) - pentru PNRSV, PDV i PPV;
-Prunus serrulata (Shirofugen, Kwanzan)-pentru PNRSV i PDV.
Datorit apariiei a numeroase soiuri, ct i diversificrii tulpinilor din interiorul agenilor
patogeni de tip viral, se impune abordarea de noi tehnici (ELISA, PCR, culturi in vitro), care s
permit att identificarea rapid a acestora, ct i eliberarea de acest tip de ageni infecioi.
Tehnicile serologice, spre deosebire de procedeele tradiionale de testare, sunt mai laborioase,
mai precise, cu specificitate foarte mare i permit efectuarea unui numr mare de teste n timp
foarte scurt. Introducerea i utilizarea pe scar tot mai larg a testului ELISA (Clark i Adams,
1977) a permis nregistrarea unor progrese marcante n detectarea virusurilor.
Cele mai multe dintre tehnicile serologice au fost preluate din medicina uman i adaptate
la virusurile plantelor. ELISA, Enzyme - Linked immunosorbent assay (ELISA), este o metod
serologic ce permite detectarea virusurilor care se gsesc n concentraie foarte mic n plante i
chiar direct din vectorii lor. Aceast metod se folosete din 1971, cnd cercettorii Clark i
Adams au dezvoltat protocolul pentru virusurile plantelor. Serologia este o tehnic tradiional
bazat pe folosirea anticorpilor. Anticorpii, cunoscui de asemenea ca imunoglobuline sunt
proteine care se gsesc n snge sau fluide ale corpului vertebratelor capabile s se uneasc
specific cu antigenele, respectiv bacterii sau virusuri.
Anticorpii sunt folosii de sistemul imunologic pentru a identifica i neutraliza obiectele
strine, aa numitele antigene. Prin serologie se pot detecta doar virusurile cunoscute, nu boli de
origine necunoscut. (Viroizii nu pot fi detectai prin aceast metod).
28
Schematic, antigenele virale sunt prinse prima dat de anticorpul specific al virusului care
cptuete (acoper) suprafaa intern a unor godeuri de polistiren, i apoi de anticorpul viral
conjugat cu enzim. n final, substratul care se adaug induce o reacie colorimetric n prezena
complexului antigen - conjugat - enzim - anticorp.
Prezena
antigenelor
virale
specifice
din
sucul
infectat
este detectat printr-o
reacie colorimetric care se dezvolt datorit reaciei unei enzime conjugate cu anticorpii n
prezena unui substrat potrivit.
2.3.3.1 Testul imunoenzimatic ELISA
Acest test sau tehnic a fost introdus n anul 1976 de ctre Clark i Adams, iar primul test
a fost fcut chiar pentru determinarea prezenei PPV-ului la smburoase. Exist numeroase
variante n ceea ce privete numele acestui tip de test cel mai des ntlnit fiind double antibody
sandwich. Tehnica permite detectarea virusurilor chiar n cantiti foarte mici, iar dac este
nevoie viruii pot fi detectai chiar direct din vectori.
Principiul pe care se bazeaz acest test este posibilitatea de cuplare a anticorpilor cu o enzim
i de fixare a acestora. Astfel pentru detectarea prezenei virusului ntr-o plant nu trebuie dect
ca n prezena unui eantion din planta care ne intereseaz s adugm anticorpii corespunztori
patogenului pe care dorim s l depistm:
dac antigenul este present se formeaz un complex imunologic asociat cu enzima fixat
de anticorpi, n prezena unui substrat al acestei enzime, iar hidrolizarea acestui substrat
este pus n eviden prin apariia unui produs colorat.
dac planta este sntoas nu se va forma complexul i nu va avea loc reacia de culoare.
dac eantionul este infectat cu un alt virus el nu va fi recunoscut de ctre anticorpii

specifici utilizai, astfel nici n acest caz nu va avea loc vreo reacie sau formarea unui
complex.
29
Sursa:fotografie proprie
Figura 2.3.5 Testul serologic Elisa

Pentru metoda ELISA frunzele (eantioane) au fost mojarate n tampon de extracie (AFT
0,2% + Dieca 2% + PVP - 10) i au fost plasate n orificiile unei placi speciale Elisa tapisat
anterior cu anticorpi policlonali conjugai, imunoglobuline conjugai (anti-PPV) i se incubeaz
la 4 0C pentru 16h. Dup 3 splri (cu AFT-Tween) s-au adugat 200 I anticorpi monoclonali
specifici pentru PPV i se incubeaz la 37 0C timp de 2 ore. Ultimul pas a fost adaugarea de
imunoglobuline conjugate cu fosfataz alcalin 1:1000 (200I) i se incubeaz timp de 2 h la
temperatura de 37 0C. Citirea a fost fcut la o lungime de unda de 405 nm, lund n considerare
valorile pozitive depesc de dou ori valoarea de citire test negativ (T-x 2). Pentru realizarea
testului ELISA este nevoie de un suport reprezentat de ctre o plac de polistiren, de anticorpi
specifici virusului pe care l detectm (imunoglobuline de tip G:IgG), de aceeai anticorpi cu o
enzim i de un substrat cu aceast enzim.
Placa de polistiren are 96 de compartimente cele de pe margine nefiind utilizate astfel
pentru test rmn 60 de compartimente disponibile. Se folosesc de asemenea dou probe, una de
la o plant sntoas i una de la plant infectat (probele trebuie sa fie extrase din acelai tip de
organ, iar plantele din care sunt extrase probele s aparin aceleiai specii vegetale creia
aparine i planta pentru care se efectueaz testul) ct i o prob martor. Eantioanele din plantele
ce trebuie testate sunt amestecate cu o soluie tampon de baz BPS-tween (specific PPV-ului), iar
apoi sunt centrifugate sau filtrate (ceea ce rezult din aceast filtrare/centrifugare este folosit n
determinarea propriu-zis). Pentru a evita contaminarea, proba extras din planta sntoas este
pregtit prima, iar cea din planta infectat ultima. Fazele de desfurare a testului sunt
urmtoarele:
peliculizarea plcii de polistiren cu soluie IgG (n soluie tampon cu pH de 9,6), aceast
faz are o durat cuprins ntre 3 i 6 ore la o temperatur de 37C;
n cea de-a 2 faz are loc legarea antigenului viral de anticorpul fixat (formarea
complexului anticorp-antigen). Antigenul (provenit din diferite esuturi i organe ale
materialului vegetal) extras cu o soluie tampon este introdus n compartimentele plcii de
polistiren unde are loc cuplarea acestuia cu anticorpii. Durata acestei etape este de 18 ore
la o temperatur de 4C;
30
n faza cu numrul 3 are loc reacia antigenului cu conjugatul imunoenzimatic (IgG

marcat). Pentru cuplarea conjugatului cu antigenul de adaug soluie diluat de conjugat
n fiecare compartiment, dup care placa se incubeaz din nou la o temperatur de 37C
pentru 3-6 ore;
n cea de-a 4 faz i ultima are loc reacia cu substrat specific. Aceast etap se bazeaz pe
reacia ce are loc ntre substratul specific. Aceast etap se bazeaz pe reacia ce are loc
ntre substrat i enzimele de conjugat cu formarea de produi colorai. Intensitatea reaciei
de culoare ce msoar cantitatea de anticorpi specifici legai de antigene, prezeni n
serulu concentrate, se determin fotometric. Reacia poate avea o durat cuprins ntre 5
minute i 2 ore, temperaturade desfurare fiind cea a ambientului;
Densitatea optic a soluiei colorate se evaluaeaz n raport cu densitatea optic a martorului
sntos. Rezultatele astfel obinute sunt interpretate n 3 moduri (fiind luat ca valoare de
referin cifra de 0,1):
eantion negativ cnd planta studiat este liber de virus sau cnd cantitatea de virus este
prea mic pentru a fi detectat (n acest caz valoarea este mai mic de 0,08); prezena unei
cantiti prea mici de virus poate fi datorat i faptului ca PPV-ul este reprezentat diferit n
plat;
eantion dubios sau suspect cu valoare cuprins ntre 0,08-0,12, acest verdict dndu-se
doar dup o a doua testare care se ncheie tot cu un rezultat inconcludent;
eantion pozitiv cnd valoarea obinut este mai mare de 0,12, n acest caz, putndu-se
afirma cu siguran c virusul este prezent n plant;
Se recomand o interpretare foarte prudent a rezultatelor n special n situaiile n care avem
de- a face cu eantioane negative sau dubioase, implicaiile unui verdict greit sunt foarte mari
att n plan profesional ct i n plan economic. De aceea se recomand, unde este cazul, i cnd
este posibil testul ELISA cu un test PCR.
Avantajele metodei ELISA sunt urmtoarele:
sensibilitate pentru detectarea unei cantiti foarte mici de virus (o concentraie a
antigenului de 1 -10 mg/ml);
vitez de reacie mare (rezultate n 6-24 ore);
31
testare la scar mare a probelor (pot fi manipulate cteva sute de probe individual sau n
grup);
specificitate pentru diferenierea serotipurilor;
este potrivit att pentru virioni intaci ct i fragmentai cu morfologie sau mrimi
diferite;
ofer posibilitatea de a face msurtori cantitative;
posibilitatea automatizrii i standardizrii testelor prin producerea de kit-uri comerciale
specifice fiecrui agent patogen;
costuri sczute i o durat de via relativ lung a reactivilor;
testul poate fi efectuat att n suc crud ct i n suspensie viral purificat;
tehnic economic cu un minim de dotare de baz.
2.3.3.2 Determinri moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetic)
O alt tehnic abordat pe plan mondial, iar n ultimul timp i n ara noastr, o constituie
utilizarea metodelor moleculare de evideniere a bolilor virotice i a tulpinilor acestora la speciile
pomicole (RT-PCR, IC-RT-PCR).
Efectuarea testrilor moleculare pentru punerea n eviden a tulpinilor virale, necesit un
protocol special de lucru. PCR (Polymerase chain reaction) este o tehnic de foarte mare precizie
dar i foarte costisitoare.
Aceast metod a biologiei moleculare de identificare a ADN-ului sau ARN-ului este cea
mai precis n identificarea tipului de tulpin viral. Amplificarea unei scurte i bine definite pri
a acidului nucleic, trebuie foarte bine condus pe baza unor primeri specifici care sunt
reprezentai de secvene de nucleotide care conin bazele azotate specifice pentru tulpina viral
respectiv.6
Tehnica de amplificare genic sau PCR este o metod extrem de sensibil de evideniere a
acidului nucleic specific din prob. Secvena int din acidul nucleic, care urmeaz a fi detectat,
se amplific exponenial prin reacii n lan catalizate de ADN-polimeraza. Tehnica are trei etape:
denaturarea dublului helix, care va servi ca matri;
cuplarea primerului (primerannealing);
6 Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. 1989 Molecular cloning. A laboratory manual.2nd ed. Cold
Spring HarbourLab. Press
32
extensia lanului catalizat de ADN-polimeraza (Maxim, Isac i colab.,2000).

Cele trei etape se desfoar ntr-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclic a fiecrei etape. Temperaturile la care se desfoar cele trei etape sunt diferite:
denaturarea la 90 - 95C, cuplarea la 40 - 60C, iar extensia la 70 - 75C. Dup 20-30 de cicluri,
n care se amplific secvena vizat, aceasta poate fi decelat prin una dintre metodele de
hibridare a acizilor nucleici (Maxim, Isac i colab., 2002).
Calitatea fructelor este o component critic a programelor de cercetare n ce privete
arborii fructiferi din grupa smburoaselor la genul Prunus. O importan particular n cadrul
programului de interaciune plant-patogen, o are rezistena la boli i duntori. Sharka (variola)
este o problem serioas pentru toata Europa, producia i calitatea fructelor fiind complet
devastate; Plum pox virus este o boal descoperit n Bulgaria n anul 1917. ntre anii 1920-1930
s-a rspndit n estul Europei, iar dup al II-lea rzboi mondial a ptruns i n Germania, Elveia,
Olanda, Frana, Italia, Anglia.
Agentul patogen ce cauzeaz boala, PPV (Plum pox virus) este clasificat ca organism de
carantin prezent n UE, fiind transmis prin intermediul afidelor. Controlul populaiilor deafide ca
vectori prin folosirea insecticidelor nu rezolv problema evoluiei n forme rezistente la
tratamente odat ce s-a instalat boala.
Pentru bolile produse de virusuri nu exist tratamente fitosanitare. Unele ri europene au
demarat un program de eradicare (n Frana au fost eradicate 30.000 de exemplare de pomi n
anul 1999), ns este dificil a se dezvolta un program eficient de eradicare prin diminuarea
populaiilor de afide. O soluie pe termen lung ar fi exploatarea rezervelor de rezisten genetic
la PPV. Deci, Sharka, constituie o ameninare pentru plantaiile de pomi fructiferi din genul
Prunus. Drept urmare, un obiectiv important de ameliorare a genului Prunus ar fi crearea de
soiuri cu rezisten genetic la aceasta boal.
Sursa: www.pomifructiferi.com
33
Fig. 2.3.6, fig. 2.3.7 Consecine ale atacului de Plum Pox Virus asupra culturilor din genul
Prunus
Sursa: Andy Vierstaete, 1999
Figura 2.3.8Etapele de desfurare ale testului RT-PCR

Aceste etape se desfoar ntr-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclic a fiecrei etape. Produii primului ciclu sunt n continuare denaturai cu ajutorul
cldurii, ciclul putndu-se repeta de pn la 20 30 de ori. La fiecare ciclu numrul de copii ale
fragmentului de ADN se dubleaz, ajungndu-se astfel dup 20 de cicluri la 1.048.576 molecule,
iar dup 30 de repetiii la uimitoarea cifr de 268.435.456 fragmente.
Folosirea tehnicii PCR permite printre altele obinerea de rezultate concludente chiar i cu
nite cantiti foare mici de acizi nucleici. Hibridrile moleculare, tehnici clasice nu sunt at t de
precise nct s detecteze cantiti infime de ADN sau ARN. Astfel n cazul ARNm care este
prezent n celule doar n cantiti foarte mici pot s apar probleme la detectarea acestuia. O
tehnic numit RT-PCR a fost dezvoltat pentru a permite detectarea i punerea n eviden a
acumulrii unui ARNm rar din esuturi, organe sau chiar dintr-o celul. Principiul const n
extragerea ARN-ului total din esutul studiat i copierea acestuia in vitro n ADNc monocatenar
cu ajutorul aciunii transcriptazei inverse.
Moleculele de ADN obinute servesc apoi ca matrice a unei reacii PCR care folosete un
cuplu de amorse specifice secvenei de ARN pentru care exist interes. Fragmentele PCR
34
obinute dup desfurarea ciclului PCR sunt analizate apoi cu ajutorul gelului de electroforez.
Una dintre problemele cu care se confrunt aceast metod o reprezint posibilitatea de
contaminare a ARN-ului cu ADN genomic, astfel amorsele se fixeaz foarte bine i pe acest
ADN. Pentru a evita acest neajuns se poate folosi ARN purificat cu ajutorul unei dezoxinucleaze
capabil se elimine toate urmele de ADN genomic prezente n eantionul de analizat. Tehnica
PCR este cu adevrat revoluionar n ceea ce privete cercetrile din domeniul biologiei
moleculare i i gsete numeroase aplicaii n clonare i n ceea ce privete studiul exprimrii
genelor, dar n acelai timp joac i un rol important n studierea polimorfismului genetic.
Caracterizarea molecular a fost finalizat prin secvenierea a patru produi amplificai
aparinnd regiunii genomice (Cter) CP i a unui produs aparinnd regiunii genomice (C-ter) NIb
/ (N-ter) CP . Ampliconii obinui n urma PCR-lui au fost migrai n gel de agaroz 1,5% i au
fost evideniai cu ajutorul fluorocromului bromur de etidium (0.5 g/ml). Purificarea produilor
PCR a fost efectuat cu kitul Wizard SV Gel and Clean-Up System de la Promega, respectnd
protocolul de lucru recomandat de productor. Dup purificarea probelor, acestea au fost migrate
n capilar, folosind aparatul ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Utiliznd versiunea 5.0.9 din pachetul de softuri BioEdit s-au ntocmit aliniamentele secven elor
care, ulterior, au fost analizate comparativ cu cele existente n bncile de date ale NCBI i Gene
Bank.
2.4
Rezultate obinute
In urma infectiilor artificial cu PPV (prin cipp budding) au fost monitorizate infectiile prin
observatii vizuale, serologice si molecular. Pentru fenotipaj aceste descendene luate n studiu, i
care nu au relevat simptomele bolii Sharka pe lstarii n cretere au fost supravegheate vizual,
serologic folosind testul imunoenzimatic (ELISA) i n completare s-au efectuat teste PCR la
genotipurile care au fost negative (far simptome) la inspeciile viziale i serologice. Deci
infecia cu PPV a fost evaluat pe parcursul a trei perioade consecutive de cre tere prin
determinri vizuale i Elisa
35
Fig. 2.4.1, fig. 2.4.2 Aspecte din momentele realizrii fenotipajului la descenden ele hibride de
cais.
Scurtarea a fost efectuat la nceputul fiecrei perioade de cretere pentru a induce
viguroare lstarilor noi i pentru a favoriza apariia simptomelor.
Infectiile artificiale cu PPV effectuate atat la parinti cat si la descendentele hibride.
Simptomele au fost evaluta le 14 zile si au fost confirmate prin testele serologice Elisa si RTPCR. Eficienta inocularii cu PPV a fost foarte ridicata in ceea ce priveste portaltoiul GF 305 de
95%. Distributia simptomelor a fost foarte neregulata in randul plantutelor tinere prezentand
simptome virale cu faze intermediare de infectie.
Fig. 2.4.3, fig. 2.4.4 Plantele scurtate

Tabel 2.4.1
Rspunsul genotipurilor studiate in urma infectiilor artificiale cu PPV
Nr
crt
Genotip
Elisa test
RT- PCR
Kesth_Phor
susceptibil
Viceroy
susceptibil
36
Raspuns in urma
infectiilor virale
H2+
rezistent
Mari de Cenad
susceptibil
NJA 17
rezistent
Cristal
rezistent
Sirena
susceptibil
Tabriz
susceptibil
SEO
rezistent
10
Pop3-175
rezistent
11
Pop3-183
susceptibil
12
Pop3-191
rezistent
13
Pop3-50
susceptibil
14
Pop3-178
susceptibil
15
Pop3-176
rezistent
16
Pop3-47
rezistent
17
Pop3-116
rezistent
18
Pop3-165
susceptibil
19
Pop3-174
susceptibil
20
Pop3-197
susceptibil
21
Pop3-177
rezistent
22
Pop3-117
rezistent
23
Pop3-186
rezistent
24
Pop3-188
rezistent
25
Pop3-51
rezistent
26
Pop1-40
susceptibil
27
Pop1-91
rezistent
28
Pop1-43
29
Pop1-38
rezistent
37
rezistent
30
Pop1-42
rezistent
31
Pop2-9
rezistent
32
Pop2-196
susceptibil
33
Pop2-166
susceptibil
34
Pop2-122
rezistent
35
Pop2-121
rezistent
36
Pop2-127
rezistent
37
Pop2-206
rezistent
38
Pop2-6
susceptibil
39
Pop2-1
susceptibil
40
Pop2-7
susceptibil
41
Pop4-37
rezistent
42
Pop4-32
rezistent
43
Pop4-28
susceptibil
44
Pop4-19
rezistent
45
Pop4-24
rezistent
46
Pop4-34
rezistent
47
pop4-33
rezistent
48
pop5.55
rezistent
49
Pop5-52
susceptibil
50
pop5-53
susceptibil
Sursa: tabel realizat dup date proprii
Dintr-un numar de 50 plante analizate se observa ca 30 dintre hibrizi au manifestat

rezistenta la PPV in urma infectiilor artificiale insemnand un procent de 60%
38
Fig. 2.4.5, fig.

2.4.6 Analiza serologica ELISA pentru portaltoiul GF305 si hibrizii de caisi apricots
Genotipurile, care nu au dezvoltat simptome la PPV nici vizual i nici prin testul ELISA,
au fost testate prin reacia de transcriere invers n lan a polimerazei (RT-PCR) folosind primerii
specifici pentru PPV: P1 i P2 (Wetzel et al. 1991), care amplific un fragment de 243 bp situat la
C -terminal al genei PPV CP. PPV-ul a fost prins cu anticorpi PPV-policlonali adsorbi i pe pere ii
unui Eppendorf micro-tub. Kit procurat de la Sigma i utilizat pentru RT-PCR.
Schema ciclurilor termice utilizat a fost urmtoarea: RT-30 min la 50 C, denaturare /
RT inactivare - 2 min la 94 C, urmat de 35 de cicluri de denaturare a matriei: - 30 s la 94 C,
alinierea primerului - 45 s la 61 C i ADN-alungire 60 s la 72 C. Ca urmare a ultimului ciclu,
ADN-ul amplificat a fost alungit timp de 10 min la 72 C. O parte alicot din produsele
amplificate (10 I) au fost fracionate ntr-ungel de agaroz de 1,5% cu electroforez n tampon
TBE 1x. Fragmentele au fost vizualizate prin colorarea cubromura etidiu de sub lumina UV.
(Kegler i colab.1998, Wetzel i colab. 1991).
1Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Sursa: fotografie proprie
Figura 2.4.7 Gel de electroforez care reveleaz manifestarea genetic a hibrizilor de cais in
urma RT-PCR.
39
Sursa: fotografii
proprii
Fig. 2.4.8,
fig. 2.4.9 Cais
Plantele au fost clasificate ca rezistente, dac acestea nu au prezentat simptome i reac ii
pozitive ELISA sau RT-PCR n ultimele trei perioade de cretere care au fost evaluate timp de trei
cicluri de vegetatie.
Fig.2.4.10, 2.4.11
Kb 1 2
78
Tabel 2.4.2
Simptome pe GF305
Nr
crt
1.
Combinatii hibride
Testul serologic
Elisa
Testul RT-PCR
+
Manifestare
simptome
sensibil
POP VIII - C41/68-SELF POL-1
sensibil
sensibil
sensibil
sensibil
40
2.
3.
4.
5.
sensibil
sensibil
sensibil
POP-I - MARI DE CENAD x SEO-1
rezistent
rezistent
rezistent
rezistent
POP-II - SIRENA x NJA 42-1
rezistent
sensibil
sensibil
sensibil
sensibil
rezistent
rezistent
sensibil
POP-IV - CRISTAL x NJA 21
sensibil
POP-IV - CRISTAL x NJA 21-1
sensibil
sensibil
sensibil
rezistent
sensibil
rezistent
POP XI - AMIRAL x NJA 21-1
rezistent
sensibil
41
6.
sensibil
sensibil
sensibil
sensibil
rezistent
rezistent
POP-III - NJA 21 x KESTH PHOR-1
sensibil
sensibil
sensibil
sensibil
POP-III - NJA 21 x KESTH +

PHOR-5
sensibil

PHOR-6
sensibil

PHOR-7
sensibil

PHOR-8
sensibil

PHOR-9
sensibil

PHOR-10
sensibil

PHOR-11
sensibil
rezistent
rezistent
42
7.
8.
sensibil
sensibil

PHOR-16
sensibil

PHOR-17
sensibil

PHOR-18
sensibil
sensibil
rezistent
rezistent
rezistent
sensibil
POP XII - TRAIAN x TABRIZ-1
rezistent
rezistent
rezistent
POP VI - VICEROY x NJA 2-1
sensibil
sensibil
sensibil
rezistent
rezistent
sensibil
sensibil
43
9.
10.
11.
12.
13.
sensibil
rezistent
rezistent
POP X - NJA 42 x VICEROY-1
sensibil
sensibil
sensibil
sensibil
POP XIII - NJA 17 x TRAIAN-1
rezistent
rezistent
rezistent
rezistent
rezistent
rezistent
POP IX - TRAIAN x CRISTAL-1
rezistent
rezistent
sensibil
sensibil
sensibil
POP V - SULMONA x NJA 17-1
sensibil
sensibil
rezistent
sensibil
POP VII - WARLEY'S x TABRIZ- +

1
sensibil

2
sensibil
sensibil
44
3
4
sensibil

5
sensibil

6
sensibil

7
sensibil

8
sensibil
TOTAL
97 individuals
Sursa: tabel realizat dup date proprii
In urma observatiilor serologice si moleculare se observa ca dintr-un numar de 97 plante

analizate au fost relevate 33 plante hibride. Rezultatele obtinute in urma fenotipajului vor fi
corelate cu cele ale genotipajului. Pentru continuarea lucrarilor a fost izolat ADN ul de la toti
indivizii strudiati si de la parintii acestora pentru a fi apoi analizati cu marker molecular specifici
care pun in evident genele ce sunt implicate in rezistenta genetic naturala la PPV.
Izolarea ADN
Izolarea ADN-ului genomic a fost efectuat din frunze proaspete de cais folosind
hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) protocol descris de catre Eldredge et al. (1992).
Concentraia de AND a fost msurat cu minifluorimeter (TKO100, Hoefer Scientific). Soluia de
ADN genomic la concentraie de 100 ng/l n TE buffer (pH 8.0) a fost preparat pentru analiza
cu markeri SSR (Simple sequence repeat).7
7 Zagrai, I. 2003, Rezistena genetic durabil element cheie n protecia livezilor. Buletin
Documentar Informativ al SRH, fil.Bistria
45
Fig.2.4.12, fig. 2.4.13 Precipitatul ce constituie ADN-ul genomic la hibrizii de cais
2.5 Concluzii i recomandri

CONCLUZII
Aceste constatri sugereaz faptul c rezistena la PPV n ce priveste genul Prunus este o
ntrebare cu diferite grade de rspuns, i nu una absolut. Pentru acesta va fi important s se
continue evaluarea soiurilor romnest de cais din fondurile de germoplasm pentru o mai bun
ntelegere a mecanismului i controlul genetic al rezistenei, n scopul de a ajuta la aspectele de
reglementare ale rspndirii bolii variolei la speciile smburoase
snatoase pe pia, dar i oferind
i pentru a oferi fructe
surse unice de rezisten la PPV pentru programele de
ameliorare.
Datorit faptului c multe dintre soiurile romaneti de cais nu sunt suficient de bine
susinute i promovate pe piaa Romneasc n aceast lucrare ne-am propus evaluarea unor
descendente hibride de cais n ceea ce priveste rezistena acestora la PPV. n urma indexrii
acestora pe GF305 i n urma analizelor serologice i molecular o serie de soiuri cum ar fi
Traian x NJA 17 s-au dovedit a fi rezistente la PPV.
Identificarea unor noi surse naturale de rezisten la PPV,folosirea acestor genotipuri n
programele de ameliorare n care sunt folosite soiuri comerciale romneti bine adaptate n ara
noastr i de asemeni implementarea SelectieiAsistate cu Markeri moleculari (MAS), bazat pe
strnsa asociere a acestora cu rezistena la PPV, sunt msuri de simplificare n mod semnificativ
a procesului de ameliorare ce poate fi o strategie promitoare pentru a obine soiuri de cais cu
rezisten genetic natural la PPV.
46
n ceea ce privete izolarea AND-ului genomic, calitatea i cantitatea acestuia depinde de

atenia i minuiozitatea modului de operare a cercetatorului. Metoda clasic de izolare bazat pe
folosirea soluiilor mam dei este mai laborioas este mai ieftin dec tcea cu Kituri.
Recomandrile se refer la:
Obinerea F2 i stabilitatea caracterului de rezisten la PPV pentru genotipurile
selecionate prin noi beak-crossuri;
Continuaarea identificarii de noi genotipuri cu rezistenta genetica naturala la PPV;
Explorarea de noi combinatii hibride,
Reintroducerea in studiile de ameliorare a soiurilor autotone si in special acelor vechi,
pentru o mai buna revitalizare si reorientare catre conditiile specifice acestei tari.
47
BIBLIOGRAFIE
1
Ioan Roca, Rada Istrate, 2001, Prognoz, avertizare i carantin fitoasanitar a

duntorilor din agricultur. Bucureti.
Ion Ligia, 2007 Pomicultur, Editura Ceres, Bucureti.
Ion Ligia, 2008 Microinmultirea plantelor horticole si initiere n biologie molecular.

Editura Ceres, Bucureti.
Ion Ligia, Moale C. 2013, Studiul.tehnologiilor de cultur i metode de detecie a

virusurilor la cais i piersic. Editura Estfalia 2013.
Mircetich S., 1982, Phytophtora root and crown of apricot trees. Acta Horticulturae
Myrta A, Di Terlizzi B, Boscia D, Caglayan K, Gavriel I, Ghanem G, Varveri C, Savino V

1998, Detection and serotyping of Mediterranean plum pox virus isolates by means of
strain-specific monoclonal antibodies. ActaVirologica. English Ed. 42, 251254.
Pelet F, Bovey R. 1968 Les symptomes de la Sharka sur les pruniers, pruneautiers,
abricotiers et pechers. Agriculture Romande 7
Polk J., 1994, Breeding for resistance to plum pox potyvirus in the Czech Republic. EPPO
Bull. 24:781782.
Pop, Ioan V., 1975,Virusurile plantelor pomicole i combaterea lor. Editura Ceres Bucureti.
10
Quiot, J.B., Labonne, G., Boeglin, M., Adamolle, C., Renaud, L.Y., Candresse, T.,
1995 ,Behaviour of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees.
Firsts results. Acta Horticulturae
11
Rankovi M., Ogaanovi D., Paunovi S., 1994, Breeding of plum cultivars resistant to
sharka (plum pox) disease. ActaHortic (The Hague) 359: 6974.
12
Ravelonandro M., Scorza R., Callahan A., Levy L., Jacquet C., Monsion M., Damsteegt V.
2000, The use of transgenic fruit trees as a resistance strategy for virus epidemics: the plum
pox (sharka) model. Virus Res 71:6369.
13
Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., Maule, A.J., 1999, New advances in understanding
the molecular biology of plant-potyvirus interactions.Mol.Plant-Microbe Interact. 12, 367
376.
14
Roy AS & Smith I.M. 1994, Plum pox situation in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin24,
15
Roy, A. S., and Smith, I. M. 1994, Plum pox situation in Europe. EPPO Bull. 24:515-523.
48
16
Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.V. 1984, Ribosomal DNA
spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and
population dynamics. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 80148019.
17
Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. 1989 Molecular cloning. A laboratory manual.2nd ed.
Cold Spring HarbourLab. Press.
18
Sosinski B., Gannavarapu M., Beck L.E., Rajapakse S., Ballard R.E., Abbott A.G. 2000
Characterization of microsatellite markers in peach [Prunuspersica (L.) Batsch].TheorAppl
Genet 101
19
Trandafirescu M., 1989, Reacia unor soiuri i hibrizi de cais fa de atacul ciupercii
Monilinia laxa (Aderh et Ruhl) Honey. Probleme de genetic teoretic i aplicat, Vol. XXI,
nr. 2: 75-80.
20
Van Oosten, H. J. 1975, Susceptibility of some woody plant species, mainly Prunus spp., to
sharka (plum pox) virus.Neth. J. Plant Pathol. 81:199-203.
21
Vanacker H., Carver T.L.W., Foyer C.H. 1998a, Pathogen-induced changes in the
antioxidant status of the apoplast in barley leaves. Plant Physiology
22
Varveri C., Ravelonardo M., Dunez J., 1987, Construction and used of cloned cDNA probe
for the detection of plum pox virus in plants. Phythopathology
23
Vilanova S., Romero C., Abbott A.G., Llacer G., Badenes M.L. 2003a An apricot
(Prunusarmeniaca L.) F2 progeny genetic linkage map based on SSR and AFLP markers
mapping plum pox virus resistance and self-incompatibility traits. Theor Appl
Genet107:.239247.
24
Vilanova S., Romero C., Abbott A.G., Llacer G., Badenes M.L. 2003, An apricot (Prunus
armeniaca L.) F2 progeny genetic linkage map based on SSR and AFLP markers mapping
plum pox virus resistance and self-incompatibility traits.Theor Appl Genet 107:239247.
25
Wallis, C. M., Fleischer, S. J., Luster, D., and Gildow, F. E. 2005, Aphid (Hemiptera:
variability using immunocapture-PCR. EPPO Bull. 24:585-594.
26
Wetzel T, Candresse T, Raveloanndro M and Dunez J, 1991 A polymerase chain reaction

assay adapted to plum pox potyvirus detection. Journal of Virological Methods 33: 355-365.
27
Wetzel, T., Candresse, T., Ravelonandro, M., Delbos, R. P.,Mazyad, H., Aboul-Ata, A. E.,
1991 Nucleotide sequence of the 3-terminal region of the RNA of the El Amar strain of
Plum pox potyvirus. Journal of General Virology
49
28
Zagrai I., Ravelonandro, M., Scorza, R., Gaboreanu Ioana, Ferencz Beatrix, Popescu O.,
Zagrai Luminia, Maxim, A. 2005,- Serological and Molecular Variability of Plum Pox
Virus in Transgenic and Conventional Plums. Bulletin of the University of Agricultural
Sciences and Veterinary Medicine Cluj Napoca, seria Horticulture, vol. 62: 84-90. ISBN
1454-2382; Seria Zootehnie i Biotehnologii vol. 61
29
Zagrai, I. 2003, Rezistena genetic durabil element cheie n protecia livezilor. Buletin
Documentar Informativ al SRH, fil.Bistria
30
Zagrai, I., Ravelonandro, M., Gaboreanu Ioana, Ferencz Beatrix, Scorza, R., Zagrai
Luminita, Capote Nieves, Pamfil, D., Popescu, O., Rosu Smaranda, 2006, Environmental
impact assesment of transgenic plums on the diversity of Plum pox virus populations. XX th
International Symposium on Virus and Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops,
Antalya, Turkey, May 22-26, Book of Abstracts
50

Licenta Finala Cais Horticultura

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Licenta Finala Cais Horticultura

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN

CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL TEMEI ABORDATE....3

Caisul caracterizare general...................................................................................................3

Importana economic i valoarea alimentar a caiselor .......................................................4

Originea si aria de raspandire a caisului................................................................................6

Particulariti de cretere i fructificare................................................................................8

Descrierea principalelor boli virotice ale caisului.....................................................................10

Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila)...........................................................................11

Originea i rspndirea virusului...............................................................................................12

Principalele trsturi ale plum pox-ului......................................................................................14

Gazde naturale ale virusului................................................................................................14

Patologia virusului Plum pox..............................................................................................15

Simptomele provocate de virusul Plum pox........................................................................16

Identificarea i caracterizarea principalelor virusuri la cais.....................................................17

Metode de identificare a virusurilor....................................................................................17

1.5.1.1. Testul de floculare...............................................................................................................18

PCR (Polymerase chain reaction).......................................................................................20

Alte virusuri ale caisului......................................................................................................21

CAPITOLUL II CONTRIBUII PROPRII..........................................................................................24

Materialul biologic folosit pentru specia cais (Armeniaca vulgaris)...................................25

Metodele de cercetare abordate pentru specia cais..............................................................28

Testul imunoenzimatic ELISA...........................................................................................30

Determinri moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetic)............................33

CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL

Caisul caracterizare general

Fig.11. , fig. 1.2 Caise atacate de Plum Pox

Importana economic i valoarea alimentar a caiselor

foarte mult apreciate de catre consumatori.

Fig.1.3. , fig. 1.4 Caise

Fig.1.5. , fig.1. 6 Cais Prunus armeniaca L.

Producia total d.c.:

Sursa: Anuarul Statistic al Romniei, 1998

1.1.3. Particulariti de cretere i fructificare

Descrierea principalelor boli virotice ale caisului

1.2.1. Apoplexia smburoas

fitopatogeni de predispozitie, infiintarea plantatilor cu pomii liberi de viroze si mycoplasma,

Fig.1.8 Stigmina carpophila

Originea i rspndirea virusului

Intre anii 2007-2013 a debutat un proiect cofinantat de UE numit SharCo pentru

Gazde naturale ale virusului

Patologia virusului Plum pox

Fig.1.9 Plum pox

Simptomele provocate de virusul Plum pox

Fig.1.10 Frunze de cais atacate de virusul Plum pox

Identificarea i caracterizarea principalelor virusuri la cais

plasate pe suprafee netede (testul de microprecipitare). Testul de microprecipitare se utilizeaz,

sensibilitate pentru detectarea unei cantiti foarte mici de virus (o concentraie a

vitez de reacie mare (rezultate n 6-24 ore);

specifice fiecrui agent patogen;

tehnic economic cu un minim de dotare de baz.

denaturarea dublului helix, care va servi ca matri;

cuplarea primerului (primerannealing);

extensia lanului catalizat de ADN-polimeraza (Maxim, Isac i colab.,2002).

Fig.1.11 Clasificarea virusului

folosirea seleciei cu markeri moleculari pentru evaluarea genotipic a acestor hibrizi.

Sursa: fotografii proprii

Fig. 2.3.1., fig. 2.3.2.

Indexarea genotipurilor de cais pe portaltoii de piersic GF 305

Evaluarea in ce privete rezistena la PPV a unor combinaii hibride de cais ameliorate la

Sursa: fotografii proprii

este detectat printr-o

dac eantionul este infectat cu un alt virus el nu va fi recunoscut de ctre anticorpii

Figura 2.3.5 Testul serologic Elisa