Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
BIOCHIMIE
BIOCHIMIE
1. Scopul
Scopul acestei proceduri specifice este de a prezenta modul de desfasurare
a etapelor necesare determinarii prezentei germenilor patogeni in materiile
fecale(Salmonella,Shigella,Escherichia coli enteropatogen,Stafilococ coagulaza-
pozitiv).
2. Domeniu de aplicare
Procedura se adreseaz personalului din laborator, care lucreaz n
compartimentul "Bacteriologie"
3. Documente de referinta
-Tratat de Microbiologie Clinica de Dumitru Buiuc;Editura Medicala 2009
4. Definitii
Coprocultura cultivarea materiilor fecale ceea ce presupune izolarea
agentului etiologic bacterian pe medii adecvate si identificarea lui pe baza
caracteristicilor morfologice,de cultivabilitate,biochimice, si antigenice.
5. Abrevieri:
-ADCL-Leifson agar dezoxicolat citrat lactoza
1
-SS-Salmonella,Shigella Agar
-AABTL:Agar bila albastru de brom timol lactoza
-EPEC: Escherichia coli enteropatogen
-MIU:mediu pentru teste biochimice: mobilitate ,indol,uree
-MILF:mediu pentru teste biochimice:mobilitate,indol
,lizindecarboxilaza,fenilalanin dezaminaza
-TSI:mediu pentru teste biochimice:triple sugar iron agar
6. Resurse
6.1 Echipamente de incercare
-termostat
-autoclav
-termometre de camera si de incinte
-bec de gaz
-anse
-stativ pentru eprubete
6.2 Reactivi si materiale consumabile
-mediu de cultura ADCL
-mediu de cultura SS
-mediu de cultura AABTL
-mediu de cultura geloza simpla
-mediu de cultura geloza sange
-mediu Chapman
-mediu de imbogatire bulion selenit acid de sodiu
-mediu Muller Hinton
-medii pentru teste biochimice:MIU,MILF,TSI
-benzi indol/reactiv Kovacs
2
-ser fiziologic
-plasma
-placi Petri
-eprubete
-seruri aglutinante pentru Salmonella,Shigella,EPEC
-solutie dezinfectanta
-marker
Primirea pacientului
Recoltarea probelor:
Materiale necesare :
coprocultoare tip din material plastic de unica
intrebuintare prevazute cu lingurita sau tija,
sonde Nelaton sterile nr 14 16.
tampoane rectale cu tija lunga
3
Pregatirea pacientului:
psihica : - asistentul explica pacientului tehnica e urmeaza a
se efectua si modul de recoltare a probelor de materii
fecale
fizica
pacientul este intrebat daca:
- proba de scaun a fost sau urmeaza sa se recolteze
- pentru probele recoltate la domiciliu nu a trecut mai mult de doua ore
prelevare,
- proba a fost pastrata si transportata la rece, imersata in mediu de transport
Cary Blair
- i s-au administrat antibiotice si sulfamide, deoarece toate acestea pot
compromite rezultatul analizei.
Procedura de recoltare
Prelevarea probelor trebuie facuta cat mai aproape de
debutul bolii si inaintea instituirii oricarui tratament
antimicrobian,
Probele de materii fecale pot fi prelevate din scaunul emis
spontan sau prin prelevare rectala
Prelevarea din scaun emis spontan:
Produsul care permite cele mai multe izolari (indiferent de
forma clinica) este scaunul proaspat, emis spontan.
Pentru defecare se utilizeaza containere de unica utilizare
din carton sau material plastic care pot fi decontaminate si
indepartate cu usurinta dupa efectuarea prelevarii,
Recoltarea se face cu ajutorul linguritei sau tijei
coprocultorului din portiuni din scaun cu mucus si eventual
urme de sange, iar cand lipsesc se recolteaza boluri fecale din
2-3 locuri diferite,
Cantitatea este de 5 g (un volum minim de 3- 5 cm 3) iar
daca scaunul este lichid recoltorul trebuie umplut in proportie
de jumatate,
La bolnavii cronici, purtatori, persoane nespitalizate,
scaunul va fi provocat prin purgativ salin (amestec de sulfat de
Na si Mg).
4
Pentru controlul purtatorilor de bacili tifici , prelevarea se
face timp de 3 zile consecutive, dupa o administrare mica de
purgative
o Prelevare rectala:
La bolnavii de dizenterie bacteriana si la investgarea
purtatorilor de Salmonella si Shigella, in cazurile in care nu
poate fi obtinuta o proba de scaun ca atare, se poate proceda
la recoltarea cu sonda Nelaton sterila nr. 14 16 sau cu
tampoane rectale sterile cu tija lunga.
La copii se poate utiliza si sonda de sticla sterila. La
adult, cu sonda sau tamponul rectal umezit cu solutie
fiziologica (nu se folosesc geluri lubrifiante) se penetreaza in
sfincterul anal prin rotare lenta si se introduce 15-20 cm, iar la
copii 10-12 cm, in colonul sigmoid.
La sonda Nelaton se adapteaza o seringa de 10 ml cu
care se fac 1- 2 aspiratii,
Produsul recoltat se suspenda in 2 ml solutie fiziologica
sterila sau in lichid conservant.
Se introduce tamponul sau proba in recoltorul etichetat
in prealabil, notandu-se codul zilnic si analizor al pacientului si
felul analizei:" corocultura, ex.microscopic, ex. micologic.
Transportul probelor
5
Conservarea in mediul de transport Cary-Blair asigurandu-se o buna
conservare la temperatura ambianta pana la 7 zile.
EXAMENUL BACTERIOLOGIC
6
Pentru stabilirea diagnosticului de laborator se vor cerceta caracterele
culturale, morfologice pe frotiuri colorate dupa metoda Gram si albastru de
metilen, comportamentul biochimic si structura antigenica.
Examinarea macroscopica
Preparate umede
Preparate native intre lama si lamela
- o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu o picatura de solutie salina izotona,
- se acopera cu o lamela evitand formarea de bule
- se examineaza cu obiectivul de 40X si se observa:
- oua si larve de helminti,
- protozoare.
Preparate colorate
7
- Coloratia cu albastru de metilen
- o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu 2 picaturi solutie de albastru de
metilen pe o lama,
- se acopera cu o lamela evitand formarea de bule de aer,
- se astepta 2 min,
- se examineaza cu obiectivul de 40X,
- se evidentiaza:
- polimorfonucleare 50/camp in shigeloze
- polimorfonucleare 20/camp in salmoneloze, dizenterie
amoebiana
- polimorfonucleare 2-5/camp in holera, infectii cu ETEC
- polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze,
- polimorfonucleare si hematii in campilobacterioze,
Preparate fixate
se urmaresc microorganismele
frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prim
omogenizarea unei anse putin incarcate intr-o picatura de
solutie salina izotona
dupa uscare se fixeaza timp de 3 4 min cu metanol
se coloreaza dupa metoda Gram
se evidentiaza flora gram-negativa dominanta si cea
gram-pozitiva (toxiinfectii alimentare cu stafilococ,
Bacillus, Clostidium)
dominanta fungilor
Examenul cultural
8
Ultimele 3 4 striuri se reiau apoi cu ansa si se descarca in trei grupe
de striuri paralele nesuprpuse,
Ansa nu se flambeaza intre grupele de striuri,
Din suspensiile de materii fecale omogenizate in mediu de transport
sau in solutie salina izotona, se depun 2 3 picaturi la marginea
placii Petri,
Cu ansa se realizeaza grupe de striuri partial suprapuse,
Din mediile de imbogatire, agitate in prealabil se procedeaza ca mai
sus.
9
Concomitant se insamateaza pe aceleasi medii culturi Salmonella ca
atare sau in suspensii de materii fecale, pentru controlul de calitate.
Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii ansei
bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de colonii izolate
Incubarea
Citire si interpretare
10
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu sau fara
halou opalescent, uneori mucoide
Sau mediul AABTL
In mod obligatoriu pe mediile politrope TSI, MIU ( 2-4 colonii sunt
insamantate prin intepare cu ansa in profunzimea portiunii verticale a
mediului si in striuri pe suprafata inclinata)
Sau mediul SS agar
Diagnosticul serologic
Serotipia - o efectuam dupa schema Kauffmann-White
Se folosesc culturile de pe panta mediului TSI pentru aglutinari cu seruri anti
Salmonella polivalente si monovalente
11
In eventualitatea unei culturi abundente pe mediile de etalare se va
proceda la o aglutinare directa cu serul antisalmonella polivalent Vi si de
grup AO, BO, CO, DO, EO- pentru un diagnostic prezumtiv.
Culturile dezvoltate pe mediile politrope si pe mediile de repicare in
placi vor fi examinate, confruntandu-se cu aspectul culturii initiale. In cazul
in care ele prezinta spectrul biochimic caracteristic salmonellor (pe TSI,
MIU), sau culture suspecte pe repicari sa va trece la aglutinarea pe lama
cu serurile antisalmonella: serurile Poli O si Vi ca etapa screening; in caz
pozitiv se vor face aglutinari pe lama cu serurile O de grup (AO, BO, CO,
DO, EO) si apoi cu cele flagelare H de tip.
NOTA:
In eventualitatea in care tulpina- desi mobila-nu aglutineaza cu
serurile flagelare, se va da rezultatul de grup Salmonella (AO,
BO, CO, DO, EO)
Acelasi rezultat este recomandabil si in cazul in care tulpina nu
poate fi diagnosticata ca un anume serotip
Exceptie face Salmonella typhi, pentru care diagnosticul de
serotip trebuie sa fie realizat in prima etapa
In cazul unei aglutinari negative cu serul Poli O si Vi ( dar cu
spectru biochimic specific ptr. Salmonella) se vor efectua teste
biochimice suplimentare: cercetarea lizindecarboxilazei, testul
ONPG, retestarea serologica dupa termoinactivare.
Tulpina de Salmonella izolata se trimite la Institutul Cantacuzino
pentru identificare de serotip si lizotip.
OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de
bacteriologie totalitatea testelor de identificare efectuate si interpretarea
acestora cat si mediile de cultura folosite suplimentar fata de setul
standard.
Eliberarea rezultatului
12
Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:
Incubarea
Placile se incubeaza 20 ore la 37C sau 48 ore in cazul in care coloniile nu
sunt bine dezvoltate.
Citire si interpretare
13
Coloniile suspecte cu aspect similar celor de pe placile martor,
dezvoltate pe mediile de etalare directa sau dupa
imbogatire se repica in mod obligatoriu pe
urmatoarele medii:
Mediul Mac Conkey
Coloniile de Shigella apar semitransparente, necolorate (ca
si alte bacterii lactozo-negative)
Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta
sub forma unor colonii rosii, fara transparenta, cu sau fara
halou opalescent, uneori mucoide
Sau mediul AABTL
In mod obligatoriu pe mediile politrope TSI, MIU si MILF ( 2-4
colonii sunt insamantate prin intepare cu ansa in profunzimea
portiunii verticale a mediului si in striuri pe suprafata inclinata)
Inocularea mediilor politrope trebuie facuta cu mare grija, pornind de
la colonii separate, fara produs de contaminare din apropierea
coloniei, deoarece acestea nu contin inhibitori pentru flora asociata.
Diagnosticul serologic
14
In eventualitatea unei culturi abundente si aproape monomorfe pe
mediile de etalare, se va putea executa pentru un diagnostic prezumtiv si
rapid, aglutinarea cu seruri antishigella.
Aglutinarea culturilor suspecte pe repicari se incepe cu antiserurile
corespunzatoare grupelor B si D, mai frecvent intalnite si in caz negativ se
fac aglutinari cu celelate seruri.
Nota:
In cazul in care cultura repicata prezinta caracterele biochimice
pe mediile politrope caracteristice Shigellelor si totusi aglutinarea
ramane negativa, se va proceda la reexaminarea aglutinabilitatii
dupa termoinactivare sau a culturii vii cu serul de tip Shigella
flexneri G ( uneori serul polivalent pentru. Shigella nu
aglutineaza Shigella flexneri G)
In cazul lipsei oricarei aglutinarii, in contrast cu spectrul
biochimic caracteristic Shigellelor, se vor efectua teste
biochimice suplimentare (inclusiv ONPG)
Eliberarea rezultatului
Un rezultat negativ va fi eliberat la 24-48 ore de la primirea probei.
Un rezultat pozitiv va preciza taxonomia agentului patogen si va preciza
testarea pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
15
Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii
ansei bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de
colonii izolate
Incubarea
Placile se incubeaza 20 ore la 37C sau 48 ore in cazul in care coloniile nu
sunt bine dezvoltate.
Citire si interpretare
Pe mediul Levine;
Coloniile lactozo-pozitive apar de culoare rosie cu sau fara
centru inchis
E. coli se dezvolta sub forma unor picaturi de fucsina
Diagnosticul serologic
16
Se procedeaza la aglutinarea pe lama cu ser polivalent anticolibacilar
In cazul unei aglutinari puternice si imediate, se vor executa aglutinari
pe lama cu seruri monovalente din setul standard.
Tulpinile E. coli serotipuri enteropatogene se testeaza pentru
sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
a. Principiu
-peste 96% din tulpinile de S. aureus coaguleaza plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei,coagulaza libera
-actiunea directa asupra fibrinogenului ,coagulaza legata de peretele celular
-aderare stafilococilor care poseda coagulaza legata la macromoleculele de
fibrinogen are ca efect macroscopic aglutinarea suspensiei bacteriene
b.Indicatii
-precizarea prezentei stafilococului coagulazo-pozitiv in cazul de toxiinfectie
alimentara
c. Procedura
-se folosesc colonii izolate din cultura pura de 18-24 ore de pe geloza sange
-se urmareste aparitia autoaglutinarii prin emulsionarea a 1-2 colonii intr-o
picatura de ser fiziologic pana la obtinerea unei suspensii laptoase;daca nu
apare autoaglutinare in 10-20 secunde ,cultura va fi identificata prin aglutinare
17
-pe o lama se pun cateva picaturi de plasma si 5 colonii suspecte;se amesteca
cu grija si se observa coagularea plasmei
a. Principiu
b.Indicatii
c.Citire si interpretare
18
TEST POZITIV:aglutinare evidenta in 1-2 minute in picatura cu ser imun de
diagnostic in absenta aglutinarii in solutie salina fiziologica
TEST NEGATIV:absenta aglutinarii in ambele picaturi
a. Principiu
-peste 96% din tulpinile se S. aureus coaguleaza plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei,coagulaza libera
-actiunea directa asupra fibrinogenului ,coagulaza legata de peretele celular
-aderare stafilococilor care poseda coagulaza legata la macromoleculele de
fibrinogen are ca efect macroscopic aglutinarea suspensiei bacteriene
b.Indicatii
-precizarea prezentei stafilococului coagulazo-pozitiv in cazul de toxiinfectie
alimentara
c. Procedura
-se folosesc colonii izolate din cultura pura de 18-24 ore de pe geloza sange
-se urmareste aparitia autoaglutinarii prin emulsionarea a 1-2 colonii intr-o
picatura de ser fiziologic pana la obtinerea unei suspensii laptoase;daca nu
apare autoaglutinare in 10-20 secunde ,cultura va fi identificata prin aglutinare
-pe o lama se pun cateva picaturi de plasma si 5 colonii suspecte;se amesteca
cu grija si se observa coagularea plasmei
8. Erori de diagnostic
19
8.1 Surse de eroare
9.Exprimarea rezultatelor
20
Estimarea incertitudinii de masurare
9. Inregistrari
21
numarul unic de inregistrare al pacientului (ID)
analizele microbiologice solicitate
germenii testati si mediile pe care s-a facut prelevarea lor
teste biochimice efectuate
reactii de aglutinare efectuate
rezultatul analizei microbiologice
22