MARCEL AVRAMIUC

LUCRĂRI PRACTICE
DE BIOCHIMIE
(Format electronic)

Universitatea “Ştefan cel Mare” din Suceava

Facultatea de Inginerie Alimentară,
2016

1
 CUPRINS

I. OPERAŢIUNI GENERALE DE LABORATOR.............................................4

II. SEPARAREA ŞI PURIFICAREA SUBSTANŢELOR ORGANICE...........5
III. ZAHARURI.....................................................................................................13
3.1. DIFERENŢIEREA CETOZELOR DE ALDOZE................................................13
3.2. IDENTIFICAREA PENTOZELOR.......................................................................14
3.3. REACŢII DE EVIDENŢIERE A CARACTERULUI REDUCĂTOR AL
GLUCIDELOR (ZAHARURILOR)..............................................................................15
3.4. DOZAREA ZAHARURILOR REDUCĂTOARE.................................................18
3.5. METODE DE DOZARE PENTRU DIZAHARIDE.............................................47
3.6. REACŢII PENTRU POLIGLUCIDE....................................................................51
IV. DOZAREA ACIDULUI FITIC.....................................................................64
V. LIPIDE...............................................................................................................65
5.1. REACŢII SPECIFICE GRĂSIMILOR DIN ŢESUTURI VEGETALE ŞI
ANIMALE........................................................................................................................65
VI. PROTIDE........................................................................................................80
6.1. SEPARAREA ŞI IDENTIFICAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA
CROMATOGRAFIEI PE HÂRTIE.............................................................................80
6.2. DETERMINĂRI CANTITATIVE ALE AMINOACIZILOR.............................84
6.3. REACŢII CALITATIVE ALE PEPTIDELOR ŞI PROTEINELOR.................89
6.4. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL ŞI PROTEIC......................................92
6.5. DOZAREA CAZEINEI DIN LAPTE......................................................................116
VII. PIGMENŢI ŞI VITAMINE........................................................................118
7.1. DOZAREA CAROTENILOR DIN PLANTE......................................................118
7.2. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE PIGMENŢI CAROTENOIDICI
DIN FĂINĂ (Standard AOAC 13050).........................................................................120
7.3. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VITAMININĂ B1 (TIAMINĂ) PRIN
METODA CU TIOCROM (STANDARD AACC 86-80)...........................................121
7.4. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. B2 (RIBOFLAVINA)............124
7.5. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. PP...........................................126
7.6. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. E.............................................127
7.7. DOZAREA ACIDULUI ASCORBIC DIN MATERIAL VEGETAL PRIN
TITRARE CU 2,6 – DICLORFENOLINDOFENOL (DCFIF).................................128
7.8. DETERMINAREA ACIDULUI ASCORBIC DIN PRODUSE ALIMENTARE
PRIN TITRARE CU 2,6 – DICLORFENOLINDOFENOL (DCFIF)......................130

2
7.9. DETERMINAREA VITAMINEI C PRIN METODA IODOMETRICĂ.........131
VIII. ENZIME.....................................................................................................133
8.1. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASCORBATOXIDAZEI PRIN METODA
OSTROVSKAIA............................................................................................................133
8.2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII PEROXIDAZEI (STANDARD ICC
301/1998).........................................................................................................................135
8.3. DETERMINAREA ACTIVITĂTII CATALAZEI PRIN METODA
TITRIMETRICĂ...........................................................................................................137
8.4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII - ŞI -AMILAZEI DIN ŢESUTURI
VEGETALE...................................................................................................................139
8.5. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII MALTAZEI (MODIFICATĂ).................142
8.6. DETERMINAREA CAPACITĂŢII AMILOLITICE (DUPĂ KLIMOVSKI ŞI
RODZEVICI).................................................................................................................143
8.7. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII LIPAZEI.....................................................144
8.8. DETERMINAREA ACTIVITATII ENZIMELOR PROTEOLITICE
(MODIFICATA)............................................................................................................146
BIBLIOGRAFIE.................................................................................................147

3
 I. OPERAŢIUNI GENERALE DE LABORATOR

Încălzirea este una dintre operaţiunile de bază utilizată pentru a realiza majoritatea reacţiilor
chimice, în scopul accelerării vitezei de reacţie prin creşterea mobilităţii moleculelor reactante.
Se foloseşte la fierberi, topiri, calcinări, evaporări, distilări, cristalizări etc.
Încălzirea substanţelor se poate face în diferite recipiente termorezistente, pe flacără (cu sau
fără sită de azbest), pe reşou sau folosind diferite tipuri de băi (de apă, nisip etc.). Pentru
temperaturi care nu depăşesc 100C se utilizează băile de apă.
Întrucât în timpul încălzirii unele substanţe pot lua foc, se pot descompune sau pot exploda,
trebuie să se cunoacsă proprietăţile substanţelor care sunt supuse acestei operaţiuni.
Dizolvarea este fenomenul prin care ionii sau moleculele unei substanţe, denumită substanţă
solubilă, se răspândesc printre moleculele altei substanţe, denumită solvent (dizolvant), având ca
urmare formarea unui amestec omogen, denumit soluţie. Numărul de particule care se desprind
în unitatea de timp din substanţa solubilă determină viteza de dizolvare, care creşte odată cu
creşterea gradului de mărunţire a substanţei (solide) solubile, cu creşterea temperaturii şi cu
gradul de mişcare a moleculelor.
După natura lor, solvenţii pot fi anorganici (apă, soluţii de acizi, de baze etc.) sau organici
(acetonă, alcooli, benzen, eter, sulfura de carbon, tetraclorura de carbon etc.).
Solubilitatea substanţelor se poate exprima prin coeficientul de solubilitate, care reprezintă
cantitatea maximă de substanţă ce se poate dizolva în 100 g de apă, la temperatura de 15C. În
cazul substanţelor lichide, solubilitatea acestora depinde de natura lor şi de temperatură, iar
solubilitatea gazelor este într-un raport direct proporţional cu presiunea lor şi invers proporţional
cu temperatura.
Precipitarea este operaţiunea prin care, în urma unei reacţii chimice a substanţelor dintr-o
soluţie, se obţine un produs greu solubil numit precipitat, care reprezintă un amestec heterogen
solid-lichid. Precipitatele sunt de mai multe tipuri: amorfe - CaCO3, cristaline - I2Pb, gelatinoase
- Al(OH)3, unele având culori caracteristice: roşu - HgI2, albastru - Cu(OH)2, verde - Ni(OH)2.
Pulverizarea este transformarea unei substanţe solide într-un praf fin prin sfărâmarea
(mărunţirea) acesteia. Această operaţiune, necesară omogenizării sau dizolvării mai rapide a
substanţei, se efectuează cu ajutorul unui mojar cu pistil, care poate fi din porţelan, sticlă groasă
sau agat. Astfel, substanţa destinată pulverizării se introduce într-o cantitate care să ocupe cel
mult 1/3 din capacitatea mojarului, sfărâmându-se, la început, bucăţile mai mari, prin ciocnire
uşoară cu pistilul. Se continuă apoi mojararea prin apăsarea şi mişcarea repetată a pistilului pe
pereţii mojarului.
Un instrument care realizează o mărunţire foarte fină a particulelor este moara cu bile,
formată dintr-o cameră metalică, sferică, având în interior bile de diferite mărimi, confecţionate
dintr-un material foarte dur. Acţionată manual sau electric, acest tip de moară face ca, în final,
din substanţa iniţială să se obţină particule uniforme şi de dimensiuni foarte mici.

4
 II. SEPARAREA ŞI PURIFICAREA SUBSTANŢELOR ORGANICE
Extracţia componentelor dintr-un amestec

După starea de agregare a amestecului, extracţia poate fi realizată din substanţe solide sau
lichide.

Extracţia din substanţe solide

Extracţia din substanţe solide se realizează cu ajutorul unui anumit solvent organic, care
trebuie să asigure o bună solubilitate a substanţei de extras şi să poată fi îndepărtat uşor după
extracţie. În cadrul acestui tip de extracţie, macerarea şi digerarea reprezintă două procedee
folosite curent pentru extracţia compuşilor naturali organici din ţesuturi sau organe vegetale ori
animale.
Macerarea este amestecarea fazei solide cu solventul, urmată de filtrarea suspensiei
rezultate, iar digerarea este o macerare la cald.

Extracţia din substanţe lichide

Extracţia din substanţe lichide are la bază principiul echlibrului heterogen, stabilit prin
repartiţia unei anumite substanţe între două faze lichide, nemiscibile. Concentraţia substanţei,
cantităţile lichidelor, asociaţiile moleculelor din soluţie etc., reprezintă factori de care depinde
raportul cantităţilor de substanţă care se repartizează între cele două lichide.
În acest procedeu, de regulă, una dintre faze este apoasă, iar cealaltă un solvent organic,
extracţia din soluţii apoase putându-se îmbunătăţi prin adăugarea la soluţia apoasă a unui
electrolit (sulfat de amoniu, clorură de sodiu, carbonat de potasiu etc.). Se realizează, astfel, o
micşorare a solubilităţii în apă, atât a substanţei organice, cât şi a solventului.
Pentru o extracţie cât mai eficientă, solventul trebuie să posede unele caracteristici, cum ar
fi: vâscozitate cât mai redusă, uşurinţă şi securitate în manipulare, posibilitatea îndepărtării
uşoare după extracţie etc.
Extracţia prin agitare
Extracţia prin agitare reprezintă metoda de extracţie cea mai des folosită în laboratorul de chimie
organică şi se efectuează cu ajutorul pâlniei de separare (fig. 1).

Fig. 1. Pâlnie de separare

5
 Lichidul care conţine substanţa şi cel care extrage componentul se introduc în pâlnie, căreia i
se aplică un dop, iar robinetul se închide bine. Se agită un anumit timp pentru stabilirea
echilibrului, iar după ce straturile s-au separat, se scoate dopul şi se colectează prin robinet, în
recipiente diferite, fiecare strat constituit. Când nu se reuşeşte extracţia totală a componentul din
faza iniţială, operaţia se poate repeta.
Pentru realizarea unei extracţii eficiente şi în condiţii de securitate trebuie respectate câteva
reguli de lucru, ca de exemplu:
- umplerea pâlniei cu lichide nu va depăşi 3/4 din volum;
- după câteva agitări, pentru egalizarea presiunii din interior cu cea din exterior,
pâlniei (orientată cu dopul în jos) i se deschide pentru scurt timp robinetul;
- durata de agitare a straturilor pentru echilibrare este de 3-5 minute, timp în care se va evita
încălzirea cu mâna a pâlniei de extracţie, dacă aceasta conţine solvenţi volatili (eter etilic, eter de
petrol etc.);
- în cazul formării emulsiilor, se vor efectua mişcări circulare ale pâlniei în plan orizontal, se
va încălzi uşor soluţia sau se vor adăuga lichide care modifică tensiunea superficială (alcool,
benzen), pH-ul, ori se va recurge la centrifugare sau filtrare peste cărbune absorbant;
- la extracţiile din faza apoasă, eliminarea apei din solventul organic (care conţine substanţa
extrasă) se face prin spălarea acestuia cu o soluţie saturată de clorură de sodiu, iar pentru
anhidrificarea finală se folosesc săruri anorganice anhidre;
- se va evita efectuarea de extracţii cu solvenţi inflamabili în apropierea surselor de căldură.

Distilarea
Distilarea este întrebuinţată pentru separarea unei substanţe lichide de substanţele străine
dizolvate în ea şi constă în transformarea lichidului în vapori, urmată de condensarea acestora
prin răcire.
Există o serie de factori de care depinde eficienţa unei distilări, dintre care menţionăm ca
mai importanţi: diferenţa presiunilor de vapori a componentelor lichidului, posibilitatea formării
unor amestecuri azeotrope şi volumul probei de distilat.

Distilarea simplă
Distilarea simplă se utilizează când lichidul de distilat conţine o singură componentă volatilă
care trebuie purificată sau pentru a separa, dintr-o soluţie, un solvent de o substanţă nevolatilă.
În fig. 2 este redată, după Beschea şi Toma (1984), instalaţia necesară acestui tip de distilare.

6
 Fig. 2. Instalaţie pentru distilare la presiune atmosferică a lichidelor cu puncte de
fierbere sub 100C

Părţile componente ale instalaţiei de distilare sunt:

a) sursa de încălzire, reprezentată de baie de apă, pentru lichide care fierb până la aprox.
80C sau baie de aer, de nisip, de ulei, bec de gaz cu sită de azbest etc.,
pentru temperaturi peste 80C;
b) balonul Würtz, prin al cărui dop trece un termometru, cu rezervorul de mercur situat cu
cca. 0,5 cm mai jos decât nivelul tubului lateral al balonului;
c) sistemul de răcire, care, în funcţie de temperatura vaporilor, poate fi un refrigerent Liebig
descendent, pentru lichide cu p.f.  120-130C sau un refrigerent cu aer descendent, pentru
lichide cu p.f.130-140C;
d) vasul de colectare a distilatului, care poate fi un pahar, în cazul lichidelor neinflamabile şi
nevolatile, sau un balon cu şlif, în cazul lichidelor toxice sau volatile. Balonul cu şlif, fixat la
capătul refrigerentului printr-o alonje prevăzută cu şlifuri, are un tub lateral care se poate
prelungi şi prin care vaporii volatili sau toxici sunt evacuaţi la nişă sau la canalul de curgere a
apei. În locul balonului cu şlif se poate folosi un flacon conic de vid.
Mod de lucru. Balonul de distilare se umple până la, cel mult, 2/3 din volumul său, iar în
interior se introduc cîteva bucăţi de porţelan poros, pentru o fierbere uniformă şi evitarea
supraîncălzirilor. În funcţie de natura lichidului, balonul se încălzeşte pe baie (de apă, aer, nisip,
ulei etc.) în aşa fel ca distilarea să se desfăşoare lent, permiţând astfel (cu ajutorul termometrului)
o apreciere corectă a temperaturii reale de fierbere. Colectarea distilatului pur are loc când
temperatura de distilare este constantă.

7
 Distilarea în vid
Distilarea în vid este un procedeu utilizat pentru distilarea substanţelor cu puncte de fierbere
prea ridicate, precum şi a substanţelor care se descompun la temperatura de fierbere la presiune
atmosferică. În anumite condiţii, determinate de componenţa amestecului ce urmează a fi
purificat, se efectuează şi distilare fracţionată în vid, prin intercalarea, între balon şi refrigerent, a
unei coloane de fracţionare.
Pentru distilarea în vid şi evaporarea în vid a lichidelor care produc spumă, respectiv pentru
evaporarea solvenţilor volatili din soluţii ale unor compuşi nevolatili se utilizează instalaţii
speciale, respectiv rotaevaporatoare, reproduse, în continuare, după Beschea şi Toma (1984).
La distilarea în vid, ca surse de încălzire se folosesc băile de ulei sau de parafină, iar balonul
de distilare este de tip Claisen (a), prevăzut cu două gâturi, în care se montează o capilară de
sticlă (b), respectiv un termometru (c) şi cu un tub lateral (d) la care se adaptează un recipient
colector obişnuit (e) sau de tip Wurtz (fig. 3).

Fig. 3. Instalaţie pentru distilare în vid

Vaporii ce pătrund în recipientul colector se pot condensa prin răcirea directă cu apă a
acestuia (aşa cum se observă în figura de mai jos) sau se pot condensa într-un refrigerent
intercalat între balonul Claisen şi vasul colector. Capilara de sticlă are rolul de uniformiza
fierberea, prin formarea unui flux continuu de bule mici de aer sau azot. Termometrul se aşează
cu rezervorul în calea vaporilor care părăsesc balonul Claisen.
Sursa de vid o constituie, de cele mai multe ori, trompa de apă (f), legată etanş de recipientul
colector printr-un sistem de tuburi, care are intercalat un vas de siguranţă şi un vacuummetru (g),
pentru controlul vidului din instalaţie. Trompa de apă necesită o presiune mare şi constanţă a
apei (cca. 4 atm.), utilizarea ei fiind limitată de tensiunea de vapori a apei: 19 mm Hg (apă de
20C), 14 mm Hg (apă de 15C) şi 10 mm Hg (apă de 10C). Un vid mai accentuat se poate
realiza prin folosirea pompelor rotative cu ulei.
Mod de lucru. După ce se asigură (cu unsoare de silicon) şi se verifică (cu vacuummetru)
etanşeitatea instalaţiei, se reglează debitul de gaz al capilarei, apoi se începe încălzirea balonului.
8
Prima dată se colectează fracţiunile volatile, iar când temperatura de distilare la presiunea
respectivă rămâne constantă se colectează produsul principal al distilării. Temperatura băii de
încălzire trebuie menţinută cu 5-10 peste temperatura de distilare, pentru a asigura un ritm
constant procesului.
Schimbarea balonului de colectare se poate face fără întreruperea vidului în instalaţie, prin
folosirea piesei de legătură numită “păianjen”, care se poate roti în şliful superior.
Pentru evaporarea în vid a lichidelor ce produc spumă se foloseşte o instalaţie care permite o
alimentare intermitentă, în cantităţi foarte mici (fig. 4).

Fig. 4. Instalaţie pentru evaporarea în vid a lichidelor care spumează

Pentru a opri distilarea, se execută, în ordine, următoarele operaţiuni: se îndepărtează sursa

de încălzire, se închide robinetul vacuumului, se deschide clema Hofmann a capilarei, se face
legătura cu presiunea atmosferică prin robinetul instalaţiei şi se întrerupe pompa de vid.
Evaporarea solvenţilor volatili din soluţii ale unor compuşi nevolatili se poate face cu
evaporatorul rotativ, denumit şi rotaevaporator (fig. 5).

Fig. 5. Evaporator rotativ

9
 Acest aparat are în componenţă un ax tubular inclinat (rotit de un motor), la care sunt ataşate
următoarele piese: balonul cu soluţie, refrigerentul şi recipientul pentru produsul distilat. Rotirea
axului asigură repartiţia uniformă a unei pelicule subţiri de lichid pe întreaga suprafaţă interioară
a balonului, împiedicând, astfel, spumările şi favorizând o evaporare foarte rapidă.

Distilarea fracţionată
Distilarea fracţionată serveşte la separarea în componente lichide pure a unor amestecuri
zeotrope (care au temperaturile de fierbere cuprinse între temperaturile de fierbere ale
componentelor pure) şi se realizează prin distilări şi redistilări ale produşilor obţinuţi. Acest tip
de distilare necesită prezenţa coloanelor de fracţionare, cu ajutorul cărora se poate realiza un
anumit număr de distilări simple, în funcţie de eficienţa coloanei respective într-o singură
operaţie.
Aparatura pentru distilarea fracţionată diferă de cea folosită la distilarea simplă doar prin
prezenţa unei coloane de fracţionare, fixată între gâtul balonului de distilare şi refrigerent (fig. 6,
după Beschea şi Toma, 1984).

Fig. 6. Tipuri de coloane de fracţionare

Modul de lucru este asemănător celui de la distilarea simplă, astfel că odată cu creşterea şi
stabilizarea temperaturii la o anumită valoare se colectează fracţiunea intermediară
corespunzătoare, după care urmează altă fracţiune, corespunzătoare unei temperaturi superioare
ş.a.m.d.

Distilarea (antrenarea) cu vapori de apă

Distilarea cu vapori de apă realizează separarea componentelor dintr-un amestec prin
antrenarea unei substanţe (din amestec) cu vapori de apă. Operaţia se mai practică şi pentru
purificarea unor substanţe, care nu pot fi distilate fără a se descompune la presiunea atmosferică.
În cazul unor amestecuri nemiscibile (anilină-apă, benzaldehidă-apă, benzen-apă etc.)
tensiunile de vapori ale componentelor sunt independente una faţă de alta, iar temperatura de
fierbere a amestecului este inferioară temperaturii de fierbere a celei mai volatile componente.

10
Aceste caracteristici permit distilarea lichidelor nemiscibile cu apa la temperaturi cu mult mai
scăzute decât temperatura lor de fierbere. De exemplu, amestecul de apă (p.f.=100C) şi benzen
(p.f.=80C) fierbe la 70C.
Aparatura pentru acest tip de distilare, reprodusă după Beschea şi Toma (1984) în fig. 7, este
formată din 5 componente: generatorul de vapori, dispozitivul de antrenare cu vapori de apă,
balonul cu fund rotund cu substanţa de separat, refrigerentul Liebig (care condensează amestecul
de vapori de apă şi substanţa antrenată) şi vasul de colectare (Erlenmeyer sau Berzelius).

Fig. 7. Instalaţie pentru distilare cu vapori de apă:

1) generatorul de vapori; 2) dispozitivul de antrenare cu vapori de apă; 3) balonul cu fund
rotund în care se introduce substanţa de separat; 4) refrigerentul Liebig (descendent), care
condensează amestecul de vapori de apă şi substanţa care se antrenează; 5) vas de
colectare (Erlenmeyer sau Berzelius).

Mod de lucru. Amestecul pentru distilarea cu vapori de apă se introduce în balonul de

antrenare, apoi se începe încălzirea generatorului, cu legătura desfăcută între generator şi balonul
de antrenare. Când apa din generator a ajuns la fierbere, se închide legătura dintre generator şi
balonul de antrenare. Acesta din urmă trebuie şi el încălzit uşor, pentru ca vaporii proveniţi de la
generator să nu se condenseze în lichidul rece din balon. Cînd distilatul începe să treacă în
refrigerent încălzirea balonului se opreşte, iar distilarea se continuă pînă când distilatul nu mai
curge sub formă de emulsie sau nu mai antrenează particule de suprafaţă. La terminarea distilării
se desface legătura dintre generator şi balonul de antrenare şi se opreşte încălzirea. Dacă în vasul
de colectare se obţine un amestec sub formă de emulsie, separarea componentelor se poate face
prin extracţie cu un solvent organic sau prin adăugarea unui electrolit.

Cromatografia
Cromatografia cuprinde un grup de metode prin care se poate realiza separarea substanţelor
dintr-un amestec, pe baza capacităţii de distribuire a componentelor între o fază staţionară şi una
mobilă.

11
 Utilizate mai frecvent în laboratoarele de biochimie, metodele cromatografice sunt
clasificate în raport cu starea de agregare a fazei staţionare şi mobile, precum şi după absorbţia
sau repartiţia între două faze nemiscibile în: cromatografia de lichide şi cromatografia în faza
gazoasă, ambele incluzând unele tehnici de mare precizie.

12
 III. ZAHARURI
3.1. DIFERENŢIEREA CETOZELOR DE ALDOZE
Reacţia Selivanoff. Sub acţiunea acizilor minerali tari, cetozele sunt transformate cu o
viteză mult mai mare decât aldozele în furfurol sau derivaţii săi, care, în reacţie cu rezorcina,
formează un complex colorat. Concret, fructoza (cetoză), tratată, în mediu acid, cu rezorcină dă
o culoare roşie care apare repede, iar glucoza (aldoză) dă o coloraţie slab-roză, care apare foarte
greu.

HO OH HO OH HO O OH
HCl
+ H
-2 H2O
CHO C
Rezorcinã Rezorcinã
O O

R R
R-furfurol Produs intermediar

HO O O
-H2O
+ 1/2 O2 C

R
Compus colorat

Reactivi
1. Reactiv Selivanoff (0,1 g rezorcină + 50 ml acid clorhidric concentrat + 50 ml apă
distilată)
2. Soluţie de glucoză 1 %
3. Soluţie de fructoză 1 %
Mod de lucru. Se pregătesc două eprubete curate şi în fiecare se introduc câte 1 ml soluţie
de glucoză 1%, respectiv fructoză 1 %. Apoi, se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv
Selivanoff, se agită şi se menţin într-o baie de apă la fierbere. Proba cu fructoză se va colora în
roşu, în scurt timp (după cca.1-3 minute), iar cea cu glucoză în slab roz, într-un interval de timp
mult mai mare.

13
 3.2. IDENTIFICAREA PENTOZELOR

Reacţia Bial. Pentozele reacţionează cu o soluţie clorhidrică de orcină (5-metil-rezorcină)

dând un compus colorat în violet. În cazul hexozelor, apare o coloraţie portocalie-brună.
Reactivi.
1. Reactiv Bial (0,1 g orcină + 50 ml acid clorhidric concentrat)
2. Soluţii 1 % de pentoze (arabinoză, riboză, xiloză) şi hexoze (glucoză, galactoză,
fructoză etc.)
Mod de lucru. În eprubete separate se prepară un amestec format din câte 1 ml soluţie de
pentoză, respectiv hexoză şi câte 1 ml reactiv Bial. Eprubetele se introduc apoi într-o baie de apă
la fierbere şi se menţin câteva minute, timp în care vor apare coloraţiile corespunzătoare
compuşilor formaţi între pentoze, respectiv hexoze şi reactivul menţionat.
Reacţia Pierre-Thomas. În mediu acid, pentozele (de fapt produsul de ciclizare al
acestora- fufurolul) formează cu -naftolul, în soluţie de acid sulfuric, un produs de condensare
colorat în albastru. Cu acelaşi reactiv, în aceleaşi condiţii, hexozele dau o coloraţie brună.
Reactivi
1. Soluţie de -naftol 1 % în acid sulfuric concentrat
2. Soluţii 1 % de pentoze (arabinoză, riboză, xiloză) şi hexoze (glucoză, galactoză,
fructoză etc.)
Mod de lucru. În eprubete separate se introduc câte 1 ml soluţie de pentoză, respectiv
hexoză şi uşor, într-un strat subţire pe pereţii eprubetelor, câte 1 ml soluţie de -naftol 1 % în
acid sulfuric concentrat. La limita de separaţie a celor două straturi va apare câte un inel colarat
diferit (albastru – pentoze şi brun  hexoze).
Reacţia Tollens. Cu soluţia alcoolică de floroglucină (reactiv Tollens), în mediu acid,
pentozele formează un complex de culoare roşie.
Reactivi
1. Reactiv Tollens (soluţie 3 % de florogucină în alcool 96 %)
2. Acid clorhidric concentrat
3. Soluţii 1 % de pentoze (arabinoză, riboză, xiloză)
Mod de lucru. Într-o eprubetă se face un amestec din 1 ml soluţie de pentoză, 2-3 picături
reactiv Tollens şi 1 ml acid clorhidric concentrat, apoi se încălzeşze pe baia de apă la fierbere sau
pe flacără. Se va obţine un compus de culoare roşu sau roz.

14
 3.3. REACŢII DE EVIDENŢIERE A CARACTERULUI REDUCĂTOR AL
GLUCIDELOR (ZAHARURILOR)

Reducerea sărurilor de cupru

Reacţia Fehling. Glucidele reducătoare reduc cuprul bivalent, din sărurile cuprice, la
cupru monovalent. Astfel, hidroxidul cupric albastru din soluţia Fehling (care este un amestec de
sulfat de cupru şi soluţie alcalină de tartrat de sodiu şi potasiu) este redus de către monoglucide
la oxid cupros, care se prezintă sub forma unui precipitat de culoare roşie. Etapele reacţiei
Fehling (care au fost redate şi la funcţiunea carbonil) sunt următoarele:

2NaOH + CuSO4 Cu (OH)2 + Na2SO4

O COO 2Na+
COOK C=O OCH
Cu (OH)2 + 2CHOH HCOH Cu HCOH + 2H2O
CHOH HCO O=C
COONa COO O 2K+

(Tartrat de Na şi K) (Complex cupro-tartric)

CHO + 2Cu (OH)2 COOH + 2 CuOH + H2O

 
(CHOH)n (CHOH)n
 
CH2OH CH2OH

Aldoză Acid aldonic

2 CuOH Cu2O + H2O

Reactivi
1. Reactiv Fehling I (35 g sulfat de cupru pentahidrat + 500 ml apă distilată)
2. Reactiv Fehling II (175 g tartrat dublu de sodiu şi potasiu + 50 g hidroxid de sodiu +
500 ml apă distilată)
3. Soluţie de glucoză 1 %
4. Soluţie de fructoză 1 %
5. Soluţie de zaharoză 1 %
Mod de lucru. Se amestecă volume egale din reactivii Fehling I şi II pentru a prepara o
mică cantitate de soluţie cupro-tartrică Fehling, din care se ia câte 2 ml şi se repartizează în trei
eprubete diferite. În prima eprubetă se adaugă 1 ml soluţie de glucoză, în cea de-a doua 1 ml
soluţie de fructoză, iar în a treia 1 ml soluţie de zaharoză, după care eprubetele se încălzesc la
fierbere, pe baia de apă, până la apariţia unui precipitat roşu de oxid cupros.

15
 În eprubeta care conţine zaharoză nu se va obţine precipitatul de oxid cupros pentru că
zaharoza este un diglucid nereducător.
În cazul în care cantitatea de glucid este în exces culoarea precipitatului nu va mai fi roşie
ci galben-brună.
Reacţia Trommer. Această reacţie, care decurge fără formarea complexului cupro-tartric,
are la bază acţiunea directă a glucidului reducător asupra hidroxidului cupric.
Reactivi
1. Sulfat de cupru pentahidrat 8 %
2. Hidroxid de sodiu 8 %
3. Soluţie 1 % de glucoză sau alt glucid reducător
Mod de lucru. Într-o eprubetă se face un amestec din 3 ml glucoză şi 3 ml hidroxid de
sodiu, peste care se adaugă, cu picătura, soluţia de sulfat de cupru care duce până la apariţia unui
precipitat. După aceea, eprubeta se încălzeşte pe baia de apă la fierbere, până ce culoarea
precipitatului se schimbă în roşu datorită formării oxidului cupros.
Reacţia Benedict. Reacţia Benedict are la bază tot reducerea cuprului ca şi reacţia
Fehling, fiind o variantă a acesteia din urmă.
Mod de lucru. Mai întâi se prepară reactivul Benedict, compus din două soluţii care se
combină: a) 5,1 g sulfat de cupru pentahidrat + 60 ml apă distilată; b) 51 g citrat de sodiu + 30 g
carbonat de sodiu anhidru + 240 ml apă distilată.
Într-o eprubetă, peste 2 ml reactiv Benedict se pun 3 picături din soluţia de glucid şi
amestecul se încălzeşte cca. 5 minute pe baia de apă la fierbere. Prezenţa şi cantitatea
aproximativă a glucidului reducător va fi evidenţiată prin apariţia unui precipitat de o anumită
culoare.
Astfel, în cazul glucozei, un precipitat redus cantitativ, de culoare verde, va indica o
cantitate de până la 1 g de glucoză, în timp ce un precipitat de culoare galbenă va indica între 10
şi 25 g de glucoză, iar unul de culoare roşie peste 25 g.
Readucerea sărurilor de argint
Reacţia Tollens. Glucidele reducătoare reducător reacţivul Tollens (hidroxidul
diamoniaco-argentic) la argint metalic:

2AgNO3 + 2NaOH Ag 2O + 2NaNO3 + H2O

Ag 2O + 4NH4OH 2Ag (NH3)2OH + 3H2O

(reactiv Tollens)

CHO + 2Ag (NH3)2OH COOH + 2Ag + 4 NH3 + H2O

 
(CHOH)n (CHOH)n
 
CH2OH CH2OH

Aldoză Reactiv Tollens Acid aldonic

16
 Reactivi
1. Soluţie de azotat de argint 10 %
2. Soluţie de hidroxid de sodiu 10 %
3. Soluţie de hidroxid de amoniu 25 %
4. Soluţie 1 % de glucoză sau alt glucid reducător
Mod de lucru. 1 ml azotat de argint 10 % se tratează cu 1 ml hidroxid de sodiu 10 %,
peste care se picură hidroxid de amoniu până la dizolvarea completă a precipitatului de oxid de
argint din prima etapă a reacţiei, cu formarea hidroxidului diamoniaco-argentic. Se ia, apoi, 1 ml
din produsul de reacţie, se introduce în altă eprubetă şi se diluează cu o cantitate egală de apă
distilată (1 ml), după care se adaugă 1 ml soluţie 1 % de glucid reducător. După menţinerea pe
baia de apă timp de câteva minute la 50-60C, se observă depunerea argintului metalic sub forma
unei oglinzi pe pereţii eprubetei.

17
 3.4. DOZAREA ZAHARURILOR REDUCĂTOARE
3.4.1. Metoda Schoorl
Principiul metodei
Zaharurile reducătoare reduc la cald soluţia alcalină cupro-tartrică (reactiv Fehling) la
Cu2O, care este determinat cantitativ indirect prin dozarea iodometrică a sulfatului de cupru
existent în soluţia Fehling, înainte şi după reducere. Diferenţa obţinută reprezintă cantitatea de
cupru redusă de către zahăr.
În continuare sunt redate reacţiile chimice care stau la baza acestei determinări:
CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4
2Cu(OH)2 + RCHO (glucid reducător) = RCOOH (acid aldonic) + Cu2O + H2O
2CuSO4 + 4KI = 2CuI + 2K2SO4 + I2
I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6
Reactivi
1. Soluţie cuprică (Fehling I): 69,2 g sulfat de cupru cristalizat (CuSO4.5H2O) la 1 litru.
2. Soluţie sodică (Fehling II): 340 g tartrat dublu de sodiu şi potasiu (sare Siegnette) + 100 g
hidroxid de sodiu la 1 litru.
3. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N
4. Iodură de potasiu cu concentraţia de 10%.
5. Acid sulfuric concentrat (d=1,11).
6. Soluţie de amidon solubil 1%.
7. Soluţie de acetat bazic de plumb şi acid acetic glacial (2/1). Acetatul bazic de plumb se
prepară astfel: 60 g acetat de plumb se mojarează cu 20 g litargă (PbO), apoi amestecul se
încălzeşte pe baia de apă, într-o capsulă de porţelan acoperită cu o sticlă de ceas pînă ce masa
capătă o culoare alb-roz. Se adaugă 200 ml de apă distilată fierbinte, trecînd totul într-un balon
cotat de 250 ml. După răcire se aduce la semn cu apă distilată şi se lasă în repaus 10-12 ore, apoi
se filtrează în flacoane de culoare brună, care se închid ermetic întrucât în contact cu aerul
soluţia se tulbură.
8. Soluţie saturată de sulfat de sodiu.
Modul de lucru
Determinarea cuprinde trei operaţii: a) extragerea glucidelor din produsul respectiv cu
ajutorul apei; b) purificarea extractului vegetal (defecarea) şi c) dozarea glucidelor reducătoare în
extractul defecat.
a) Extracţia. O cantitate de 5-25 g (în funcţie de conţinutul presupus de glucide) din
materialul vegetal, uniform omogenizat, se introduce într-un flacon conic cu capacitatea de 150-
200 ml. Se adaugă 70-80 ml apă distilată încălzită la 85-90C, apoi proba se introduce într-o baie
de apă, iar din momentul când apa începe să fiarbă se ţine 30 de minute, agitând cu intermitenţă.
Extractul se filtrează într-un balon cotat de 100 ml şi se spală cu apă distilată fierbinte (cu câte 5
ml), atât materialul vegetal din flacon cât şi filtrul,
b) Defecarea extractului glucidic. În extractul obţinut vor exista şi substanţe reducătoare
de altă natură, cum ar fi poliglucide, dar mai ales protide. Din această cauză, este necesară

18
defecarea extractelor glucidice în vederea purificării lor. Astfel, la filtratul fierbinte din balonul
cotat se adaugă soluţia de acetat bazic de plumb şi acid acetic, picătură cu picătură până când nu
mai are loc nici o precipitare şi se agită energic. Se lasă în repaus pentru sedimentarea
precipitatului format. După 10-15 minute se controlează dacă defecarea materialului este
completă, adăugându-se la extract 2-3 picături de soluţie de acetat şi acid acetic. Dacă soluţia nu
devine opalescentă, precipitarea este completă. Conţinutul balonului cotat se răceşte şi se
completează la semn cu apă distilată. Apoi se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează într-un
pahar sau un flacon uscat. O cantitate de 50 ml filtrat se trece într-un balon cotat de 100 ml şi se
adaugă 3-5 ml soluţie saturată de sulfat de sodiu pentru îndepărtarea acetatului de plumb rămas
în exces. Conţinutul balonului se completează la semn cu apă distilată şi se agită. După
depunerea precipitatului, soluţia se filtrează, iar din filtratul obţinut se dozează glucidele
reducătoare.
Observaţie. Pentru dozarea zaharurilor reducătoare din carne se omogenizează 20 g carne
cu 50 ml apă distilată. Se precipită proteinele cu acid percloric sau tricloracetic şi se aduce la 100
ml cu apă distilată. Se centrifughează şi din supernatant se iau 20 ml, care se folosesc la dozare.
c) Dozarea glucidelor reducătoare. Într-un vas Erlenmeyer de 300 ml se introduc 20 ml
din extractul defecat (sau o soluţie de analizat cu un conţinut de cca. 1% glucide), apoi 10 ml
soluţie Fehling I şi 10 ml soluţie Fehling II. Vasul se încălzeşte pe o sită de azbest, reglând
flacăra astfel ca să se ajungă la fierbere în 3 minute, iar durata fierberii să fie exact de 2 minute.
Se răceşte repede vasul la curent de apă, după care se adaugă 20 ml soluţie de iodură de potasiu
şi 15 ml acid sulfuric.
Se titrează iodul eliberat cu tiosulfat de sodiu 0,1 N, în prezenţa amidonului ca indicator.
Soluţia de amidon (cca. 5 ml) se adaugă către sfârşitul titrării, atunci când soluţia are culoarea
galbenă-pal. Titrarea se continuă până când dispare culoarea albastră datorită prezenţei iodului.
În paralel se execută o probă martor, în aceleaşi condiţii, cu diferenţa că în locul probei
de analizat (20 ml extract) se introduce aceeaşi cantitate de apă distilată.
Calculul rezultatelor. Cantitatea de cupru redusă de către zahăr se determină în funcţie de
cantitatea de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosită la titrare, pe baza relaţiei: V = V1 – V2, unde V1 =
volumul de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrarea probei martor (în ml), iar V2 = volumul de
tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrarea probei de analizat (în ml). Se caută apoi în tabelul
Schoorl mg de zahăr invertit corespunzătoare valorii lui V. În final se află valoarea zahărului
reducător din proba analizată pe baza relaţiei:
g % zahăr reducător = (z • d) • 100 unde:
g
z = cantitatea de zahăr invertit din tabele corespunzătoare pentru V ml Na2S2O3 0,1 N
(mg se transformă în g);
d = cifra diluţiei;
g = greutatea probei analizate în g.
Observaţie. Când dozarea zaharurilor reducătoare se face dintr-un extract gata defecat sau
dintr-o soluţie (fără a se cunoaşte masa probei), formula de mai sus devine: g % = z.100.100/20.

19
 Tabelul Schoorl
Cantitatea de zahăr invertit corespunzătoare soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N
Tiosulfat de sodiu Cupru (mg) Glucoză (mg) Zahăr invertit (mg)
0,1 N (ml)
1 6,4 3,2 3,2
2 12,7 6,3 6,4
3 19,1 9,4 9,7
4 25,4 12,6 13,0
5 31,8 15,9 16,4
6 38,2 19,2 19,8
7 44,5 22,4 23,2
8 50,9 25,6 26,0
9 57,3 28,9 29,9
10 63,6 32,3 33,4
11 70,0 35,7 36,8
12 76,3 39,0 40,3
13 82,7 42,4 43,8
14 89,1 45,8 47,3
15 95,4 49,3 50,8
16 101,8 53,8 54,3
17 108,1 56,3 58,0
18 114,4 59,8 61,8
19 120,8 63,3 65,5
20 127,2 66,9 69,4
21 133,5 70,7 73,3
22 139,8 74,5 77,2
23 146,2 78,5 81,2
24 152,6 82,6 85,2
25 159,0 86,6 89,2

20
 3.4.2. Metoda Bertrand

Principiul metodei
Extractul vegetal se tratează cu un exces de soluţie alcalină cupro-tartrică, având ca
rezultat precipitarea oxidului cupros (Cu2O) la fierbere, în urma reducerii care a avut loc.
Precipitatul de oxid cupros se filtrează, se spală, apoi se dizolvă într-o soluţie ferică
(sulfat feric în acid sulfuric). În urma oxidării oxidului cupros, se formează o cantitate
echivalentă de sulfat feros, care se titrează cu o soluţie de permanganat de potasiu. Reacţiile
chimice care stau la baza acestei determinări sunt următoarele:
2Cu(OH)2 + RCHO (glucid reducător) = RCOOH (acid aldonic) + Cu2O + H2O
Cu2O + H2SO4 + Fe2(SO4)3 = 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4
2KMnO4 + 3H2SO4 = 2 MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5O
10 FeSO4 + 5O + 5H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + 5 H2O
Deoarece prima reacţie nu este strict stoechiometrică, nu se poate determina prin calcul
cantitatea de zahăr corespunzătoare oxidului cupros, folosindu-se tabele în care datele au fost
stabilite empiric. Acest fapt implică respectarea întocmai a condiţiilor de lucru.
Reactivi
1. Soluţie cuprică (Fehling I): 69,2 g sulfat de cupru cristalizat (CuSO4 . 5H2O) la 1 litru.
2. Soluţie sodică (Fehling II): 340 g tartrat dublu de sodiu şi potasiu (sare Siegnette) + 100 g
hidroxid de sodiu la 1 litru.
3. Soluţie ferică: 50 g sulfat feric se dizolvă în 500 ml apă distilată fierbinte. După răcire, se
adaugă 200 g acid sulfuric 96%, se răceşte din nou şi se aduce cu apă distilată la 1000 ml..
4. Soluţie de permanganat de potasiu 0,1 N.
5. Soluţie de acetat bazic de plumb şi acid acetic glacial (2/1). Acetatul bazic de plumb se
prepară astfel: 60 g acetat de plumb se mojarează cu 20 g litargă (PbO), apoi amestecul se
încălzeşte pe baia de apă, într-o capsulă de porţelan acoperită cu o sticlă de ceas pînă ce masa
capătă o culoare alb-roz. Se adaugă 200 ml de apă distilată fierbinte, trecînd totul într-un balon
cotat de 250 ml. După răcire se aduce la semn cu apă distilată şi se lasă în repaus 10-12 ore, apoi
se filtrează în flacoane de culoare brună, care se închid ermetic întrucât în contact cu aerul
soluţia se tulbură.
6. Soluţie saturată de sulfat de sodiu.
Modul de lucru.
Determinarea cuprinde trei operaţii: a) extragerea glucidelor din produsul respectiv cu
ajutorul apei; b) purificarea extractului vegetal (defecarea) şi c) dozarea glucidelor reducătoare în
extractul defecat.
a) Extracţia. O cantitate de 5-25 g (în funcţie de conţinutul presupus de glucide) din
materialul vegetal, uniform omogenizat, se introduce într-un flacon conic cu capacitatea de 150-
200 ml. Se adaugă 70-80 ml apă distilată încălzită la 85-90C, apoi proba se introduce într-o baie
de apă, iar din momentul când apa începe să fiarbă se ţine 30 de minute, agitând cu intermitenţă.

21
Extractul se filtrează într-un balon cotat de 100 ml şi se spală cu apă distilată fierbinte (cu câte 5
ml), atât materialul vegetal din flacon cât şi filtrul.
b) Defecarea extractului glucidic. În extractul obţinut vor exista şi substanţe reducătoare
de altă natură, cum ar fi poliglucide, dar mai ales protide. Din această cauză, este necesară
defecarea extractelor glucidice în vederea purificării lor. Astfel, la filtratul fierbinte din balonul
cotat se adaugă soluţia de acetat bazic de plumb şi acid acetic, picătură cu picătură până când nu
mai are loc nici o precipitare şi se agită energic. Se lasă în repaus pentru sedimentarea
precipitatului format. După 10-15 minute se controlează dacă defecarea materialului este
completă, adăugându-se la extract 2-3 picături de soluţie de acetat şi acid acetic. Dacă soluţia nu
devine opalescentă, precipitarea este completă. Conţinutul balonului cotat se răceşte şi se
completează la semn cu apă distilată. Apoi se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează într-un
pahar sau un flacon uscat. O cantitate de 50 ml filtrat se trece într-un balon cotat de 100 ml şi se
adaugă 3-5 ml soluţie saturată de sulfat de sodiu pentru îndepărtarea acetatului de plumb rămas
în exces. Conţinutul balonului se completează la semn cu apă distilată şi se agită. După
depunerea precipitatului, soluţia se filtrează, iar din filtratul obţinut se dozează glucidele
reducătoare.
c) Dozarea glucidelor reducătoare. Într-un vas conic se iau 20 ml soluţie Fehling I şi 20
ml soluţie Fehling II şi se încălzesc. Cînd conţinutul a ajuns la fierbere se adaugă 20 ml extract
defecat şi se fierbe exact 3 minute. Se lasă să se depună oxidul cupros, iar decantatul se filtrează
la trompă printr-un filtru de sticlă cu placă filtrantă 3 G4. După ce s-a separat prin decantare tot
lichidul, se spală precipitatul de 2 ori cu apă distilată fiartă, care, de asemenea, se filtrează. Se
goleşte vasul de trompă şi se spală bine cu apă, apoi se clăteşte cu apă distilată şi se adaptează
filtrul la vasul de trompă.
Peste precipitatul de oxid cupros din vasul conic se adaugă, imediat după spălare, 20-30
ml soluţie ferică pentru dizolvare, obţinându-se o soluţie limpede colorată în verde. Se trece
această soluţie pe filtru ca să dizolve precipitatul antrenat prin decantare şi se mai adaugă puţină
soluţie ferică. Se spală paharul şi filtrul cu apă distilată fiartă. Se decuplează vasul de trompă şi
se titrează la rece cu permanganat de potasiu, până când o picătură de permanganat în exces
colorează lichidul în roz.
Calculul rezultatelor
La 1 ml KMnO4 0,1 N corespund 6,357 mg cupru, iar mg Cu = V. 6,357, în care: V =
volumul de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrare, în ml. Se caută apoi în tabelul
Bertrand cantitatea de zahăr invertit (z), corespunzătoare cantităţii de cupru determinată după
calculul de mai sus.
g % zahăr reducător = (z • d) • 100 unde:
g
z = cantitatea corespunzătoare de zahăr invertit găsită în tabel (mg se transformă în g);
d = cifra diluţiei;
g = greutatea probei analizate în g.

22
 Tabelul Bertrand
Cantitatea de zahăr invertit corespunzătoare cuprului
Cu (mg) Zahar invertit Cu (mg) Zahar invertit Cu (mg) Zahar invertit
(mg) (mg) (mg)
20,6 10 79,5 41 132,4 72
22,6 11 81,2 42 134,8 73
24,6 12 83,0 43 135,6 74
26,5 13 84,0 44 137,2 75
28,5 14 86,5 45 138,9 76
30,5 15 88,3 46 140,5 77
32,5 16 90,1 47 142,1 78
34,5 17 91,9 48 143,7 79
36,4 18 92,6 49 145,5 80
38,4 19 95,4 50 146,9 81
40,4 20 97,1 51 148,5 82
42,8 21 98,8 52 150,0 83
44,2 22 100,5 53 151,6 84
46,3 23 102,3 54 153,2 85
48,0 24 104,0 55 154,8 86
49,8 25 105,7 56 156,4 87
51,7 26 107,4 57 157,9 88
53,6 27 109,0 58 159,5 89
55,5 28 110,9 59 160,6 90
57,4 29 112,6 60 161,1 91
59,3 30 114,3 61 164,2 92
61,6 31 115,9 62 165,7 93
63,0 32 117,6 63 167,5 94
64,8 33 119,2 64 168,8 95
66,7 34 120,9 65 170,5 96
68,5 35 122,6 66 171,9 97
70,5 36 124,2 67 173,4 98
72,2 37 125,9 68 175,0 99
74,0 38 126,5 69 176,5 100
75,9 39 129,2 70 - -
77,7 40 130,8 71 - -

23
 3.4.3. Determinarea zahărului total (STAS 1227-67)
Metoda Bertrand (metodă de litigiu)

Reactivi:
- Acid clorhidric 20 %.
- Acid sulfuric 25 %:
- Hidroxid de sodiu, soluţie 1,25 %.
- Permangannt de potasiu, soluţie 0,1 N.
- Carbonat de sodiu anhidru.
- Hârtie de turnesol.
- Ferocianură de potasiu, soluţie 10 %.
- Sulfat de zinc, soluţie 15 %.
- Soluţie cuprică.
- Soluţie sodică.
- Soluţie ferică.
Prepararea reactivilor necesari pentru determinarea zahărului total
- Ferocianură de potasiu, soluţie 10 %: 100 g K4[Fe(CN)6] · 3 H2O se dizolvă şi se aduce la 1000
cm3, cu apă distilată.
- Sulfat de zinc, soluţie 15 %: 150 g ZnSO4 · 7H2O se dizolvă şi se aduce la 1000 cm3, cu apă
distilată.
- Soluţie sodică: 346 g sare Seignette şi 100 g hidroxid de sodiu se dizolvă şi se aduce la 1000 cm3
cu apă distilată.
- Acid sulfuric 25 %: 1 volum H2SO4 conc. se amestecă cu 6 volume apă distilată.
- Bicromat de potasiu, soluţie 0,1N: 4,9036 g K2Cr2O7 (uscat cca. 1 oră la 150 … 200°C, apoi răcit
la exicator) se dizolvă şi se aduce la 1000 cm3, cu apă distilată.
- Amidon solubil, soluţie 1 %: se amestecă 1 g amidon cu puţină apă rece luată din 100 cm 3 apă
distilată şi se toarnă în restul de apă încălzită la fierbere. Se firbe circa 1 minut. Se foloseşte după
răcire.
- Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N: 25 g Na2S2O3 · 5H2O şi 3,8 g borax Na2B4O7 · 10 H2O se
dizolvă în apă distilată proaspăt fiartă şi răcită şi se aduce la 1000 cm3. Se lasă soluţia să stea
circa două zile, după care se stabileşte factorul cu soluţia de bicromat de potasiu 0,1 N.
- Acid clorhidric 20 %: 496 cm3 acid clorhidric concentrat se aduce la 1000 cm3 cu apă distilată.
Pregătirea extractului apos.
O parte din proba pregătită (măcinată fin într-un mojar) se cerne prin sita de mătase nr. 8.
Din proba cernută, se ia o cantitate de cca. 5 g, cântărită cu o precizie de 0,001 g, şi se introduce
cantitativ într-un balon cotat de 250 cm3. Se adaugă 150 cm3 apă distilată, încălzită la 35-40°C.
Se agită balonul din 5 în 5 minute, timp de 30 minute, apoi se răceşte la temperatura camerei. Se
introduc 5 cm3 soluţie de sulfat de zinc şi 5 cm3 soluţie de ferocianură de potasiu, agitându-se
mereu, apoi se aduce balonul la semn cu apă distilată. Se agită din nou, se lasă cca. 15 minute
pentru decantare, apoi se filtrează.

24
 Hidro1iza zaharozei şi dozarea zahărului invertit
Se iau cu pipeta 15 cm3 din filtrat, se introduc într-un vas Erlenmeyer de 200 cm3, se
adaugă 8 cm3 apă şi 2 cm3 acid clorhidric şi se încălzeşte pe o baia de apă timp de 5 minute
la temperatura de 67-70°C. Vasul se răceşte imediat la robinet. Excesul de acid se neutralizează
cu porţiuni mici de carbonat de sodiu anhidru, până când nu se mai degajă bioxid de carbon, iar
culoarea hâtiei roşii de turnesol introdusă în balon virează în albastru.
Peste soluţia hidrolizată şi neutralizată, se introduc 20 cm3 soluţie cuprică şi 20 cm3
soluţie sodică, se încălzeşte la flacără şi se fierbe exact 3 minute. Se lasă să se depună oxidul
cupros şi se trece lichidul decantat într-un creuzet de sticlă cu placă filtrantă 3 G4 montat la
vasul de trompă.
După ce s-a trecut prin creuzet tot lichidul decantat, precipitatul rămas în vasul
Erlenmeyer se spală de 2 sau 3 ori cu apă distilată fiartă, care se trece tot prin creuzet. Se
goleşte vasul de trompă şi se spală bine cu apă, apoi se clăteşte cu apă distilată şi se montează din
nou creuzetul la vasul de trompă.
Pentru dizolvarea precipitatului de oxid cupros din vasul Erlenmeyer se adaugă,
după spălare, 20-30 cm3 soluţie ferică. Se obţine o soluţie limpede, colorată în verde, care se
toarnă pe filtru, pentru a se dizolva precipitatul antrenat prin decantare. Se mai adaugă puţină
soluţie ferică.
Se spală apoi vasul Erlenmeyer şi creuzetul cu apă fiartă care se trece tot prin filtru.
Se desface vasul de trompă şi soluţia verde se titrează la rece cu soluţie de permanganat de
potasiu, până când o picătură de permanganat în exces colorează lichidul în roz.
Observaţie. Se recomandă ca în tot timpul determinării precipitatul de oxid cupros să fie
acoperit cu un strat de lichid.
Cupru = V . 6,307 [mg] în care:
V = volumul soluţiei de permanganat de potasiu 0,1 n folosit la titrare, în cm3,
6,357 = cantitatea de cupru, în mg, corespunzătoare la 1 cm3 soluţie de permanganat de potasiu
0,1 N.
Se caută în tabelul 1 (anexă) cantitatea de zahăr invertit, corespunzătoare cantităţii
de cupru calculată cu formula de mai sus.
% Zahăr (exprimat în zaharoză şi raportat la substanţa uscată) =

m1 • 250 • 0,95 • 100 100 m1 • 158,33

= . = în care:
m • 15 • 1000 100 – U m • (100–U)

m1 = cantitatea de zahăr invertit din tabelul 1, în mg, corespunzătoare la cantitatea de cupru

determinată;
250 = volumul balonului cotat;
15 = volumul soluţiei luate în analiză (din balonul cotat), în cm3;
m = masa substanţei cântărite pentru analiză, în g;
U = umiditatea substanţei luate pentru analiză, în procente;

25
0,95 = factorul de convertire a zahărnlui în zaharoză.
Observaţie. Pentru produsele cu un conţinut sporit de zahăr, cantitatea luată pentru analiză va fi
de 3 g, pentru a nu depăşi cantitatea de 176,5 mg cupru din tabelul Bertrand.

Tabelul Bertrand
Cantitatea de zahăr invertit corespunzătoare cuprului

Cupru Zahăr Cupru Zahăr Cupru Zahăr Cupru Zahăr

(mg) invertit (mg) invertit (mg) invertit (mg) invertit
(mg) (mg) (mg) (mg)
20,6 10 64,8 33 105,7 56 143,7 79
22,6 11 66,7 34 107,4 57 145,3 80
24,6 12 68,5 35 109,2 58 146,9 81
26,5 13 70,3 36 110,9 59 148,5 82
28,5 14 72,2 37 112,6 60 150,0 83
30,5 15 74,0 38 114,3 61 151,6 84
32,5 16 75,9 39 115,9 62 153,2 85
34,5 17 77,7 40 117,6 63 154,8 86
36,4 18 79,5 41 119,2 64 156,4 87
38,4 19 81,2 42 120,9 65 157,9 88
40,4 20 83,0 43 122,6 66 159,5 89
42,3 21 84,3 44 124,2 67 161,1 90
44,2 22 86,5 45 125,9 68 162,6 91
46,1 23 88,3 46 127,5 69 164,2 92
48,0 24 90,1 47 129,2 70 165,7 93
49,8 25 91,9 48 130,8 71 167,3 94
51,7 26 93,8 49 132,1 72 168,8 95
53,6 27 95,4 50 134,4 73 170,3 96
55,5 28 97,1 51 135,6 74 171,9 97
57,4 29 98,8 52 137,2 75 173,4 98
59,3 30 100,0 53 138,9 76 175,0 99
61,1 31 102,3 54 140,5 77 176,5 100
63,0 32 104,0 55 142,1 78 - -
1 |

26
 Metoda Schoorl (metoda curentă)

Reactivi
- Ferocianură de potasiu, soluţie 10 %.
- Sulfat de zinc, soluţie 15 %.
- Soluţie cuprică.
- Soluţie sodică.
- Acid sulfuric 25 %.
- Bicromat de potasiu, soluţie 0,1 N.
- Amidon, soluţie 1 %.
- Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N.
- Iodură de potasiu, soluţie 30 % (fără iodaţi şi fără iod liber).
- Hidroxid de sodiu, soluţie 30 %.
- Acid clorhidric, conc şi 20 %.
- Fenoftaleină, soluţie alcoolică 1 %.
Pregătirea extractului apos
O parte din proba pregătită conform pct.1. se cerne prin sita de mătase nr. 8. Din proba
cernută, se ia o cantitate de circa 5 g, cântărită cu precizie de 0,001 g şi se introduce cantitativ
într-un balon cotat de 250 cm3. Se adaugă 150 cm3 apă distilată, încălzită la 35...40°C. Se agită
balonul din 5 în 5 minute, timp de 30 de minute, apoi se răceşte la temperatura camerei. Se
introduc 5 cm3 soluţie de sulfat de zinc şi 5 cm3 soluţie de ferocianură de potasiu, agitându-se
mereu, apoi se aduce balonul la semn cu apă distilată. Se agită din nou, se lasă circa 15 minute
pentru decantare, apoi se filtrează.
Hidroliza zaharozei
50 cm3 extract apos luaţi cu pipeta se introduc într-un balon cotat de 100 cm3 şi se adaugă
5 cm3 acid clorhidric 20%. Balonul se introduce într-o baie de apă la 68...70°C şi se ţine la
această temperatură timp de 8 minute, apoi se introduce într-un vas cu apă la 20°C pentru răcire.
Se adaugă fenoftaleină şi se neutralizează cu soluţie de hidroxid de sodiu până la coloraţia roz
slab a soluţiei. După răcirea soluţiei la 20°C, se aduce balonul la semn cu apă distilată şi se
omogenizează.
Dozarea zahărului invertit
Într-un vas Erlenmeyer de 200...300 cm3 se introduc 30 cm3 soluţie de analizat, 10 cm3
soluţie cuprică, 10 cm3 soluţie sodică şi se fierbe exact 2 minute.
Încălzirea vasului până la fierbere trebuie să dureze maxim 3 minute. Fierberea se face la
flacără, pe o sită de azbest, la care se decupează în centru un orificiu cu diametrul de circa 3 cm.
După fierbere, vasul se răceşte repede la temperatura camerei (în curent de apă rece), se
adaugă 10 cm3 soluţie de iodură de potasiu, 10 cm3 acid sulfuric 25 %, apoi se titrează imediat cu
soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N până la schimbarea culorii din brun în galben deschis. Se
adaugă 5 cm3 soluţie amidon 1 % şi se continuă titrarea până la dispariţia culorii albastre.

27
 Titrul soluţiei cuprice se stabileşte faţă de o probă martor conţinând toţi reactivii de mai
sus, cu deosebirea că în loc de 30 cm3 soluţie de analizat se iau în lucru 30 cm3 apă distilată.
Verificarea titrului trebuie repetată la interval de 14 zile.
Pentru calculul conţinutului de zahăr invertit, din volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu
0,1 N întrebuinţat la proba martor se scade volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N consumat
la determinarea probei analizate şi se înmulţeşte cu factorul de corecţie al soluţiei de tiosulfat de
sodiu.
Din diferenţa calculată mai sus, pentru cei 30 cm3 filtrat luaţi în lucru, se calculează cu
ajutorul tabelului 15 cantitatea de zahăr invertit, în mg, care corespunde la volumul soluţiei de
tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrare.

% Zahăr (exprimat în zaharoză şi raportat la substanţa uscată) =

m1 • 5 • 100 • 0,95 • 100 100 m1 • 5 • 95

= . = în care:
m • 30 • 1000 100 – U m • 3(100–U)

m1 - cantitatea de zahăr invertit din tabelul Schoorl, în mg, corespunzătoare volumului

soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N,
5 - raportul dintre volumul balonului cotat (250 cm3) folosit la prepararea extractului
apos (pct. 3.2) şi volumul soluţiei luate în lucru la pct. 3.3.,
m - masa produsului luat în analiză, în g,
U - umiditatea produsului de analizat, în procente, determinată la pct. 2.,
30 - volumul soluţiei luate în analiză din balonul cotat de 100 cm3, în cm3,
1000 - transformarea cantităţii de zahăr invertit, din mg în g,
0,95 - factorul de convertire a zahărului invertit în zaharoză.
Rezultatul se exprimă cu o zecimală.
Pentru factorul de corecţie la tiosulfatul de sodiu s-au folosit: 20 ml bicromat de potasiu,
15 ml soluţie iod în iodură de potasiu 0,1 N şi 5 ml de acid clorhidric concentrat. Toate acestea
se ţin la întuneric timp de 5 minute, apoi se adaugă 30 ml apă, după care se titrează cu tiosulfat
0,1 N până la virarea culorii galben pal; după care se adaugă 1 ml amidon şi se titrează cu
tiosulfat până la dispariţia culorii albastre.

28
 Tabelul Schoorl
Cantitatea de zahăr invertit corespunzătoare soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N
Zecimi de cm3 Na2S2O3 0,1 N
Na2S2O3
0,1 N 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
(cm )3 Zahăr invertit, în mg
1 3,20 3,53 3,86 4,19 4,52 4,85 5,18 5,51 5,81 6,17
2 6,50 6,83 7,16 7,49 7,82 8,15 8,18 8,81 9,14 9,47
3 9,80 10,12 10,14 10,76 11,08 11,40 11,72 12,04 12,36 12,68
4 13,00 13,34 13,08 14,02 14,36 14,70 15,01 15,38 15,73 16,06
5 16,40 16,74 17,08 17,12 17,76 18,10 18,11 18,78 19,12 19,46
6 19,80 20,12 20,18 20,82 21,16 21,50 21,84 22,18 22,50 22,86
7 23,20 23,55 23,86 24,19 21,52 24,85 25,18 25,51 25,81 26,17
8 26,50 26,81 27,18 27,52 27,86 28,20 28,54 28,88 29,22 29,36
9 29,90 30,25 30,60 30,05 31,50 31,65 32,00 32,35 32,70 33,05
10 33,40 33,74 34,08 34,42 34,76 35,10 35,42 35,78 36,12 36,46
11 36,80 37,15 37,50 37,85 38,20 38,55 38,90 39,25 39,60 39,95
12 40,30 40,65 41,00 41,35 41,70 42,05 42,40 42,75 43,10 43,45
13 43,80 44,15 44,50 44,85 45,20 45,55 45,90 46,25 46,60 46,05
14 47,30 47,05 48,00 48,35 48,70 49,05 49,40 49,75 50,10 50,45
15 50,80 51,15 51,50 51,85 52,20 52,55 52,90 53,25 53,60 53,95
16 51,30 54,67 55,04 55,11 55,78 56,15 56,52 56,80 57,26 57,63
17 58,00 58,38 58,76 59,14 59,52 59,90 60,28 60,66 61,04 61,42
18 61,80 62,17 62,54 62,91 63,28 63,65 64,02 64,30 64,76 65,13
19 65,50 65,80 66,28 66,97 67,06 67,45 67,84 68,23 68,62 69,01
20 69,40 69,78 70,18 70,57 70,96 71,35 71,74 72,13 72,52 72,91
21 73,30 73,69 74,08 74,47 74,86 75,25 75,64 76,03 76,42 76,81
22 77,20 77,60 78,00 78,40 78,80 79,20 79,60 80,00 80,40 80,80
23 81,20 81,60 82,00 82,40 82,80 83,20 83,60 81,00 81,40 84,80
24 85,20 85,60 86,00 86,40 80,80 87,20 87,60 88,00 88,40 88,80
25 89,20 89,60 90,00 90,40 90,80 91,20 91,60 92,00 92,40 92,90

în care:
f – factorul la bicromat;
V – ml tiosulfat folosiţi la titrare.

29
 3.4.4. Determinarea zahărului reducător din mierea de albine
prin metoda Elser

Principiul metodei
În stare liberă, glucoza şi fructoza pot reduce sulfatul de cupru, în mediu alcalin la cald,
transformându-l în oxid cupros. Cantitatea de oxid cupros care se formează este proporţională cu
concentraţia celor două zaharuri reducătoare din soluţia de cercetat.
Reactivi
1. Soluţie apoasă de sulfat de cupru 5 %;
2. Soluţie alcalinizată de sare Seignette: 175 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu şi
potasiu), 25 g carbonat de sodiu şi 15 g hidroxid de sodiu se dizolvă în apă distilată şi se aduce la
1000 ml ;
3. Soluţie saturată de clorură de sodiu: la 1000 ml soluţie saturată de clorură de sodiu se
adaugă 250 ml soluţie apoasă de acid clorhidric 10 %;
4. Bicarbonat de sodiu p.a.;
5. Soluţie de iod 0,05 N;
6. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,05 N;
7. Soluţie de amidon 1 % proaspăt preparată;
Modul de lucru
Se cântăresc 3 g miere de albine la balanţa analitică şi se aduc cu apă distilată la 200 ml.
Din această soluţie se iau 20 ml într-un balon cotat de 100 ml şi se completează la semn cu apă
distilată, apoi se omogenizează prin agitare.
Într-un pahar Erlenmeyer de 300 ml se face un amestec compus din 20 ml soluţie sulfat
de cupru, 20 ml soluţie sare Seignette şi 20 ml apă distilată, care se încălzeşte la flacără, pe sita
de azbest. Când s-a ajuns la fierbere, se adaugă cu grijă (fără a se atinge pereţii vasului
Erlenmeyer) 20 ml din soluţia de miere preparată la început. Din momentul în care reîncepe
fierberea, se cronometrează 5 minute, după care se răceşte vasul la jet de apă, cu atenţie mărită
deoarece vasul încălzit pe flacără se poate sparge. Sub acţiunea reducătoare a zahărului invertit
din probă analizată, în timpul fierberii se formează pe fundul recipientului un precipitat roşu-
cărămiziu de oxid cupros.
În continuare, se adaugă 30 ml soluţie de clorură de sodiu şi se agită. Soluţia de clorură
de sodiu determină dizolvarea oxidului cupros, lichidul din vas devenind limpede, cu o nuanţă
albăstrui-verzuie deschisă. Se adaugă apoi 2-3 g bicarbonat de sodiu pulbere pentru neutralizare,
în aşa fel ca pe fundul vasului să rămână un depozit de bicarbonat în exces. După neutralizare,
soluţia, care devine albăstruie şi perfect clară, se titrează cu soluţia de iod sub agitare continuă.
În prima parte a titrării apare o tulbureală lăptoasă, care dispare treptat pe măsură ce se adaugă
soluţie de iod şi lichidul din vas începe să se clarifice şi să capete culoarea verde, ce indică un
exces de iod. În acest moment se adaugă 0,25-0,50 ml soluţie de amidon, care în contact cu iodul
în exces determină o modificare bruscă de culoare a soluţiei în albastru închis, cu nuanţă

30
negricioasă. Se notează volumul de iod folosit la titrare (care pentru mierea de albine naturală
trebuie să fie între 26-30 ml).
Se retitrează atent (picătură cu picătură) iodul în exces cu soluţia de tiosulfat de sodiu,
până când culoarea virează brusc din albastru negricios în albastru deschis.
Numărul de ml de iod folosiţi pentru oxidarea cationului cupros se calculează făcând
diferenţa între volumul soluţiei de iod, în ml, flosit la titrare şi volumul de tiosulfat de sodiu, în
ml, folosit la retitrare.
Calculul rezultatelor
Conţinutul de zahăr reducător, exprimat în zahăr invertit %, se calculează cu ajutorul
următoarei relaţii:

z • 10 • 5
Zahăr invertit % = 100 în care:
3 • 1000

z = cantitatea de zahăr invertit, în mg, corespunzătoare volumului de iod utilizat, care se

citeşte din tabelul 1
10 = raportul dintre volumul balonului cotat de 200 ml şi volumul de probă luat pentru
pregătirea soluţiei de lucru (20 ml);
5 = raportul dintre volumul balonului cotat de 100 ml şi volumul de soluţie luat în lucru;
3 = cantitatea de miere de albine cântărită pentru analiză;
1000 = factorul de transformare al mg în g.

31
 Tabelul 1
Cantitatea de zahăr invertit, în mg, corespunzătoare volumelor de soluţie de iod 0,05 N
Soluţie de iod Zahăr invertit Soluţie de iod Zahăr invertit Soluţie de iod Zahăr invertit
0,05 N (ml) (mg) 0,05 N (ml) (mg) 0,05 N (ml) (mg)
5,0 8,6 12,2 20,1 19,4 31,4
5,2 8,9 12,4 20,4 19,6 31,7
5,4 9,2 12,6 20,8 19,8 32,0
5,6 9,6 12,8 21,2 20,2 32,6
5,8 9,9 13,0 21,4 20,6 33,3
6,0 10,2 13,2 21,7 21,0 33,9
6,2 10,5 13,4 22,0 21,4 34,5
6,4 10,8 13,6 22,4 21,8 35,1
6,6 11,2 13,8 22,7 22,2 35,7
6,8 11,5 14,0 23,0 22,6 36,3
7,0 11,8 14,2 23,3 23,0 37,0
7,2 12,1 14,4 23,6 23,4 37,6
7,4 12,4 14,6 23,9 23,8 38,3
7,6 12,7 14,8 24,2 24,2 38,9
7,8 13,1 15,0 24,5 24,6 39,6
8,0 13,4 15,2 24,8 25,0 40,2
8,2 13,7 15,4 25,1 25,4 40,8
8,4 14,0 15,6 25,5 25,8 41,4
8,6 14,4 15,8 25,8 26,2 42,0
8,8 14,7 16,0 26,1 26,6 42,6
9,0 15,0 16,2 26,4 27,0 43,2
9,2 15,3 16,4 26,7 27,4 43,8
9,4 15,6 16,6 27,0 27,8 44,4
9,6 16,0 16,8 27,3 28,2 45,0
9,8 16,3 17,0 27,6 28,6 45,6
10,0 16,6 17,2 27,9 29,0 46,2
10,2 16,9 17,4 28,2 29,4 46,8
10,4 17,2 17,6 28,6 29,8 47,4
10,6 17,6 17,8 28,9 30,2 48,0
10,8 17,9 18,0 29,2 30,6 48,6
11,0 18,2 18,2 29,5 31,0 49,2
11,2 18,5 18,4 29,8 31,4 49,8
11,4 18,9 18,6 30,2 31,8 50,4
11,6 19,2 18,8 30,5 32,2 51,0
11,8 19,5 19,0 30,8 32,6 51,6
12,0 19,8 19,2 31,1 33,0 52,2

32
 3.4.5. Determinarea colorimetrică a glucidelor reducătoare
Reacţia cu fericianură de potasiu

Principiul metodei. Glucidele reducătoare reacţionează la fierbere cu fericianură de potasiu,

în mediu alcalin. Excesul de fericianură se determină spectrofotometric la 420 nm.

2K3[Fe(CN)6] + R-CHO + 2 KOH 2 K4 [Fe (CN)6] + R-COOH + H2O

fericianură glucid ferocianură glucid
de potasiu reducător de potasiu oxidat

Aparatură:
- Spectrofotometru.
Reactivi:
- Fericianură de potasiu, soluţie 0,05 N (16,46 g/l);
- Carbonat de sodiu, soluţie 1 N (53 g/l);
- Reactiv de culoare care se prepară pentru fiecare set de probe: 2 ml fericianură de potasiu
0,05 N se aduc la semn în balon cotat de 100 ml cu carbonat de sodiu 1 N;
- Reactiv de defecare. Sulfat de zinc, soluţie 30 % şi ferocianură de potasiu, soluţie 15 %
în raport volumetric 3/5;
- Hidroxid de sodiu sau potasiu, soluţie 40%;
- Acid clorhidric, d = 1,19.
Modul de lucru
Se cântăresc 10 g produs de analizat într-un pahar Berzelius. Glucidele din probă se dizolvă
cu 20 ml apă distilată şi proba se trece cantitativ în cilindru gradat de 100 ml. Se filtrează prin
filtru cutat. Pentru îndepărtarea compuşilor din probă (proteine simple, aminoacizi liberi,
pigmenţi vegetali, tanin) care ar interfera în reacţie, se realizează o operaţie de defecare. în acest
scop se iau 50 ml filtrat în balon cotat de 100 ml, se adaugă 10 ml reactiv de defecare (sulfat de
zinc şi ferocianură de potasiu) şi se ţine la frigider pentru accelerarea precipitării.
După precipitare şi aducerea soluţiei la temperatura de 20°C, se aduce la semn cu apă
distilată şi se filtrează prin filtru cutat. în filtratul obţinut se determină glucidele direct
reducătoare. în acest scop se efectuează o diluţie a probei luându-se 10 ml de filtrat într-un balon
cotat de 100 ml şi se aduce la semn. Din proba diluată se iau 2 ml şi se trec într-o eprubetă cu
dop rodat, se adaugă 5 ml reactiv de culoare proaspăt preparat şi se fierbe pe o baie de apă timp
de 15 minute. După răcirea probei cu jet de apă se determină la spectrofotometru extincţia prin
cuvă de 1 cm, la lungimea de undă de 420 nm având drept fond apă distilată.
Trasarea curbei etalon
Se realizează o curbă etalon cu soluţie de glucoză pură cu concentraţia de 0,1 %. Se
efectuează diluţii succesive cuprinse între 10...150 μg (în 2 ml). Se obţin astfel 15 probe cu care
se realizează reacţia de culoare ca şi în cazul probei de analizat. Pentru fiecare probă se
determină extincţia. Cu valorile obţinute se trasează curba etalon trecând pe abscisă μg de
glucoză iar pe ordonată extincţia. Se obţine astfel o curbă descendentă. Pentru a obţine o curbă

33
ascendentă se realizează în paralel cu soluţiile de glucoză şi o probă martor cu apă distilată (2
ml) în aceleaşi condiţii. În acest caz, se trasează curba etalon având pe abscisă μg de glucoză, iar
pe ordonată diferenţa dintre extincţia probei martor (Em) şi extincţia fiecărei probe din scara
etalon, (E).
Pentru a putea folosi curba ascendentă în cazul diverselor determinări de glucide se
efectuează de fiecare dată o probă martor în paralel cu proba de analizat.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Rezultatul se exprimă în grame glucoză la 100 g produs şi se calculează cu relaţia:

a•d
Glucide reducătoare (%) = —— • 100 în care:
10 6 • m

a = cantitatea de glucoză de pe curba etalon ce corespunde diferenţei dintre extincţia

probei martor (Em) şi extincţia probei de analizat (E), μg/2ml;
m = masa probei luată în analiză, g;
d = diluţiile efectuate (d = 1000).

Reacţia cu acidul 3,5-dinitrosalicilic

Principiul metodei. În mediu alcalin şi la cald, gruparea carbonilică a mono- şi

oligoglucidelor este oxidată la gruparea carboxil de către acidul 3,5- dinitrosalicilic (DNS). în
reacţie, o grupare nitro a acidului dinitrosalicilic se reduce la o grupare aminică formând un
compus colorat de la galben la roşu-maroniu. Acidul amino-nitrosaiicilic format se determină
colorimetric. Deoarece oxidarea glucidelor are loc stoichiometric, se va construi o curbă etalon
pentru glucoză.

Reactivi:
- Acid clorhidric, soluţie 0,05 N;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 10% şi soluţie 0,05 N;
- Tartrat de Na şi K, soluţie 1,06 M. Se cântăresc 74,783 g tartrat de Na şi K hidratat cu 4
molecule de apă şi se aduc la 250 ml cu apă distilată;

34
 - Hidroxid de sodiu, soluţie 0,4 N. Se cântăresc 4 g NaOH şi se aduc la balon cotat de 250
ml cu soluţie de tartrat de Na şi K 1,06 M;
- Acid 3,5-dinitrosalicilic '(DNS), soluţie 0,04 M. Se cântăresc 0,9130 g DNS, se dizolvă în
soluţie de NaOH 0,4 N în tartrat de Na şi K, se aduce la 100 ml şi se omogenizează;
- Roşu de metil, soluţie alcoolică 0,2 %;
- Soluţie stoc de glucoză, 0,1 %.
Modul de lucru
Prepararea extractului
Se cântăresc 5,675 g făină într-un vas conic de 150 ml, se umezeşte proba cu 5 ml alcool şi
se adaugă 52 ml apă distilată. Se agită flaconul pentru dizolvarea glucidelor şi se filtrează
aruncându-se primele 10 picături.
Determinarea glucidelor reducătoare (glucoză, fructoză, maltoză)
Pentru determinarea glucidelor reducătoare filtratul obţinut trebuie diluat. Pentru aceasta,
10 ml extract se introduc într-un balon cotat de 100 ml şi se aduce la semn cu apă distilată. Din
acesta se folosesc pentru dozarea glucidelor 2 ml, care se introduc într-o eprubetă cu pereţi groşi.
în altă eprubetă se introduc 2 ml apă distilată. în fiecare eprubetă se introduc 4-5 picături de
hidroxid de sodiu soluţie 10 % pentru a aduce pH-ul la 8,4...8,5 şi apoi 2 ml soluţie acid 3,5-
dinitrosalicilic. Se agită şi se introduc eprubetele la care s-au ataşat dopuri de vată sau plută
(dacă eprubetele nu sunt prevăzute cu dop rodat) într-o baie de apă la fierbere, timp de 10
minute. După răcire, conţinutul eprubetelor se aduce la volumul de 10 ml cu apă distilată şi se
omogenizează. Se determină extincţia la un spectrofotometru la lungimea de undă de 535 nm,
folosind cuve de 1 cm şi apă distilată ca fond.
Determinarea glucidelor reducătoare totale (glucoză, fructoză, maltoză, zaharoză)
Determinarea are ca primă etapă o operaţie de hidroliză (invertire) a zaharozei. în acest
scop se iau 10 ml extract de făină (nediluat), se introduc într-un vas conic de 150 ml şi se adaugă
0,3 ml soluţie 0,05 N de acid clorhidric. Se introduce flaconul pentru 15 min într-o baie de apă la
fierbere, apoi se răceşte şi se neutralizează cu soluţie 0,05 N de hidroxid de sodiu în prezenţă de
roşu de metil ca indicator. Se diluează la 100 ml şi apoi se iau 2 ml extract diluat şi se determină
glucidele reducătoare.
Trasarea curbei etalon
Pentru stabilirea curbei etalon se foloseşte o soluţie stoc de glucoză sau alt glucid reducător
în concentraţie de 0,1 %.
Din această soluţie se pipetează într-o serie de eprubete în care se găsesc câte 2 ml reactiv
DNS, următoarele cantităţi în ml: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0. Volumul
eprubetelor se aduce cu apă distilată la 4 ml, iar tratamentele ulterioare şi adăugarea reactivilor se
fac în modul descris la determinarea glucidelor reducătoare în proba de cercetat.
După determinarea extincţiilor, se scade valoarea extincţiei probei etalon de zero, din
valoarea extincţiilor celorlalte etaloane.
Se trasează curba etalon trecând pe abscisă cantităţile de glucid reducător, iar pe ordonată,
extincţiile corespunzătoare.

35
 Calculul şi modul de exprimare
Glucidele reducătoare se exprimă în grame glucoză la 100 g produs:
a•d
Glucide reducătoare (%) = • 100 în care:
10 6 • m

a = cantitatea de glucoză de pe curba etalon care corespunde diferenţei dintre extincţia

probei de analizat (E) şi extincţia probei martor (Em), μg/2ml;
m = masa probei luată în analiză, g;
d = dilutiile efectuate (d = 57/10 • 100/2 = 285 ).
Observaţii
După reacţia de culoare, probele se pot păstra în stare nediluată nu mai mult de o oră.
Dacă pentru probă este nevoie de o cantitate de soluţie mai mică de 2 ml (pentru a obţine
concentraţia corespunzătoare), volumul se aduce cu apă distilată la 2 ml, astfel ca amestecul de
reacţie cu reactivul DNS să fie întotdeauna de 4 ml.

3.4.6. Determinarea colorimetrică a glucidelor reducătoare totale

Reacţia cu fenolul (metoda Dubois)

Principiul metodei. Metoda se bazează pe reacţia de culoare pe care o dau glucidele cu

fenolul în mediu de acid sulfuric concentrat la temperatura camerei (culoare galben-orange).
Această reacţie de culoare o dau glucidele simple, oligoglucidele, poliglucidele şi derivaţii lor cu
grupări reducătoare libere sau potenţial libere astfel că prin această metodă se determină
glucidele totale.
Aparatură:
- Spectrofotometru;
- Balanţă analitică.
Reactivi:
- Acid sulfuric concentrat, d = 1,84;
- Fenol, 80 %. Se prepară prin adăugarea a 20 g apă la 80 g fenol distilat. Soluţia limpede
care rezultă este stabilă luni de zile la temperatura camerei. O culoare slab gălbuie care apare
încet, după un anumit timp, nu interfera la determinare.
- Soluţie standard de glucoză, concentraţia 50 μg/ml.
Modul de lucru
Din proba de analizat se cântăresc la balanţa analitică 0,01...0,02 g şi se trec cantitativ într-
un balon cotat de 100 ml, cu apă distilată. Balonul cu produs se lasă la temperatura camerei timp
de 10...12 ore pentru hidratare şi dizolvare, după care se aduce la semn conţinutul şi se
omogenizează. Proba astfel pregătită se foloseşte pentru determinarea glucidelor totale.
Pentru aceasta, într-un pahar Erlenmeyer (sau într-o eprubetă) se iau 2 ml din soluţia
apoasă de analizat. Se adaugă 0,05 ml fenol 80 % şi rapid 5 ml acid sulfuric concentrat (d =
1,84). După menţinere timp de 30 minute la temperatura camerei probele se examinează la

36
spectrofotometru, stabilindu-se extincţia la λ = 480...490 nm, faţă de proba martor care conţine
apă distilată în loc de soluţie de glucid.
Curba etalon
Pentru stabilirea cantităţii de glucide totale se utilizează o curbă etalon stabilită în aceleaşi
condiţii (se vor folosi aceiaşi reactivi şi acelaşi spectrofotometru ca şi în cazul determinării
propriu-zise) utilizând soluţii de glucoză cu concentraţii de 10... 100 μg/2 ml. Extincţia probelor
cu glucoză se citeşte tot faţă de proba martor (cu apă distilată în loc de soluţie de glucid).
Modul de calcul
Conţinutul de glucide se exprimă în procente. Ţinând cont de extincţia determinată la
spectrofotometru pentru proba de analizat, din curba etalon se citeşte cantitatea de glucid în μg/2 ml:
a • 100
Glucide totale (%) = •d în care:
m • 106

a = cantitatea de glucide totale stabilită în funcţie de extincţie, din curba etalon, μg/2 ml;
m = cantitatea de produs luată în analiză, g;
d = diluţia sau diluţiile făcute în cazul determinărilor respective.

3.4.7. Determinarea glucidelor reducătoare şi nereducătoare

Metoda cu fericianură de potasiu

Principiul metodei. Glucidele reducătoare reduc în mediu alcalin şi la fierbere, în cantitate

echivalentă fericianura de potasiu la ferocianură de potasiu. Fericianura de potasiu rămasă
neredusă, în mediu acid, reacţionează cu iodura de potasiu şi rezultă o cantitate echivalentă de
iod, care se titrează cu tiosulfat de sodiu soluţie 0,1 N în prezenţă de amidon ca indicator.
Zaharoza (glucid nereducător), în mediu acid şi la cald, se hidrolizează şi trece în zahăr
invertit, care se dozează ca glucide reducătoare. Au loc reacţiile:

2K3[Fe(CN)6] + 2Na2CO3 + H2O K3Na[Fe(CN)6] + 2 NaHCO3 + O

fericianură soluţie ferocianură de oxigen
de potasiu alcalină sodiu şi potasiu nativ

R— CHO + O R— COOH
glucid glucid
reducător oxidat

Excesul de fericianură de potasiu în mediu acid:

K3[Fe(CN)] + 2KI CH3COOH I2 + 2K 4[Fe(CN)6]

37
 Pentru ca reacţia să aibă loc până la sfârşit, aceasta se face în prezenţa sulfatului de zinc.

I2 + 2Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6

tiosulfat de tetrationat
sodiu de sodiu

Aparatură:
- Baie de apă.
Reactivi:
- Alcool, 96 %(v/v);
- Soluţie tampon acidă. 3 ml acid acetic glacial şi 4,1 g acetat de sodiu anhidru sau 6,8 g
acetat de sodiu hidratat cu 3 molecule de apă şi 4,5 ml acid sulfuric, se dizolvă în apă aducându-
se la un volum de 1000 ml;
- Soluţie de fericianură de potasiu 0,1 N alcalină. 33 g fericianură de potasiu pură şi uscată
şi 44 g carbonat de sodiu se dizolvă în 1000 ml apă distilată;
- Wolframat de sodiu, soluţie 12 %;
- Soluţie sărată de acid acetic: 70 g clorură de potasiu, 40 g sulfat de zinc hidratat cu 7
molecule de apă şi 200 ml acid acetic glacial se dizolvă în apă şi se aduce la 1000 ml cu apă
distilată;
- Soluţie amidon-iodură de potasiu: 2 g amidon solubil se introduc într-o cantitate mică de
apă caldă, se trece totul în 50 ml apă cu temperatura de 100°C. Se agită, se răceşte la temperatura
camerei şi se adaugă 50 g iodură de potasiu. Se completează la 100 ml cu apă distilată şi se
adaugă o picătură soluţie hidroxid de sodiu 1n;
- Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N: 24,82 g tiosulfat de sodiu (Na2S203 • 5H2O) şi 3,8 g borax
(Na2B2O7 • H2O) se dizolvă în apă şi se aduce la 1000 ml cu apă distilată.
Modul de lucru
Prepararea extractului
Se introduc 5,675 g făină într-un vas conic de 125 ml, se umezeşte proba cu 5 ml alcool şi
se adaugă 50 ml soluţie tampon acidă. Se agită vasul pentru dizolvarea glucidelor, se adaugă
imediat 2 ml soluţie wolframat de sodiu (pentru inactivarea enzimelor) şi se agită. Se filtrează
prin hârtie cantitativă nr. 4 (Whatman) şi se aruncă primele 10 picături.
Glucidele nereducătoare (zaharoza) se determină ca glucide reducătoare după o prealabilă
hidroliză acidă.
Determinarea glucidelor reducătoare
Se pipetează 5 ml extract (filtrat) de făină într-un vas conic de 150 ml. Se adaugă exact 10
ml soluţie fericianură de potasiu, se agită şi se introduce vasul într-o baie de apă în fierbere,
astfel ca lichidul din vas să fie cu 4 cm sub nivelul apei din baie şi se lasă să fiarbă exact 20
minute. După fierbere se răceşte imediat flaconul în curent de apă şi se adaugă apoi 25 ml soluţie
de amidon-iodură de potasiu. Se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N dintr-o
microbiuretă, până la dispariţia culorii albastre. În paralel se face o probă martor.
38
 Determinarea glucidelor nereducătoare (zaharoza)
Se pipetează 5 ml extract de făină într-un Erlenmeyer de 150 ml şi se încălzeşte 15 min. în
baia de apă care fierbe. Se răceşte flaconul în curent de apă şi se adaugă exact 10 ml soluţie de
fericianură de potasiu. Se procedează mai departe ca la determinarea glucidelor reducătoare.
Proba martor se execută astfel: se face un amestec de 5 ml alcool, 50 ml soluţie tampon
acidă şi 2 ml soluţie wolframat de sodiu. Se folosesc 5 ml din acest amestec în locul celor 5 ml
extract de făină şi se procedează ca la determinarea glucidelor reducătoare.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Glucidele reducătoare se exprimă în maltoză la 100 g făină, folosindu- se relaţia:

a • V0
Glucide reducătoare (%) = - • 100 în care:
1000 • 10 • m •V1

a = mg maltoză la 10 g făină care corespund volumului V de fericianură de potasiu redus de

glucidele reducătoare (tab. 3.4.8)
V = 10 - (Vp - Vm)
10 = volumul soluţiei de fericianură de potasiu 0,1 N luat în analiză, ml;
\/p = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrarea excesului de fericianură
pentru proba de analizat, ml;
Vm = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrarea probei martor, ml;
V0 = volumul de lichid în care s-au extras glucidele (57 ml);
V1 = volumul de extract luat în analiză (5 ml);
m = masa probei de făină luată în analiză (5,675 g).
Glucidele nereducătoare se exprimă în zaharoză la 100 g făină şi se calculează cu relaţia:

b • V0
Glucide reducătoare (%) = - • 100 în care:
1000 • 10 • m •V1

b = mg zaharoză la 10 g făină care corespund volumului V' de fericianură de potasiu redus

de glucidele nereducătoare (tab. 3.4.7.)
V' = 1 0 - V'p - (10 - Vp) - Vm = Vp - V'p - Vm
V'p - volum soluţie tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrare pentru dozarea glucidelor
nereducătoare, ml;
V0, V1, m, Vp şi Vm au aceleaşi semnificaţii;
10 - V'p - volum fericianură de potasiu soluţie 0,1 N redusă de glucidele reducătoare şi cele
nereducătoare, ml;
Observaţii. Metoda se aplică şi pentru cereale sub formă de şrot.

39
 Tablelul 3.4.7
Transformarea ml soluţie 0,1 N de fericianură de potasiu redusă în mg maltoză,
respectiv zaharoză, existente în 10 g făină
Sol. de fericianură de potasiu 0,1 Maltoză la 10 g făină [mg] Zaharoză la 10 g făină
N redusă [ml] [mg]
0,10 5 5
0,20 10 10
0,30 15 15
0,40 20 19
0,50 25 24
0,60 31 29
0,70 36 34
0,80 41 38
0,90 46 43
1,00 51 48
1,10 56 52
1,20 60 57
1,30 65 62
1,40 71 67
1,50 76 71
1,60 80 76
1,70 85 81
1.80 90 86
1,90 96 91
2,00 101 95
2,10 106 100
2,20 111 104
2,30 116 109
2,40 121 114
2.50 126 119
2,60 130 123
2,70 135 128
2,80 140 133
2,90 145 138
3,00 151 143
3,10 156 148
3,20 161 152
3,30 166 157
3,40 172 161
3,50 176 166
3,60 182 171
3,70 188 176
3,80 195 181
3,90 201 185
4,00 207 190
4,10 213 195

40
4,20 218 200
4,30 225 204
4,40 231 209
4,50 237 214
4,60 244 218
4,70 251 223
4,80 257 228
4,90 260 233
5,00 270 238
5,10 276 242
5,20 282 247
5,30 288 251
5,40 295 256
5,50 302 261
5,60 308 266
5,70 315 270
5,80 322 275
5,90 328 280
6,00 334 285
6,10 341 290
6,20 347 294
6,30 353 299
6,40 360 304
6,50 367 309
6,60 373 313
6,70 379 318
6,80 385 323
6.90 392 328
7,00 398 333
7,10 406 337
7,20 412 342
7,30 418 347
7,40 425 352
7,50 431 357
7,60 438 362
7,70 445 367
7,80 451 372
7,90 458 377
8,00 465 382
8,10 472 387
8,20 478 392
8,30 485 397
8,40 492 402
8,50 499 407
8,60 505 -
8,70 512 -
8,80 519 -

41
 3.4.8. Determinarea glucidelor reducătoare şi nereducătoare
Micrometoda Somogyi

Principiul metodei
Metoda se bazează pe proprietatea glucidelor reducătoare de a reduce în mediu alcalin şi la
fierbere cuprul bivalent la cupru monovalent sub formă de oxid cupros. Acesta este solubilizat în
mediu acid şi în prezenţă de iodat de potasiu şi iodură de potasiu se eliberează iodul care se
titrează cu tiosulfat de sodiu în prezenţă de amidon ca indicator.
Reactivi:
- Alcool, 96 % (v/v);
- Reactiv alcalin de cupru. Se dizolvă 12 g tartrat dublu de sodiu şi potasiu, 20 g carbonat
de sodiu şi 25 g bicarbonat de sodiu în 500 ml apă distilată şi se introduce totul în soluţie de sulfat
de cupru obţinută prin dizolvarea a 6,5 g sulfat de cupru (CuS04 • 5H20) în 100 ml apă. Se adaugă
apoi o soluţie din 10 g iodură de potasiu, 0,8 g iodat de potasiu cântărit cu precizie de 0,0001 g şi
18 g oxalat de potasiu (K2C2O4 • H2O) şi se aduce totul la 1000 ml cu apă distilată;
- Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,005 N. Se dizolvă 1,24 g tiosulfat de sediu (Na2S2O3 • 5H2O)
în apă şi se diluează la 1000 ml;
- Acid sulfuric, soluţie 5 N;
- Amidon solubil, soluţie 1 %;
- Acid clorhidric, soluţie 0,05 N;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 0,05 N;
- Roşu de metil, 0,2 % în alcool 96 % (v/v).
Modul de lucru
Prepararea extractului
Se cântăresc 5,675 g făină şi se trec într-un vas conic de 150 ml. Se umezeşte proba cu 5 ml
alcool şi apoi se adaugă 52 ml apă distilată. Se agită flaconul pentru dizolvarea glucidelor, apoi
se filtrează prin hârtie cantitativă nr. 4 (Whatman) aruncându-se primele 10 picături.
Determinarea glucidelor reducătoare
În vederea determinării glucidelor reducătoare, extractul obţinut rebuie diluat. În acest scop,
10 ml extract se introduc într-un balon cotat de 100 ml şi se aduce la semn cu apă distilată. Din
acesta se folosesc pentru dozarea glucidelor 2 ml.
Se măsoară cu o micropipetă 5 ml reactiv alcalin de cupru, care se introduc într-un vas
conic de 50 ml şi apoi se adaugă 2 ml extract diluat de făină. Se agită flaconul, se acoperă şi se
introduce într-o baie de apă care fierbe, unde se menţine 15 min. Se răceşte flaconul la 35...40°C.
Se adaugă sub agitare, 1 ml soluţie 5 N de acid sulfuric şi se observă ca tot precipitatul de oxid
cupros să se dizolve. După 2 minute se titrează cu soluţie 0,005 N tiosulfat de sodiu folosind
amidonul ca indicator. În paralel se face o probă martor.
Determinarea glucidelor nereducătoare (zaharoza)
Se iau 10 ml extract de făină (nediluat), se introduc într-un vas conic de 150 ml şi se adaugă
0,3 ml soluţie 0,05 N de acid clorhidric. Se introduce vasul pentru 15 minute într-o baie de apă

42
care fierbe (pentru invertirea zaharozei), apoi flaconul se răceşte şi se neutralizează cu soluţie
0,05 N hidroxid de sodiu, folosind o picătură de roşu de metil ca indicator. Se diluează la 100 ml
şi apoi se iau 2 ml extract diluat şi se determină glucidele reducătoare.
Proba martor se execută astfel: într-un vas conic se introduc 5 ml soluţie alcalină de cupru,
exact măsuraţi, şi 5 ml apă. Se încălzeşte şi se titrează cu tiosulfat de sodiu soluţie 0,005 N, în
prezenţă de amidon ca indicator.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Glucidele reducătoare se exprimă în glucoză la 100 g făină, folosindu- se relaţia:

a•d
Glucide reducătoare (%) = • 100 în care:
1000 • m

a = cantitatea de glucoză ce corespunde volumului V de soluţie tiosulfat de sodiu, 0,005 N

corespunzătoare glucidelor reducătoare (tabelul 3.4.8), mg;
V = Vp - Vm
Vp - volum soluţie tiosulfat de sodiu 0,005 N folosit la titrarea probei de analizat, ml;
Vm - volum soluţie tiosulfat de sodiu 0,005 N folosit la titrarea probei martor, ml;
m - masa probei luată în analiză (m = 5,67 g);
d - dilutia efectuată (d = 57/10 • 100/2 = 285 ).
Glucidele nereducătoare se exprimă în glucoză la 100 g făină şi se calculează cu relaţia:

b•d
Glucide nereducătoare (%) = • 100 în care:
1000 • m

b = cantitatea de glucoză ce corespunde volumului V' de soluţie 0,005 N tiosulfat de sodiu

corespunzătoare glucidelor nereducătoare (se ia din tabel), mg;
V' = V'P - Vp - Vm
V'p = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,005 N folosit la titrare pentru dozarea
glucidelor nereducătoare, ml;
Vp, Vm, m, d au aceleaşi semnificaţii.

43
 Tabelul 3.4.8
Echivalenţa tiosulfat de sodiu - glucoză (după Somogyi)

Soluţie Zecimi ml soluţie 0,005 N tiosulfat de sodiu

0,005N
Na 2 S 2 0 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[ml]
mg glucoză

0 - - 0,11 0,12 0,13 0,15 0,16 0,17 0,18 0,20

1 0,21 0,22 0,23 0,25 0,26 0,27 0,28 0,29 0,31 0,32
2 0,33 0,34 0,35 0,36 0,38 0,39 0,40 0,41 0,42 0,43
3 0,45 0,46 0,47 0,485 0,495 0,505 0,515 0,530 0,540 0,550
4 0,565 0,575 0,586 0,595 0,606 0,620 0,630 0,640 0,650 0,660
5 0,670 0,685 0,695 0,705 0,715 0,730 0,740 0,750 0,760 0,770
6 0,785 0,795 0,805 0,815 0,825 0,840 0,850 0,860 0,870 0,880
7 0,895 0,905 0,915 0,925 0,935 0,950 0,960 0,970 0,980 0,995
8 1,005 1,015 1,025 1,035 1,050 1,060 1,070 1,080 1,090 1,105
9 1,115 1,125 1,135 1,150 1,160 1,170 1,185 1,195 1,205 1,215
10 1,225 1,240 1,250 1,260 1,270 1,280 1,295 1,305 1,315 1,325
11 1,335 1,350 1,240 1,370 1,380 1,395 1,405 1,415 1,425 1,440
12 1,450 1,460 1,360 1,480 1,495 1,505 1,515 1,525 1,540 1,550
13 1,560 1,570 1,580 1,590 1,605 1,615 1,630 1,640 1,650 1,660
14 1,670 1,685 1,695 1,705 1,715 1,725 1,735 1,750 1,760 1,770
15 1,780 1,795 1,805 1,815 1,825 1,835 1,850 1,860 1,870 1,880
16 1,890 1,905 1,915 1,930 1,940 1,950 1,960 1,970 1,980 1,990

44
 3.4.9. Dozarea aldozelor în prezenţa cetozelor

Principiul metodei
Dozarea aldozelor în prezenţa cetozelor se poate face prin metoda iodometrică Auerbach-
Bodlander, care se bazează pe faptul că aldozele se oxidează cu iod în mediu alcalin, spre
deosebire de cetoze care nu dau această reacţie.

CHO COO Na+

 
(CHOH)4 + I2 + 3 NaOH (CHOH)4 + 2 NaI + 2 H2O
 
CH2OH CH2OH
Aldohexoză Acid aldonic (sare de sodiu)

I2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6

Reactivi
1. Soluţie de carbonat de sodiu 0,2 M;
2. Soluţie de carbonat acid de sodiu 0,2 M
3. Soluţie de iod 0,1 N sau iod in iodură de potasiu 0,1 N. Pentru prepararea soluţiei de
iod în iodură de potasiu 0,1 N, se dizolvă 30 g KI în 300 ml apă distilată, apoi se introduc
12,7 g iod, se agită până la dizolvare şi se aduce la 1000 ml cu apă distilată.
3. Soluţie de acid sulfuric 25%
4. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N
5. Soluţie de amidon 1%
Modul de lucru
Se cântăreşte 1g de miere şi se diluează la balon cotat de 100 ml. Din balon se pipetează
20 ml probă în flacon iodometric de 300 ml, adăugând 50 ml soluţie Na2CO3 0,2 M, 50 ml
NaHCO3 0,2 M şi 20 ml soluţie de iod 0,1 N. Se omogenizează conţinutul vasului, se acoperă cu
dopul rodat şi se lasă la întuneric timp de o oră şi jumătate. Se adaugă apoi 12 ml soluţie de
H2SO4 25% şi iodul rămas liber se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 N, în prezenţă de
amidon până la incolor.
În paralel, se face o probă martor în aceleaşi condiţii de lucru, cu deosebirea că în locul
celor 20 ml soluţie de miere se foloseşte un volum echivalent de apă distilată.
Calculul rezultatelor
Conţinutul de glucoză în probă (g la %) se află cu ajutorul relaţiei:

Glucoză % = 9,005 (V-V1) 5 • 100 unde:

m • 1000
9,005 = cantitatea de glucoză (mg) corespunzător la 1 ml soluţie iod 0,1 N;

45
 V = volumul de iod consumat la proba de lucru (miere), care se determină făcând
diferenţa între volumul soluţiei de iod adăugat iniţial (20 ml) şi volumul de tiosulfat de sodiu
folosit la titrarea iodului rămas liber în proba de lucru;
V1 = volumul de iod consumat la proba martor, care se determină făcând diferenţa între
volumul soluţiei de iod adăugat iniţial (20 ml) şi volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titrarea
iodului rămas liber în proba martor;
5 = raportul dintre volumul balonului (100 ml) şi volumul de soluţie luată în lucru (20 ml);
m = masa probei de miere analizate (1 g);
1000 = factorul de transformare al mg în g;
100 = factorul de exprimare procentuală (g la 100 g miere).

Dozarea fructozei
Dozarea fructozei din miere
Fructoza, fiind tot un zahăr reducător, se determină împreună cu glucoza (ca zahăr
invertit) din proba de analizat folosind una dintre metodele: Schoorl, Elser, Bertrand etc.
Pentru a doza fructoză din miere, din cantitatea totală de zahăr invertit (zahăr reducător),
obţinută prin una din metodele menţionate, se scade cantitatea de glucoză determinată prin
metoda iodometrică Auerbach-Bodlander:
Fructoză % = Zahăr invertit %  Glucoză %

46
 3.5. METODE DE DOZARE PENTRU DIZAHARIDE
3.5.1. Dozarea zaharozei din produse naturale
În multe fructe, legume, frunzele plantelor şi în alte produse naturale, alături de glucide
reducătoare se găseşte, uneori în cantităţi însemnate, şi zaharoza care nu are proprietăţi
reducătoare. Pentru determinarea zaharozei este necesară hidroliza prealabilă (invertirea sa), care
se realizează sub acţiunea HCl, obţinându-se un amestec de glucoză şi fructoză (zahăr invertit):

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

(zaharoză) (zahăr invertit)
Principul metodei. Pentru dozarea zaharozei, se determină zahărul reducător înainte şi după
invertire, iar prin diferenţă se calculează concentraţia zaharozei.
Reactivi. 1. Soluţie de acid clorhidric 50 %.
2. Soluţie saturată de carbonat de sodiu
3. Soluţie roşu de metil (indicator), care se prepară astfel: se dizolvă 0,1 g roşu de metil în
30 ml alcool etilic 96 % şi se aduce la 50 ml cu apă distilată.
Modul de lucru
În cazul mierii de albine, se cântăresc 5 g la balanţa analitică şi se aduc cu apă distilată la
100 ml, iar în cazul altor produse vegetale sau animale care conţin proteine, se procedează, în
prealabil, la operaţiunile de extracţie şi defecare (vezi matoda Schoorl). În continuare, se iau 25
ml şi se trec într-un flacon conic de 100 ml peste care se adaugă 2,5 ml soluţie de HCl 50 %.
Apoi flaconul se introduce într-o baie de apă la fierbere timp de 10 minute. După acest interval,
în care a avut loc hidroliza zaharozei, flaconul se răceşte cu apă de robinet şi se neutralizează
conţinutul cu soluţie saturată de carbonat de sodiu, în prezenţa unei picături de roşu de metil. Se
adaugă soluţie de carbonat până ce culoarea roşie a indicatorului virează în galben-auriu. După
neutralizare, soluţia din flacon se trece într-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu apă
distilată şi se agită. Dacă lichidul este tulbure sau depus un precipitat, atunci se filtrează. Din
soluţia limpede obţinută se determină glucidele reducătoare conform metodelor Schoorl,
Bertrand etc.
Calculul rezultatelor
Conţinutul de zaharoză în probă (g la %) se calculează cu ajutorul formulei:
Zaharoză % = (ZtZi) . 0,95, în care:
Zt = zahărul reducător total după invertire, în g;
Zi = zahărul reducător înainte de invertire, în g;
0,95 = factorul de convertire a zahărului reducător în echivalent zaharoză.
Acest factor de convertire are la bază raportul dintre masa moleculară a zaharozei şi cea a
zahărului invertit:
Zaharoză (C12H22O11) 342
= = 0,95
Zahăr invertit (2 C6H12O6) 360

Zaharoză = Zahăr invertit x 0,95

47
 3.5.2. Dozarea spectrofotometrică a lactozei (metoda Nelson)

Lactoza reprezintă principalul diglucid din laptele de vacă (4-6 %) şi din cel matern (2-3 %).
Principiul metodei. Ionii de Cu (II) sunt reduşi de zaharuri la ioni de Cu (I), care, la
rândul lor, reduc acidul fosfomolibdenic la un produs de reacţie de culoare albastră.
Reactivi. 1. Reactiv alcalin de cupru. Se dizolvă 40 g Na2CO3 anhidru în aproximativ 400 ml
apă, apoi se adaugă 7,5 g acid tatrtric şi după dizolvarea acestuia se introduc 4,5 g CuSO4 . 5 H2O.
După o omogenizare energică, soluţia se diluează cu apă distilată până la un volum final de 1000 ml.
2. Reactiv fosfomolibdenic. Se dizolvă 70 g acid molibdenic şi 10 g wolframat de sodiu
în 700 ml soluţie NaOH 5%. Soluţia se fierbe aproximativ 40 minute pentru a îndepărta
amoniacul din acidul molibdenic. După răcire se adaugă 250 ml H3PO4 86 % şi reactivul se
diluează la un volum final de 1000 ml.
3. Soluţie 10 % de wolframat de sodiu.
4. Soluţie M/3 de acid sulfuric.
5. Soluţie stoc de lactoză 1 %, preparată într-o soluţie 0,2 % de acid benzoic.
6. Soluţie 0,2 % de acid benzoic.
Modul de lucru. La 1 ml lapte degresat prin centrifugare se adaugă 2 ml soluţie
wolframat de sodiu 10 % şi încet, sub agitare constantă, 2 ml soluţie M/3 de acid sulfuric.
Amestecul este adus la un volum final de 100 ml, iar după 5 minute de staţionare este filtrat
printr-o hârtie de filtru Whatman No. 42.
Într-o eprubetă (No.1) se pipetează 1 ml filtrat şi 1 ml apă distilată. Într-o a doua eprubetă
(No.2) se pipetează 2 ml soluţie standard de lactoză, conţinînd 0,6 mg lactoză – preparată prin
diluarea a 3 ml soluţie stoc de lactoză la un volum final de 100 ml cu acid benzoic, soluţie 0,2 %.
Într-o a treia eprubetă (No.3) se prepară un blanc prin pipetarea a 2 ml apă distilată.
În fiecare eprubetă se pipetează 2 ml reactiv alcalin de cupru, se incubează pe o baie de
apă la fierbere timp de 8 minute, se răceşte şi se adaugă 4 ml reactiv fosfomolibdenic. După 1
minut de staţionare, amestecurile de reacţie se diluează la un volum final de 25 ml cu reactiv
fosfomolibdenic, diluat 1/4. Se citeşte densitatea optică a probei No.1 faţă de blanc (No.3) şi a
probei No.2 faţă de blanc, la 630 nm.
Calculul rezultatelor. Densităţile optice sunt proporţionale cu concentraţiile, deci:

D.O. proba 1 C1
= unde:
D.O. proba 2 C2

C1 = concentraţia lactozei din 0,01 ml lapte;

C2 = concentraţia lactozei din standard (0,6 mg).
Concentraţia lactozei din lapte, exprimată în g/100 ml este dată de relaţia:

D.O. proba 1 0,6 100

• •
D.O. proba 2 1000 0,01

48
 3.5.3. Dozarea titrimetrică a lactozei (metoda Vlădescu)

Principiul metodei. Lactoza are proprietatea de a reduce cantitativ, în mediu alcalin,

fericianura de potasiu (FeIII) la ferocianură de potasiu (FeII):
C12H22O11 + 2 K3FeIII(CN)6 + 3 KOH C11H21O10COOK + 2 K4FeII(CN)6 + 2 H2O
Lactoză Fericianură de K (galbenă) Sarea ac. lactobionic Ferocianură de K (incoloră)
Reactivi. 1. Soluţie alcalină de fericianură de potasiu: a) 23 g K3FeIII(CN)6 se dizolvă
în 400 ml apă distilată.; b) 23 g KOH (sau NaOH) se dizolvă în 400 ml apă distilată. Soluţiile a)
şi b) se amestecă, aducându-se la un volum total de 1000 ml cu apă distilată.
2. Soluţie saturată de CuSO4 30 %.
3. Soluţie saturată de fericianură de potasiu 50 %.
4. Soluţie de lactoză 5 g/1000 ml (pentru conservare, se adaugă 1 ml toluol)
5. Pulbere de zinc.
Stabilirea titrului soluţiei alcaline de fericianură de potasiu. Într-o capsulă de porţelan se
măsoară 10 ml soluţie alcalină de K3Fe(CN)6, se adaugă 30 ml apă distilată şi câteva granule de
porţelan poros. Se încălzeşte capsula pe sită până la fierbere, apoi dintr-o biuretă se adaugă,
picătură cu picătură, soluţie de lactoză, amestecându-se continuu cu o baghetă de sticlă până la
dispariţia culorii galbene caracteristice fericianurii de potasiu. Soluţia din capsulă se menţine la
fierbere tot timpul titrării.
Calcul. Dacă Vt reprezintă volumul soluţiei de lactoză folosit pentru titrarea a 10 ml
soluţie de K3Fe(CN)6, titrul în lactoză al soluţiei de fericianură de potasiu se stabileşte astfel:
1 ml soluţie lactoză………………………0,005 g lactoză
Vt ml soluţie lactoză………………………x
x = Vt . 0,005 g lactoză
Dar, 10 ml soluţie K3Fe(CN)6………………….Vt ml soluţie lactoză………Vt . 0,005 g
lactoză
1 ml soluţie K3Fe(CN)6……………………T
T = Vt . 0,0005 g lactoză/ml K3Fe(CN)6
Modul de lucru. Într-un valon cotat de 50 ml se introduc 5 ml lapte. Se adaugă 40 ml apă
distilată, 10 picături soluţie de CuSO4 30 % şi apoi 5 picături soluţie saturată de K3Fe(CN)6. Se
aduce volumul total la 50 ml cu apă distilată, apoi se agită bine, se lasă câteva minute în repaus şi
se filtrează. În filtrat se introduce un vârf de spatulă de pulbere de zinc şi se agită câteva minute.
După decolorare, soluţia se filtrează; filtratul astfel obţinut se trece într-o biuretă.
În continuare, se procedează ca la determinarea titrului soluţiei de K3Fe(CN)6, titrând
10 ml soluţie de fericianură de potasiu (la fierbere) cu filtrat de lapte obţinut ca mai sus (Vp).
Calculul rezultatelor. Dacă pentru titrarea a 10 ml soluţie de K3Fe(CN)6 s-au folosit Vp
ml filtrat de lapte, cunoscând că:
10 ml soluţie K3Fe(CN)6………………..Vt . 0,005 g lactoză
10 ml soluţie K3Fe(CN)6………………..Vp ml filtrat de lapte

49
 Rezultă: Vp ml filtrat de lapte…………………….. Vt . 0,005 g lactoză
În cei 50 ml filtrat de lapte (provenit din 5 ml lapte) se vor găsi:

Vt • 0,005 • 50
g lactoză =
Vp

Într-un litru de lapte, cantitatea de lactoză va fi:

Vt • 0,005 • 50 • 103 Vt • 50
g lactoză/l = =
Vp • 5 Vp

Interpretarea rezultatelor. Conţinutul în lactoză al laptelui la diferite specii este, în medie,

de 45-49 g/l. Cantitatea de lactoză variază în funcţie de alimentaţie şi sezon, fiind crescută în
perioada de lactaţie.

50
 3.6. REACŢII PENTRU POLIGLUCIDE
3.6.1. Identificarea poliglucidelor
Amidonul
1. Identificarea amidonului. Principiul metodei are la bază coloraţia albastră, pe care
amidonul o dă cu iodul la rece (care dispare la cald), datorită absorbţiei moleculei de iod la
suprafaţa macromoleculei poliglucidului.
Reactivi:
1. Soluţie Lugol (1 g iod cristale + 2 g iodură de potasiu + 100 ml apă distilată);
2. Soluţie de amidon 1 %.
Mod de lucru. Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie de amidon şi 3-4 picături din soluţia
Lugol. Imediat apare o culoare albastră, care dispare la încălzire, reapărând la rece.
2. Hidroliza amidonului. Amidonul este hidrolizat atât de acizii minerali la cald, cât şi de
enzimele hidrolitice (la 37oC) până la maltoză şi glucoză. Ambele tipuri de hidroliză decurg treptat,
formându-se dextrine care în reacţie cu iodul se colorează diferit:

Amidon amilodextrine eritrodextrine acromodextrine maltoză glucoză

albastru violet roşu incolor incolor incolor

Reactivi: 1. Soluţie de amidon 2%;

2. Soluţie Lugol;
3. Hidroxid de sodiu (soluţie 3%);
4. Acid clorhidric concentrat
5. Reactiv Fehling (Fehling I şi Fehling II în părţi egale).
Mod de lucru. Într-un vas de sticlă se introduc în ordine: 20 ml din soluţia de amidon, 1 ml
acid clorhidric conc. şi 0,5 ml apă distilată. Se încălzeşte pe baia de apă la 90 oC, adăugând pe
parcurs în vas o cantitate de apă distilată echivalentă cu cea care s-a evaporat.
Se iau 10 eprubete, se aşează într-un stativ şi în primele 5 se adaugă câte 1 ml reactiv
Fehling, iar în ultimele 5 se adaugă câte o picătură soluţie Lugol.
După anumite intervale de timp (2, 8, 15, 25 minute) se iau câte 2 ml din soluţia de amidon
hidrolizată, din care 1 ml se introduce în eprubeta cu reactiv Fehling şi 4-5 picături în eprubeta cu
soluţia Lugol.
Soluţia din eprubetele în care se determină caracterul reducător se neutralizează cu 1 ml din
soluţia de hidroxid de sodiu şi se fierbe câteva minute.
Se realizează un tabel cu următoarele rubrici: numărul eprubetei, timpul de hidroliză,
produsul rezultat din hidroliză, reactivii adăugaţi, caracterul reducător şi culoarea obţinută cu
soluţia Lugol.

51
 Celuloza
Dizolvarea celulozei. Celuloza se poate dizolva numai cu reactivul Schweitzer, care
rezultă în urma reacţiei dintre hidroxidul cupric şi hidroxidul de amoniu. Se formează hidroxidul
tetra-amoniaco-cupric:
Cu(OH)2 + 4 NH4OH Cu(NH3)4 (OH)2 + 4 H2O
Reactivi: 1. Reactivul Schweitzer (se filtrează prin vată de sticlă)
2. Acid clorhidric concentrat.
Mod de lucru. Într-o eprubetă se introduc 5 ml reactiv Schweitzer şi un fragment de vată
sau hârtie de filtru, după care se agită şi apoi se lasă în repaus. Se formează un lichid vâscos, care
prin adăugare de acid clorhidric concentrat (1 ml) se decolorează şi precipită celulozo-hidratul.

Glicogenul
Identificarea glicogenului. Principiul metodei se bazează pe coloraţia roşie-brună pe care
glicogenul o dă cu iodul.
Reactivi : 1. Soluţie Lugol;
2. Soluţie de glicogen 2%.
Modul de lucru. Într-o eprubetă se introduce 1 ml din soluţia de glicogen, peste care se pun
2-3 picături soluţie Lugol şi se agită. Apare o coloraţie roşie-brună sau roşu-violet. Deşi hidroliza
are loc în condiţii asemănătoare celei a amidonului, la glicogen nu se evidenţiază dextrine care să
dea culori specifice cu iodul

52
 3.6.2. Determinarea amidonului prin metoda chimică

Principiul metodei. Se hidrolizează amidonul în mediu acid şi la cald, iar glucoza rezultată
se dozează după o metodă cunoscută de dozare a glucidelor reducătoare. Reacţia de hidroliză
care are loc este următoarea:
(C6H10O5)n + (n - 1 ) H2O HCI n C6H12O6
Reactivi:
- Acid clorhidric, d = 1,125;
- Acid clorhidric, d = 1,19;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 30-40 %;
- Fenolftaleină, soluţie alcoolică 1 %;
- Fosfowolframat de sodiu, soluţie 4 %.
Modul de lucru
Se cântăresc 2 g din produsul de analizat bine mărunţit, se trec cantitativ într-un pahar
Berzelius împreună cu 50 ml acid clorhidric cu d = 1,125, se omogenizează bine şi se introduc
într-o baie de apă care fierbe. Paharul cu proba de analizat se fierbe astfel 30 minute, timp în care
se omogenizează cu o baghetă de sticlă şi care se lasă tot timpul în pahar. După încălzire, proba
se răceşte, apoi se trece cu atenţie într-un balon cotat de 100 ml. Paharul se spală cu 20 ml acid
clorhidric d = 1,19 care se trece tot în balonul cotat. Peste proba din balon se adaugă 4 ml
fosfowolframat de sodiu 4 %, se aduce la semn cu apă distilată, se omogenizează cu atenţie şi se
filtrează prin filtru cutat, într-un balon Erlenmeyer curat şi uscat.
Din filtratul obţinut se iau 20 ml, se introduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 20 ml
apă distilată şi se neutralizează cu hidroxid de sodiu
concentrat în prezenţa fenolftaleinei. După răcire, conţinutul balonului cotat se aduce la semn şi
se omogenizează. Din soluţia obţinută se iau 10-20 ml şi se determină glucoza prin metodele
Schoorl, Bertrand etc.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de amidon se exprimă în procente faţă de făină.

a • 0,9 • d
Amidon (%) = • 100 în care:
m

a = glucoza determinată prin una din metodele de determinare a glucidelor reducătoare (ex.
Schoorl sau Bertrand etc.), g/10 ml sau g/20 ml;
0,9 = coeficient de transformare a glucozei în amidon (162 g amidon/180g glucoză = 0,9);
m = masa probei luată în analiză, g;
d = diluţiile efectuate.
Observaţii. În determinare intervin şi glucidele proprii ale făinii precum şi cele care rezultă
prin hidroliză hemicelulozelor şi a dextrineior.

53
 3.6.3. Determinarea amidonului prin metoda chimico-enzimatică

Principiul metodei. Se realizează hidroliza enzimatică a amidonului, urmată de hidroliza

acidă a dextrinelor formate şi dozarea glucozei rezultate.
Reactivi:
- Extract de malţ. Se foloseşte malţ din orz proaspăt, curat şi măcinat. Din acest malţ se
prepară un extract imediat înainte de folosire. Pentru fiecare 80 ml extract de malţ necesar, se iau
5 g malţ măcinat, se tratează cu 100 ml apă la temperatura camerei şi se menţine 2 ore, sau 20
minute (la un agitator mecanic). Se filtrează, întorcându-se pe filtru primele porţiuni de filtrat.
Extractul obţinut trebuie să fie limpede.
- Alcool etilic, 96 % (v/v);
- Alcool etilic, soluţie 10 %(v/v);
- Acid clorhidric, d = 1,125. Se diluează 68 ml acid clorhidric concentrat (d = 1,19) la 100 ml;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 10 %;
- Eter etilic.
Modul de lucru
Pe un filtru des, se extrag 5 g făină trecând de cinci ori succesiv câte 10 ml eter etilic. Se
spală cu 150 ml alcool 10 % şi apoi cu câţiva mililitri de alcool 96 %.
Reziduul obţinut se trece cantitativ într-un balon cotat de 250 ml folosind 50 ml apă, se
introduce într-o baie de apă la fierbere şi se agită timp de 5 minute sau până gelatinizează. Se
răceşte la 55°C, se adaugă 20 ml extract de malţ şi se menţine la această temperatură timp de o
oră. Se încălzeşte din nou până la fierbere timp de câteva minute, se răceşte la 55°C, se adaugă
20 ml extract de malţ şi se menţine la această temperatură (pentru hidroliza amidonului) timp de
o oră sau până când -eziduul nu mai dă cu iodul culoare albastră. Se răceşte, se aduce la 250 ml
şi se filtrează.
Se iau 200 ml filtrat într-un balon, se adaugă 20 ml acid clorhidric d = 1,125, se ataşează
balonului un refrigerent ascendent şi se încălzeşte pe baia de apă timp de 2,5 ore (pentru
hidroliza dextrinelor formate anterior la hidroliza enzimatică). Se răceşte, se neutralizează cu
soluţie de hidroxid de sodiu 10 % şi se diluează la 500 ml. Se amestecă bine conţinutul
balonului, se filtrează folosind o hârtie de filtru uscată şi se determină glucoza în 25 sau 50 ml
filtrat prin una din metodele de determinare a glucidelor reducătoare.
În paralel se face o probă martor cu acelaşi extract de malţ, repetându-se modul de lucru
fără a adăuga făină şi se face corecţia pentru glucoză (se scade din glucoza găsită la proba de
analizat).
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Amidonul se exprimă în procente faţă de făină şi se calculează cu relaţia:

a • 0,9 • d
Amidon (%) = • 100 în care:
m

54
 a = glucoza determinată prin una din metodele de determinare a glucidelor reducătoare (ex.
Schoorl sau Bertrand etc.), g/10 ml sau g/20 ml;
0,9 = coeficient de transformare a glucozei în amidon;
m = masa probei luată în analiză, g;
d = diluţiile efectuate.
Observaţii. Metoda elimină influenţa hemicelulozelor asupra rezultatelor deoarece acestea
nu sunt hidrolizate de extractul de malţ (α-amilaza).

55
 3.6.4. Dozarea amidonului prin metoda polarimetrică

Principiul metodei. Amidonul solubilizat în anumite condiţii bine determinate (cu acid
clorhidric, la rece, timp de 30 minute) prezintă o deviaţie specifică, în funcţie de provenienţă,
astfel:
Porumb +202°
Grâu +183°
Orz +181°
Orez +185°
Secară +184°

În condiţiile în care se face solubilizarea amidonului, se dizolvă alături de acesta şi glucide

simple, dextrine, hemiceluloze. Datorită valorii ridicate a deviaţiei specifice a soluţiei de amidon
şi a valorii mici a deviaţiei specifice a glucidelor simple şi a proporţiei lor reduse în făinuri,
precum şi activităţii optice reduse a hemicelulozelor, rezultatele obţinute prin această metodă se
apropie mult de conţinutul real de amidon al făinii. Valorile obţinute se consideră amidon brut.
Aparatură:
- Polarimetru.
Reactivi:
- Acid clorhidric, d = 1,125;
- Acid clorhidric, d = 1,19;
- Fsfowolframat de sodiu, soluţie 4 %: 20 g wolframat de sodiu şi 12 g fosfat disodic se
dizolvă la cald în 40-50 ml apă distilată şi se aduce la 100 ml cu apă distilată.
Modul de lucru
Se cântăresc 2,5 g produs bine mărunţit într-un pahar Berzelius de 100 ml şi se amestecă
bine cu 10 ml apă distilată, folosind o baghetă de sticlă. Se adaugă apoi 20 ml acid clorhidric cu
d = 1,19, amestecând din nou. Se lasă în repaus timp de 30 de minute.
Se trece apoi cantitativ conţinutul într-un balon cotat de 100 ml cu 30 ml acid clorhidric (d
=1,125), se adaugă 5 ml soluţie fosfowolframat de sodiu pentru defecare (precipitarea
substanţelor care prezintă activitate optică şi ar interfera cu amidonul) şi se agită bine balonul. Se
aduce apoi la semn cu apă distilată, omogenizând bine conţinutul balonului. Se filtrează soluţia
printr-un filtru cutat, uscat, într-un vas uscat. Soluţia filtrată se examinează imediat la
polarimetru (examinarea tardivă a soluţiei filtrate este o cauză de erori).
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul procentual în amidon al probei analizate este dat de relaţia:

100 • α • 100
Amidon (%) = în care:
l • [α]D20 • m

α = unghiul citit la polarimetru;

56
 m = masa de produs luată în analiză, g;
l = lungimea tubului polarimetric, dm;
[α]D20 = deviaţia specifică a amidonului

3.6.5. Determinarea polarimetrică a amidonului din tărâţe sau făină furajeră.

Metoda Ewers modificată

Principiul metodei. Are la bază solubilizarea amidonului cu acid ciorhidric la fierbere şi

măsurarea unghiului de rotaţie a luminii polarizate.
Aparatură:
- Polarimetru;
- Baie de apă.
Reactivi:
- Acid ciorhidric, soluţie 0,3 N;
- Wolframat de sodiu, soluţie 12 %. Se dizolvă 12 g wolframat de sodiu cristalizat
(Na2WO4 • 2H2O) în 100 ml apă distilată.
Modul de lucru
Se cântăresc 10 g tărâţe într-un pahar Berzelius de 200 ml, se adaugă 50 ml acid clorhidric
soluţie 0,3 N şi se amestecă cu o baghetă. Apoi conţinutul se trece cantitativ într-un balon cotat
de 200 ml folosind 50 ml soluţie acid clorhidric şi se introduce într-o baie de apă la fierbere,
unde se nenţine 15 minute, agitându-se pe durata primelor 3 minute.
Se răceşte balonul în apă rece până la 20°C, se adaugă 20 ml soluţie fosfowolframat de
sodiu şi se aduce la semn cu apă distilată .
Se filtrează printr-un filtru cutat, iar cu filtratul limpede se măsoară deviaţia la polarimetru.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de amidon se exprimă în procente faţă de tărâţe:

100 • α • 100
Amidon (%) = în care:
l • [α]D20 • m

α = deviaţia citită la polarimetru;

m = masa de produs luată în analiză, g;
l = lungimea tubului polarimetric, dm;
[α]D20 = deviaţia specifică a amidonului.

Valori orientative:
- tărâţe mari 7... 12 %;
- tărâţe fine 8... 15 %;
- făină furajeră 19...30 % (în funcţie de extracţie).

57
 3.6.6. Determinarea celulozei prin metoda cu agenţi de oxidare
Principiul metodei. Se efectuează solubilizarea componentelor produsului de analizat ce
însoţesc celuloza, cu ajutorul unui agent de oxidare format dintr-un amestec de acizi acizii acetic,
azotic, tricloracetic), separarea celulozei prin filtrare şi dozarea ei gravimetric.
Aparatură:
- Creuzet Gooch;
- Etuvă;
- Balanţă analitică.
Reactivi:
- Reactiv de oxidare. Se dizolvă 20 g acid tricloracetic într-un amestec de 750 mi acid
acetic 70 % şi 50 ml acid azotic 65,3 % (d = 1,4);
- Alcool etilic, 95%;
- Eter etilic.
Modul de lucru
Se cântăresc 5 g făină, se introduc cantitativ într-un vas conic şi se adaugă 25 ml reactiv de
oxidare. Vasul conic se adaptează la un refrigerent ascendent şi se încălzeşte la fierbere 30
minute. Se filtrează la cald într-un creuzet Gooch de porţelan, adus la masă constantă prin
menţinere în etuvă a 110°C timp de o oră şi tarat.
Se spală vasul cantitativ cu trei porţiuni de apă fierbinte, care sunt trecute peste acelaşi
filtru, apoi se spală şi filtrul de trei ori cu câte 2 ml alcool etilic şi de trei ori cu câte 2 ml de eter
de petrol. După filtrare, creuzetul se usucă la etuvă la 110°C timp de o oră, iar după răcire în
exsicator se cântăreşte.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de celuloză se exprimă în procente faţă de făină.

m1 – m0
Celuloză (%) = 100
• în care:
m

m0 = masa iniţială a creuzetului Gooch, g;

m1 = masa finală a creuzetului Gooch, g;
m = masa probei luată în analiză, g.

58
 3.6.7. Determinarea conţinutului de fibre solubile, insolubile şi totale
Metoda gravimetrică (Standard AACC 32-07)

Principiul metodei. Hidroliza enzimatică succesivă a probei cu a-amilaza termostabilă,

:rotează şi amiioglucozidază pentru îndepărtarea materialului digestibil amidon, proteine),
urmată de precipitarea poliglucidelor din fibre. Reziduul abţinut este uscat şi cântărit, iar masa
lui este corectată pentru conţinutul :e proteină şi cenuşă.
Aparatură:
- Creuzete fritate (Buchner). În vederea utilizării, creuzetele se pregătesc astfel: se
calcinează ceste noapte la 495°C, se îndepărtează Celita şi cenuşa prin aplicarea vacuumului,
după care se introduc în soluţie de spălare Micro 2 % pentru o oră. Se clătesc cu apă şi apă
ionizată şi în final cu 15 ml acetonă şi se face uscare la aer. În creuzetele uscate se introduce
aproximativ 1 g Celită (pentru uşurarea filtrării) şi apoi se usucă la 130°C până la masă
constantă. Se răcesc în exsicator aproximativ o oră şi se cântăresc.
- Vas de filtrare, cu pereţi rezistenţi, cu volum util de 1 l, etanşat cu o garnitură de cauciuc;
- Sursă de depresiune (vid): pompă de vid sau aspirator capabil să -egleze depresiunea
creată;
- Baie de apă vibratoare de capacitate mare (20-24 l) cu capac, :ermoreglabilă;
- Balanţa, cu precizie de cântărire de 0,1 mg;
- Cuptor de calcinare;
- Etuve, una reglată la 103°C, iar alta la 130°C;
- pH-metru.
Reactivi:
- Etanol 95 % (v/v);
- Etanol, soluţie 78 % (v/v). Se introduc 207 ml apă într-un balon cotat de 1 l şi se adaugă
etanol 95 % până la semn. Se omogenizează;
- Acetonă;
- Enzime: α-amilaza termostabilă (Sigma A5426 sau echivalentă); protează (Sigma P3910
sau echivalentă). Se prepară o soluţie de concentraţie 50mg/ml în tampon MES/TRIS proaspătă;
amiloglucozidază (AMG - Sigma A9913 sau echivalentă);
- Apă deionizată;
- Celită, spălată cu acid, calcinată (Sigma C8656);
- Soluţie de spălare Micro 2 % în apă deionizată;
- Soluţie tampon MES/TRIS, 0,5 M fiecare, pH 8,2 la 24°C. Se dizolvă 19,52 g acid 2 (N-
morfolino)etansulfonic (MES) (Sigma M8250) şi 14,2 g tris (hidroximetil) aminometan (TRIS)
(Sigma T1503) în 1,7 l apă deionizată. Se ajustează pH-ul la 8,2 cu soluţie de hidroxid de sodiu
0,6 N. Se diluează la 2 litri cu apă. Este important să se ajusteze pH-ul soluţiei tampon la ~ 8,3 la
20°C şi ~ 8,1 la 27-28°C;
- Acid clorhidric, soluţie 0,561 N. Se adaugă 93,5 ml soluţie HCI 6 N la aproximativ 700
ml de apă într-un balon cotat de 1 l;

59
 - Standardele de pH . Soluţii tampon la pH 4,0; 7,0; 10,0.
Pregătirea probei
Conţinutul de fibre se determină faţă de substanţa uscată a probei. Pentru aceasta, proba de
făină/tărâţe este uscată peste noapte la etuvă la 70°C. în funcţie de masa iniţială, înainte de
uscare, şi masa finală, după uscare şi răcire în exsicator, se calculează umiditatea probei. Proba
uscată (tărâţele) este apoi măcinată astfel încât să treacă prin sita cu ochiuri de 0,3-0,5 mm.
Proba uscată şi măcinată este păstrată în borcane închise, în exsicator, până la începerea
analizelor.
Modul de lucru
1. Hidroliza enzimatică a componentelor nefibre
Se cântăresc, în două baloane de 400 ml, câte 1g din proba de analizat, cântărit cu precizie
de 0,005 g. Se adaugă 40 ml amestec soluţie tampon MES-TRIS (pH 8,2) în fiecare balon, apoi
se introduce câte o baghetă magnetică pentru agitare şi se face omogenizarea la un agitator
magnetic până la dispersarea completă a probei. Scopul omogenizării este facilitarea accesului
enzimelor la probe.
Continuând omogenizarea (cu viteză mică) se trece la termostatarea cu α-amilaza. În acest
scop, în fiecare balon se adaugă câte 200 μl soluţie α-amilaza termostabilă, se acoperă baloanele
cu folii de aluminiu şi apoi se introduc în baia de apă vibratoare la temperatura de 95...100°C,
unde se menţin 35 min. Cronometrarea începe din momentul introducerii babanelor în baia de
apă fierbinte.
Urmează răcirea babanelor cu probe, scoase din baia de apă. Răcirea se face până la 60°C,
temperatura optimă pentru protează. Dacă este necesar, se curăţă urmele circulare sau gelul din
partea superioară a babanelor cu ajutorul unei spatule. Se clătesc pereţii balonului şi spatula cu
10 ml apă distilată cu ajutorul unei pipete.
Are loc o nouă termostatare, în prezenţa proteazei. Pentru aceasta, în fiecare balon se
adaugă câte 100 μl soluţie protează, se acoperă cu folie de aluminiu şi se introduc în baia de apă
vibratoare încălzită la 60±1°C, unde se menţin timp de 30 min. Cronometrarea începe când
temperatura băii de apă atinge 60°C.
Se scot babanele din baia de apă şi în continuare se ajustează pH-ul probelor, urmărindu-se
să se aducă la valori de 4,1 ... 4,8, pH optim pentru activitatea amiloglucozidazei, enzimă care va
completa hidroliza amidonului din probe. În acest scop, continuând agitarea, în fiecare probă se
adaugă câte 5 ml soluţie de acid clorhidric 0,561 N. Se verifică la pH-metru pH-ul, care trebuie
să fie 4,1 ... 4,8. Dacă este necesar, se face ajustarea pH-ului, prin adăugarea de soluţie de
hidroxid de sodiu 5 % sau de soluţie de acid clorhidric 5 %.
O dată create condiţiile optime de temperatură (60°C) şi de pH (4,1...4,8) pentru
amiloglucozidază, urmează o a treia termostatare în prezenţa acestei enzime. Pentru aceasta, se
adaugă în cele două baloane, câte 300 μl soluţie de amiloglucozidază, în timp ce se continuă
agitarea cu bagheta magnetică. Se acoperă cu folie de aluminiu şi se introduc în baia de apă
vibratoare la 60°C timp de 30 min. pentru hidroliza enzimatică. Se începe cronometrarea când
temperatura din baia de apă atinge 60°C.
Cu probele astfel pregătite se trece la determinarea fibrelor.
60
 2. Determinarea fibrelor insolubile (IDF)
Hidrolizatul enzimatic obţinut anterior se filtrează. Filtrarea se face prin creuzet într-un vas
de filtrare, pentru cele două probe paralele. În vederea filtrării, creuzetele care conţin Celită se
cântăresc cu precizie de 0,1 mg (tara). Se umectează stratul de Celită cu 3 ml apă distilată şi apoi
se face o absorbţie la creuzete pentru a apropia Celita de creuzete. Se spală cu apă baloanele în
care s-a făcut hidroliza enzimatică, se trec apele de spălare prin creuzet, se spală şi cele două
reziduuri de două ori cu câte 10 ml apă distilată preîncălzită la 70°C.
Filtratele obţinute se transferă în baloane cu capacitatea de 600 ml, tarate în prealabil, şi vor
fi folosite pentru dozarea fibrelor solubile (SDF).
Reziduurile de pe filtru sunt folosite pentru dozarea fibrelor insolubile (IDF). În acest scop
ele se spală mai departe de două ori, odată cu 10 ml etanol 95 % şi a doua oară cu 10 ml acetonă.
Creuzetele împreună cu reziduurile se usucă peste noapte la etuvă la 103°C. Se răcesc în
exsicator aproximativ o oră şi se cântăresc cu precizie de 0,1 mg. Se calculează masa celor două
reziduuri, R1 şi R2, scăzând din cântăririle făcute (reziduu + creuzet cu Celită) tara creuzetelor cu
Celită.
Pentru corectarea conţinutului de fibre, se ţine seama de hidroliza incompletă a proteinelor
şi de conţinutul de cenuşă al probei analizate. în acest scop, unul din reziduurile obţinute mai sus
(R1) este analizat pentru proteine, iar cel de-al doilea (R2) pentru cenuşă. Analiza pentru
proteine constă în determinarea conţinutului de proteine prin metoda Kjeldahl al reziduului R1,
iar analiza pentru cenuşă constă în calcinarea reziduului R2 la 495°C timp de 5 ore, urmată de o
răcire în exsicator şi cântărire cu precizie de 0,1 mg. Cenuşa (A) se obţine scăzând tara
creuzetului cu Celită.
3. Determinarea fibrelor solubile (SDF)
Se folosesc filtratele obţinute la determinarea fibrelor insolubile, care au fost colectate în
baloane cu capacitatea de 600 ml, tarate în prealabil. Aceste filtrate conţin fibrele solubile. Cele
două filtrate se cântăresc, după care se face precipitarea fibrelor solubile cu etanol 95 %. Pentru
aceasta, filtratele se tratează cu 4 volume de etanol 95 % preîncălzit la 60°C faţă de masa
filtratelor. O parte din acest etanol este folosit pentru clătirea vaselor de filtrare, după transferul
filtratelor în baloanele de 600 ml. Alternativ se poate ajusta masa filtratului + apele de spălare la
80 g şi se adaugă 320 ml etanol 95 % preîncălzit la 60°C.
Se lasă să se precipite la temperatura camerei timp de 60 min, după care se filtrează prin
creuzet. În vederea filtrării, creuzetele care conţin Celită se cântăresc cu precizie de 0,1 mg, se
umectează stratul de Celită cu 15 ml etanol 78 %, după care creuzetele se supun unei absorbţii
pentru a apropia Celita de creuzet cât mai mult.
Se filtrează, se spală cele două baloane cu etanol 78 % pentru a transfera cantitativ
precipitatul în creuzete, după care, utilizând vacuumul, reziduurile se spală succesiv de două ori
cu câte 15 ml din soluţiile: etanol 78 %; etanol 95 % şi acetonă. Reziduurile astfel obţinute se
usucă peste noapte în etuvă la 103°C, se răcesc în exsicator aproximativ 1 oră şi se cântăresc.
Masa reziduurilor (R1 şi R2) se obţine scăzând tara creuzetelor cu Celită.
Pentru corectarea conţinutului de fibre ţinând seama de hidroliza incompletă a proteinelor
şi de conţinutul de cenuşă al probei, după cântărire, în reziduul R1 se determină conţinutul de
61
proteine prin metoda Kjeldahl, iar în reziduul R2 se determină conţinutul de cenuşă prin
calcinare la 495°C timp de 5 ore şi după răcire cântărind cenuşa. Cenuşa (A) se obţine scăzând
tara creuzetului cu Celită.
4. Determinarea fibrelor totale (TDF)
În hidrolizatul enzimatic obţinut (punctul 1) se face precipitarea fibrelor alimentare cu
etanol. În acest scop, la fiecare din cele două hidrolizate (probe) se adaugă 225 ml etanol 95 %
preăncălzit la 60°C (volumul se măsoară după ce s-a făcut încălzirea). Raportul volumului de
etanol faţă de volumul probei trebuie să fie 4:1. Se acoperă probele cu folii de aluminiu, se lasă
să precipite la temperatura camerei timp de 60 de min, după care se filtrează. Se folosesc
creuzete cu Celită. În vederea filtrării, creuzetele cu Celită se cântăresc cu precizie de 0,1 mg, se
umectează stratul de Celită cu 15 ml etanol 78 %, după care creuzetele se supun unei absorbţii
pentru a apropia cât mai mult Celita de creuzet.
Se filtrează, se spală baloanele în care s-au format precipitatele cu etanol 78 % pentru a
trece cantitativ conţinutul acestora în creuzete, după care utilizând vacuumul, reziduurile se spală
succesiv de două ori cu câte 15 ml din soluţiile: etanol 78 %, etanol 95 %, acetonă. Reziduurile
astfel obţinute se usucă peste noapte la etuvă la 103°C, se răcesc în exsicator aproximativ 1 oră şi
se cântăresc. Masa reziduurilor (R1 şi R2) se obţine scăzând tara creuzetelor cu Celită.
Pentru corectarea conţinutului de fibre totale se ţine seama de hidroliza incompletă (cu
protează) a proteinelor şi de conţinutul de cenuşă al probei. Pentru aceasta în reziduul R1 se
determină proteinele prin metoda Kjeldahl, iar în reziduul R2 se determină cenuşa, prin
calcinarea la temperatură de 495°C timp de 5 ore, răcire şi cântărire. Conţinutul de cenuşă (A) se
obţine scăzând tara creuzetului cu Celită.
5. Probe martor
În paralel cu analiza conţinutului de fibre al probei de analizat, se fac două probe martor
pentru a observa contribuţia reactivilor asupra reziduului. Se urmează acelaşi mod de lucru cu
deosebirea că în loc de 1 g probă se ia 1 ml apă distilată.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de fibre solubile, insolubile şi totale, se exprimă în procente faţă de proba
analizată. Indiferent de tipul de fibre determinat, calculul se face folosind relaţia:

R1 + R2 – P – A – RM
2
Fibre alimentare (%) = • 100 în care:
m1 + m2
2

R1 = masa reziduului obţinut din m1, g;

R2 = masa reziduului obţinut din m2, g;
m1 = masa probei 1;
m2 = masa probei 2;
P = masa proteinei din reziduul R1; g;
A = masa cenuşii din reziduul R2;

62
RM = reziduul probei martor;
RM1 + RM2
RM = – PM1 – AM2
2
RM1 = masa reziduului martorului 1;
RM2 = masa reziduului martorului 2;
PM1 = masa proteinei din RM1;
AM2 - masa cenuşii din RM2 .
Observaţie. Metoda se aplică şi pentru produsele obţinute pe bază de cereale.

63
 IV. DOZAREA ACIDULUI FITIC
4.1. Determinarea acidului fitic prin metoda titrimetrică (Garcia-Villanova)

Principiul metodei. Tratarea probei cu o sare ferică şi titrarea ionilor Fe3+ care au precipitat
cu acidul fitic, cu soluţie EDTA în prezenţa acidului sulfosalicilic ca indicator.
Aparatură:
- Balanţă analitică;
- Baie de apă.
Reactivi:
- Soluţie HCl-Na2SO4. Soluţie 0,4 M HCI ce conţine 5 % sulfat de sodiu;
- Soluţie 0,2 M FeCl3 în soluţie 0,16 M HCI;
- Acid sulfosalicilic, soluţie 20 %;
- Glicocol, soluţie sărată. Conţine 0,75 g glicocol, 0,585 g NaCI într- un volum de 100 ml;
- EDTA (acid etilendiaminotetraacetic), soluţie 0,01 M.
Modul de lucru
Se cântăresc 2 g făină sau grâu măcinat care trece prin sită cu ochiuri de 500 μm, se adaugă
40 ml soluţie HCI-Na2SO4 şi se lasă în repaus timp de 90 min. agitând cu intermitenţă (pentru
extragerea acidului fitic). Se filtrează, iar din filtrat se iau 25 ml, se introduc într-un tub prevăzut
cu dop, se adaugă 20 ml soluţie HCI-Na2SO4, 20 ml soluţie clorhidrică de clorură ferică şi 20 ml
soluţie acid sulfosalicilic 20 %. Se fierbe în tubul închis timp de 15 min. pe baie de apă, după
care se răceşte sub jet de apă. Se formează precipitatul feric care se separă prin filtrare. Din
filtratul (limpede) obţinut se iau 25 ml, se introduc într-un vas Erlenmeyer, se adaugă
aproximativ 175 ml apă distilată, după care se reglează pH-ul la 2,5±0,5 cu soluţie sărată de
glicocol. Amestecul obţinut este încălzit la 70°C şi se titrează (la cald) excesul de Fe3+ care nu a
precipitat cu acidul fitic, cu soluţie EDTA 0,01 M până la virarea culorii în galben strălucitor.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de acid fitic se exprimă în procente şi se calculează cu relaţia:

10 – V
Acid fitic (%) = 1,32 • în care:
m

V = volumul soluţiei de EDTA 0,01 M folosit la titrare,

m = masa probei luată în analiză.

64
 V. LIPIDE
5.1. REACŢII SPECIFICE GRĂSIMILOR DIN ŢESUTURI VEGETALE ŞI
ANIMALE

Dozarea grăsimilor din ţesuturi vegetale, animale şi produse alimentare are la bază
solubilitatea acestor compuşi în solvenţi organici (eter etilic, eter de petrol) şi se poate face prin
metode extractive, refractometrice şi spectrofotometrice.

5.1.1. Determinarea grăsimii prin metoda Soxhlet

Extracţia şi determinarea conţinutului de grăsime brută al unor ţesuturi vegetale sau

animale se poate face cu ajutorul extractorului Soxhlet. Produsul obţinut după îndepărtarea
solventului se numeşte grăsime brută, întrucât în extract trec, pe lângă lipide propriu-zise, şi alte
substanţe (înrudite cu lipidele), cum ar fi răşini, uleiuri eterice, ceruri, precum şi pigmenţi
vegetali.
Extractorul Soxhlet are trei componente: balonul, extractorul propriu-zis şi refrigerentul.
În extractor se introduce un cartuş filtrant special sau un plic din hârtie de filtru, care conţine
materialul de extras, peste care se toarnă solventul până când acesta sifonează în balonul de sticlă
de la baza extractorului. Sifonarea se produce atunci când nivelul lichidului trece peste nivelul
sifonului.
Deoarece solvenţii organici sunt inflamabili şi o încălzire cu flacără ar putea cauza
accidente grave, balonul de sticlă se încălzeşte cu ajutorul unei surse electrice, iar vaporii
solventului ajung în refrigerent, unde se condensează şi cad în extractor peste cartuşul sau plicul
de hârtie, care conţine materialul biologic. Se acumulează în extractor o cantitate din ce în ce mai
mare de solvent care îmbibă cartuşul, extrăgând la rece grăsimea din material. Atunci când
depăşeşte nivelul sifonului, solventul, care conţine o anumită cantitate de grăsime extrasă, ajunge
înapoi în balon şi procesul se repetă, realizându-se astfel extracţii repetate, cu aceeaşi cantitate de
solvent.
Întraga operaţiune durează 4-6 ore, finalizată cu extracţia întregii cantităţi de grăsime în
balon şi recuperarea solventului care revine la aspectul său iniţial (incolor).
Există două variante ale mtodei Soxhlet:
1) cântărirea grăsimii brute (rămasă în balon);
2) cântărirea materialului uscat, rămas după extracţie în cartuş (metoda Ruşcovski).

1) Metoda Soxhlet prin cântărirea grăsimii brute (rămasă în balon)

Această variantă a metodei Soxhlet este mai exactă, fiind considerată o metodă de
referinţă pentru determinarea grăsimii brute din ţesuturi vegetale, animale şi produse alimentare.
Aparatură. 1. Aparat de extracţie continuă, model Soxhlet, cu balon de 250 ml, extractor
de 150 ml şi refrigerent.
2. Etuvă electrică.

65
 Reactivi şi materiale 1. Eter de petrol p.a. sau eter etilic p.a. (cu reziduu la evaporare 
0,002 %).
2. Sulfat de sodiu anhidru sau nisip şi vată fără urme de grăsime.
3. Cartuşe filtrante sau plicuri confecţionate din hârtie de filtru.
Modul de lucru. Se cântăresc la balanţa analitică cca. 5-10 g din materialul de analizat şi
se introduc într-un cartuş filtrant sau plic. Dacă proba este dintr-un produs alimentar cu umiditate
ridicată şi consistenţă moale (ex. carne tocată), peste produsul cântărit, aşezat pe o fâşie de vată,
se adaugă o cantitate egală sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru sau nisip. Se rulează vata cu
grijă şi se introduce în cartuşul filtrant sau plicul făcut din hârtie de filtru.
În cazul probelor cu un conţinut mare de grăsime, cartuşul cu proba se introduce într-o
fiolă de sticlă curată şi uscată. Cartuşul sau fiola, conţinând proba de analizat, se aşează pe un
capac Petri sau pe o tavă emailată curată şi uscată şi se introduce în etuvă, unde se usucă timp de
6 ore la temperatura de 103  2C sau o oră şi jumătate la 125  2C.
Se pregătesc unul sau mai multe baloane Soxhlet (corespunzător numărului de probe
luate în lucru) curate, uscate, care se tarează la balanţa analitică.
Se asamblează cele trei componente ale aparatului, care se fixează în stativ. După uscare,
fiolele sau cartuşele cu probe se scot din etuvă şi se răcesc, apoi fiecare cartuş (plic) se introduce în
extractorul aparatului. Fiolele în care au fost cartuşe şi în care se observă urme de grăsime, se
clătesc de câte 3-4 ori cu cantităţi mici de solvent care se adaugă în balonul extractorului. Se toarnă
solventul (de preferinţă eter de petrol) printr-o pâlnie, prin partea de sus a aparatului, până are loc o
sifonare şi apoi încă 25-30 ml în exces, pentru a se evita lipsa solventului din balon înainte de o
nouă sifonare. Se acţionează circuitul continuu de apă rece în refrigerent, apoi se conectează sursa
de căldură şi se reglează în aşa fel distilarea, încât să se asigure 10-12 sifonări pe oră.
Dacă extracţia trebuie continuată a doua zi, trebuie ca, după răcirea băii, să rămână în
extractor o cantitate de solvent egală cu 1/2-1/3 din capacitatea acestuia, pentru ca plicul
(cartuşul) să nu rămână într-un mediu uscat, care ar prelungi durata determinării.
După cca. 6 ore de distilare continuă, extracţia se consideră încheiată, dar nu înainte de a
verifica acest fapt cu ajutorul unei hârtii de filtru, pe care se picură 1-2 picături din solventul care
sifonează. Dacă după evaporare pe hârtia de filtru nu rămâne nici o pată grasă, înseamnă că toată
grăsimea din probă a fost extrasă şi putem scoate plicul din extractor.
Pentru recuperarea solventului, se procedează în felul următor: când extractorul este
aproape umplut (înainte de sifonare), se desface instalaţia şi solventul din extractor se colectează
într-un recipient. Se continuă această operaţiune până când din refrigerent nu mai cad picături de
solvent condensat, deci când întreaga cantitate de solvent din balon s-a colectat, rămânând în
interior doar grăsimea extrasă.
Se dazasamblează instalaţia şi balonul cu grăsimea extrasă se mai menţine încă 10-15
minute pe baia de apă pentru îndepărtarea urmelor de solvent, după care se şterge la exterior cu
hârtie de filtru şi se introduce în etuva reglată la 103  2C, menţinându-se timp de 60 de minute.
O temperatură mai mare de uscare ar duce la oxidarea grăsimii.

66
 Următoarea etapă este răcirea balonului în exicator şi cântărirea balonului cu grăsimea
extrasă, urmată de uscări repetate de câte 20-30 minute fiecare şi repetarea cântăririi până la
greutate constantă.

Calculul rezultatelor. Conţinutul de grăsime al probei analizate se calculează astfel:

mg
Grăsime % = • 100 în care:
mp

mg = cantitatea (masa) de grăsime extrasă, în g. Se deduce din diferenţa între greutatea

balonului cu grăsime extrasă, după uscare şi greutatea balonului gol (tara).
mp = cantitatea (masa) de material biologic analizat.
Observaţii. Se poate exprima şi conţinutul de grăsime raportat la substanţa uscată.
(grăsime, % S.U.), care se calculează cu ajutorul relaţiei:

G%
Grăsime, % S.U. = . 100 în care:
100  U%

G % = conţinutul de grăsime al probei analizate;

U % = umiditatea probei, în procente.

5.1.2. Determinarea grăsimilor din făinuri sau aluat prin metoda

de extracţie cu amestec de solvenţi

Principiul metodei. Lipidele din făină sau din aluat sunt extrase cu un amestec de solvenţi
hidrofobi şi hidrofili format din cloroform, metanol şi apă sărată. Prezenţa alcoolului permite
inhibarea activităţii lipazice, iar combinarea unui solvent polar şi a unui solvent nepolar permite
ruperea legăturilor stabile între lipide şi alţi constituenţi ai făinii (aluatului). Prezenţa apei şi a
unei forţe ionice permit decantarea cloroformului, în care se solubilizează lipidele, de amestecul
metanol/apă.
Aparatură:
- Agitator - omogenizator;
- Centrifugă;
- Recipient ermetic;
- Balanţă analitică;
- Etuvă, reglabilă la 105°C
Reactivi:
- Acid acetic glacial;
- Metanol;

67
 - Cloroform, care conţine 0,05% BHT (butilhidroxitoluen);
- Apă sărată, cu conţinut în NaCl de 1 % pentru determinarea lipidelor din făină şi de 1,25
% pentru determinarea lipidelor din aluat.
Modul de lucru
Se cântăreşte, cu precizie de 0,01 g, o cantitate de făină sau aluat (proaspăt recoltat sau
congelat pentru blocarea activităţii enzimatice) echivalentă cu 5 g substanţă uscată, într-un vas
cilindric. La aceasta se adaugă succesiv, 100 μl acid acetic, 20 ml metanol, de două ori câte 10
ml cloroform conţinând 0,05 % BHT şi un volum de apă sărată, astfel ca volumul final de apă în
amestec să fie 20 ml şi conţinutul de NaCl 1 % (60 mm forţă ionică); adică pentru 6 g făină
umedă (5 g substanţă uscată) se adaugă 20 ml apă cu 1 % NaCI, iar pentru 12 g aluat (preparat
din 100 g făină şi 60 ml apă; fără adaos de sare) se adaugă 16 ml apă conţinând 1,25% NaCl.
După fiecare incorporare de solvent, amestecul se omogenizează timp de 120 s, cu ajutorul
omogenizatorului (viteza maximă).
Amestecul obţinut se centrifughează 10 min la 6000 rot./min. şi 4°C. Un volum de 10 ml
din faza cloroformică, măsurat cu pipeta, care conţine lipidele extrase, se introduce într-un balon,
adus în prealabil la masă constantă prin menţinere 2-3 ore la etuvă la 105°C, răcit şi cântărit la
balanţa analitică.
Balonul se ataşează la un refrigerent şi se distilă cloroformul, fiind aşezat pe o baie de apă.
Apoi se usucă la etuvă la 105°C până la masă constantă. Se lasă balonul în exsicator şi se
cântăreşte la balanţa analitică.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de lipide se exprimă în g la 100 g produs:

m2 – m1
Lipide libere şi legate (%) = • d •100 în care:
m

m1 = masa balonului gol, g;

m2 = masa balonului cu lipidele extrase, g;
m = masa de produs luată la analiză, g;
d = diluţia (2).

68
 5.1.3. Determinarea conţinutului de grăsime prin metoda butirometrică

Conţinutul de grăsime al probelor de lapte şi produse lactate se poate determina prin

metoda acido-butirometrică, cu ajutorul butirometrului Van Gulik.
Reactivi: 1. Acid sulfuric (d= 1,522);
2. Alcool izoamilic, d= 0,810.
Modul de lucru. În paharul butirometrului se introduc 3 g din proba de analizat bine
omogenizată. Prin deschiderea superioară se introduce acid sulfuric cu grijă ca să se scurgă încet
pe pereţii butirometrului, până ce se acoperă păhărelul cu proba de analizat. Se închide
butirometrul cu dopul de cauciuc şi se încălzeşte timp de 5 minute, pe baia de apă la temperatura
de 65ºC, după care butirometrul se agită puternic timp de 10 secunde. Operaţia se repetă până la
dizolvarea completă a probei de analizat.
Se adaugă în butirometru 1 ml alcool izoamilic şi se agită timp de 3 minute, după care se
completează cu acid sulfuric până la reperul 35% de pe scara butirometrului. Se agită prin
răsturnări repetate şi se centriughează timp de 10minute, apoi se menţine din nou în baia de apă
la 65ºC timp de 5 minute.
Se citesc pe scara gradată a tijei butirometrului valorile corespunzătoare pentru nivelul
inferior şi superior al coloanei de grăsime. Dacă grăsimea este tulbure sau închisă la culoare,
determinarea trebuie repetată.
Calculul rezultatelor:
Grăsime % = B – A în care:
A – valoarea corespunzătoare nivelului superior, în %;
B – valoarea corespunzătoare nivelului inferior, în %.
Conţinutul de grăsime, raportat la substanţa uscată, se calculează astfel:
G
Grăsime în S.U. % = 100 în care:
100  A
G – conţinutul de grăsime determinat cu butirometrul, în %;
A – conţinutul de apă, în %.

69
 5.1.4. Determinarea indicelui de peroxid

Principiul metodei. În primele etape ale procesului de alterare a grăsimilor se formează

peroxizi, prin adiţionarea oxigenului la dublele legături. Peroxizii pun în libertate iodul din
iodura de potasiu, care se titrează cu tiosulfat de sodiu. Determinarea peroxizilor se face în
mediu acid, când se produce trecerea iodurii în acid iodhidric:

R1CHCHR2 + 2CH3COOH + 2KI = R1CHCHR2 + I2 + 2CH3COOK + H2O

O O O
Iodul pus în libertate este titrat cu tiosulfat de sodiu în prezenţa soluţiei de amidon, ca indicator:

I2 + 2Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6

Reactivi necesari:
1.Cloroform;
2. Acid acetic glacial;
3. Soluţie saturată de iodură de potasiu, care se prepară în momentul utilizării;
4. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,01N;
5. Soluţie de amidon 1%.
Modul de lucru. Într-un flacon conic de 100-150 ml se cântăreşte la balanţa analitică 1 g
de grăsime cu o exactitate la a 4-a zecimală. Într-un alt flacon (control) se măsoară 2 ml apă. În
ambele flacoane se adaugă cu un cilindru câte 10 ml cloroform şi se agită până la dizolvarea
grăsimii. Apoi se măsoară în fiecare flacon câte 15 ml acid acetic glacial (cu un cilindru) şi 1 ml
soluţie iodură de potasiu (cu pipeta). Conţinutul flacoanelor se agită şi se lasă la întuneric. După
3 minute, se titrează iodul eliberat cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,01 N. Titrarea se continuă
până la culoarea galben, după care se pipetează în fiecare flacon câte 1 ml soluţie de amidon şi se
titrează apoi până la dispariţia culorii albastre.
Calculul rezultatelor. Indicele de peroxid al grăsimii cercetate se calculează cu ajutorul
formulei:
(Vv) . F . 0,00127 . 100 unde:
IP =
G

V = ml soluţie de tiosulfat 0,01 N consumaţi la titrarea probei cu grăsime;

v = ml soluţie de tiosulfat 0,01 N consumaţi pentru control;
F = factorul soluţiei de tiosulfat de sodiu.
0,00127 = cantitatea de iod (g) echivalentă pentru 1 ml soluţie de tiosulfat 0,01 N;
G = greutatea grăsimii analizate.
Aprecierea gradului de alterare oxidativă a grăsimii, în funcţie de valoarea indicelui
peroxidic, este în continuare:

70
Indice peroxidic (% Iod) Grad de alterare
mai mic de 0,03…………………………………… ……........................grăsime proaspătă
0,03-0,06…...................................grăsime proaspătă, dar nerecomandabilă pentru păstrare
0,06-0,10………………………………………………….grăsime cu prospeţime dubioasă
mai mare de 0,1…………………………………………...........................grăsime alterată.

71
 5.1.5. Determinarea indicelui de iod al grăsimilor prin metoda Hanus

Indicele de iod reprezintă cantitatea de iod, în g, adiţionat de acizii graşi nesaturaţi din
100 g grăsime.
Legăturile duble ale acizilor graşi nesaturaţi din componenţa grăsimilor conferă acestor
acizi o instabilitate chimică pronunţată, care se manifestă prin capacitatea lor de a adiţiona uşor
halogeni la nivelul acestor legături.
Proporţia acizilor graşi nesaturaţi (numărul dublelor legături) din compoziţia chimică a
grăsimilor condiţionează valoarea indicelui de iod. Astfel, grăsimile cu un conţinut ridicat de
acizi graşi nesaturaţi au un indice de iod mare (uleiurile), iar cele cu un conţinut mai mic de acizi
graşi nesaturaţi, au, corespunzător, şi un indice de iod mai mic (grăsimile animale, ex. untul).
Principiul metodei Hanus. O anumită cantitate de grăsime se tratează cu o soluţie de iod,
apoi se titrează excesul de iod rămas neconsumat cu o soluţie de tiosulfat de sodiu. Cantitatea de
iod adiţionată de acizii graşi se calculează din diferenţa între volumele soluţiei de tiosulfat
folosite la titrarea probei analizate şi la titrarea probei martor.
Reacţiile chimice care stau la baza metodei Hanus sunt următoarele:

RCH=CHR + 2KI + 2BrI RCH−CHR + I2 + 2 KBr

Grăsime I I

I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

Reactivi. 1. Cloroform sau tertraclorură de carbon p.a.

2. Reactiv Hanus (monobromură de iod). Este gata preparat şi se achiziţionază de la
unităţile de aprovizionare specializate. Se păstrează în sticle brune şi la întuneric. 1000 g soluţie
Hanus conţine: 978 g acid acetic glacial, 13 g I şi 9 g Br. Pentru prepararea a 200 ml soluţie
Hanus, într-un vas de culoare brună, se dizolvă 2,6 g iod în 200 ml acid acetic glacial încălzit. Se
răceşte amestecul la temperatura camerei, apoi se adaugă 1,8 ml (0,63ml?) soluţie saturată de
brom şi se închide cu un dop etanş.
3. Iodură de potasiu, soluţie 15 % proaspăt preparată.
4. Tiosulfat de sodiu, soluţie 0,1 N.
5. Amidon, soluţie 1 % proaspăt preparată.
Modul de lucru. Grăsimea care se analizează trebuie să fie bine purificată, astfel încât să
nu conţină şi alte substanţe cum ar fi: impurităţi mecanice, apă, substanţe proteice etc. Pentru o
determinare cât mai exactă, este necesară o corelare a cantităţii de grăsime care se ia în lucru cu
indicele de iod probabil al acesteia, după cum urmează:
 1,00 g pentru indicele de iod cuprins între 10-50;
 0,60 g pentru indicele de iod cuprins între 50-70;
 0,25 g pentru indicele de iod cuprins între 70-120;
 0,15 g pentru indicele de iod mai mare de 120.

72
 De exemplu, în cazul grăsimilor animale se folosesc următoarele cantităţi: 1,00 g pentru
unt şi 0,25-0,60 g pentru celelalte grăsimi de origine animală.
Într-un vas de iod de 300 ml, cu dop rodat, se introduce cantitatea de grăsime cântărită la
balanţa analitică şi se adaugă 10 ml cloroform sau tetraclorură de carbon, sub agitare continuă
pentru dizolvare completă, apoi 25 ml soluţie Hanus. Cunoscându-se greutatea exactă a vasului,
grăsimea (topită) se poate cântări şi cu vasul de iod, greutatea acesteia aflându-se prin diferenţă.
După omogenizare, se astupă cu dopul şi se lasă la întuneric 30-60 minute (în funcţie de
valoarea indicelui de iod). Se adaugă apoi 20 ml soluţie iodură de potasiu şi 100 ml apă distilată,
cu care se spală bine dopul şi gâtul vasului pentru a nu rămâne urme de iod pe acestea.
Se titrează repede cu soluţie tiosulfat de sodiu 0,1 N. Spre sfârşitul titrării, adică atunci
când culoarea lichidului din vas este galben-pai, se adaugă 1 ml soluţie de amidon şi se continuă
titrarea, picătură cu picătură, până la dispariţia bruscă a culorii albastre.
În aceleaşi condiţii, dar fără grăsime, se efectuează, în paralel două probe martor.
Calculul rezultatelor. Valoarea indicelui de iod se calculează cu ajutorul formulei
următoare:

0,01269 . (V0Vp)
Indice de iod = . 100 în care:
m

0,01269 = cantitatea de iod, în g, corespunzătoare la 1 ml tiosulfat de sodiu 0,1 N;

V0 = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei martor (media
celor două probe martor);
Vp = volumul soluţiei de tiosulfat de sodiu, în ml, folosit la titrarea probei de lucru;
m = cantitatea de grăsime, în g, luată pentru analiză .

73
 5.1.6. Determinarea indicelui de refracţie al grăsimilor

Raportul dintre sinusul unghiului de incidenţă (i) şi sinusul unghiului de refracţie (r) al unei
raze de lumină se numeşte indice de refracţie (n). De regulă, se alege ca mediu de referinţă aerul,
iar indicele de refracţie al diferitelor substanţe în raport cu aerul se notează: n = sin i / sin r.
Valoarea indicelui de refracţie depinde de cantitatea şi natura substanţei cercetate, de
temperatura mediului extern, de lungimea de undă a luminii folosite etc.
Indicele de refracţie al grăsimilor, ca şi al altor substanţe, se poate determina cu ajutorul
refractometrului Abbé, utilizabil atât pentru substanţe lichide a cât şi pentru solide. Valorile
indicelui se pot citi direct la aparat, nefiind nevoie de nici un calcul.
Valoarea indicelui de refracţie creşte odată cu creşterea conţinutului de hidroxiacizi a
grăsimii şi cu indicele de iod (grăsime cu conţinut ridicat de acizi graşi nesaturaţi). De asemenea,
încălzirea probei de grăsime duce la creşterea, odată cu temperatura, a valorii acestui indice.
Lipidele au, în general, indicele de refracţie cuprins între 1,450 şi 1,482, cu valori mai mari
pentru uleiuri (1,460-1,482) şi mai mici pentru: unt, seu, untură de porc (1,450-1,460).
Părţile componente ale refractometrului Abbé(fig. 1).Aparatul este format din două
prisme identice din sticlă specială: prisma de iluminare (2) şi prisma de măsurare (1), situate într-
un corp metalic paralelipipedic, între care se introduce materialul de analizat. Aceste prisme au
un orificiu (8), în care este fixat un termometru pentru citirea temperaturii probei în timpul
determinării şi se pot roti în jurul unui ax orizontal, prin intermediul dispozitivului numit alidadă
(4). Prisma inferioară (de iluminare) este mobilă, are o suprafaţă mată care vine în contact cu
substanţa de cercetat şi serveşte pentru a primi lumina de reflecţie de la o oglindă (3) situată la
partea inferioară a aparatului. Prisma superioară (de măsurare) este fixă şi are suprafaţa lustruită,
care vine în contact cu substanţa de cercetat.
Refractometrul Abbé mai conţine o lunetă pentru observarea câmpului (5), cu un sistem
de compensare a luminii. Deoarece acest aparat utilizează lumina albă, din cauza dispersiei, în
ocularul lunetei, în locul unei limite de separaţie nete între cele două câmpuri apărute (luminat şi
întunecat), se obţine o bandă spectrală irizată, neclară. Pentru înlăturarea acestui efect se
foloseşte compensatorul de dispersie (6), fixat în partea inferioară a tubului lunetei, care constă
din două prisme Amici, prin a căror rotire, cu ajutorul unui buton, se obţine o limită de separaţie
netă a câmpului.
Alte componente ale aparatului sunt: o lunetă cu scală gradată pentru citirea indicilor de
refracţie (7) şi un dispozitiv pentru încălzirea probelor la diverse temperaturi (9).

74
 Fig. 1. Refractometrul Abbé

Funcţionarea aparatului. Raza de lumină de la oglinda refractometrului trece prin prisma

de iluminare, străbate stratul lichidului de cecetat şi prisma de măsurare, apoi pătrunde în lunetă.
În ocularul lunetei se vede un câmp luminat. Complexul prismelor poate fi rotit cu ajutorul unui
buton al alidadei în aşa fel, încât într-o anumită poziţie are loc reflexia interioară totală a razei de
lumină pe suprafaţa materialului de cercetat şi în ocularul lunetei apare un câmp, pe jumătate
luminat, pe jumătate întunecat. Unghiul de rotire al prismelor depinde de indicele de refracţie al
materialului analizat. Când limita de separaţie dintre câmpul luminat şi cel întunecat se
suprapune pe intersecţia firelor reticulare, se citeşte indicele de refracţie pe sectorul circular
gradat, urmărind totodată şi temperatura apei de termostatare cu ajutorul termometrului.
Modul de lucru. Prima operaţiune este etalonarea refractometrului, care se face la 20C.
Pentru aceasta, se deschid prismele, se lasă să cadă dintr-o pipetă 1-2 picături de apă distilată pe
suprafaţa prismei de iluminare, după care se închid repede. Se acţionează sectorul circular astfel
ca reperul scării gradate să fie fixat la valoarea 1,333. Cu celălalt ocular al lunetei se urmăreşte
câmpul optic, care trebuie să se prezinte ca două câmpuri, unul iluminat şi altul întunecat, limita
de separaţie dintre ele situându-se pe intersecţia celor două fire centrale perpendiculare (firele
reticulare). În cazul în care limita de separaţie este deplasată, se acţionează butonul alidadei
astfel încât această separaţie să ajungă exact pe intersecţia firelor. După terminarea etalonării se

75
deschide blocul prismelor, se usucă feţele lor cu hârtie de filtru şi se şterg cu vată îmbibată în
alcool. Blocul prismelor se lasă deschis un anumit timp pentru uscare.
Pentru determinarea indicelui de refracţie al unei probe (ulei, ser etc.) se picură între
prisme 2-3 picături din produs, se reglează temperatura de termostatare, după care se închide
blocul prismelor şi se mişcă butonul alidadei până ce câmpul apare jumătate luminat şi jumătate
întunecat, cu limita de separaţie dintre ele pe intersecţia firelor reticulare. La nevoie se
acţionează compensatorul de dispersie şi se citeşte valoarea indicelui de refracţie pe scara
gradată. Se ia media a 2-3 citiri.
După fiecare determinare se deschid prismele, se absoarbe produsul cu o hârtie de filtru şi
se curăţă suprafaţa prismelor cu vată îmbibată cu alcool. Se spală cu alcool sau eter
introducându-se câteva picături de solvent între prisme. După spălare, prismele se şterg din nou
şi blocul se lasă deschis un anumit timp pentru uscare.
Corelaţia de temperatură. În cazul în care nu se poate asigura temperatura de lucru
prescrisă, respectiv 20, 40 sau 60ºC, se admit abateride ±5ºC, cu condiţia ca în tot timpul
determinării temperatura să rămână constantă cu o precizie de ±2ºC.
Calcularea indicelui de refracţie la temperatura prescrisă se face cu ajutorul formulei:
n = n1 ± 0,000385Δt (în cazul uleiurilor)
n = n1 ± 0,000365Δt (în cazul grăsimilor)
în care:
n = indicele de refracţie la temperatura prescrisă, respectiv t = 20, 40 sau 60ºC;
n1= indicele de refracţie determinat la temperatura de lucru t1;
Δt = diferenţa între temperatura la care s-a făcut determinarea şi temperatura prescrisă.
Observaţie. Valoarea 0,000385Δt sau 0,000365Δt se scade în cazul în care t1< t şi se
adună când t1> t.

76
 5.1.7. Determinarea indicelui de saponificare al grăsimilor

Indicele de saponificare reprezintă cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, necesară

pentru saponificarea unui gram de grăsime.
Valoarea indicelui de saponificare este într-o relaţie directă cu numărul acizilor graşi din
cantitatea de grăsime analizată, iar acest număr este condiţionat de greutatea moleculară a
acizilor graşi respectivi. De exemplu, un gram de grăsime va conţine un număr mai mic de acizi
graşi cu greutate moleculară mare, ca în cazul uleiurilor în care predomină acidul oleic sau al
seului de rumegătoare unde predomină acidul stearic. Analiza acestor grăsimi va indica un indice
de saponificare cu o valoare mică.
În cazul untului, unde predomină acizii graşi saturaţi inferiori cu greutate moleculară
mică, indicele de saponificare va avea o valoare mare, pentru că un gram din această grăsime
conţine un număr mai mare de acizi graşi.
Principiul metodei. Metoda are la bază reacţia de saponificare prin care gliceridele sunt
hidrolizate în mediu bazic în glicerol şi săpun (sarea de sodiu sau potasiu a acizilor carboxilici):

CH2 OOCR CH2OH

 
CHOCR + 3 KOH CHOH + 3RCOOK
 
CH2OOCR CH2OH

Trigliceridă Glicerol Săpun

Practic, se supune saponificării cu hidroxid de potasiu o cantitate dată de grăsime şi se

titrează cu acid clorhidric, în prezenţa fenolftaleinei, excesul de hidroxid de potasiu rămas după
terminarea operaţiunii. Cantitatea de hidroxid necesară saponificării se deduce din diferenţa între
volumul de acid clorhidric folosit la titrarea probei martor şi cel folosit la titrarea probei de lucru.
Reactivi. 1. Soluţie alcoolică de hidroxid de potasiu (40 g hidroxid de potasiu se dizolvă
într-un litru de alcool etilic 95 % vol. În cazul în care soluţia este tulbure se filtrează).
2. Acid clorhidric 0,5 N.
3. Fenolftaleină, soluţie alcoolică 1 %.
Instalaţia necesară saponificării este compusă dintr-un balon de fierbere de 250 ml,
prevăzut cu un dop perforat, prin care trece o ţeavă din sticlă (refrigerent de aer) cu lungimea de
cel puţin 75 cm.
Modul de lucru. După ce grăsimea pentru analiză, purificată în prealabil, a fost topită, se
cântăreşte la balanţa analitică (cca. 2 g) şi se introduce în balonul de fierbere curat şi uscat. Se
introduc apoi 25 ml soluţie alcoolică de hidroxid de potasiu şi se montează dopul cu refrigerentul
de aer, acţionându-se sursa de căldură astfel încât să se realizeze o fierbere moderată şi uniformă.
În condiţii normale de lucru saponificarea durează 50-60 minute.
Pentru evitarea pierderilor de acizi volatili (mai ales în cazul untului), se va regla astfel
cantitatea de căldură, încât nivelul de condensare al vaporilor în refrigerent să nu depăşească
limita dintre treimea mijlocie şi cea superioară.
77
 După terminarea saponificării, se spală refrigerentul cu câţiva ml de apă distilată caldă,
după care se îndepărtează, iar proba răcită se titrează cu acid clorhidric, în prezenţa
fenolftaleinei, până la dispariţia culorii roşii.
În paralel, se execută o probă martor în aceleaşi condiţii, grăsimea fiind înlocuită cu
aceeaşi cantitate de apă.
Calculul rezultatelor. Indicele de saponificare se calculează cu ajutorul formulei:

28,05 . (V0Vp)
Indice de saponificare = în care:
m

28,05 = cantitatea de hidroxid de potasiu, în mg, corespunzătoare la 1 ml acid clorhidric

0,5 N;
V0 = volumul acidului clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei martor;
Vp = volumul acidului clorhidric, în ml, folosit la titrarea probei analizate;
m = cantitatea de grăsime, în g, luată pentru analiză.

78
 5.1.8. Determinarea indicelui de aciditate al grăsimilor

Indicele de aciditate reprezintă numărul de mg hidroxid de potasiu necesare pentru

neutralizarea acizilor graşi liberi dintr-un gram de grăsime. Se poate defini şi ca volumul soluţiei
de hidroxid de sodiu 1 N care neutralizează acizii graşi liberi din 100 g grăsime.
Indicele de aciditate de determină prin titrare cu o soluţie de hidroxid de potasiu 0,1 N, în
prezenţă de fenolftaleină.
Reactivi. 1. Hidroxid de potasiu 0,1 N
2. Amestec alcool-eter de petrol 1/1(v/v)
3. Soluţie alcoolică 1% de fenolftaleină
Modul de lucru. Într-un vas Erlenmeyer de 100 ml se cântăresc 3-5 g grăsime, care se
dizolvă în 20-30 ml amestec alcool-eter, apoi se adaugă 2-3 picături de fenolftaleină. În
continuare, sub agitare continuă, se titrează cu soluţia de hidroxid de potasiu până la coloraţia
roz, care persistă un minut. Dacă în timpul titrării amestecul se tulbură, vasul se va încălzi uşor
într-o baie cu apă caldă.
Pentru calcularea indicelui de aciditate (IA) se foloseşte următoarea formulă:

5,6104 . V
IA (mg KOH/g) = în care:
Mp

V = volumul de hidroxid de potasiu (în ml) folosit la titrare;

Mp = masa probei de grăsime (în g) luată pentru determinare;
5,6104 = mg hidroxid de potasiu corespunzător la 1 ml soluţie hidroxid de potasiu 0,1 N.

Observaţii. Pentru a determina IA al grăsimii din lapte sau produse lactate acide (iaurt,
lapte bătut, sana etc.), se toarnă într-o pâlnie cu filtru cutat, prelungită cu un tub de cauciuc
închis cu o clemă, 90 ml soluţie de acid acetic 2%, peste care se adaugă 10 ml (12-13 g) de lapte
(produs lactat acid). Cazeina va precipita, înglobând în masa sa de coagul şi grăsimea. După 5-10
minute se deschide clema şi se lasă să curgă filtratul, care trebuie să fie limpede, apoi filtrul cu
coagulul se lasă să se usuce la aer 12-20 ore sau la etuvă, la maximum 100˚C, timp de 15-20
minute. Coagulul uscat, împreună cu hârtia de filtru, se introduce în extractorul Soxhlet,
extrăgându-se toată grăsimea cu ajutorul eterului etilic. Din grăsimea astfel extrasă se determină
valoarea indicelui de aciditate (IA).

79
 VI. PROTIDE

6.1. SEPARAREA ŞI IDENTIFICAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA

CROMATOGRAFIEI PE HÂRTIE

Cromatografia este procedeul prin care se realizează separarea componentelor unui

amestec pe baza distribuţiei acestor componente, ca rezultat al unor procese de adsorbţie sau
repartiţie, între două sau mai multe faze nemiscibile, dintre care una este faza staţionară şi
cealaltă faza mobilă.
În funcţie de natura fazei mobile şi a celei staţionare, cromatografia (metodele
cromatografice) se clasifică în două mari grupe: A) cromatografia de lichide (CL) şi B)
cromatografia în fază gazoasă (CG), fiecare incluzând o serie de metode specifice, redate în
schema de mai jos:

Cromatografia pe hârtie
(CH)

A) Cromatografia de lichide Cromatografia pe strat subţire

(CL) (CSS)
Cromatografia lichid-solid
(CLS)

Cromatografia pe coloană Cromatografia lichid-lichid

(CC) (CLL)
Cromatografia prin
excluziune sterică (CES)

Cromatografia prin schimb

ionic (CSI)

Cromatografia gaz-lichid (CGL)

B) Cromatografia în fază gazoasă

(CG)
Cromatografia gaz-solid (CGS)

80
 Principiul metodei. Pe o fâşie de hârtie cromatografică, la o anumită distanţă de unul din
capete, se aplică o cantitate mică (0,005-0,007 ml) din soluţia de cercetat, apoi hârtia se usucă şi
se introduce, cu capătul unde s-a pipetat soluţia, într-o cuvă cu solvent organic, aşezată într-un
vas de sticlă închis sau într-o cameră de cromatografiere de construcţie specială. Solventul
organic (faza mobilă sau eluent) îmbibă hârtia şi se deplasează de-a lungul suprafeţei spre
capătul opus. În momentul în care solventul atinge punctul unde s-a pipetat soluţia de analizat are
loc o repartiţie (distribuire) a moleculelor diferiţilor aminoacizi din amestec, între faza mobilă şi
faza staţionară, reprezentată, în acest caz, prin hârtia cromatografică. Moleculele de aminoacizi
antrenate de faza mobilă sunt transportate într-un punct vecin pe cromatogramă. Astfel,
aminoacizii din soluţia de cercetat aplicată se vor deplasa odată cu solventul, cu viteze diferite de
a acestuia din urmă, depinzând de structura aminoacizilor, de gradul lor de solubilitate în
solventul ales, de temperatură, pH şi de tipul de hârtie. Când solventul s-a deplasat până aproape
de marginea fâşiei de hârtie, aceasta se scoate din vas sau din camera cromatografică, se usucă şi
se imersează sau se pulverizează cu o soluţie de ninhidrină. Între aminoacizi şi ninhidrină se
produce următoarea reacţie:

C=O C =O
OH H
C + R CH-COOH C +
OH OH
C=O NH2 C=O

Ninhidrinã Aminoacid Ninhidrinã redusã

R C-COOH + H2O

NH

Iminoacid

În prezenţa apei (la cald) are loc descompunerea iminoacidului într-o moleculă de
aldehidă, una de amonuiac şi una de bioxid de carbon:

RCCOOH + H2O (t) RCHO + NH3 + CO2


NH

În ultima etapă, reacţia dintre ninhidrină oxidată (tricetohidrinden), amoniac şi ninhidrină

redusă duce la formarea unui complex de culoare albastru-purpuriu sau roşu-violet, care
reprezintă sarea de amoniu a diceto-hidrindenului şi dicetohidrinden-aminei:

81
 C=O C= O C=O O= C
H _ N= C
C =O + NH3 + C C
OH +
C=O C=O C= O NH4 O= C

Tricetohidrinden Ninhidrinã redusã Sare de amoniu (culoare albastrã)

După imersare sau pulverizare cu ninhidrină, cromatograma se usucă. Corespunzător

diverşilor aminoacizi, pe hârtie apar pete (spoturi) colorate în diferite locuri, pe baza cărora se
pot identifica aminoacizii existenţi în soluţia analizată.
Cea mai simplă metodă de identificare este metoda martorilor, care constă în
cromatografierea, pe aceeaşi fâşie de hârtie, a amestecului de cercetat şi a unei probe cu
aminoacizi cunoscuţi. Soluţia martorilor şi cea de analizat se aplică pe hârtie, în acelaşi timp, pe
linia de start. Pe cromatogramă se compară vizual poziţia spoturilor colorate a aminoacizilor din
soluţia de analizat cu poziţia aminoacizilor martori.
O altă metodă de identificare este prin determinarea aşa-numitului coeficient de mobilitate Rf
al aminoacizilor şi compararea lui cu datele din literatură. Rf se determină după ecuaţia:
Rf = da / ds, unde:
da = distanţa de la linia de start până în centrul spotului dat de aminoacidul respectiv;
ds = distanţa de la linia de start până la linia frontului solventului.
O variantă a cromatografiei pe hârtie este metoda circulară sau radială, care se bazează pe
migrarea substanţelor din soluţia aplicată, din mijlocul hârtiei în toate direcţiile. În cromatografia
circulară rondela de hârtie de filtru se aşează orizontal, probele se aplică circular la o mică
distanţă de punctul central, iar faza mobilă se aduce din vas cu ajutorul unui fitil din hârtie de
filtru.
Reactivi şi materiale. 1. Soluţie M/100 de acid glutamic, alanină şi leucină în alcool
izopropilic 10 %.
2. Soluţie M/100 de acid glutamic în alcool izopropilic 10 %.
3. Soluţie M/100 de alanină în alcool izopropilic 10 %.
4. Soluţie M/100 de leucină în alcool izopropilic 10 %.
5. Solvent preparat prin amestecarea a 20 (40) ml de alcool butilic normal cu 5 (10) ml de
acid acetic glacial şi cu 25 (50) ml de apă distilată într-o pâlnie de separare de 100 (200) ml.
După separarea în straturi, se foloseşte stratul superior de acid acetic cu butanol, saturat cu apă,
care se scurge într-o cutie Petri.
6. Soluţie de ninhidrină 0,1 % în alcool butilic saturat cu apă.
Pentru efectuarea cromatografiei sunt necesare două jumătăţi de cutii Petri de acelaşi
diametru şi un disc (rondelă) de hârtie cromatografică cu diametrul mai mare cu un centimetru,
decât al cutiilor Petri.

82
 Modul de lucru. Pe rondela de hârtie cromatografică se aşează, cu ajutorul unei pensete,
un şablon transparent cu cinci orificii; unul central cu diametrul de 0,5 cm şi alte patru cu
diametre mult mai mici (cca. 1 mm), dispuse la aceeaşi distanţă de orificiul central şi la aceeaşi
distanţă între ele (fig 1). Se înseamnă cu un creion pe rondelă locurile respective, decupându-se
orificiul central şi însemnându-se locurile celorlalte patru orificii. Înfăşurând, pe o baghetă de
sticlă cu diametrul ceva mai mic decât al orificiului central, o fâşie de hârtie cromatografică lată
de 2 cm şi lungă de 3-4 cm, se face un fitil care se introduce în orificiul central al rondelei.
Pe unul din cele patru semne radiale ale rondelei se aplică, cu o micropipetă, o picătură
(0,002 ml) din soluţia amestecului de aminoacizi, iar pe celelalte trei semne picături separate din
fiecare soluţie de aminoacid. Se notează pe marginea rondelei de hârtie aminoacidul, a cărui
soluţie s-a pipetat pe locul indicat prin semnul respectiv. Hârtia cromatografică se usucă în aer
cald, apoi rondela de hârtie se aşează cu capătul lung al fitilului în jos pe cutia Petri, conţinând
solventul pentru eluare şi se acoperă cu cealaltă cutie Petri. Solventul de ridică prin fitil şi se
răspândeşte radial în hârtia cromatografică. Viteza de cromatografiere depinde de grosimea
filtrului şi de distanţa dintre suprafaţa solventului şi suprafaţa hârtiei, precum şi de calitatea
hârtiei cromatografice.
După 60 de minute, când solventul pe rondela de hârtie va avea diametrul de 5-7 cm,
hârtia cromatografică se ia cu ajutorul unei pensete şi se usucă în aer sau într-un termostat cu
aerisire, la 70-80C pentru îndepărtarea solventului. Cromatograma uscată se developează (prin
pulverizare) cu soluţie de ninhidrină 0,1 % şi se introduce din nou în termostat la 80-100C,
pentru 5-10 minute.
După developare şi uscare, pe cromatogramă vor apare, în cazul amestecului de
aminoacizi, trei arcuri de cerc colorate în roşu-violet, care indică separarea acidului glutamic,
alaninei şi leucinei. În cazul soluţiilor separate de aminoacizi vor apare câte un arc de cerc
colorat, corespunzător aminoacidului respectiv. Zona corespunzătoare acidului glutamic se află
aproape de centru, zona alaninei ocupă o poziţie intermediară, iar zona leucinei se găseşte
aproape de marginea cromatogramei.

83
 6.2. DETERMINĂRI CANTITATIVE ALE AMINOACIZILOR.
6.2.1. Metoda Sörensen (după Beschea şi Toma, 1984)

Principiul metodei. În soluţii apoase neutre de aminoacizi se blochează gruparea amino a

acestora cu aldehidă formică, formându-se metilen-derivaţi cu reacţie acidă, care se determină
titrimetric.

RCHNH2 + CH2O RCHN=CH2 + H2O

 
COOH COOH

Aminoacid Metilen-derivat

RCHN=CH2 + HO− RCHN=CH2 + H2O

 
COOH COO−

Cele două reacţii se desfăşoară complet atunci când la prima reacţie se întrebuinţează un
exces de aldehidă formică, iar la titrare un exces de hidroxil-ioni.
Sărurile de amoniu reacţionează, de asemenea, cu formaldehida cu formare de
hexametilen-tetramină (urotropină) şi de aceea amoniacul trebuie, în prealabil, îndepărtat.
Carbonaţii şi fosfaţii influenţează şi ei determinarea, de aceea trebuie îndepărtaţi prin
adăugare de clorură de bariu şi hidroxid de bariu.
Reactivi necesari
1. Soluţie de hidroxid de sodiu sau hidroxid de bariu 0,5 N (liberă de CO2)
2. Soluţie de acid clorhidric 0,5 N
3. Soluţie de fenolftaleină: 0,5 g în 100 ml alcool etilic 50% (v/v)
4. Soluţie de aldehidă formică 30-40% neutralizată în prealabil până la culoare slab roz,
cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N
5. Soluţie etalon: 50 ml apă distilată se tratează cu 20 ml soluţie aldehidă formică
neutralizată, se adaugă 5 ml hidroxid de sodiu 0,5 N, 1-2 picături fenolftaleină şi se
titrează cu soluţie de acid clorhidric 0,5 N până la culoare slab roz. Se adaugă apoi 3
picături soluţie hidroxid de sodiu 0,5 N, formându-se o culoare roşie intensă.
6. Soluţie de clorură de bariu 20%
7. Soluţie saturată de hidroxid de bariu
Modul de lucru
Se cântareşte cu precizie de 0,001 g, 20 g din proba de carne tocată şi se introduce într-un
vas conic de 200 ml. Se adaugă 50 ml apă distilată şi se încălzeşte 30 minute pe baia de apă
vasul, care a fost închis bine cu un dop. După răcire, extractul se filtrează într-un vas uscat,
spălând cantitativ carnea prin triturare într-un mojar. Filtratul se completează la 100 ml şi din
acesta se iau 50 ml într-un balon cotat de 100 ml, adăugându-se 1 ml soluţie fenolftaleină, 10 ml

84
soluţie clorură de bariu (BaCl2) 20% şi atâta soluţie saturată de hidroxid de bariu până la virarea
culorii în roşu şi apoi încă un exces de 5 ml soluţie hidroxid de bariu. Se completează cu apă la
100 ml şi după 15 minute se filtrează pe un filtru uscat. Din acest filtrat se iau 50 ml
(corespunzător la 5 g de probă) şi se neutralizează cât mai exact cu acid clorhidric 0,5 N, prin
încercare pe hârtie de turnesol. Se adaugă 20 ml soluţie formaldehidă şi apoi se titrează cu
hidroxid de sodiu 0,5 N până la identitate de culoare cu soluţia etalon. Se adaugă încă câţiva ml
de hidroxid de sodiu şi se retitrează cu acid clorhidric 0,5 N până ce culoarea soluţiei devine mai
slab roşu decât soluţia etalon. Se adaugă din nou hidroxid de sodiu 0,5 N până ce culoarea
soluţiei este aceeaşi cu a soluţiei etalon.
Calculul rezultatelor

(V1 – V2) . 0,0028

% Azot din aminoacizi = . 100 în care:
5

V1 = cantitatea totală de hidroxid de sodiu 0,5 N folosită la titrare, în ml;

V2 = cantitatea de acid clorhidric 0,5 N folosită la titrare, în ml ;
0,0028 = cantitatea de azot, în g, corespunzătoare la 1 ml soluţie hidroxid de sodiu 0,5 N.
Rezultatul se raportează la masa probei uscate (SU) la 70˚C, astfel:

% Azot din aminoacizi

% Azot din aminoacizi în SU = . 100 în care:
SU

SU = substanţa uscată, determinată prin uscarea probei la 70˚C.

Pentru peşte, un conţinut de aminoacizi mai mare de 0,1 g este asociat, de obicei, cu un
început de alterare.
Trebuie însă menţionat că nivelul aminoacizilor din carne, peşte, etc. nu constituie un
indice al stării de prospeţime, deoarece acest conţinut al aminoacizilor liberi este dependent de
durata de maturare şi de temperatura la care a avut loc maturarea produsului respectiv.

85
 6.2.2. Metoda Sörensen (modificată)

Această metodă simplă are la bază titrarea aminoacizilor aflaţi într-o soluţie de o anumită
concentraţie. Deoarece aminoacizii au caracter amfoter, gruparea acidă nu poate fi titrată cu o
bază decât după ce gruparea aminică a fost blocată. În metoda Sörensen blocarea aminei se
realizează prin condensarea ei cu aldehidă formică, conform reacţiei:

RCHNH2 + CH2O RCHN=CH2 + H2O

 
COOH COOH
Aminoacid Formaldehidă Bază Schiff
Produsul de condensare are în soluţie un caracter acid datorită prezenţei grupării carboxilice.
Reactivi: 1. Aldehidă formică (20 % neutralizată în prezenţa fenolftaleinei)
2. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N (titrată)
3. Soluţie de fenolftaleină 1 % în alcool
4. Soluţie de acid clorhidric 0,1 N
Modul de lucru. Într-un flacon se introduc 10 ml soluţie de aminoacid, peste care se
adaugă 10 picături de fenolftaleină şi se neutralizează cu NaOH 0,1 N, dacă soluţia este acidă sau
cu HCl 0,1 N, dacă soluţia este alcalină, până la apariţia culorii slab roz. Se adaugă apoi 10 ml
aldehidă formică şi se titrează cu hidroxid de sodiu până la apariţia culorii slab roz.
Calculul rezultatelor. Concentraţia aminoacidului din soluţie se calculează cu ajutorul
formulei:
n . f . 0,0014
Aminoacid % = 100 unde:
10

n = numărul de ml soluţie de NaOH folosiţi la titrare;

f = factorul soluţiei de NaOH 0,1 N;
0,0014 = cantitatea de azot, în g, corespunzătoare la 1 ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1 N.
Observaţii. Când determinarea se face dintr-un produs solid (vegetal sau animal), se
cântăresc 10 grame, care se mojarează cu 50 ml apă distilată, apoi se aduce la volum de 100 ml,
se filtrează, iar din filtrat se iau 10 ml şi se procedează ca mai sus. Se aplică formula:

n . f . 0,0014 . d
Aminoacid % = 100 = n . f . 0,0014 . 100 unde:
m

n = numărul de ml soluţie de NaOH folosiţi la titrare;

f = factorul soluţiei de NaOH 0,1 N;
0,0014 = cantitatea de azot, în g, corespunzătoare la 1 ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1 N;
d = cifra diluţiei (10);
m = masa produsului cântărit (10 grame);

86
 6.2.3. Micrometode pentru determinarea lizinei
6.2.3.1. Determinarea lizinei din cereale

Reactivi necesari
1. Carbonat bazic de cupru
2. Soluţie alcalin-alcoolică. 30 grame hidroxid de potasiu se dizolvă în 400 ml apă
distilată şi se aduce la 1000 ml cu alcool etilic 96%
3. Reactiv cu ninhidrină. Se cântăresc 0,1 g ninhidrină şi 0,4 g Cd(NO3)2 . 2 H2O (sau
CdCl2), apoi se adaugă 25 ml tampon formiat şi se completeză la 100 ml cu etilen glicol sau
metil-etilenglicol, agitându-se energic pentru a se dizolva complet granulele de ninhidrină.
4. Soluţie de tampon formiat. Se cântăresc 30 g formiat de sodiu, care se dizolvă în 30 ml
apă distilată caldă, apoi se adaugă 10 ml acid formic şi apă distilată până la 100 ml.
Modul de lucru
Se cîntăresc 50 mg făină de grâu (secară, porumb etc.) şi se introduc în flacoane conice de 50
ml, apoi se adaugă 10 ml soluţie alcalin-alcoolică, după care se acoperă şi se lasă în repaus până a
doua zi. După intervalul de repaus, se adaugă câte un vârf de spatulă de carbonat bazic de cupru, se
agită o oră pe agitatorul orizontal şi se filtrează, după ce soluţia s-a limpezit timp de 30-60 minute.
În continuare, din hidrolizatul proteic, obţinut în urma operaţiunilor anterioare, se
pipetează 1 ml într-o eprubetă curată şi uscată, apoi se adaugă 2 ml de reactiv cu ninhidrină şi se
agită energic. Proba se menţine 20 minute pe baia de apă la temperatura de 100C, după care se
răceşte, se adaugă 5 ml alcool 60% şi se agită.
Se efectuează citirea la fotocolorimetru cu filtru verde (540±10 nm), în cuve de sticlă de
3 mm drum optic, faţă de un martor realizat cu reactivi.
Valorile respective ale extincţiilor se raportează la o curbă etalon, trasată cu lizină pentru
intervalul 40-200 μg/ml. Pentru aceasta, se introduc 20 mg lizină într-un balon cotat de 100 ml şi
se aduce la semn cu apă distilată. Se obţine o soluţie care conţine 0,20 mg/ml sau 200 μg/ml
lizină. Se diluează succesiv această soluţie pentru obţinerea eprubetelor cu diluţiile
corespunzătoare intervalului 40-200 μg/ml.
Pentru trasarea curbei etalon se introduce în fiecare eprubetă câte 1 ml soluţie de lizină + 2 ml
reactiv cu ninhidrină + 5 ml alcool etilic 60 %, procedându-se ca în cazul probelor de lucru.
Extincţiile citite la fotocolorimetru (540±10 nm) se trec pe ordonată, iar valorile lizinei pe abscisă.
Pentru a calcula numărul de mg lizină la % produs, se aplică următoarea relaţie:
mg lizină % = a/m x 100 , unde:
a = valoarea lizinei (mg) citită pe curba etalon;
m = masa produsului (mg);
100 = coeficient de raportare procentuală.
Pentru raportarea la substanţa uscată, se aplică formula:
mg lizină % S.U. = L x100/SU unde: L = valoarea lizinei determinate;
SU = substanţa uscată; U = umiditatea probei; SU = 100 −U

87
 6.2.3.2. Determinarea lizinei din probe de făină

Reactivi necesari.
1. Carbonat de sodiu 2 %
2. Reactiv cu ninhidrină. Se cântăresc 0,1 g ninhidrină şi 0,1 g Cd(NO3)2 . 2 H2O (sau
CdCl2), apoi se adaugă 25 ml tampon formiat şi se completeză la 100 ml cu etilen
glicol sau metil-etilenglicol.
3. Soluţie de tampon formiat. Se cântăresc 30 g formiat de sodiu, care se dizolvă în 60 ml
apă distilată caldă, apoi se adaugă 10 ml acid formic şi apă distilată până la 100 ml.
Modul de lucru
Se cîntăresc 50 mg făină de grâu sau porumb şi se mojarează cu 50-200 mg nisip de
cuarţ, chimic inert, frecându-se bine cu o baghetă groasă de sticlă cu capătul rotunjit. Se adaugă
0,5 ml soluţie 2% carbonat de sodiu şi după amestecare se toarnă conţinutul intr-o eprubetă,
folosindu-se, pentru această operaţiune, încă 0,5 ml soluţie 2% de carbonat de sodiu.
Se lucrează cu patru probe, pregătite după modul descris mai sus, ale căror eprubete se
introduc într-o baie de apă la 80C, timp de 10 minute, ametecând din timp în timp conţinutul
eprubetelor.
După răcire la jet de apă, se adaugă câte 2 ml reactiv cu ninhidrină, amestecându-se
conţinutul, după care două eprubete se introduc în baia de apă la 80C, iar celelalte două la 55C
(în cazul probelor de grâu) sau la 65C (în cazul probelor de porumb), timp de 40 minute.
Conţinutul eprubetelor se mai amestecă cu bagheta în tot acest interval.
Eprubetele se răcesc cu apă de robinet, apoi se adaugă în fiecare câte 5 ml alcool etilic
70%, după care se agită şi se filtrează. Se citeşte extincţia coloraţiei violete la filtrul verde
(540±10 nm), în cuve de sticlă de 3 mm drum optic, faţă de proba încălzită la 55C sau 65C.
Valorile extincţiilor se raportează la o curbă de etalonare realizată cu lizină pentru
intervalul 40-200 μg lizină/ml.
Pentru trasarea curbei etalon se introduce în fiecare eprubetă câte 1 ml soluţie de lizină + 2 ml
reactiv cu ninhidrină + 5 ml alcool etilic 60 %, procedându-se ca în cazul probelor de lucru.
Extincţiile citite la fotocolorimetru (540±10 nm) se trec pe ordonată, iar valorile lizinei pe abscisă.
Pentru a calcula numărul de mg lizină la % produs, se aplică următoarea relaţie:
mg lizină % = a/m x 100 , unde:
a = valoarea lizinei (mg) citită pe curba etalon;
m = masa produsului (mg);
100 = coeficient de raportare procentuală.
Pentru raportarea la substanţa uscată, se aplică formula:
mg lizină % S.U. = L x100/100-U*
L = valoarea lizinei determinate din proba analizată;
U = umiditatea probei;
* Se poate utiliza fie relaţia 100-U fie valoarea S.U. a probei analizate

88
 6.3. REACŢII CALITATIVE ALE PEPTIDELOR ŞI PROTEINELOR
6.3.1. Reacţia biuretului

Reacţia biuretului are la bază formarea unor chelaţi coloraţi între substanţele proteice şi
unele metale (Cu, Co, Ni), iar numele acestei reacţii provine de la biuret, substanţă ce se
formează din două molecule de uree prin eliminare de amoniac:

2 H2NCONH2 H2NCONHCONH2 + NH3

Reacţia biuretului se datorează legăturii peptidice CONH şi este pozitivă începând cu

tripeptidele. Peptidele dau o coloraţie roşie-violetă, iar proteinele albastră-violetă, mecanismul
reacţiei având la bază formarea unor complecşi solubili coloraţi între legătura peptidică şi ionii
de Cu2+ (Ni sau Co) din soluţie. Reacţia biuretului este pozitivă şi pentru substanţele care conţin
în moleculă gruparea CSNH2.
Deoarece sărurile de amoniu împiedică reacţia, un exces de NaOH în soluţie poate
remedia acest aspect.
Sensibilitatea reacţiei biuretului este de 1:10 000 şi, în anumite condiţii, poate fi folosită
la dozarea colorimetrică a proteinelor.
Reactivi. 1. Soluţie de CuSO4 1 %
2. Soluţie de NaOH 10 %
3. Soluţie proteică sau peptidică diluată
Modul de lucru. Peste 2-3 ml soluţie de proteină se adaugă un volum egal de NaOH 10 %
şi apoi 4-5 picături soluţie de CuSO4 1 %. Lichidul se va colora în albastru-violet. Atunci când
conţinutul de proteină este mic apare o culoare neclară, caz în care se repată experienţa,
adăugându-se la suprafaţa soluţiei de cercetat alcalinizată un strat de 0,5-1 cm3 CuSO4. La limita
dintre straturi va apare un inel de culoare violetă.

89
 6.3.2. Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Sarcina electrică a unei proteine în soluţie depinde de numărul şi gradul de disociere al

grupărilor acide sau bazice ale aminoacizilor din constituţia ei.
Posedând atât o grupare acidă (COOH) cât şi una bazică (NH2), aminoacizii au
caracter amfoter, adică sunt, în acelaşi timp, acizi slabi şi baze slabe. Într-o soluţie apoasă, ei se
prezintă ca molecule ionizate bipolar, numite amfiioni, neutre spre exterior. Amfiionii posedă un
moment electric (dipolmoment), care este direct legat de unele proprietăţi ale aminoacizilor, ca
de exemplu: solubilitatea în apă, caracterul hidrofil, punctul de topire etc. În mediu acid,
gruparea carboxilică a amfiionului fixează un proton rezultând un cation, iar în mediu bazic,
gruparea amino pierde protonul legat coordinativ constituindu-se un anion:

+H+ +OH
H3N CH2COOH
+
H3N+CH2COO H2NCH2COO + HOH
Cation Amfiion Anion
+
În molecula amfiionilor are loc o atracţie reciprocă între grupările COO şi NH3,
ducând la o aglomerare a moleculelor de aminoacid din soluţie şi modificarea solubilităţii care
devine minimă.
Ca şi aminoacizii, majoritatea proteinelor sunt electroliţi amfoteri, în soluţii apoase putând
forma ioni bipolari: (OOC)nProteină(+NH3)p. În soluţie, molecula proteică dă naştere unui
macroion bipolar (np+), pozitiv (p+) sau negativ (n) şi la numeroşi microioni (H+ sau OH).
Pentru fiecare aminoacid sau proteină există o valoare a pH-ului la care molecula este
neutră spre exterior şi deci migrarea într-un câmp electric (electroforeza) nu se produce. Acest
pH a fost denumit pH izoelectric (pHi) sau punct izoelectric (PI) şi este diferit pentru fiecare
aminoacid sau proteină.

6.3.2.1. Determinarea punctului izoelectric al gelatinei

Reactivi. 1. Soluţie acetat de sodiu 0,1 N

2. Soluţie acid acetic 0,1 N
3. Soluţie gelatină 0,1 %
4. Alcool metilic
Modul de lucru. Într-un stativ se pregătesc 6 eprubete şi în fiecare se adaugă cantităţile de
soluţii indicate în tabelului de mai jos:

90
 Reactivi care se adaugă (ml) Eprubete
1 2 3 4 5 6
Acetat de sodiu 0,1 N 2 2 2 2 2 1,2
Acid acetic 0,1 N 0,25 0,5 1 2 4 4,8
Apă distilată 3,75 3,5 3 2 - -
Gelatină 1 % 2 2 2 2 2 2
Alcool metilic 8 8 8 8 8 8
Tulbureală ++ +++
pH-ul care se obţine 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1
După adăugarea alcoolului metilic se agită energic eprubetele şi se lasă în repaus o jumătate
de oră. Dacă s-a lucrat corect, se va observa că eprubeta a 4-a prezintă un maximum de tulbureală,
ceea ce duce la concluzia că în această eprubetă s-a realizat pHi, a cărui valoare este de 4,7.

6.3.2.2. Determinarea punctului izoelectric al cazeinei

Reactivi. 1. Soluţie de acid acetic 0,01 N

2. Soluţie de acid acetic 0,1 N
3. Soluţie de acid acetic 1 N
4. Soluţie de cazeină în acetat de sodiu 0,1 N. Pe o baie de apă încălzită la 40-50C se
dizolvă 0,2 g cazeină în 5 ml soluţie 1 N acetat de sodiu. În cazul în care cazeina se dizolvă cu
greutate, se mai adaugă puţină apă. După preparare, soluţia de cazeină se toarnă într-un balon cotat
de 50 ml şi se completează la semn
Modul de lucru. Într-un stativ se pregătesc 9 eprubete şi în fiecare se adaugă cantităţile de
soluţii indicate în tabelului de mai jos. După terminarea operaţiunii de pipetare, eprubetele se
lasă în repaus cca. 10-15 minute, după care (la ultima rubrică a tabelului) se notează cu semnul +
eprubetele în care s-a produs o tulbureală şi cu semnul x cele în care s-a format un precipitat. În
funcţie de intensitatea tulburelii sau a floculării se pune un număr corespunzător de semne.
Nr. eprubetei 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Apă distilată (ml) 8,38 7,75 8,75 8,50 8,00 7,00 5,00 1,00 7,40
Acid acetic 0,01 N (ml) 6,62 1,25 - - - - - - -
Acid acetic 0,1 N (ml) - - 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00 8,00 -
Acid acetic 1 N (ml) - - - - - - - - 1,6
Soluţie cazeină în acetat de 1 1 1 1 1 1 1 1 1
sodiu 0,1 N (ml)
pH-ul soluţiei obţinute 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,2 3,5
Gradul de tulbureală
(floculare)
 = tulbureală foarte redusă; + = tulbureală intensă (floculare uşoară); ++ = floculare intensă
xx = maxim de floculare.

91
 6.4. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL ŞI PROTEIC

6.4.1. Determinarea azotului total din carne şi produse din carne

Azotul intră în compoziţia multor compuşi chimici prezenţi în organismele animale şi

vegetale: aminoacizi, peptide, proteine, acizi nucleici, etc. (N-aminic, N-peptidic, N-proteic, N-
nucleic, etc.). Toate formele de azot existente într-un preparat biologic reprezintă azotul total.
Pentru determinarea azotului total se utilizează metoda Kjeldahl.
Principiul metodei. Substanţele organice, conţinute în materialele biologice, prin fierbere
cu acid sulfuric concentrat în prezenţă de catalizatori, se distrug eliberând elementele constitutive
sub diferite forme: carbonul ca bioxid de carbon, hidrogenul şi oxigenul ca apă, fosforul ca acid
fosforic sau fosfor mineral, iar azotul este transformat cantitativ în amoniac. Amoniacul
reacţionează cu acidul sulfuric aflat în exces, formând sulfat de amoniu:

NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Sulfatul de amoniu rezultat, în mediu puternic alcalin se descompune cu eliberarea

amoniacului, conform ecuaţiei:

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

Amoniacul eliberat este distilat prin antrenare cu vapori de apă şi captat într-un volum
cunoscut de soluţie titrată de acid sulfuric, legându-se sub formă de sulfat de amoniu. Excesul de
acid sulfuric este titrat cu o soluţie de aceeaşi normalitate de NaOH:

H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2H2O

După cantitatea de acid sulfuric care a reacţionat cu amoniacul se calculează conţinutul

procentual de azot total.
Reactivi: 1. Acid sulfuric concentrat (d=1,84).
2. Sulfat de cupru cristalizat p.a.
3. Sulfat de potasiu p.a.
4. Soluţie de NaOH 33%. Soluţia se fierbe pentru îndepărtarea combinaţiilor organice
azotate, care ar putea să existe în reactiv. Se păstrează într-o sticlă cu dop de cauciuc.
5. Soluţie de acid sulfuric 0,1 N, liber de compuşi cu azot;
6. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N;
7. Soluţie indicator roşu de metil 0,2% în alcool etilic 96% (v/v);
Aparatură: - baloane de mineralizare Kjeldahl, de 300 şi 500 ml;
- instalaţie de distilare Parnas-Wagner (balon de fierbere, refrigerent, colector);
- instalaţie de mineralizare şi sursă de căldură pentru distilare;
- sticlărie de laborator (pahare, baloane, pipete, biurete etc.).

92
 Modul de lucru. Determinarea cuprinde trei etape succesive:
a) mineralizarea preparatelor biologice;
b) distilarea amoniacului;
c) titrarea indirectă a amoniacului.
a) Mineralizarea preparatelor biologice. Într-un balon Kjeldahl cu capacitatea de 300
(500) ml se introduce o cantitate corespunzătoare de material de analizat (<1 g), cu un conţinut
de cca. 0,005-0,2 g azot. Înainte de introducere în balon, materialul biologic se cântăreşte la
balanţa analitică într-o fiolă de cântărire. Se trece cu atenţie conţinutul fiolei într-un balon
Kjeldahl uscat, apoi se cântăreşte fiola din nou. Diferenţa dintre prima şi cea de-a doua cântărire
reprezintă greutatea probei luată pentru determinare. În cazul lichidelor biologice, volumul
probei de analizat se măsoară cu ajutorul unei pipete.
În balonul Kjeldahl se adaugă 5-6 g de amestec catalizator format din sulfat de potasiu şi
sulfat de cupru (4/1) şi 20 ml acid sulfuric concentrat. Sulfatul de potasiu are rolul de a ridica
temperatura de fierbere, iar sulfatul de cupru accelerează procesul de mineralizare a substanţei
organice. Pot fi utilizaţi drept catalizatori şi apa oxigenată, mercurul metalic, seleniul etc. Pentru
diminuarea spumării, se introduc şi 2-3 perle de sticlă în balonul Kjeldahl care se încălzeşte
progresiv.
Pierderea vaporilor de acid sulfuric poate fi stopată prin introducerea unei mici pâlnii sau
a unui dop de sticlă în gura balonului, care se fixează în poziţie oblică într-un stativ metalic sub
nişă şi se încălzeşte cu grijă pe sita de azbest la flacăra unui bec de gaz. În cazul analizelor în
serie, încălzirea se poate face pe un suport comun, construit special, avînd grijă să se asigure
completa evacuare a gazelor rezultate.
În decursul primelor minute de încălzire conţinutul balonului devine negru şi spumos. În
această etapă, recipientul se încălzeşte treptat până la oprirea spumării conţinutului, după care se
intensifică încălzirea şi se continuă până ce lichidul din balon devine incolor sau uşor colorat în
albastru, datorită sulfatului de cupru. Dacă pe pereţii balonului s-au depus particule de substanţă
carbonizată, atunci se spală cu ajutorul amestecului fierbinte, rotind cu atenţie balonul, după care
lichidul este supus unei încălziri suplimentare. Durata mineralizării este în funcţie de natura
materialului biologic supus analizei (cca. 4-6 ore), fiind mai mare la probele ce conţin grăsime
sau care au proteine cu un procent ridicat de lizină (8-12 ore).
După terminarea mineralizării, balonul Kjeldahl se răceşte prin adăugarea unei cantităţi
de apă distilată (50 ml), se agită şi conţinutul lui se trece într-un balon cotat de 250 ml. Întrucât
adaosul de apă peste mineralizat produce o reacţie puternic exotermă, se recomandă ca în timpul
acestei operaţii balonul Kjeldahl să fie ţinut sub jet de apă rece, iar gura acestuia să nu fie
îndreptată spre operator. Pentru a antrena întreaga cantitate de mineralizat din balonul Kjeldahl,
pereţii acestuia se spală de 2-3 ori cu volume de apă distilată, care se adaugă, de asemenea, la
amestecul din balonul cotat. Apoi, se completează conţinutul balonului cotat la semn cu apă
distilată. Această soluţie se utilizează pentru distilarea amoniacului.
b) Distilarea amoniacului. Această etapă se realizează într-un aparat de distilare Pregl,
modificat de Parnas şi Wagner. Se măsoară 100 ml de mineralizat din balonul cotat şi se introduc
în balonul de distilare care se închide rapid, apoi extremitatea inferioară a tubului refrigerentului

93
se introduce în soluţia titrată de acid sulfuric din paharul colector (20 ml acid sulfuric 0,1 N + 2-
4 picături soluţie roşu de metil) pentru a evita pierderea amoniacului. Se introduce, apoi, în
balonul de distilare 70 ml de NaOH 33% şi 30 ml apă distilată, după care se închide imediat
circuitul. Este necesat ca reacţia lichidului din balonul de distilare să fie net alcalină, lucru care
se poate constata prin schimbarea culorii mineralizatului din verde-deschis în albastru, datorită
formării hidroxidului de cupru.
Distilarea durează 15-25 minute. În decursul ultimelor 5 minute, partea inferioară a
refrigerentului nu trebuie să se afle în contact cu soluţia de acid sulfuric, coborându-se, în acest
scop, recipientul colector. Sfârşitul distilării se apreciază verificând reacţia unei picături din
refrigerent cu ajutorul hârtiei de turnesol (lipsa culorii albastre). După terminarea distilării,
capătul inferior al refrigerentului, aflat în contact cu soluţia de acid sulfuric, se spală cu volume
mici de apă distilată, care se adaugă în recipientul colector.
c) Titrarea indirectă a amoniacului. Excesul de acid sulfuric 0,1 N, rămas după captarea
amoniacului în recipientul colector, se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N până la
virarea coloraţiei soluţiei de la roşu la galben.
Se titrează în acelaşi mod o probă martor, care conţine aceeaşi cantitate (20 ml) de acid
sulfuric 0,1 N şi indicator roşu de metil.
Calculul rezultatelor. Cantitatea de azot total se calculează cu relaţia :

(V0 Vp) • 0,0014 • d

AT % = • 100 unde:
m

V0 = ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1 N consumaţi pentru titrarea acidului sulfuric din
proba martor;
Vp = ml soluţie hidroxid de sodiu 0,1 N folosiţi la titrarea excesului de acid sulfuric din
proba de analizat;
d = cifra diluţiei (250/100);
m = masa (sau volumul) probei biologice analizate;
0,0014 = titrul acidului sulfuric 0,1 N în raport cu azotul, g/ml, care rezultă din relaţia :
TH2SO4 = NH2SO4 . EN / 1000 = 0,1 . 14 / 1000 = 0,0014 g/ml;
NH2SO4 = normalitatea soluţiei de acid sulfuric;
EN = Echivalentul gram al azotului;

Cantitatea de azot total, raportat la substanţa uscată se calculează cu relaţia :

100
AT % SU = unde:
SU

SU = substanţa uscată, în procente

94
 Importanţa practică. Prin determinarea conţinutului de azot total se pot trage concluzii
asupra cantităţii de proteine din produsul analizat. Proteinele conţin o cantitate determinată de
azot, care reprezintă, în medie, 16%. Deci fiecare gram de azot determinat corespunde la 6,25
grame de proteine. Această valoare, cunoscută sub numele de coeficient proteic sau factor de
convertire, variază după natura proteinelor, respectiv după originea materialului analizat:
nutreţuri – 6,25; făină de grâu, orz, secară, ovăz – 5,71; seminţe de oleaginoase – 5,30; lapte –
6,38, carne – 6,25 etc. Înmulţind conţinutul procentual de azot găsit cu valoarea coeficientului
proteic, se află cantitatea procentuală de proteină brută din materialul respectiv.

6.4.2. Determinarea azotului total din lapte şi produse lactate

Azotul intră în compoziţia multor compuşi chimici prezenţi în organismele animale şi

vegetale: aminoacizi, peptide, proteine, acizi nucleici, etc. (N-aminic, N-peptidic, N-proteic, N-
nucleic, etc.). Toate formele de azot existente într-un preparat biologic reprezintă azotul total.
Pentru determinarea azotului total se utilizează foarte frecvent micrometoda Kjeldahl.
Principiul metodei. Substanţele organice, conţinute în materialele biologice, prin fierbere
cu acid sulfuric concentrat în prezenţă de catalizatori, se distrug eliberând elementele constitutive
sub diferite forme: carbonul ca bioxid de carbon, hidrogenul şi oxigenul ca apă, fosforul ca acid
fosforic sau fosfor mineral, iar azotul este transformat cantitativ în amoniac. Amoniacul
reacţionează cu acidul sulfuric aflat în exces, formând sulfat de amoniu:

NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Sulfatul de amoniu rezultat, în mediu puternic alcalin se descompune cu eliberarea

amoniacului, conform ecuaţiei:

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

Amoniacul eliberat este distilat prin antrenare cu vapori de apă şi captat într-un volum
cunoscut de soluţie titrată de acid sulfuric, legându-se sub formă de sulfat de amoniu. Excesul de
acid sulfuric este titrat cu o soluţie de aceeaşi normalitate de NaOH:

H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2H2O

După cantitatea de acid sulfuric care a reacţionat cu amoniacul se calculează conţinutul

procentual de azot total.
Reactivi: 1. Acid sulfuric concentrat (d=1,84).
2. Sulfat de cupru cristalizat p.a.
3. Sulfat de potasiu p.a.
4. Soluţie de NaOH 33%. Soluţia se fierbe pentru îndepărtarea combinaţiilor organice
azotate, care ar putea să existe în reactiv. Se păstrează într-o sticlă cu dop de cauciuc.

95
 5. Soluţie de acid sulfuric 0,02 N. Se stabileşte factorul soluţiei de acid sulfuric cu
ajutorul soluţiei titrate de hidroxid de sodiu 0,02 N.
6. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,02 N. Factorul soluţiei de NaOH se stabileşte cu ajutorul
unei soluţii de acid oxalic 0,02 N. Pentru aceasta se cântăreşte la balanţa analitică 0,1261 g de
acid oxalic p.a. şi se dizolvă la balon cotat în 100 ml de apă distilată. Într-un pahar Berzelius de
250 ml se măsoară cu ajutorul unei biurete 20 ml soluţie de acid oxalic, se adaugă 1-2 picături
soluţie alcoolică de fenolftaleină 1% şi se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,02 N până la
apariţia unei coloraţii slab roz persistente. Se calculează normalitatea exactă şi factorul soluţiei
de hidroxid de sodiu.
7. Soluţie roşu de metil ca indicator (0,1 g roşu de metil se dizolvă în 30 ml alcool etilic
96% şi se diluează la 50 ml cu apă distilată).
Aparatură: - baloane de mineralizare Kjeldahl, de 250 ml;
- instalaţie de distilare Parnas-Wagner (balon de fierbere, refrigerent, colector)
- instalaţie de mineralizare şi sursă de căldură pentru distilare;
- sticlărie de laborator (pahare, baloane, pipete, biurete etc.).
Modul de lucru. Determinarea cuprinde trei etape succesive:
a) mineralizarea preparatelor biologice;
b) distilarea amoniacului;
c) titrarea indirectă a amoniacului.
a) Mineralizarea preparatelor biologice. Într-un balon Kjeldahl cu capacitatea de 50-100
ml se introduce o cantitate corespunzătoare de material de analizat, cu un conţinut de cca. 5-10
mg azot. Înainte de introducere în balon, materialul biologic se cântăreşte la balanţa analitică
într-o fiolă de cântărire. Se trece cu atenţie conţinutul fiolei într-un balon Kjeldahl uscat, apoi se
cântăreşte fiola din nou. Diferenţa dintre prima şi cea de-a doua cântărire reprezintă greutatea
probei luată pentru determinare. În cazul lichidelor biologice, volumul probei de analizat se
măsoară cu ajutorul unei pipete.
În balonul Kjeldahl se adaugă 0,1-1,0 g de amestec catalizator format din sulfat de
potasiu şi sulfat de cupru (3/1) şi 1-5 ml acid sulfuric concentrat. Sulfatul de potasiu are rolul de
a ridica temperatura de fierbere, iar sulfatul de cupru accelerează procesul de mineralizare a
substanţei organice. Pot fi utilizaţi drept catalizatori şi apa oxigenată, mercurul metalic, seleniul
etc. Pentru diminuarea spumării, se introduc şi 2-3 perle de sticlă în balonul Kjeldahl care se
încălzeşte progresiv.
Pierderea vaporilor de acid sulfuric poate fi stopată prin introducerea unei mici pâlnii sau
a unui dop de sticlă în gura balonului, care se fixează în poziţie oblică într-un stativ metalic sub
nişă şi se încălzeşte cu grijă pe sita de azbest la flacăra unui bec de gaz. În cazul analizelor în
serie, încălzirea se poate face pe un suport comun, construit special, avînd grijă să se asigure
completa evacuare a gazelor rezultate.
În decursul primelor minute de încălzire conţinutul balonului devine negru şi spumos. În
această etapă, recipientul se încălzeşte treptat până la oprirea spumării conţinutului, după care se
intensifică încălzirea şi se continuă până ce lichidul din balon devine incolor sau uşor colorat în
albastru, datorită sulfatului de cupru. Dacă pe pereţii balonului s-au depus particule de substanţă

96
carbonizată, atunci se spală cu ajutorul amestecului fierbinte, rotind cu atenţie balonul, după care
lichidul este supus unei încălziri suplimentare. Durata mineralizării este în funcţie de natura
materialului biologic supus analizei (cca. 4-6 ore), fiind mai mare la probele ce conţin grăsime
sau care au proteine cu un procent ridicat de lizină (8-12 ore).
După terminarea mineralizării, balonul Kjeldahl se răceşte prin adăugarea unei mici
cantităţi de apă distilată (5 ml), se agită şi conţinutul lui se trece într-un balon cotat de 50 ml.
Întrucât adaosul de apă peste mineralizat produce o reacţie puternic exotermă, se recomandă ca
în timpul acestei operaţii balonul Kjeldahl să fie ţinut sub jet de apă rece, iar gura acestuia să nu
fie îndreptată spre operator. Pentru a antrena întreaga cantitate de mineralizat din balonul
Kjeldahl, pereţii acestuia se spală de 2-3 ori cu volume mici de apă distilată (5-10 ml), care se
adaugă, de asemenea, la amestecul din balonul cotat. Apoi, se completează conţinutul balonului
cotat la semn cu apă distilată. Această soluţie se utilizează pentru distilarea amoniacului.
În paralel, se face o probă martor pentru controlul reactivilor. În acest scop, într-un alt
balon Kjeldahl, în locul preparatului biologic, se ia un volum egal de apă distilată şi se
efectuează aceleaşi operaţii descrise pentru proba cu materialul de analizat.
b) Distilarea amoniacului. Această etapă se realizează într-un aparat de distilare Pregl,
modificat de Parnas şi Wagner. Se măsoară 10 ml de mineralizat din balonul cotat şi se introduc
în balonul de distilare care se închide rapid, apoi extremitatea inferioară a tubului refrigerentului
se introduce în soluţia titrată de acid sulfuric din paharul colector (20 ml acid sulfuric 0,02 N +
2-4 picături soluţie roşu de metil) pentru a evita pierderea amoniacului. Se introduce, apoi, în
balonul de distilare soluţia de NaOH 33% (la 1 ml de H2SO4 concentrat 5 ml soluţie de NaOH
33%), după care se închide imediat circuitul. Este necesat ca reacţia lichidului din balonul de
distilare să fie net alcalină, lucru care se poate constata prin schimbarea culorii mineralizatului
din verde-deschis în albastru, datorită formării hidroxidului de cupru.
Distilarea durează 10-15 minute. În decursul ultimelor 5 minute, partea inferioară a
refrigerentului nu trebuie să se afle în contact cu soluţia de acid sulfuric, coborându-se, în acest
scop, recipientul colector. Sfârşitul distilării se apreciază verificând reacţia unei picături din
refrigerent cu ajutorul hârtiei de turnesol (lipsa culorii albastre). După terminarea distilării,
capătul inferior al refrigerentului, aflat în contact cu soluţia de acid sulfuric, se spală cu volume
mici de apă distilată, care se adaugă în recipientul colector.
Se procedează similar şi cu proba martor, după spălarea prealabilă a aparatului de distilare.
c) Titrarea indirectă a amoniacului. Se titrează excesul de acid sulfuric 0,02 N, rămas
după captarea amoniacului în recipientul colector, cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,02 N până la
virarea coloraţiei soluţiei de la roşu la galben.
Calculul rezultatelor. Un ml soluţie hidroxid de sodiu exact 0,02 N corespunde la 0,28 mg de
azot. Conţinutul procentual de azot total (AT %) în preparatul biologic cercetat se calculează după
formula:

(Vm Vp) • 0,28 • 100 • 100 2,8 (Vm Vp)

AT % = = unde:
V0 • m •1000 V0 • m

97
 Vm = ml soluţie hidroxid de sodiu 0,02 N consumaţi pentru titrarea acidului sulfuric din
proba martor;
Vp = ml soluţie hidroxid de sodiu 0,02 N folosiţi la titrarea excesului de acid sulfuric din
proba de analizat;
V0 = ml de mineralizat luat pentru determinare;
m = masa (sau volumul) probei biologice analizate;

Importanţa practică. Înmulţind conţinutul procentual de azot găsit cu valoarea

coeficientului proteic, care la lapte şi produse din lapte este 6,38, se află cantitatea procentuală de
proteină brută din materialul respectiv.

98
 6.4.3. Determinarea conţinutului de proteine totale prin metoda Kjeldahl
(STAS 90/1988; SR ISO 1871/2002)

Principiul metodei. Determinarea azotului total se bazează pe mineralizarea materiei

organice cu acid sulfuric concentrat în prezenţă de catalizator, urmată de alcalinizarea produsului
de reacţie pentru eliberarea amoniacului, distilarea şi titrarea acestuia.
În timpul mineralizării, substanţele organice din proba de analizat se descompun eliberând
elementele lor constitutive sub diferite forme: carbonul ca dioxid de carbon, hidrogenul şi
oxigenul ca apă, fosforul ca acid fosforic sau fosfor mineral, iar azotul este transformat cantitativ
în amoniac.
Catalizatorul (sulfat de cupru, mercur, seleniu ş.a.), accelerează punerea în libertate a
oxigenului din acidul sulfuric, iar acesta oxidează substanţele organice.
Au loc reacţiile:

CuSO4----------------►CuO + SO3
4CuO-------------------►2CU2O + O2 sau
Hg + H2SO4----------►HgO + SO2 + H2O
4HgO-------------------►2Hg2O + O2
Proteine + [O--------►CO2 + H2O+ NH3

Amoniacul rezultat în urma mineralizării reacţionează cu acidul sulfuric aflat în exces,

formând sulfatul de amoniu:

2NH 3 + H2SO4-------------►(NH4)2SO4

În următoarea etapă, sulfatul de amoniu rezultat, în mediu puternic alcalin, se scindează cu

eliberarea amoniacului, conform reacţiei:

(NH4)2SO4 + 2NaOH-------►Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

Amoniacul eliberat este distilat şi captat într-un volum cunoscut de acid sulfuric cu titru
cunoscut, legându-se sub formă de sulfat de amoniu. Excesul de acid sulfuric este titrat cu soluţie
de hidroxid de sodiu de aceeaşi normalitate cu acidul sulfuric.
Aparatură:
- Balon Kjeldahl, de 500ml;
- Instalaţie de mineralizare formată din: suport, pe care balonul Kjeldahi poate fi încălzit în
poziţie înclinată, surse de încălzire (bec de gaz sau sursă electrică), nişă;
- Aparat de distilare simplă sau aparat de distilare cu antrenare de vapori (Parnas-Wagner);
- Biuretă, de 50 ml cu va\oarea diviziunii de 0,05 ml;
- Pipetă, de 25 şi 100ml;

99
 - Balon cotat, de 250 ml.
Reactivi:
- Acid sulfuric, d = 1,84, liber de compuşi cu azot;
- Acid sulfuric, soluţie 0,1 N, liber de compuşi cu azot;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 0,1 N;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 30% sau 33%;
- Sulfat de cupru, pulbere, sau mercur;
- Indicator roşu de metil 0,2% în alcool 96%(v/v) sau alt indicator (verde de bromcrezol
sau un indicator mixt ca de exemplu indicatorul Polonovski obţinut din 0,03 g albastru de
metilen, 0,1 g roşu de metil şi 60 ml alcool 96% (v/v) totul adus la 100ml cu apă distilată)
Modul de lucru
a. Proba de lucru
Proba de lucru trebuie să conţină 0,005...0,2 g azot, de preferat, mai mult de 0,02 g. În cazul
probelor insuficient omogene, proba de lucru trebuie să fie mai mare, fără să depăşească 1 g şi în
acest caz determinarea se efectuează pe o probă alicotă de lichid rezultată din mineralizarea
probei de lucru.
b. Mineralizarea
Într-o fiolă de cântărire tarată în prealabil, se cântăresc 1...2 g probă de făină cu precizie de
0,001 g. Se trece făina cantitativ în balonul Kjeldahl fără a atinge gâtul balonului. Se adaugă 1g
catalizator, se agită balonul pentru amestecarea probei de făină cu catalizatorul pulbere (sulfat de
cupru), după care se adaugă 30 ml acid sulfuric d = 1,84 măsurat cu un cilindru gradat sau cu o
pipetă automată şi este lăsat să se prelingă pe gâtul balonului pentru a antrena eventualele
particule aderente din probă. Se aşează în gâtul balonului o pâlnie de sticlă, apoi se montează în
poziţie înclinată (axa balonului la 30...45° faţă de orizontală) într-un stativ metalic sub nişă, cu
ventilaţie, pe sită de azbest şi se încălzeşte la flacăra unui bec de gaz. începutul încălzirii este un
moment critic. Conţinutul balonului devine negru şi spumos, iar spuma poate să se ridice până la
gâtul Dalonului sau chiar să scape din balon. Pentru a evita pierderea probei în timpul
mineralizării, se recomandă ca la începutul operaţiei să se aplice o "ncălzire moderată şi numai
după ce conţinutul a încetat să spumeze se rrtensifică încălzirea, mărind flacăra becului de gaz
sau coborând balonul.
Încălzirea se consideră adecvată dacă acidul care fierbe condensează către mijlocul gâtului
balonului Kjeldahl. Este necesar să se evite supraîncălzirea pereţilor balonului care nu sunt în
contact cu lichidul, lucru care se poate realiza, de exemplu, prin aşezarea balonului pe o sită de
azbest cu o gaură cu diametrul puţin mai mic decât al suprafeţei libere a lichidului din balon.
Mineralizarea se consideră, în general, terminată când lichidul din balon s-a decolorat şi a
devenit transparent. Totuşi, acest lucru nu indică neapărat o mineralizare completă a materiei
organice, deoarece azotul din unii compuşi precum lizina, triptofanul şi tirozina este adus în stare
anorganică numai prin prelungirea încălzirii. O încălzire suplimentară de 30...40 min după ce
lichidul devine limpede se consideră suficientă.

100
 Distilarea şi titrarea
Distilare simpl ă (macro-metodă)
Aparatul de distilare folosit este format dintr-un balon de distilare cu capacitatea de 1000
ml, deflegmator, refrigerent şi vas colector (vas conic) cu capacitatea de 500 ml. După răcirea
balonului Kjeldahl în care s-a făcut mineralizarea, se spală pâlnia cu circa 100 ml apă distilată
care se trec în balon, apoi întreg conţinutul balonului Kjeldahl se trece cantitativ, prin spălări
succesive, cu apă, în balonul de distilare, care conţine circa 100 ml apă.
Volumul de lichid din balonul de distilare trebuie să fie de minim 400 ml. În vasul colector
se introduc, cu biureta, 30 ml acid sulfuric soluţie 0,1 N şi 3...5 picături de soluţie de roşu de
metil.
În balonul de distilare se mai pot adăuga 3-4 picături soluţie fenolftaleină, câteva granule
de porţelan poros şi se montează balonul la aparatul de distilare, după ce s-a montat vasul
colector. În balonul de distilare se adaugă circa 100 ml soluţie de hidroxid de sodiu 30%, cu
precauţie, prin pâlnia cu robinet, astfel ca lichidul să se prelingă pe pereţii balonului, până când
conţinutul acestuia capătă reacţie alcalină. Se încălzeşte balonul şi se distilă până când volumul
lichidului din vasul colector ajunge la circa 300 ml distilat. în timpul distilării, capătul alonjei
refrigerentului trebuie să fie sub nivelul lichidului din vasul colector. Se coboară apoi vasul
colector, astfel ca vârful alonjei refrigerentului să fie deasupra nivelului lichidului, se spală
pereţii vasului colector şi alonja cu 15...20 ml apă distilată care se colectează în vasul colector şi
se continuă distilarea încă 5 min. Se titrează excesul de acid din vasul colector cu soluţie de
hidroxid de sodiu 0,1 N până la virarea culorii (în cazul indicatorului roşu de metil de la galben
la roz-vişiniu).
Distilarea cu antrenare de vapori (semi -macro metodă)
Distilarea se realizează folosind aparatul Parnas-Wagner. Acesta este format dintr-un balon
de distilare, un deflegmator, un refrigerent cu alonjă şi generator de vapori (fig. X.)
După răcirea balonului Kjeldahl în care s-a realizat mineralizarea, se adaugă cu pipeta
spălând pâlnia 50...100 ml apă distilată care se colectează în balon. Se omogenizează, apoi se
trece cantitativ într-un balon cotat de 250 ml, se aduce la semn cu apă distilată şi se
omogenizează. Din balon se iau pentru distilare 25 ml din soluţia bine omogenizată.
Soluţia de analizat se introduce în balonul de distilare, apoi la capătul refrigerentului se montează
un vas conic în care se introduc 10 ml acid sulfuric 0,1 N, 3...5 picături de indicator şi o cantitate
de apă distilată, astfel ca alonja din capătul refrigerentului să pătrundă cu 1-2 cm în soluţia de
prindere a distilatului.
După ce vasul s-a montat, în balonul de distilare se introduc, prin pâlnia aparatului, 20 ml
hidroxid de sodiu 33% pentru alcalinizare, după care întreaga instalaţie se etanşează pentru a
evita pierderile de amoniac. Distilarea se consideră terminată atunci când o picătură de distilat nu
mai dă reacţie alcalină cu hârtia roşie de turnesol. în acest moment alonja este spălată cu porţiuni
mici de apă distilată care sunt prinse în vasul conic.
Excesul de acid sulfuric se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N.

101
 Fig. 6.4.3. Aparatul Parnas-Wagner
1-balon de distilare; 2-deflegmator; 3-generator de
vapori; 4-vas de evacuare; 5-refrigerent
(Bordei şi colab., 2007)

Se efectuează două determinări din aceeaşi probă de analiză.

Calculul şi exprimarea rezultatelor

Cantitatea de azot total se calculează cu relaţia:

(V0 – V1) • 0,0014 • 100

Azot (%) = • d
m

Conţinutul de proteină totală raportat la substanţa uscată se exprimă în procente şi se

calculează cu relaţia:
100
Proteină totală % SU = Azot (%) • 5,7 • în care:
100 - u

V0 = volumul de acid sulfuric soluţie 0,1 N introdus în vasul colector, ml;

V1 - volumul de hidroxid de sodiu soluţie 0,N folosit la titrare, ml;
m - masa produsului luat pentru determinare, în g;
0,0014 - titrul acidului sulfuric 0,1 N în raport cu azotul, g/ml, şi rezultă din relaţia:
t H2SO4 = N H2SO4 . EN /1000 = 0,1 . 14/1000 = 0,0014 g/ml
N H2SO4 = normalitatea soluţiei de acid sulfuric;
EN = echivalentul gram al azotului.
d = dilutia efectuată (d = 250/25 = 10);
u - umiditatea probei de analizat, în %;
5,7 - coeficient de transformare a azotului în proteine.
Ca rezultat se ia media aritmetică a celor două determinări, dacă diferenţa dintre ele nu
depăşeşte 0,5 g substanţe proteice pentru 100 g probă de făină (la substanţa uscată).

102
 6.4.4. Determinarea conţinutului total de proteine prin micrometoda Kjeldahl
(Standard AACC 46-13)
Principiul metodei
Substanţele proteice din produsul analizat, prin fierbere cu acid sulfuric în prezenţa
oxidului de mercur drept catalizator, se descompun eliberând elementele lor constitutive sub
diferite forme. Dintre acestea, azotul este transformat cantitativ în amoniac. Acesta este distilat
prin antrenare cu vapori de apă şi titrat cu soluţie 0,02 N acid clorhidric.
Aparatură
4.Stativ pentru mineralizare cu încălzitor electric sau cu gaz;
5. Aparat de distilare cu generator de abur;
6. Balon pentru mineralizare cu capacitate de 30 ml, tip Kjeldahl sau Soltys;
Balanţă analitică.
Reactivi
Indicator roşu de metil - albastru de metilen. Se amestecă 2 părţi soluţie 0,2 % roşu de
metil cu 1 parte soluţie 0,2 % albastru de metilen;
Indicator roşu de metil - verde de bromcrezol. Se amestecă 5 părţi soluţie apoasă 0,2 %
de verde bicromcrezol cu 1 parte soluţie apoasă 0,2 % de roşu de metil;
7. Soluţie hidroxid de sodiu - tiosulfat de sodiu. Se dizolvă 50 g hidroxid de sodiu şi 5 g
tiosulfat de sodiu (Na2S2O6 • 5H2O) în apă şi se aduce la 100 ml;
8. Acid boric, soluţie 4 %. Se dizolvă 4 g acid boric în 100 ml apă;
9. Acid clorhidric, soluţie 0,02 N;
10. Acid sulfuric, d = 1,84;
11. Sulfat de potasiu, pulbere; Oxid de mercur.
Modul de lucru
O cantitate de 10...30 mg probă se cântăreşte la balanţa analitică şi se transferă în balonul
de mineralizare. Cântărirea probei se face într-un tub tarat în prealabil sau pe o bucăţică de hârtie
şi se trece cantitativ în balonul Kjeldahl, fără a atinge gâtul balonului. La probă se adaugă 40 mg
oxid de mercur (catalizator), 1,3 g sulfat de potasiu şi 2 ml acid sulfuric. Se adaugă spărturi de
sticlă care trec prin sita nr. 10 şi se montează o pâlnie în gâtul balonului. Balonul Kjeldahl se
montează în poziţie înclinată în stativ sub nişă şi se face mineralizarea timp de 4 ore cu încălzire
viguroasă, acidul condensând pe gâtul balonului. La sfârşitul mineralizării, balonul se răceşte, se
adaugă o cantitate minimă de apă necesară pentru a spăla gâtul balonului (aproximativ 5 ml).
Se transferă cantitativ conţinutul balonului Kjeldahl în aparatul de distilare, inclusiv
spărturile de sticlă, clătind cu apă distilată balonul (cu condiţia ca după o perioadă de nefolosire a
aparatului, să se treacă abur timp de câteva minute prin aparat). Transferul complet al
conţinutului balonului Kjeldahl se controlează cu o picătură de indicator metil-oranj.
Pentru prinderea distilatului se foloseşte un vas conic de 125 ml în care se introduc 5 ml
acid boric 4% şi 4 picături de indicator (roşu de metil- albastru de metilen sau roşu de metil-
verde de bromcrezol). Alonja refrigerentului trebuie să intre în soluţia din vas.

103
 Se adaugă 8 ml soluţie de hidroxid de sodiu-tiosulfat de sodiu în aparatul de distilare şi se
începe distilarea prin antrenare cu vapori, care continuă până se colectează aproximativ 15 ml de
distilat.
După întreruperea distilării, refrigerentul şi alonja se spală cu apă distilată, aceasta fiind
prinsă tot în balonul conic. Se adaugă apă distilată până la un volum de 50 ml şi conţinutul
vasului se titrează cu soluţie 0,02 N acid clorhidric până la culoarea gri sau prima apariţie a
culorii roşii.
În paralel, se face o probă martor folosind aceleaşi cantităţi de reactivi şi acelaşi timp de
mineralizare şi spălarea identică a balonului de mineralizare.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Rezultatul se exprimă pentru 100 mg probă:

(V2 – V1) • N • E
Azot total % = • 100 în care:
m

V2 = volumul soluţiei 0,02 N de acid clorhidric folosit la titrarea probei de analiză, ml;
V1 = volumul soluţiei 0,02 N de acid clorhidric folosit la titrarea probei martor, ml;
N - normalitatea soluţiei de acid clorhidric folosită la titrare (0,02 N);
E - echivalentul gram al azotului (E = 14);
m - masa probei luată în analiză, g.
Proteine (%) = Azot total (%) • 5,7
5,7 - coeficient de transformare a azotului în proteine.

6.4.5. Determinarea proteinelor totale din făină prin metoda

cu mineralizare rapidă

Principiul metodei. Proteinele se degradează până la amoniac, dioxid de carbon şi apă cu

acid sulfuric concentrat, în prezenţa oxidului cromic drept catalizator. Oxidarea se finalizează
prin fierbere cu persulfat de sodiu sau de potasiu. Au loc reacţiile:
2CrO3 + 3H2S04 ----------- ► Cr2(SO4)3 + 3H2O + 3[O]
Proteine + [O] -----------►CO2 + H2O + NH3
Cr2(SO4)3 + 4H2O+ K2S2O8 -----►2 KHSO4 + 2CrO3 + 3H2SO4
Amoniacul rezultat reacţionează cu excesul de acid sulfuric:
2NH 3 + H 2 SO 4 --------►(NH 4 ) 2 SO 4
Amoniacul sub formă de sulfat de amoniu se distilă în mediu alcalin, distilatul prinzându-se
într-o soluţie de acid sulfuric cu titru cunoscut:
(NH 4 )2SO4 + 2NaOH -----------►Na2SO4 + 2NH4OH
Aparatură
- Balanţă analitică;
- Balon cotat de 250 ml;

104
 - Aparat de distilare Parnas-Wagner.
Reactivi
- Oxid cromic, soluţie 50%;
- Persulfat de sodiu sau de potasiu;
- Acid sulfuric, d = 1,84%;
- Acid sulfuric, soluţie 0,1 N;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 33%;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 0,1 N;
- Indicator roşu de metil 0,2% în alcool 96% (v/v) sau alt indicator.
Modul de lucru
Se cântăresc 0,5... 1 g făină care se introduc într-un balon Erlenmeyer, se adaugă 20 ml
soluţie de oxid cromic 50 % măsurată cu cilindrul gradat şi apoi, sub agitare continuă şi în
porţiuni mici, se adaugă şi 25 ml acid sulfuric concentrat (măsurat cu cilindrul gradat). După 30
de minute se trece conţinutul balonului Erlenmeyer într-un balon cotat de 250 ml. O porţiune de
25 ml se fierbe cu o cantitate mică de persulfat de sodiu sau de potasiu pentru oxidarea resturilor
de substanţă organică rămase nedegradate. Amestecul obţinut se distilă în aparatul Parnas-
Wagner în prezenţa a 25 ml hidroxid de sodiu soluţie 33 %. Distilatul se prinde în 10 ml acid
sulfuric soluţie 0,1 N la care s-a adăugat indicator (3...5 picături). Alonja refrigerentului trebuie
să fie cufundată în soluţia de prindere a distilatului. Distilarea are loc până când distilatul nu mai
dă reacţie alcalină faţă de hârtia roşie de turnesol (hârtia nu-şi modifică culoarea). Se titrează
excesul de acid sulfuric cu o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Cantitatea de azot total din produsul analizat se exprimă în procente şi se calculează cu
relaţia:
(V0 – V1) • 0,0014 • 100
Azot (%) = • d
m

Conţinutul de proteină totală raportat la substanţa uscată se exprimă în procente şi se

calculează cu relaţia:
100
Proteină totală % SU = Azot (%) • 5,7 • în care:
100 - u

V0 = volumul de acid sulfuric soluţie 0,1 N introdus în vasul colector, ml;

V1 - volumul de hidroxid de sodiu soluţie 0,N folosit la titrare, ml;
m - masa produsului luat pentru determinare, în g;
0,0014 - titrul acidului sulfuric 0,1 N în raport cu azotul, g/ml,
d = dilutia efectuată (10);
u - umiditatea probei de analizat, în %;
5,7 = coeficient de transformare a azotului în proteine

105
 Determinarea conţinutului de proteină brută din cereale (STAS 6283/4-84)
Principiul metodei
Are le bază mineralizarea şrotului de cereale cu acid sulfuric, în prezenţa unui catalizator
conform metodei Kjeldhal, alcalinizarea mineralizatului, distilarea şi titrarea amoniacului
eliberat. Titrarea se poate efectua prin două variante, respectiv directă sau indirectă.
Aparatură:
- balanţă analitică;
- balanţă tehnică;
- instalaţie Kjeldhal compusă din instalaţie mineralizare cu patru posturi, instalaţie
neutralizare a vaporilor, instalaţie de distilare cu un post.
- moară de laborator;
- sticlărie de laborator.
Reactivi:
- acid boric, 4%;
- acid sulfuric cu densitatea 1,84 g/cm3 şi soluţie 0,1 N;
- soluţie hidroxid de sodiu 33% şi 10%;
- catalizator (din comerţ);
- indicator mixt: so!uţie alcoolică 0,2% de roşu de metil cu soluţie alcoolică 0,2% de verde
de brom crezol (1 + 5vol.)
Modul de lucru
Se cântăreşte cu precizie de 0,0002g, circa 1,5 g probă măcinată. Se trece într-un balon
Kjeldhal, se adaugă catalizator şi 25 ml acid sulfuric (dens. 1,84 g/cm3). Se ataşează balonul la
instalaţia de mineralizare, legată la instalaţia de absorbţie vapori, pentru neutralizare cu soluţie
NaOH, 10%.
După terminarea mineralizării, se răceşte proba, după care se introduce în aparatul de
distilare unde are loc automat adaosul de soluţie NaOH, 33%. În vasul colector, existent în
instalaţia de distilare, se adaugă 25 ml soluţie acid boric 4% şi indicator mixt (2- 3 picături). La
sfârşitul operaţiei de distilare, azotul prins în acid boric se titrează cu acid sulfuric 0,1 N, până la
coloraţie gri.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Se calculează azotul raportat la substanţa uscată, exprimat în procente masice, % (m/m),
cu formula:

106
 N = T x 14 / W(100–M) în care:
N = azotul total, % masice
T = cantitatea de acid standard consumat în ml
W = masa probei introduse în lucru, în g
M = umiditatea probei, % masice
Exprimarea rezultatelor se face cu două zecimale.
Dacă se calculează azotul din substanţa proaspătă formula de mai sus devine:
N = T x 0,14 / W
Pentru a transforma rezultatul obţinut în procente masice proteină la substanţă uscată, se
înmulţeşte valoarea pentru azotul total cu factorul de conversie..

6.4.6. Determinarea azotului proteic

Produsele animale şi vegetale conţin, alături de substanţele proteice propriu-zise, şi alte

combinaţii azotate neproteice. În majoritatea cercetărilor biochimice este necesar să cunoaştem
conţinutul real al substanţelor proteice, determinând separat numai azotul corespunzător
proteinelor (azotul proteic).
Principiul metodei. Pentru determinarea azotului proteic, proteinele se separă de alte
combinaţii azotate prin precipitare, apoi precipitatul proteic se mineralizează cu H2SO4 în
prezenţă de catalizatori şi se determină conţinutul azotului după micrometoda Kjeldahl.
Reactivii, aparatură şi sticlăria sunt aceleaşi ca pentru dozarea azotului total.
Modul de lucru. O cantitate de material biologic fărâmiţat fin, care să conţină 3-5 mg azot
proteic, se introduce într-un pahar de 100 ml. Se adaugă 25 ml de apă distilată şi se încălzeşte
până la fierbere, agitând conţinutul paharului cu o baghetă de sticlă. În cazul materialelor
vegetale bogate în amidon (seminţe de cereale, leguminoase, cartofi), conţinutul paharului se
încălzeşte pe baia de apă, timp de 30 minute, la temperatura de 50-55C, întrucât la o
temperatură mai ridicată amidonul cleisterizează şi se îngreuează filtrarea ulterioară. După
încălzire, se precipită proteinele cu soluţie de acid tricloracetic. Pentru aceasta, se adaugă în
pahar, prin agitare, 5 ml soluţie de acid tricloracetic 50%. După 30-40 minute de repaus,
conţinutul paharului se filtrează pe hârtie de filtru cantitativă. Paharul şi precipitatul de pe filtru
se spală de câteva ori cu soluţie de acid tricloracetic 2%.
După terminarea filtrării, se usucă filtrul împreună cu pâlnia timp de 1-2 ore în termostat,
la 50-60C. Când hârtia de filtru începe să se desprindă uşor de pe pâlnie, filtrul, împreună cu
precipitatul se introduc într-un balon Kjeldahl şi, în continuare, se urmează aceleaşi etape ca în
cazul dozării azotului total, iar rezultatele se exprimă, de obicei, în procente la substanţa uscată.

107
 Teste de verificare a reactivilor şi aparaturii

1. Test de verificare a reactivilor

La reînnoirea reactivilor sau pentru verificarea reactivilor aflaţi în lucru se face o probă
martor, care cuprinde toate etapele modului de lucru şi se face înlocuind proba de lucru printr-o
cantitate echivalentă dintr-o substanţă organică lipsită de azot (ex. glucoză sau zaharoză). Ar
trebui ca volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,1N folosit la titrare să fie echivalent cu cel de
acid sulfuric, soluţie 0,1N introdus în vasul colector. Dacă apar erori, se determină care reactiv
introduce azot sau dacă aparatul de distilat (deflegmatorul) permite preluarea în distilat, din
conţinutul alcalin al balonului de distilare.
2. Test de verificare a aparatului de distilare
În balonul de distilare al instalaţiei se introduc 10 ml sulfat de amoniu 0,1 N, se
alcalinizează, se distilă şi se titrează. Dacă rezultatul este mai mic decât cantitatea de sulfat de
amoniu introdusă în instalaţie, aceasta este din cauza neetanşeităţilor aparatului sau distilării
incomplete (volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,1N folosit la titrare trebuie să corespundă
unui exces de 8 ml acid sulfuric 0,1 n rămas în vasul colector al aparatului de distilare din cei 10
ml acid sulfuric 0,1 n introduşi în vasul colector).
3. Test de verificare a eficienţei deflegmatorului
Se introduc în aparat 10 ml soluţie sulfat de amoniu 1N şi 300 ml apă distilată. Se
alcalinizează soluţia cu hidroxid de sodiu soluţie 30%, se distila şi se titrează. Volumul soluţiei
de hidroxid de sodiu 0,1 N folosit la titrare trebuie să corespundă unui exces de 10 ml acid
sulfuric 0,1 N rămas în vasul colector al aparatului de distilare, dintr-un volum total de 30 ml.
Dacă volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,1 N folosit la titrare este mai mare de 10 ml,
înseamnă că distilarea este incompletă sau există scăpări de amoniac, datorită unor defecţiuni ale
aparatului.
4. Test de verificare a mineralizării
Se determină conţinutul de azot din 0,5...1 g de compus organic cunoscut, care este dificil
de descompus, de exemplu triptofan, singur sau în amestec cu substanţe care nu conţin azot. În
acest scop se mai pot folosi: clorură de amoniu uscată (25,15 % azot), glicocol (18,66 % azot),
cistina (11,66 % azot), acid nicotinic (11,38 % azot).
Un rezultat inferior celui exact, care nu poate fi atribuit cauzelor deja descrise (distilare,
mod de lucru), se poate datora insuficientei distrugeri a materiei organice (de exemplu o încălzire
neadecvată) sau utilizării unui catalizator necorespunzător.
Observaţii
- Proba de analizat se poate cântări pe o hârtie pergaminată (lipsită de azot) tarată în
prealabil; se împachetează şi se introduce în balonul Kjeldahl.
- Reactivii folosiţi trebuie să aibă puritate mare (p.a.).
- Apa trebuie să fie distilată şi lipsită de amoniac. Obţinerea apei lipsită de amoniu se face
adăugând 0,1 ml acid sulfuric concentrat la 1 litru de apă distilată şi se distilă din nou.
- Pentru mineralizare şi pentru distilare se pot folosi aparate automate (ex. aparat de
mineralizare rapidă tip Digesdahl, aparat de distilare automată tip UDK 130D).
108
 6.4.7. Determinarea proteinelor din făină prin metoda biuretului

Principiul metodei. Reacţia biuretului este o reacţie de culoare a proteinelor cu ionii de

Cu în mediu alcalin. Apare o culoare violetă sau albastră-violetă datorită formării unor compuşi
2+

de tip chelatic între ionui de Cu2+ şi legăturile peptidice din structura moleculară a proteinelor.
Această reacţie necesită existenţa a cel puţin două legături peptidice, astfel că ea este pozitivă şi
în cazul oligo- şi polipeptidelor. Aminoacizii, în general, nu dau această reacţie de culoare, fac
excepţie serina, treonina şi histidina. Intensitatea culorii este direct proporţională cu conţinutul de
proteine.
Aparatură:
- Fotocolorimetru.
Reactivi:
- Sulfat de cupru, soluţie 5%;
- Hidroxid de sodiu, soluţie 30%.
Modul de lucru
Se cântăresc 0,2...0,6 g făină care se trec cantitativ într-un mojar. Se adaugă 6 ml soluţie
5% sulfat de cupru şi 6 ml soluţie 30% hidroxid de sodiu şi se mojarează până se obţine o masă
omogenă; se adaugă 30 ml apă distilată, se omogenizează din nou, apoi se lasă în repaus timp de
20 de minute pentru decantare. Lichidul decantat se centrifughează timp de 10 minute la 3000
rot/min. După centrifugare lichidul trebuie să fie perfect clar, în caz contrar, se repetă
centrifugarea. Soluţia limpede se fotocolorimetrează pentru determinarea extincţie la 620 nm,
folosind cuve de 0,5 cm şi apă distilată ca fond.
Conţinutul de azot total al probei se determină în funcţie de extincţia citită, folosind o curbă
etalon.
Trasarea curbei etalon
Curba etalon se construieşte astfel: se cântăresc minim 3 probe de masă diferită între 0,2 şi
0,6 g din produsul de analizat. Cu aceste probe se fac determinări paralele, prin metoda Kjeldahl
şi metoda biuretului. Cantitatea de azot determinată prin metoda Kjeldahl pentru fiecare probă se
trece în curbă pe abscisă, iar extincţia determinată prin metoda biuretului, pentru aceleaşi
cantităţi de probă, se trece pe ordonata curbei. Se obţin astfel o serie de puncte care prin unire
vor da o dreaptă care porneşte de pe ordonată ceva mai sus de origine.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
În funcţie de extincţia determinată la proba de analizat, se ia din curba etalon cantitatea de
azot total corespunzătoare cantităţii de produs analizat. Se calculează azotul pentru 100 g produs
cu relaţia:
a
Azot (%) = •100
1000 • m

Conţinutul de substanţe proteice raportat la substanţa uscată se exprimă în procente şi se

calculează cu relaţia:

109
 100
Proteine totale (%) = Azot (%) • 5,7 • în care:
100 – u

a = conţinutul de azot citit pe curba etalon pentru proba analizată, mg;

m = masa probei luată în analiză, g;
u = umiditatea probei de analizat, %;
5,7 = coeficient de transformare a azotului în proteine.

6.4.8. Determinarea proteinelor folosind reactivul Folin-Ciocâlteu

Principiul metodei. Proteinele reacţionează la nivelul legăturilor peptidice cu ionul de Ca2+

în condiţii alcaline şi în prezenţa acidului fosfomolibdenic-fosfowolframic (reactivul Folin-
Ciocâlteu), cu acţiune reducătoare, când se formează un compus aromatic colorat în albastru,
căruia i se poate determina extincţia la lungimea de undă de 760 nm, intensitatea coloraţiei fiind
proporţională cu concentraţia proteinelor din mediu. Metoda este foarte sensibilă la concentraţii
reduse de proteină (0,1...2 mg proteină/ml).
Aparatură:
- Spectrofotometru;
- Balanţă analitică;
- Agitator mecanic;
- Microbiuretă automată de 1 ml.
Reactivi:
- Carbonat de sodiu, soluţie 2 % în soluţie 0,1n de hidroxid de sodiu;
- Sulfat de cupru (CuSO4-5H2O), soluţie 0,5 % în soluţie 1 % de tartrat de sodiu şi potasiu;
- Amestec de 50 ml soluţie carbonat de sodiu 2 % cu 1 ml soluţie sulfat de cupru 0,5 %.
Reactivul este stabil 24 ore;
- Tetraclorură de carbon;
- Reactiv Folin-Ciocâlteu. Într-o sticlă pentru reactivi de 1500 ml se prepara un amestec
format din 10 g wolframat de sodiu şi 25 g molibdat de sodiu în 700 ml apă distilată se adaugă
50 ml soluţie de 85 % acid fosforic, 100 ml acid ctorhidric concentrat si se fierbe într-un balon
prevăzut cu refrigerent ascendent, timp de 10 ore. Se adaugă 150 g sulfat de litiu şi câteva
picături de brom; se continuă fierberea încă 15 min. Se răceşte şi se aduce la volumul de 1000 ml
cu apă distilată. Înainte de întrebuinţare se diluează un volum reactiv cu două volume de apă
distilată.
Modul de lucru
Extracţia proteinelor
Se cântăresc 0,5 g făină sau şrot de grâu măcinat fin, cu o precizie de 0,005 g, într-o fiolă
de aluminiu sau de material plastic. Proba se trece cantitativ într-o sticlă cu gât larg de 100 ml
care se acoperă cu dop rodat (sau dop obişnuit acoperit cu o folie de material plastic). Se adaugă

110
apoi 2 ml tetraclorură de carbon şi 50 ml soluţie 2 % carbonat de sodiu. Se agită timp de 60 min
la un agitator mecanic. Extractul se centrifughează la 4500 rot/min timp de 10...15 min.
Determinarea conţinutului de proteine
Cu ajutorul unei microbiurete automate de 1 ml, se transferă într-o eprubetă 0,1 ml extract
centrifugat. Se adaugă 10 ml din amestecul soluţiei 2 % Na2CO3 şi soluţiei 0,5 % CuSO4 şi se
amestecă totul. După cel puţin 15 min se adaugă 1 ml reactiv Folin-Ciocâlteu diluat şi se agită
energic. După minimum 30 min, timp în care coloraţia rămâne neschimbată, se determină
extincţia la spectrofotometru, la lungimea de undă de 760 nm, în cuve de 1 cm.
Trasarea curbei etalon
Curba etalon se construieşte astfel: se cântăresc minim trei probe de masă diferită între
0,2...0,5 g din produsul de analizat. Cu aceste probe se fac determinări paralele, prin metoda
Kjeldahl şi metoda cu reactivul Folin-Ciocâlteu. Cantitatea de azot determinată prin metoda
Kjeldahl pentru fiecare probă se trece pe curbă pe abscisă, iar extincţia determinată prin reacţia
cu reactivul Folin-Ciocâlteu, pentru aceleaşi cantităţi de probă, se trece pe ordonată. Se obţin
astfel o serie de puncte care prin unire vor da curba etalon.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
În funcţie de extincţia determinată la proba de analizat, se extrage din curba etalon
cantitatea de azot corespunzătoare cantităţii de produs analizat. Cunoscând cantitatea de azot se
calculează cantitatea de proteine din produsul analizat, exprimată în procente, folosind relaţia:
N • 5,7 • d
Proteine (%) = în care:
m
N = cantitatea de azot extrasă din curba etalon, în g;
d = diluţia efectuată (52/0,1 = 520)
m = masa produsului, luată în analiză, în g;
5,7 - coeficientul de transformare a azotului în proteine.

111
 6.4.9. Determinarea proteinelor solubile din făină prin metoda spectrofotometrică

Principiul metodei. Extracţia proteinelor în soluţie de clorură de sodiu 1 % şi citirea extincţiei

la 210 nm. Metoda se bazează pe proprietatea proteinelor aflate în soluţie de a absorbi maxim în
domeniul UV.
Aparatură:
- Spectrofotometru;
- Balanţă analitică.
Reactivi:
- Clorură de sodiu, soluţie 1 %;
- Soluţie standard de proteină 10% în soluţie NaC11%.
Modul de lucru
Se cântăresc exact 0,025 g făină şi se amestecă energic, într-un mojar, cu 20 ml soluţie 1 %
NaCI. Se filtrează prin filtru cutat care se spală de trei ori cu câte 10 ml soluţie 1% NaCI. Totul
se adună într-un balon cotat de 50 ml aducându-se la semn cu soluţie salină. Cu această soluţie se
citeşte extincţia la spectrofotometru în cuvă de 1 cm la 210 nm.
În paralel se trasează o curbă etalon pornindu-se de la o soluţie standard de proteină 10% în
soluţie salină 1 % din care se fac diluţii până la 1/5000, curba având în abscisă concentraţiile şi
în ordonată extincţiile.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Rezultatul se exprimă în g proteine pentru 100 g produs. Din compararea extincţiei probei
de analizat cu cele de pe curba etalon a căror concentraţii sunt cunoscute, se calculează
conţinutul în proteine solubile în apă al probei de analizat.

c
Proteine (%) = • 100 în care:
1000 • m

c = cantitatea de proteine din curba etalon care corespunde extincţiei probei de analizat, mg;
m = masa probei luată în analiză, g;
1000 = factor de transformare din mg în g.
Tehnica acestei metode este simplă, cu o bună specificitate pentru proteine şi sensibilitate
mare (0,5 γ).

112
 6.4.10. Separarea electroforetică a proteinelor din făină pe gel de poliacrilamidă
(SDS-PAGE)

Principiul metodei. Separarea proteinelor (fracţiunilor proteice) se poate face prin migrarea
într-un câmp electric în funcţie de masa lor moleculară şi determinarea densitometrică a
intensităţii benzilor obţinute.
Varianta 1
Aparatură:
- Aparat de electroforeză pe verticală;
- Matriţe pentru prepararea gelurilor;
- Sursă de curent. Un generator de curent continuu care produce tensiune constantă şi stabilă
la 200 V;
- Baie de apă;
- Sistem de purificare a apei. Un sistem de deionizare pentru a obţine apă de calitate;
- Balanţă analitică;
- Micropipete cu volum reglabil pentru a putea măsura de la 5 μl la 50 μl;
- Microseringi cu capacitatea de 15 μl;
- Microcentrifugă, turaţie 14000 rpm;
- Tuburi de centrifugă cu capacitatea de 1,5-2,0 ml;
- Agitator cu viteză reglabilă, capabil de a avea viteza de agitare de aproximativ 50 rpm.
- Recipiente rigide din polietilenă;
- Cutii de pyrex, 33 cm x 23 cm x 5 cm pentru spălarea gelului şi examinare vizuală;
- Cutie cu lumină (negatoscop) echipată cu o sursă de lumină;
- Aparat de fotografiat cu cameră digitală;
- Stativ pentru aparatul de fotografiat;
- Analizor de imagini Kodak.
Reactivi:
- Soluţie stoc de acrilamidă, 30% (w/v);
- N,N'-metilenbisacrilamidă;
- SDS (sodiu dodecil sulfat);
- Soluţie tampon tetraborat 0,0125 M, pH 10 care conţine 1 % dodecilsulfat de sodiu (SDS)
şi 2 % 2-mercapoetanol (v/v);
- Tris-HCl 0,3 M, pH 8,8;
- Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8;
- N,N,N',N'-tetrametilendiamidă;
- Persulfat de amoniu, soluţie 5 %;
- Tris-HCI 0,0132 M, pH 6.8;
- Glicerol, soluţie 10 %;
- Bromfenol blue, 0,05 %;
- Gelcode blue;

113
 - Soluţie tampon de migrare: Tris-HCI 0,025 M, glicină 0,192 M şi 1% SDS (pH 8,3).'
Modul de lucru
a. Extracţia proteinelor
La 50...70 mg făină se adaugă 0,5 ml soluţie tampon tetraborat 0,0125 M, cu pH 10 ce
conţine 1 % SDS (w/v) şi 2 % 2-mercaptoetanol (v/v).
Proteinele se extrag timp de 1 oră la temperatura camerei, sub agitare. Suspensia se
centrifughează timp de 10 min la 1400 rpm şi supernatantul se utilizează pentru analiză prin SDS
-PAGE.
b. Prepararea gelurilor
Gelul de separare conţine 15 % acrilamidă. Se prepară din soluţia stoc de acrilamidă şi 0,8
% N,N'-metilenbisacrilamidă (w/v). Se diluează apoi până la 15 % acrilamida adăugând 0,3 M
Tris-HCI (pH 8,8) şi 0,1 % SDS (w/v). Gelul de concentrare conţine 4 % acrilamidă. Se prepară
din soluţia stoc de acrilamidă 30 % şi 0,6 % (w/v) N,N'-metilenbisacrilamida. Pentru a ajunge (a
concentraţia finală de 4% acrilamidă se adaugă 0,125m Tris-HCI (pH 6,8) şi 0,1% SDS (w/v).
Pentru polimerizarea acestor geluri se folosesc 5 μl de tetrametilendiamidă şi 10 μl
persulfat de amoniu 5 %.
Grosimea gelurilor este de 1,5 mm. Gelurile se prepară cu ansamblul de plăci şi
distanţatoare ale instalaţiei (matriţa). Se prepară mai întâi gelul de separare prin pipetarea
amestecului în matriţa aşezată în poziţie verticală. Se lasă la temperatura camerei cel puţin 12
ore. Se îndepărtează clemele şi matriţa cu gelul se ataşează cuvei de electroforeză. Apoi se
pipetează amestecul pentru gelul de concentrare, iar după polimerizare se îndepărtează piptenele
şi se aplică probele. În acest scop, 15 μl de amestec 1:1 de extract de proteină şi probă tampon
(0,0132 M Tris-HCI pH 6,8, 2 % SDS, 10 % glicerol, 0,05 % bromfenol blue şi 2 % de 2-
mercaptoetanol) se agită; apoi amestecul se fierbe pe baie de apă 3 min., se răceşte şi se aplică,
folosind o microseringă, în fiecare godeu realizat de pieptene în gelul de concentrare.
Peste probe se adaugă soluţie tampon de migrare şi apoi se umplu cele două rezervoare,
superior şi inferior cu aceeaşi soluţie, care constă în 0,25 M Tris, 0,192 M glicină şi SDS 1 %
(pH 8,3). Se conectează electrozii la sursa de curent: polul pozitiv la rezervorul superior (anod),
iar polul negativ la rezervorul inferior (catod).
Electroforeza
Se efectuează la temperatura camerei şi la o tensiune de 200 V timp de 45 min. Când
migrarea se termină, se întrerupe curentul electric, se îndepărtează capacul de protecţie al cuvei
superioare şi se goleşte de soluţia tampon pe care o conţine.
Colorarea
Se detaşează plăcile cu gel din aparatul de electroforeză. Se deschid plăcile, se iau gelurile
şi se amplasează fiecare într-o cutie de material plastic şi se spală de 3 ori cu câte 100 ml apă
distilată deionizată, timp de 5 min. de fiecare dată.
Pentru evidenţierea proteinelor separate, apa din tăvile de material plastic se înlocuieşte cu
soluţie de colorare care reacţionează 60 min la temperatura camerei. Pentru decolorare gelurile se
aşează în tăvi care conţin 100 ml apă distilată deionizată.

114
 Fotografierea
Gelurile umede cu benzi proteice colorate se fotografiază. În acest scop, se montează
aparatul de fotografiat pe un stativ. Gelul se introduce în pungi de plastic, se plasează sub sursa
de lumină şi se fotografiază. Imaginile se transferă la un analizor de imagini Kodak care măsoară
intensitatea benzilor sau se foloseşte un microdensimetru (Cari Zeiss) cuplat la un înregistrator
prevăzut cu un integrator automat, ce exprimă procentual fiecare fracţiune proteică raportată la
proteina totală.

Varianta 2
Aparatură:
- Aparat de electroforeză pe verticală;
- Matriţe pentru prepararea gelurilor;
- Sursă de curent. Un generator de curent continuu care produce tensiune constantă şi
stabilă la 200 V;
- Sistem de deionizare a apei;
- Balanţă analitică;
- Microseringi cu capacitatea de 10 μl;
- Recipiente rigide din polietilenă;
- Cutii pyrex, 33 cm x 23 cm x 5 cm pentru spălarea gelului;
- Aparat de fotografiat cu cameră digitală;
- Analizor de imagini Kodak;
- Probă tampon stoc. Se prepară din 20 ml glicerol, 12,5 ml 1M Tris-HCI (pH 6,8), 4 g
SDS, 24,1 ml apă distilată şi 2.0 mg Pyronin Y în calitate de colorant;
- Probă tampon. Se prepară proaspătă de fiecare dată combinând 2,5 ml probă tampon
stoc, 6 ml apă distilată şi 0,45 ml de 2-mercaptoetanol 4 % (v/v);
- Soluţie stoc de acrilamidă, 30 % (w/v);
- N,N'-metilenbisacrilamida;
- Tris-HCI, 1,5 M (pH 8,8) şi 0,5 M (pH 6,7);
- SDS (sodiu dodecil sulfat);
- N,N,N',N'-tetrametilendiamidă (TEMED);
- Persulfat de amoniu;
- Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), soluţie. Soluţia se prepară din 2 g/l de CBB,
10 % acid acetic, 50 % metanol, 2 % acid tricloracetic. Se dizolvă 2 g CBB în 500 ml metanol, se
filtrează şi se aduce la 1 litru cu 10 % acid acetic şi 2 % acid tricloracetic;
- Soluţie de decolorare. Conţine 40 % metanol şi 5 % acid acetic glacial;
- Soluţie tampon de migrare. Tris-HCI 25 mM, glicină 192 mM şi SDS 0,1 % (pH 8,3).
Modul de lucru
1. Pregătirea probei
Proba de proteină liofilizată (20...50 mg) se dizolvă cu 1 ml probă tampon (obţinută prin
diluarea probei tampon stoc). Se agită timp de 16 ore la 37°C. Soluţia obţinută se foloseşte
pentru SDS-PAGE.

115
 2. Prepararea gelurilor
Gelul de separare se obţine din soluţia stoc de acrilamidă 30 % şi 0,8 % (w/v) N,N'-
metilenbisacrilamidă care se diluează apoi până la 12 % acrilamida adăugând 1,5 M Tris-HCI
(pH 8,8) şi 0,1 % SDS. Pentru iniţierea polimerizării se adaugă 0,03 % (w/v) persulfat de
amoniu, iar în calitate de accelerator al polimerizării N,N,N',N'-tetramertilendiamidei (TEMED)
în proporţie de 0,03 % (w/v).
Gelul de concentrare are concentraţia finală de 4 % acrilamidă. Se prepară din soluţia stoc
de acrilamidă 30 % şi 0,6 % (w/v) N,N'- metilenbisacriiamida. Pentru aducerea la concentraţia
finală de 4 % acrilamidă, se adaugă 0,5 M Tris-HCI (pH 6,7) şi 0,1 % SDS. Se mai adaugă apoi
0,13 % (v/v) TEMED şi 0,04 % (w/v) persulfat de amoniu. Grosimea gelurilor este de 1,5 mm.
Gelurile se prepară cu ansamblul de plăci şi distanţatoare ale instalaţiei (matriţa). Se
prepară mai întâi gelul de separare prin pipetarea amestecului în matriţa aşezată în poziţie
verticală. Se lasă la temperatura camerei cel puţin 12 ore, se îndepărtează clemele şi matriţa cu
gelul se ataşează cuvei de electroforeză. Apoi se pipetează amestecul pentru gelul de
concentrare, iar după polimerizare se îndepărtează pieptenele şi se aplică probele.
Folosind o microseringă, în fiecare godeu realizat de pieptene în gelul de concentrare se
aplică 10 pi din soluţia de proteină.
3. Electroforeza
Peste probele aplicate în gelul de concentrare, se adaugă soluţie tampon de migrare şi apoi
se umplu cele două rezervoare, superior şi inferior cu aceeaşi soluţie, care constă în 25 mM Tris-
HCI, 192 mM glicină şi 1% SDS (pH 8,3). Se conectează electrozii la sursa de curent: polul
pozitiv la rezervorul superior (anod), iar polul negativ la rezervorul inferior (catod).
Electroforeza se efectuează la temperatura camerei la o tensiune de 200 V timp de 45 min.
Când migrarea se termină, se întrerupe curentul electric, se îndepărtează capacul de protecţie al
cuvei superioare şi se goleşte de soluţia tampon pe care o conţine.
4. Colorarea
Se detaşează plăcile cu gel din aparatul de electroforeză. Se deschid plăcile, se iau gelurile
şi se pune fiecare într-o cutie de material plastic şi se spală de 3 ori cu câte 100 ml apă distilată
purificată timp de 5 min de fiecare dată.
Pentru evidenţierea proteinelor separate, apa din tăvile de material plastic se înlocuieşte cu
soluţie de Coomassie Brilliant Blue. Se lasă gelurile pentru colorare în colorant peste noapte
agitând uşor. După colorare, gelurile se spală de 3-5 ori cu apă deionizată.
Pentru decolorare, gelurile se aşează în tăvi care conţin soluţia de decolorare unde se lasă
până când gelurile sunt clare.
5. Fotografierea
Gelurile umede, decolorate, se fotografiază. în acest scop se introduc în pungi de plastic, se
plasează sub sursa de lumină şi se fotografiază. Imaginile se transferă la un analizor de imagini
Kodak care măsoară intensitatea benzilor sau se foloseşte un microdensimetru (Carl Zeiss) cuplat
la un înregistrator prevăzut cu un integrator automat, care exprimă procentual fiecare fracţiune
proteică faţă de proteina totală.

116
 6.5. DOZAREA CAZEINEI DIN LAPTE
6.5.1. Dozarea cazeinei prin metoda Kjeldahl

Metoda poate fi folosită atât pentru laptele proaspăt cât şi pentru cel conservat cu formol,
iar etapele determinării constau în:
- precipitarea cazeinei din lapte cu acid acetic şi filtrarea produsului;
- determinarea azotului din precipitat şi multplicarea rezultatului cu 6,38 pentru calculul
cantităţii de cazeină.
Reactivi. 1. Acid acetic, soluţie 10%
2. Acid sulfuric concentrat (d=1,84)
3. Sulfat de cupru cristalizat p.a.
4. Sulfat de potasiu p.a.
5. Soluţie de NaOH 33%
6. Soluţie de acid sulfuric 0,02 N
7. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,02 N
Modul de lucru. Se introduc într-un pahar Berzelius 10 ml lapte şi 90 ml apă distilată
încălzite la 40-42C, apoi 1 ml acid acetic 10% şi paharul cu amestecul de reacţie se agită şi se
menţine în repaus 3-5 minute. Se decantează, apoi se spală precipitatul prin decantare de 2-3 ori cu
apă rece, după care se trece pe filtrul prin care au fost trecute apele de spălare. Filtrul se spală de
două ori cu apă distilată.
Dacă primele porţiuni de filtrat nu sunt limpezi, se reia filtrarea şi spălarea precipitatului,
apoi se determină azotul din precipitatul spălat şi hârtia de filtru prin metoda Kjeldahl sau micro-
Kjeldahl. Azotul se multiplică cu 6,38 pentru a se obţine cantitatea de cazeină.
În proba de lapte conservat, acidul acetic se adaugă picătură cu picătură sub agitare
continuă, până când lichidul de deasupra precipitatului devine limpede sau aproape limpede.

6.5.2. Dozarea volumetrică a cazeinei (metoda Buruiană)

Cazeina este principala proteină din lapte, reprezentând aproximativ 80 % din totalul
protidelor conţinute. Ca structură, cazeina este o heteroproteină cu caracter acid, gruparea
prostetică fiind reprezentată de radicalul ortofosforic grefat pe aminoacidul serină sau treonină:

HOOCCHCH2 HOOCCHCHCH3
   
H2N OPO3H2 H2N OPO3H2

Fosforilserină Fosforiltreonină

Cazeina se găseşte în lapte sub formă solubilă ca sare de calciu, denumită cazeinat de
calciu. Ca valoare alimentară, este o proteină completă deoarece conţine în structura sa aminoacizi
esenţiali.

117
 Principiul metodei. Cazeina, datorită caracterului său acid, este neutralizată în prezenţa
unei soluţii în exces de hidroxid de sodiu de concentraţie cunoscută. Excesul de hidroxid de
sodiu se titrează cu o soluţie de acid sulfuric de concentraţie cunoscută.
Componentă proteică-Ser-O-PO3H2 + 2NaOH Componentă proteică-Ser-O-PO3Na2
2NaOH + H2SO4 Na2SO4 + 2 H2O
Reactivi. 1. Soluţie de CH3COOH 1 N
2. Soluţie NaOH 1 N
3. Soluţie H2SO4 0,1 N
4. Indicator roşu de metil 0,31 %.
5. Indicator fenolftaleină 0,2 %.
Modul de lucru. Într-un pahar Berzelius se măsoară 10 ml de lapte, la care se adaugă 50
ml apă distilată şi 2-3 picături indicator roşu de metil. Se omogenizează bine şi amestecul se
acidulează prin adăugare, picătură cu picătură, de acid acetic până la obţinerea unei coloraţii
roşie intensă; prin acidulare, cazeina, eliberată din cazeinatul de calciu, precipită sub formă de
flocoane. Se evită un exces de acid acetic, deoarece la o valoare mai mică decât cea a pH-ului
izoelectric al cazeinei aceasta se redizolvă.
Se lasă în repaus cinci minute, după care precipitatul format se filtrează cantitativ,
spălându-se repetat paharul cu porţiuni mici de apă acidulată (10 picături acid acetic la 100 ml
apă distilată). În cazul în care filtratul obţinut este opalescent, se refiltrează, iar precipitatul de pe
hârtia de filtru se aduce cantitativ într-un pahar Berzelius prin spălare cu apă distilată. Apoi,
dintr-o biuretă se măsoară în paharul respectiv 2,5 ml soluţie NaOH 1 N; se omogenizează bine
până la dizolvarea completă a cazeinei, care se transformă în cazeinat de sodiu solubil. Se adaugă
2-3 picături de fenolftaleină şi se titrează excesul de NaOH cu o soluţie de H2SO4 0,1 N.
Se efectuează şi o probă martor constituită din 2,5 ml NaOH 1 N, care se titrează cu
H2SO4 0,1 N.
Calculul rezultatelor. Se aplică relaţia:
g cazeină/100 ml lapte = (VmVp) • F • 0,11 • 10 = (VmVp) • F • 1,1 unde:
Vm = ml H2SO4 0,1 N consumaţi pentru titrarea probei martor;
Vp = ml H2SO4 0,1 N consumaţi pentru titrarea probei de analizat;
F = factorul soluţiei de H2SO4 0,1 N;
0,11 = cantitatea de cazeină care corespunde la 1 ml soluţie de NaOH 1 N;
10 = coeficient pentru exprimarea procentuală a rezultatului.
Interpretarea rezultatelor. Proteinele totale din lapte variază în funcţie de specie. Astfel,
laptele de vacă conţine 3,5 % proteine, cel de oaie 5,8 %, iar cel de capră 4,1 %.
Conţinutul în cazeină totală variază, de asemenea, la diferite specii. De exemplu, laptele
de vacă conţine 2,5-2,8 % cazeină, iar cel de oaie 3,8-4,0 % cazeină. Conţinutul laptelui în
proteine, respectiv în cazeină, prezintă variaţii în funcţie de perioada de lactaţie, de hrană şi de
sezon. În anumite cazuri patologice, se constată o scădere a conţinutului în cazeină.

118
 VII. PIGMENŢI ŞI VITAMINE
7.1. DOZAREA CAROTENILOR DIN PLANTE

Principiul metodei. Materialul vegetal se triturează cu un amestec de sulfat de sodiu

anhidru şi oxid de calciu, care reţin substanţele colorate înafară de caroteni. Pentru a preveni
descompunerea carotenilor în mediu acid, se adaugă la amestec carbonatul de sodiu anhidru.
Carotenii din amestecul triturat se extrag cu acetonă şi eter de petrol sau benzină. În
extractul obţinut se determină colorimetric, direct sau după o prealabilă purificare cromatografică
pe coloană de oxid de aluminiu, conţinutul de caroteni în materialul analizat.

Dozarea colorimetrică directă a carotenilor în soluţie benzinică (eterică)

Reactivi: 1. Acetonă;
2. Sulfat de sodiu anhidru p.a.
3. Oxid de calciu;
4. Carbonat de sodiu anhidru p.a.
5. Eter de petrol (p.f.=35-70C) sau benzină cu p.f.=70-80C;
6. Fosfat dicalcic p.a.
7. Soluţie etalon de azobenzen. Se dizolvă 14,5 mg de azobenzen - recristalizat din alcool
etilic - în 100 ml de etanol 96%. Intensitatea culorii acestei soluţii corespunde cu cea a unei
soluţii conţinând 0,00235 mg caroten într-un ml.
8. Soluţie etalon de dicromat de potasiu. Se dizolvă 72 mg K2Cr2O7 în 100 ml apă
distilată. Extincţia acestei soluţii corespunde unui conţinut de 0,00416 mg caroten în 1 ml.
Modul de lucru.
A) Extracţia produselor vegetale uscate. Într-un flacon conic cu dop rodat se introduce o
cantitate exact cântărită de material vegetal mărunţit cât mai fin posibil. La un conţinut de
caroteni mai mare de 10 mg % se va lua 1g de material; la 5 mg % se vor lua 2 g şi 4 g la un
conţinut mai mic de 5 mg %. Se adaugă 30 ml amestec de acetonă cu hexan (3/7) şi se lasă la
temperatura camerei timp de 15-24 ore, la întuneric. Extractul se filtrează prin decantare într-un
balon cotat de 100 ml, conţinând 9 ml acetonă, se spală reziduul de câteva ori cu volume mici de
hexan şi se completează la semn cu acelaşi solvent.
B) Extracţia materialului vegetal proaspăt. O probă de 0,1-10 g (în funcţie de conţinutul
presupus de caroteni) din materialul vegetal proaspăt, în prealabil mărunţit, se triturează în mojar
cu o cantitate dublă (în greutate) de nisip de cuarţ sau sticlă pisată, până la completa dispariţie a
elementelor structurale vegetale şi obţinerea unui amestec omogen. Întrucât carotenii sunt
instabili la pH acid, în timpul mojarării se adaugă un vârf de spatulă de carbonat de sodiu anhidru
pentru neutralizarea acizilor. De asemenea, se adaugă o cantitate de sulfat de sodiu anhidru
aproximativ egală cu aceea a probei cântărite, cu scopul de a fixa apa din materialul vegetal, şi o
cantitate echivalentă de oxid de calciu pentru reţinerea clorofilei şi xantofilei. Amestecul se
mojarează până se transformă într-o pulbere fină de culoare galben-verzuie. În mojar se
pipetează 5-20 ml de acetonă şi se continuă mojararea încă câteva minute. Apoi conţinutul

119
mojarului se trece cantitativ într-un pahar Berzelius de 50 ml sau într-o eprubetă, spălând
mojarul de mai multe ori cu cantităţi mici de acetonă. După ce materialul se lasă timp de 15-20
minute în contact cu acetona, se varsă extractul acetonic, prin decantare, într-o pâlnie de
separare. Se repetă extracţia materialului din pahar sau eprubetă, cu cantităţi mici de acetonă de
4-10 ori, până când acetona folosită în acest scop rămâne incoloră.
Extractul acetonic din pâlnia de separare se amestecă cu 10-20 ml de benzină sau eter de
petrol. Acetona din amestec se îndepărtează prin spălare cu apă distilată. În acest scop, se
introduce în pâlnia de separare 10-20 ml apă distilată şi se agită uşor. Se aşteaptă câteva minute
până când are loc separarea distinctă a două straturi de lichide. Stratul inferior apos-acetonic se
elimină din pâlnie cu atenţie. Se repetă spălarea extractului din pâlnie cu apă încă de 2-3 ori. Ca
rezultat, carotenii trec complet în stratul de benzină sau de eter de petrol.
Soluţia benzenică sau eterică de caroteni se usucă de urmele de apă prin amestecare cu 1-
5 g de sulfat de sodiu anhidru, urmată de filtrare. La filtratul obţinut se adaugă 0,5-1g de fosfat
dicalcic pentru izolarea clorofilei şi xantofilei. Soluţia de caroteni se filtrează şi se completează
la volum cunoscut cu benzină sau eter de petrol.
C) Dozarea colorimetrică directă a carotenilor în soluţia benzinică (eterică). Măsurarea
intensităţii culorii soluţiei benzinice (eterice) de caroteni, obţinută în modul descris, se poate
efectua la fotocolorimetru sau spectrofotometru, folosind lungimea de undă de 450 nm (filtru
albastru), iar pentru compensaţie benzina sau eterul de petrol.
Calculul rezultatelor. Pentru calcularea conţinutului de caroteni în probe se măsoară, în
aceleaşi condiţii, extincţia soluţiei etalon de azobenzen sau K2Cr2O7. Cantitatea carotenilor în
materialul vegetal cercetat se calculează după formula:

E1• a • v •100
mg caroten % = unde:
E2 • p

E1 = extincţia probei de cercetat;

E2 = extincţia soluţiei etalon;
a = numărul mg de caroten într-un ml soluţie etalon (0,00416 mg dacă s-a lucrat cu
soluţia de K2Cr2O7 şi 0,00235 în cazul soluţiei de azobenzen);
v = volumul soluţiei de caroten (ml);
p = greutatea materialului luat pentru analiză (g).

120
 7.2. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE PIGMENŢI CAROTENOIDICI
DIN FĂINĂ (Standard AOAC 13050)

Principiul metodei. Extracţia pigmenţilor carotenoizi la temperatura camerei cu apă saturată

în alcool n-butilic şi măsurarea densităţii optice a extractului la spectrofotometru.
Aparatură:
- Spectrofotometru;
- Balanţă analitică.
Reactivi:
- Apă saturată cu alcool n-butilic. Se amestecă agitând puternic 6 părţi de alcool n-butilic
cu 1-2 părţi apă distilată şi se foloseşte stratul limpede superior după separare.
Modul de lucru
Într-un flacon Erlenmeyer cu dop rodat de 125 ml se introduc 10 g făină, cântărite cu
precizie de 0,01 g, şi cu o pipetă se adaugă 50 ml apă saturată cu alcool n-butilic. Se agită timp
de 1 minut şi se lasă să stea la întuneric 15 minute. Se agită din nou şi se filtrează prin filtru
cutat. Se colectează filtratul într-un pahar conic de 50 ml. Se determină absorbanţa la
spectrofotometru, la lungimea de undă 435,8 nm, folosind ca fond apă saturată cu alcool n-butilic
şi cuve de 1 cm.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Rezultatele se exprimă în p.p.m. caroteni.
Pentru calcul se foloseşte o curbă etalon construită cu o soluţie standard de β-caroten,
citirea făcându-se pe curbă în funcţie de absorbanţa probei sau utilizând regresia liniară, când
absorbanţa probei de analizat se introduce în ecuaţia de regresie liniară (aleasă pentru r2 cât mai
aproape de 1) şi se calculează conţinutul de β -caroten.
În absenţa curbei etalon, se foloseşte formula:

A
Caroten (p.p.m.) = 5 • = 30,1 • A în care:
b•k

A = absorbanţa
k = absorbanţa (mg/l) pentru caroten la 435,8 nm în apa saturată în n-butanol în cuvă de 1
cm; (k = 0,16632);
b = grosimea stratului de extract de făină în cuva spectrofotometrului; b = 1 cm.

121
 7.3. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VITAMININĂ B1 (TIAMINĂ)
PRIN METODA CU TIOCROM (STANDARD AACC 86-80)

Principiul metodei. Oxidarea tiaminei cu fericianură de potasiu în mediul alcalin cu

formarea de tiocrom, compus cu o puternică fluorescenţă albastră în ultraviolet.
Pentru determinarea cantitativă a tiaminei se compară fluorescenta soluţiei standard de
tiamină pură oxidată şi a soluţiei analizate, la fluorimetru.
Metoda se aplică pentru pâine, grâu orez, porumb, cereale expandate şi alte produse din
cereale.
Aparatură:
- Fluorimetru;
- Baie se apă, pentru temperatura de 100°C;
- Termostat reglat la temperatura 37.. ,40°C;
- Cilindru de sticlă cu dop sau pâlnie de separare de 25 ml;
- Centrifugă.
Reactivi:
- Hidroxid de potasiu, soluţie 15%. Se dizolvă 15 g NaOH în apă, se răceşte şi se aduce la
100 ml;
- Fericianură de potasiu, soluţie 1%. Din această soluţie se prepară zilnic, soluţia alcalină
de fericianură de potasiu, folosind 3 ml soluţie 1% de fericianură de potasiu care se aduce la 100
ml cu soluţie 15% de hidroxid de sodiu;
- Acid sulfuric, soluţie 0,1 N. Se diluează cu apă 2,8 ml H2SO4 concentrat la 1000 ml;
- Preparat enzimatic. Se prepară zilnic sub formă de soluţie sau suspensie de enzimă 2% în
acetat de sodiu 2,5 M. În acest scop poate fi folosit orice preparat enzimatic fungic ce conţine
amilaze şi proteaze (circa 250 U. SKB/ml şi respectiv 500 U, Hemoglobină/ml soluţie). Exemplu
Taka - Diastase, Clarase etc.
- Izobutanol. Dacă este necesar, se distilă produsul comercial în instalaţii de sticlă sau se
agită cu cărbune pentru a elimina impurităţile fluorescente;
- Clorură de potasiu, soluţie 25%. Se dizolvă 25 g KCI în apă şi se aduce la 100 ml;
- Soluţie stoc de tiamină (100 //g/ml). Se usucă clorura de tiamină pe pentaoxid de fosfor
în exsicator cel puţin 24 ore. Se dizolvă 100 mg în. etanol 25% şi se diluează la 1000 ml cu
etanol 25%. Această soluţie este stabilă timp de câteva luni, dacă se păstrează în frigider;
- Soluţie standard de tiamină (0,2 μg/ml). Se diluează 5 ml soluţie stoc de tiamină (la
temperatura camerei) la 100 ml cu apă. Se diluează 4 ml din această soluţie de concentraţie
intermediară la 100 ml cu acid sulfuric 0,1 N. Se prepară zilnic;
- Sulfat de chinină, soluţie. Se dizolvă 100 mg sulfat de chinină în soluţie H2SO4, 0,1 N
şi se aduce la 1000 ml cu soluţie de H2SO4 0,1 N, Se diluează 3 ml din această soluţie la 1000 ml
cu soluţie H2SO4 0,1 N. Se păstrează în sticle brune.

122
 Modul de lucru
1. Pregătirea probei
a) Grâul, orzul şi alte cereale se macină la o moară de laborator astfe încât după măcinare
produsul rezultat să treacă prin sita cu ochiuri având Φ = 20 mesh;
b) Pâinea. Se folosesc felii de pâine de masă cunoscută care se usucă liber, în aer, cu
lumină redusă, până când proba este în echilibru cu umiditatea din mediu. După uscare, proba de
pâine se cântăreşte pentru a se determina umiditatea pierdută prin uscare. Proba uscată se
măcinată la o moară de laborator pentru a trece prin sita cu ochiuri de 20 mech.
2. Extracţia tiaminei
Se cântăreşte o cantitate din proba pregătită ca mai sus, astfel încât să conţină circa 20 μg
tiamină, pentru ca în volumul de extract (5ml) luat în analiză să existe aproximativ 1 μg tiamină.
Proba cântărită se introduce într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 50 ml soluţie de acid
sulfuric 0,1 N şi se încălzeşte pe baia de apă la fierbere timp de 10 min. Se răceşte apoi la 40°C
sau mai puţin, se adaugă 5 ml suspensie de enzimă (preparat enzimatic), se incubează în
termostat la 37...40°C timp de 4 ore. Se răceşte şi se aduce la 100 ml.
Extractul astfel obţinut se agită puternic, se filtrează prin hârtie Whatman nr. 41H,
aruncând primii ml de filtrat. Dacă filtratul este tulbure, înainte de filtrare se centrifughează.
3. Oxidarea şi măsurarea
Din filtratul obţinut se pipetează 5 ml într-o fiolă de centrifugă de 25 ml cu dop. Într-o a
doua fiolă de centrifugă se introduc, de asemenea, 5 ml filtrat (proba martor). În prima fiolă
(proba de analizat) se adaugă 3 ml soluţie alcalină de fericianură de potasiu, iar în cea de a doua
fiolă (martor) se adaugă 3 ml soluţie 15% hidroxid de sodiu. Cele două fiole de centrifugă se
agită uşor circa 30 s şi apoi, în fiecare, se adaugă câte 15 ml izobutanol. Se agită puternic timp de
1 min. Se centrifughează, pentru separarea straturilor, timp de 1 min la 1800 rpm. Se
îndepărtează stratul apos şi se adaugă 1 ml etanol 95% în stratul de izobutanol şi se agită.
Din soluţia de iuzobutanol se trec circa 10 ml într-o cuvă pentru a citi fluorescenţa
tiocromuiui la fluorimetru, urmând modul de operare indicat de producător. Citirile se fac pentru
cele două probe de analiză şi martor, în paralel, se lucrează identic pentru soluţia standard de
tianină.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de tiamină se exprimă în mg pentru 100 g produs sau mg la 100 g substanţă
uscată.
Rx – Rxm V 1 c
Tiamină (mg/100 g) = • • • • 100 în care:
Rs – Rsm V1 x m

Rx = valoarea citită la fluorimetru pentru proba de analizat;

Rxm = valoarea citită la fluorimetru pentru martorul probei de analizat;
Rs = valoarea citită la fluorimetru pentru proba standard de tiamină;
Rsm = valoarea citită la fluorimetru pentru martorul probei standard de tiamină;
V = volumul total de extract (V = 100 ml), ml;

123
V1 = volumul de extract luat pentru determinare (5 ml);
c = concentraţia soluţiei standard de tiamină (de obicei 0,2 μg/ml);
x = ml soluţie de proba folosiţi pentru reacţie/ ml soluţie standard folosiţi pentru reacţie,
(de obicei x = 5/5 =1)
Observaţie. În cazul extractelor intens colorate sau pentru extractele care conţin substanţe
care pot interfera, înainte de a realiza etapa de oxidare şi măsurare (pct. 3) se face o purificare. În
acest scop se folosesc tuburi de adsorbţie cromatografice (tub cu diametrul interior de 5-6 mm,
140 mm lungime, cu un rezervor de 50 mm lungime şi 25 mm diametru. Canalul tubului trebuie
să fie astfel, ca sub încărcare, debitul fluxului să nu fie mai mare de 1 ml/min), iar drept
umplutură schimbători pe bază de silicat (decalso activat sau Bio-Rex 70 de 50... 100 mesh).
Pentru a testa prezenţa substanţelor ce pot interfera se folosesc probe duble cu şi fără
purificare.
Pentru purificare, se introduce o porţiune alicotă din filtratul limpede obţinut, în tubul de
adsorbţie pe schimbătorul pe bază de silicat (care trebuie să se menţină umed prin spălări
prealabile). Se spală rezervorul ş tubul de adsorbţie de trei ori cu câte 5 ml apă fierbinte pentru a
asigura distribuţia completă a tiaminei pe coloană.
Se eluaeză tiamina adsorbită de schimbătorul pe bază de silicat prin umplerea tubului cu
soluţie fierbinte de KCl 25%. Acest volum conţine toată cantitatea de tiamină. Se colectează
eluatul într-un vas de sticlă gradat ce 25 ml, cu dop, pentru a permite măsurarea cu precizie a
volumului de aluat. Pentru umplerea tubului de adsorbţie se folosesc 0,5 g schimbător pe bază de
silicat, ceea ce asigură o coloană de circa 3 cm înălţime. Pentru umplutura de Bio-Rex 70, se
recomandă o coloană cu înălţimea de 10 cm. În acest caz, calculul conţinutului de tiamină se face
cu formula:
Rx – Rxm V E c
Tiamină (mg/100 g) = • • • • 100 în care:
Rs – Rsm V1 x m

E este volumul de eluat colorat, ml;

Rx - valoarea citită la fluorimetru pentru proba de analizat;
Rxm - valoarea citită la fluorimetru pentru martorul probei de analizat;
Rs - valoarea citită la fluorimetru pentru proba standard de tiamină;
Rsm - valoarea citită la fluorimetru pentru martorul probei standard de tiamină;
V - volumul total de extract (100 ml);
V1 - volumul de extract trecut prin tubul cu schimbător pe bază de silicat, ml;
c - concentraţia soluţiei standard de tiamină (de obicei 0,2 μg/ml).

124
 7.4. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. B2 (RIBOFLAVINA)

Principiul metodei . Determinarea vitaminei B2 se bazează pe măsurarea fluorescente

soluţiilor sale în alcool butilic. Metoda se aplică pentru pâine, făină şi cereale.
Aparatură:
- Fluorimetru;
- Termostat. Reactivi
- Acid sulfuric, soluţie 0,1 N;
- Permanganat de potasiu, soluţie 4%;
- Apă oxigenată, soluţie 3%.
- Soluţie de clorură de staniu. Soluţia se prepară prin dizolvarea a 10 g SnCl2 în 25 ml HCI
concentrat. Se pregăteşte înaintea determinării prin diluarea a 0,1 ml soluţie de bază în 50 ml apă;
- Soluţie de hidrosulfit de sodiu. Înaintea întrebuinţării se dizolvă 0,25 g Na2S2O4 • 2H2O în
10 ml NaHCO3 2%;
- Preparat enzimatic. Se prepară zilnic sub formă de soluţie sau sub formă de suspensie de
enzimă 2% în acetat de sodiu 2,5 M. Pentru aceasta se poate folosi orice preparat enzimatic
fungic care conţine amilaze şi proteaze (circa 250 U. SKB/ml şi respectiv 500 U.
Hemoglobină/ml soluţie). Ex. Taka - Diastase, Clarase etc.
- Soluţie de riboflavină: 10 mg riboflavină se dizolvă în 250 ml apă, care conţine câteva
picături de acid acetic şi toluen. Soluţia de riboflavină care să conţină 0,4 γ la 1 ml se obţine prin
diluarea de 100 ori a soluţiei mamă.
Modul de lucru
4. Pregătirea probei
Miezul pâinii se usucă liber, în aer, cu lumină redusă, după care se macină la o moară de
laborator pentru a trece prin sita cu ochiuri de 20 mesh. Cerealele, grâul, orzul şi alte cereale se
macină la aceeaşi granulozitate.
5. Extracţia riboflavinei
O probă de 5... 10 g, cântărită cu precizie de 0,1 mg se introduce într- un balon cotat de 100
ml, se adaugă 50 ml soluţie 0,1 N de acid sulfuric şi se încălzeşte pe baia de apă la fierbere timp
de 10 min. Se răceşte la 40°C, se adaugă 5 ml suspensie de enzimă (preparat enzimatic), se
incubează în termostat la 37...40°C timp de 4 ore. Se răceşte şi se aduce la semn.
Extractul astfel obţinut se agită puternic, se filtrează prin hârtie Whatman nr. 41 H,
aruncând primii ml de filtrat.
6. Dozarea riboflavinei
Două porţiuni a câte 8 ml filtrat se introduc în eprubete gradate de 10 ml. în una din ele,
pentru control, se adaugă 0,1 ml soluţie standard de riboflavină, adică 0,2 μg. Se adaugă în
picături în ambele eprubete o cantitate egală de soluţie 4% de KMnO4 până la apariţia unei
coloraţii slab roz (de obicei 1 ml). După 10 min, pentru îndepărtarea excesului de permanganat,
soluţiilor li se adaugă în picături apă oxigenată 3% (aproximativ 2...5 picături) până la
decolorare. La soluţiile decolorate se adaugă 0,2 ml soluţie SnCl2 şi 0,1 ml soluţie de hidrosulfit

125
de sodiu şi amestecul se agită intens timp de 20 min. Volumul de lichid din eprubetă se aduce cu
apă la 10 ml şi apoi se măsoară fluorescenţa. Drept soluţie de comparaţie se utilizează soluţia
standard de riboflavină.
După fluorometrare în eprubetele cu soluţia de analizat şi cu soluţia standard se adaugă
câte 0,1 g NaHCO3 şi 0,1 g Na2S2O4 • 2H2O (hidrosulfit de sodiu) pentru înlăturarea fluorescenţei
riboflavinei şi din nou se măsoară fluorescenţa amestecului.
Calcul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul de riboflavină se exprimă în jug la 1 g probă de analizat şi se determină cu
formula:
(A–B) • 0,4 • V2 • V
Riboflavină (μg/g) = în care:
(A1–B1) • V1 • m

A = fluorescenta soluţiei analizate;

B = fluorescenţa soluţiei analizate după îndepărtarea fluorescenţe riboflavinei;
A1 = fluorescenţa soluţiei standard de riboflavină;
B1 = fluorescenţa soluţiei standard după înlăturarea fluorescenţei (~ 0)
0,4 = cantitatea în riboflavină conţinută în 1 ml de soluţie standard;
V1 = volumul de extract luat pentru analiză (8 ml);
V = volumul total al extractului (100 ml);
V2 = volumul de extract înainte de măsurarea fluorescenţei (10 ml);
m = masa probei luată în analiză ( 5...10 g).
Determinarea de control (cu 0,5 ml soluţie de riboflavină) dă posibilitatea să se stabilească
pierderile de riboflavină în timpul analizei; dacă acestea sunt mari atunci analiza se reia utilizând
o cantitate mai mică de permanganat.

126
 7.5. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. PP

Principiul metodei. Metoda se bazează pe reacţia de culoare a acidului nicotinic cu rodan-

bromură în prezenţa amidelor aromatice.
Aparatură:
- Spectofotometru.
Reactivi:
- HCI, soluţie 1 N;
- NaOH, soluţie 1 N şi 40%;
- Alcool etilic, 96%;
- Azotat de plumb;
- Tampon fosfat pH 5,1 în amestec cu alcool etilic(1:1);
- Reactiv rodan-bromură. într-un balon se introduc 10 ml soluţie 0,1 N de KCNS sau
NH4CNS, se adaugă 1 g KBr cristale şi 1 ml soluţie HCl 17%. La amestecul obţinut se adaugă 2
ml brom;
- Soluţie alcoolică de anilină. Anilină se amestecă cu alcoolul etilic în raport 1:6. Soluţia se
păstrează în sticlă de culoare închisă;
- Soluţia etalon: se pregăteşte o soluţie de acid nicotinic care să conţină 10 mg la 1 ml de
solvent (alcool/apă 1:1);
- Kieselgur;
- K3PO4 cristalizat.
Modul de lucru
O probă de produs uscat, fin mărunţit, care să conţină 100...150 mg acid nicotinic se trece
cu 100 ml HCIl soluţie 1 N într-un balon şi se hidrolizează pe baia de apă timp de o oră. După
răcire se adaugă NaOH 40% până la pH 6,5. Amestecului neutralizat i se adaugă 100 ml alcool
etilic şi precipitatul format se separă prin filtrare. În filtrat se introduc 2 g adsorbant (kieselgur) şi
după o agitare intensă suspensia se filtrează printr-pâlnie Buhner (la vid). Filtrul cu precipitat se
spală cu 20 ml soluţie NaOH 1 N, pentru extragerea acidului nicotinic.
Eluatul se trece într-o fiolă de centrifugă care conţine 1 g azotat de plumb şi se
neutralizează în prezenţa fenolftaleinei prin adăugare de K3PO4 cristalizat până la apariţia unei
coloraţii slab-roz; apoi se aduce la pH 6 cu HCI 1 N şi se centrifughează până la limpezirea
deplină a lichidului supernatant. Supernatantul se trece într-un balon cotat de 25 ml şi se aduce la
semn cu apă distilată. Se iau 5 ml de extract, se introduc într-o eprubetă gradată de 10 ml, se
încălzesc până la 70°C, se adaugă 1 ml soluţie proaspătă de rodan-bromură şi 2 ml soluţie
alcoolică de anilină, se amestecă; se aduce lichidul la semn cu soluţie alcoolică de anilină, se lasă
1-1,5 ore, se filtrează şi filtratul galben se colorimetrează la spectrofotmetru, la 440 nm.
Se stabileşte o curbă etalon folosind soluţia standard de vitamină PP diluată (preparată din
soluţia mamă), în diferite cantităţi aduse la un volum de 5 ml şi se adaugă reactivii indicaţi mai
sus pentru soluţia de analizat. În funcţie de extincţia probei, se citeşte din curba etalon cantitatea
de vitamină corespunzătoare.

127
 7.6. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE VIT. E (TOCOFEROLI) PRIN
METODA SPECTROFOTOMETICĂ

Principiul metodei. Tocoferolii se oxidează în prezenţa clorurii ferice pe care o reduc la

clorura feroasă. Clorura feroasă se determină după adăugarea de α,α'-dipiridil, care formează cu
fierul bivalent un complex colorat.
Aparatură:
- Spectrofotometriu;
- Coloană cromatografică.
Reactivi:
- Benzen;
- Na2SO4 anhidru;
- CuSO4 anhidru;
- Diatomită;
- Soluţie benzenică de reactiv pregătită din 1 ml soluţie de FeCl3 0,2%, 1 ml soluţie 0,5%
de α,α'-dipiridil în alcool etilic absolut şi 8 ml benzen pentru o probă.
Modul de lucru
O probă de 0,1...0,5 g miez uscat liber şi măcinat sau făină, se trece cantitativ cu benzen
într-o coloană de adsorbţie. Grosimea stratului de diatomită în coloana cromatografică trebuie să
fie de 3...5 cm. Deasupra adsorbantului se pune un strat de 0,5 cm de Na2SO4 sau CuSO4
anhidru.
Tocoferolii se eluează cu benzen (20...50 ml) printr-un vid uşor. Eluatul se trece cantitativ
într-un balon cotat la 100 ml, din care benzenul se îndepărtează până la sec pe baia de apă în
vacuum realizat cu trompă de vid în apă. După aceasta, reziduul se preia cu 10 ml soluţie
benzenică de reactiv şi benzen, se astupă eprubeta şi se lasă la loc întunecos.
Intensitatea coloraţiei se măsoară după 15 min. la spectofotometru cu filtru verde (absorbţia
maximă A = 490 nm). În condiţii asemănătoare se stabileşte o curbă etalon folosind o soluţie de
α,α'-tocoferol sintetic.
Curba etalon se construieşte după rezultatul colorimetrării unor soluţi din a,a'-tocoferolul
sintetic.

128
 7.7. DOZAREA ACIDULUI ASCORBIC DIN MATERIAL VEGETAL
PRIN TITRARE CU 2,6 – DICLORFENOLINDOFENOL (DCFIF)

Principiul metodei. Acidul ascorbic are proprietatea de a reduce 2,6-diclorfenol-

indofenolul (reactiv Tillmans) în leucoderivatul corespunzător:

O OH
Cl Cl Cl Cl
C O C O
HO C O O C O
HO C + N O C + NH
H C H C
HO C H HO C H
C H OH C H2OH
2
OH OH

Acidul ascorbic 2,6-DCFIF Acidul dehidroascorbic Leucoderivat 2,6-DCFIF

Reactivi: 1. Soluţie de acid oxalic 0,01 N;

2. Soluţie de acid sulfuric 50 %;
3.Soluţie de permanganat de potasiu 0,01 N. Se stabileşte factorul soluţiei de
permanganat cu ajutorul soluţiei de acid oxalic. La 10 ml soluţie de acid oxalic exact 0,01 N se
adaugă 1,5 ml soluţie de acid sulfuric 50 % şi se încălzeşte la 75-80C. Se titrează cu soluţie de
KMnO4 0,01 N până se obţine o culoare slab roz. Factorul soluţiei de KMnO4 (Fp) va fi :

nso • Fso nso unde: nso = ml soluţie de acid oxalic;

Fp = = Fso = factorul soluţiei de acid oxalic;
np np np = ml soluţie de KMnO4.

4. Soluţie de sulfat feroamoniacal Fe (NH4)2 (SO4)2 . 6 H2O (sare Mohr) 0,01 N. Se

dizolvă 3,92 g sare Mohr la 1000 ml soluţie de HCl 0,005 N. Factorul soluţiei de sare Mohr se
stabileşte cu soluţia de KMnO4 0,01 N. Se amestecă 10 ml soluţie de sare Mohr cu 1,5 ml soluţie
de H2SO4 50 %. Se titrează cu soluţie de KMnO4 0,01 N până la apariţia culorii slab roz. Se
calculează factorul soluţiei de sare Mohr (FSM) după formula:

Fp • np unde: nSM = ml soluţie de sare Mohr

FSM =
nSM

5. Soluţie saturată de oxalat de amoniu;

129
 6. Soluţie de 2,6 – diclorfenolindofenol 0,001 N. Se dizolvă 0,05 g diclorfenolindofenol
în 100-150 ml apă distilată fierbinte într-un balon cotat de 250 ml. Se completează volumul la
semn cu apă distilată fiartă şi se filtrează. Se păstrează în sticlă de culoare închisă şi la frigider.
Factorul soluţiei de diclorfenolindofenol se determină înainte de fiecare experienţă, folosind în
acest scop soluţia de sare Mohr 0,01 N. Într-un pahar Berzelius se măsoară 10 ml soluţie de
diclorfenolindofenol şi 5 ml soluţie saturată de oxalat de amoniu. Amestecul din pahar se titrează
(folosind o microbiuretă) cu soluţia de sare Mohr cu normalitatea cunoscută, până la virarea
culorii albastre a diclorfenolindofenolului (DCFIF) în galben-oranj. Factorul soluţiei de DCFIF
(Fcol) se calculează astfel:

nSM • FSM unde: ncol = ml soluţie de DCFIF

Fcol =
ncol

7. Soluţie de acid clorhidric 1 %;

8. Soluţie de acid oxalic 1 %.
Modul de lucru. Materialul vegetal (fructe, frunze, tuberculi) se fărâmiţează, în prealabil,
cu ajutorul unui cuţit din oţel inoxidabil sau oţel cromat, pe o farfurie de plexiglas (urmele de fier
şi mai ales de cupru catalizează descompunerea acidului ascorbic). Procesul de divizare se
realizează cât mai repede posibil. O cantitate de 5-20 g material de cercetat (în dependenţă de
conţinutul acidului ascorbic) se introduce într-un mojar şi se adaugă 5-20 ml soluţie de HCl 1 %
(acidul clorhidric împiedică oxidarea acidului ascorbic sub acţiunea ascorbatoxidazei prezente în
ţesuturile vegetale) şi 5-10 g nisip de cuarţ sau sticlă pisată. Se mojarează până la obţinerea unei
mase omogene. Amestecul uniform din mojar se trece cantitativ într-un balon cotat sau un
cilindru gradat de 100 ml. Mojarul şi pistilul se spală de trei ori cu câte 20 ml soluţie de acid
oxalic 1 %, soluţiile de spălare adunându-se în balon sau cilindru. Se completează volumul
extractului la 100 ml cu soluţie de acid oxalic (şi se agită). Conţinutul balonului sau cilindrului se
filtrează pe filtru uscat într-un pahar uscat. Acidul oxalic ameliorează stabilitatea acidului
ascorbic în extract.
Din filtratul obţinut se măsoară în două flacoane conice câte 10-20 ml şi se titrează
fiecare probă cu soluţie de 2,6-diclorfenolindofenol 0,001 N din microbiuretă, până la apariţia
unei culori slab-roz care persistă 30-60 secunde.
Calculul rezultatelor. Se află media valorilor obţinute la titrarea celor două probe. Conţinutul
de acid ascorbic, exprimat în mg la 100 g de ţesut vegetal, se calculează după formula:

n • F • 0,088 • 100 • 100

mg acid ascorbic % = unde:
m• v

n = volumul (ml) soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol consumat la titrare;

F = factorul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol;
0,088 = mg de acid ascorbic corespunzătoare la 1 ml soluţie de 2,6- DCFIF 0,001 N;

130
 m = greutatea materialului analizat în g;
v = volumul (ml) de filtrat luat pentru titrare.
Observaţii. Pentru determinarea acidului ascorbic din lichide biologice, se măsoară 10 ml
lichid, apoi se adaugă 50 ml acid clorhidric 1% şi se completează la 100 ml cu acid oxalic 1%.
Se filtrează pe filtru uscat, iar din filtratul obţinut se măsoară în două flacoane conice câte 10 ml
şi se titrează fiecare probă cu soluţie de 2,6-DCFIF 0,001 N din microbiuretă, până la apariţia
unei coloraţii slab-roz care persistă 30-60 secunde. Pentru calculul rezultatelor se aplică formula
de mai jos, făcându-se media valorilor obţinute la titrarea celor două probe:

mg acid ascorbic % = n • F • 0,088 • d • 100 / v = n • F • 8,8 unde:

n = volumul (ml) soluţiei de 2,6-DCFIF consumat la titrare;

F = factorul soluţiei de 2,6-DCFIF;
0,088 = mg de acid ascorbic corespunzătoare la 1 ml soluţie de 2,6-DCFIF exact 0,001 N;
d = cifra diluţiei;
v = volumul (ml) de filtrat luat pentru titrare.

7.8. DETERMINAREA ACIDULUI ASCORBIC DIN PRODUSE

ALIMENTARE PRIN TITRARE CU 2,6 – DICLORFENOLINDOFENOL
(DCFIF)

Principiul metodei. Acidul ascorbic are proprietatea de a reduce 2,6-diclorfenol-

indofenolul (reactiv Tillmans) în leucoderivatul corespunzător:

Reactivi:
- 2,6-Diclorfenolindofenol, soluţie 0,01 N, preparată astfel: 0,2 g 2,6- diclorfenolindofenol
se dizolvă în 130...140 ml apă distilată (într-un pahar Berzelius) încălzindu-se uşor; soluţia
obţinută se filtrează prin filtru cutat, într-un balon cotat de 1000 ml. După filtrare, filtrul se spală

131
de câteva ori cu apă distilată care se lasă să cadă tot în balon. Se adaugă apoi 150 ml soluţie
0,067 N fosfat monopotasic şi 300 ml soluţie 0,067 N fosfat disodic, după care balonul se aduce
la semn cu apă distilată;
- Acid clorhidric, soluţie 2%;
- Soluţie standard de acid ascorbic preparată astfel: 100 mg acid ascorbic chimic pur se
dizolvă în acid clorhidric 2%, se trece într-un balon cotat de 500 ml şi se aduce la semn cu acid
clorhidric 2%;
- Soluţie tampon de fosfaţi formată din: soluţie de fosfat monopotasic ( KH2PO4) 0,067 N
(9,0789 g în 1000 ml) şi soluţie de fosfat disodic ( Na2HPO4 • 2H2O) 0,067 N (11,786 g în 1000
ml).
Modul de lucru
Se cântăreşte o cantitate de 5... 10 g din produsul de analizat, se introduce imediat într-un
mojar care conţine 20 ml acid clorhidric 2% (pentru a evita oxidarea). Se mojarează bine, după
care conţinutul mojarului se trece cantitativ într-un cilindru gradat de 100 ml şi se aduce la semn
cu apă distilată. Proba obţinută se omogenizează bine, se lasă în repaus 10 minute, apoi se
filtrează prin filtru cutat, într-un balon conic curat şi uscat. Din filtratul obţinut se iau 10 ml şi se
titrează cu soluţia de 2,6-diclorfenolindofenol până la coloraţia roz care trebuie să persiste cel
puţin 30 secunde.
În paralel cu proba de analizat, se determină titrul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol în
raport cu acidul ascorbic (T) astfel: într-un vas conic se ia 1 ml din soluţia standard de acid
ascorbic proaspăt preparată, se adaugă 10 ml soluţie de acid clorhidric 2% şi se titrează cu 2,6-
diclorfenolindofenol până la coloraţia roz persistentă cel puţin 30 secunde. Volumul obţinut la
titrare se notează cu A. Atunci:
T (2,6-diclorfenolidofenol/acid ascorbic) = 0,2/A.
Calcul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul în acid ascorbic al produsului se exprimă în mg/100 g produs şi se stabileşte cu
relaţia:
V •T
mg acid ascorbic/100 g = •100 • d în care:
m

V = volumul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol folosit la titrare, ml;

T = titrul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol în raport cu acidul ascorbic, mg/ml;
m = masa de produs analizat, g;
d = diluţia efectuată.

7.9. DETERMINAREA VITAMINEI C PRIN METODA IODOMETRICĂ

Principiul metodei. Vitamina C extrasă cu acid clorhidric 2% se titrează cu iodat de potasiu

în prezenţă de iodură de potasiu şi amidon, până la coloraţia albastră.
Oxigenul rezultat oxidează acidul ascorbic.

132
 Reactivi:
- Iodat de potasiu 0,004 N. Se cântăresc cu precizie 0,14228 g iodat de potasiu, care se trec
cantitativ cu apă distilată într-un balon cotat de 1000 ml; se aduce la semn cu apă distilată şi se
omogenizează bine;
- Acid clorhidric, soluţie 2%;
- Iodură de potasiu, soluţie 1% proaspăt preparată;
- Amidon, soluţie 1%.
Modul de lucru
Din produsul de analizat se cântăresc 5...10 g, se introduc imediat într-un mojar care
conţine 20 ml acid clorhidric 2% ( pentru a evita oxidarea) şi se mojarează fin. Proba se trece
cantitativ într-un cilindru gradat şi se aduce la volumul de 100 ml cu apă distilată. Se
omogenizează bine şi se lasă 10 minute pentru extracţie, având grijă să se mai omogenizeze de
câteva ori. Se filtrează prin filtru cutat într-un balon curat şi uscat. Din filtrat se iau 10 ml într-un
vas conic, se adaugă 30 ml apă distilată, 5 ml iodură de potasiu 1% şi 0,5...1 ml amidon 1%.
După omogenizare, se titrează cu iodat de potasiu 0,004 N, până la o coloraţie slab -albastră care
să persiste cel puţin 30 secunde.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Conţinutul în acid ascorbic al produsului se exprimă în mg/100 g şi se stabileşte cu relaţia:

100 • V • T • d
mg acid ascorbic/100 g = în care:
m

V = volumul soluţiei de iodat 0,004 N folosit la titrare, ml;

T = titrul soluţiei de iodat 0,004 N în raport cu acidul ascorbic, care se calculează astfel:
Mac. ascorbic =176 g, iar Eac. ascorbic= 88 g (176/2), deci TKIO3/ac ascorbic=0,004 • 88/1000= 0,352 mg/ml
d = diluţia efectuată;
m = masa de produs analizat, g.

133
 VIII. ENZIME
8.1. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASCORBATOXIDAZEI PRIN
METODA OSTROVSKAIA

Ascorbatoxidaza (L-ascorbat: O2 – oxidoreductaza, E.C. 1.10.3.3.) catalizează oxidarea

directă a acidului ascorbic în acid dehidro-ascorbic:

CO CO CO

OC O HOC O OC O
HOCH HOC OC
HC HC ½O2 H2O HC
HOCH HOCH HOCH
CH2OH CH2OH CH2OH

(formă cetonică) (formă enolică)

Acid ascorbic Acid dehidroascorbic

Funcţionând ca transportator de hidrogen, acidul ascorbic este strâns corelat cu toate

sistemele enzimatice participante în metabolismul respirator al celulei vegetale.
Ascorbatoxidaza este o metalenzimă care conţine 0,24 % cupru în moleculă, răspândită în
diferite specii vegetale, cu o activitate foarte ridicată mai ales în varză, castraveţi şi dovleac.
Principiul metodei. Metoda se bazează pe titrarea restului de acid ascorbic rămas
neoxidat în mediul de reacţie.
Reactivi. 1. Soluţie tampon acid citric-fosfat disodic cu pH 6. Se amestecă 73,70 ml
soluţie de acid citric 0,1 M cu 126,30 ml soluţie de Na2HPO4 • 12 H2O, 0,2 M.
2. Soluţie de acid ascorbic 100 mg%.
3. Soluţie de acid metafosforic 5 %.
4. Soluţie de iodat de potasiu (KIO3) 0,001 N.
5. Iodură de potasiu.
6. Soluţie de amidon 1%.
Modul de lucru. O cantitate de 1-2 g de material vegetal (în funcţie de activitatea
enzimei) se mojarează cu soluţie tampon acid citric-fosfat disodic (pH 6). După obţinerea unei
mase omogene, se aduce la un volum de 25 sau 50 ml cu soluţie tampon şi se agită.
Într-un flacon conic de 50 ml se introduc 2 ml de omogenat centrifugat sau filtrat,
conţinând ascorbatoxidaza şi se adaugă 2 ml soluţie de acid ascorbic. Flaconul se ţine la
temperatura de 25 sau 30C timp de 60 de minute. La sfârşitul intervalului se inhibă
ascorbatoxidaza cu 2 ml soluţie de acid metafosforic 5%.
În paralel, se pregăteşte o probă de control, care conţine, în ordine, aceleaşi cantităţi de
enzimă, acid metafosforic şi acid ascorbic, fără perioadă de incubaţie.

134
 Conţinutul flacoanelor se titrează cu soluţie de iodat de potasiu 0,001 N. Titrarea se
efectuează în prezenţa unui cristal (5-10 mg) de KI şi a câtorva picături de amidon. Apariţia unei
coloraţii albastre este momentul care pune capăt operaţiei de titrare.
Calculul rezultatelor. Activitatea ascorbatoxidazei se exprimă în mg de acid ascorbic
oxidat la 1 g ţesut umed:

(n1n2) • F . v1 • 0,088
X = unde:
v2 • p

n1 = volumul (ml) soluţiei de iodat consumat la titrarea probei de control;

n2 = volumul (ml) soluţiei de iodat consumat la titrarea probei de lucru;
F = factorul soluţiei de iodat de potasiu;
0,088 = mg de acid ascorbic corespunzătoare la 1 ml soluţie de iodat de potasiu 0,001 N;
v1 = volumul total al omogenatului (ml);
v2 = volumul de omogenat sau filtrat luat pentru titrare (2 ml);
p = masa ţesutului cântărit (g).

135
 8.2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII PEROXIDAZEI
(STANDARD ICC 301/1998)

Metoda se aplică pentru cereale şi făinurile obţinute din acestea.

Principiul metodei. Metoda se bazează pe proprietatea peroxidazei de a oxida, în prezenţa
apei oxigenate, compuşi aromatici. Se foloseşte în calitate de cosubstrat o soluţie de 1,2-fenilen
diamina.
Aparatură:
- Moară de laborator, cu sită de 0,5 mm;
- pH-metru, calibrat cu soluţie tampon pH 4,0 şi pH 7,0;
- Balanţă, cu precizie de 0,0001 g;
- Agitator magnetic;
- Spectrofotometru (A = 440 nm) cu cuvă termostatată prin recircularea apei şi înregistrator
(UV-VIS).
Reactivi:
- Soluţie tampon acetat de sodiu pH 5,0, 0,05 M. Se dizolvă 14,7 g CaCI2 • 2H2O în
aproximativ 500 ml apă deionizată şi se adaugă 2,95 ml acid acetic 96%, se ajustează pH-ul la
5,0 cu soluţie de hidroxid de sodiu 2 mol/l şi se aduce la 1000 ml cu apă deionizată.
Pentru alte cereale se folosesc concentraţiile din tabelul 2.14.
Tabelul 8.2
Concentraţia soluţiilor şi temperatura de lucru pentru diferite cereale
Cereala Soluţie tampon Temperatura Soluţie apă oxigenată
molaritate [mol/l] [°C] [%]
Grâu 0,05 25 0,48
Secară 0,50 25 0,12
Triticale 0,50 30 1,20
Orz 0,50 30 1,20
Ovăz 0,10 30 0,60
Porumb 0,50 25 1,20
Orez 0,10 25 0,48

- Apă oxigenată, soluţie 0,48%. Se diluează 1,6 ml apă oxigenată 30% la 100 ml cu apă
deionizată;
- 1,2-fenilen diamina, soluţie 0,8% (w/v). Se dizolvă 40 mg în 5 ml metanol. Se prepară
zilnic.
- Filtru din fibră de sticlă (ex. Schleicher & Schull nr. 6, 90 mm).
Modul de lucru
1. Prepararea extractului enzimatic
Se macină grâul/cerealele, se cerne prin sita de 0,5 mm. Se cântăresc 2 g grâu măcinat sau
făină într-un pahar de laborator. Se adaugă 20 ml soluţie tampon acetat de sodiu 0,05 mol/l (sau

136
altă molaritate corespunzătoare cerealei studiate), se agită timp de 30 min la un agitator magnetic
şi se filtrează printr-un filtru de fibră de sticlă. Dacă este necesar se diluează cu soluţie tampon.
2. Determinare
Se pipetează 2,5 ml soluţie tampon acetat de sodiu 0,05 mol/l (pentru alte cereale a se
vedea tabelul 8.2.) într-o cuvă şi se adaugă 0,1 ml soluţie apă oxigenată 0,48% (pentru altă
cereală a se vedea tabelul 2.14.) şi 0,1 ml soluţie 0,8% fenilen diamina. Se amestecă şi se
menţine cel puţin 5 min. la temperatura de 25°C (pentru altă cereală a se vedea tabelul 2.14.) în
cuva termostatată a spectrofotometrului. Reacţia se porneşte prin adăugarea a 0,01 ml extract
enzimatic şi se urmăreşte modificarea absorbanţei la 440 nm timp de 2-5 min cu înregistratorul.
Cantitatea de extract poate fi variată în funcţie de activitatea enzimatică. Creşterea absorbanţei
este lineară în timp.
În paralel se face o probă martor, în aceleaşi condiţii, înlocuind extractul enzimatic cu
soluţie tampon.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Activitatea peroxidazei se exprimă în creşterea absorbanţei pe minut şi mg substanţă uscată
a produsului (ΔA/min • mg). La înregistrarea lineară a timpului, ΔA/min este calculată grafic.
Pentru calcul se foloseşte relaţia:

ΔAp ΔAm Vext • d 100

Activitate peroxidază (ΔA/min •mg) = [ – ] • • în care:
t t Vexp • m 100 – u

AAp = modificarea absorbanţei probei;

AAm = modificarea absorbanţei martorului;
t = timpul de reacţie, min (2-5 min);
Vext = volumul de extract enzimatic obţinut (20 ml);
Vexp = volumul de extract luat în analiză (0,01 ml);
d = diluţia (se ia în calcul la diluarea extractului enzimatic);
m = masa produsului luată în analiză (2000 mg);
u = umiditatea probei, %.

137
 8.3. DETERMINAREA ACTIVITĂTII CATALAZEI PRIN METODA
TITRIMETRICĂ

Catalaza este o enzimă din clasa oxidoreductazelor, răspândită în majoritatea

mcroorganismelor aerobe, în celulele animalelor şi plantelor superioare. Este o cromoproteidă
heminică şi conţine patru subunităţi heminice într-o moleculă. Hemul din catalază conţine Fe3+.
Reacţia catalizată este următoarea:
H2O2 H2O + ½ O2
Este una din cele mai active enzime, un mol de catalază transformând 5-106 moli de H2O2 la
0°C timp de 1 minut.
Domeniul de temperatură la care acţionează optim este cuprins între 0...10°C.
Conţinutul în catalază al făinurilor este influenţat de extracţia făinii şi de soiul grâului. Cele
mai bogate sunt făinurile de extracţie mari şi cele provenite din grâu de primăvară.
Principiul metodei . Extractul enzimatic obţinut din făină este pus să acţioneze asupra
unei cantităţi de apă oxigenată, la temperatura camerei un anumit timp. Apoi, în mediu acid, se
titrează apa oxigenată, rămasă netransformată, cu permanganat de potasiu.
Reacţia care are loc este următoarea:
5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 5O2 + K2SO4 + 8H2O + 2MnSO4
Aparatura:
- Ultraomogenizator;
- Centrifugă, 3000 rpm;
- Balanţă, precizie 0,1 g.
Reactivi:
- Apă oxigenată, soluţie 1%;
- Acid sulfuric, soluţie 10%;
- Permanganat de potasiu, soluţie 0,1 N;
- Toluen.
Modul de lucru
1. Prepararea extractului enzimatic
O cantitate de 5 g făină sau 7,5 g aluat liofilizat şi mărunţit se omogenizează cu 100 ml
soluţie 100 mM tampon fosfat, pH 7,5, într-un vas introdus într-o baie de gheaţă folosind un
ultraomogenizator. Omogenizarea durează 15 s urmată de un repaus de 30 s şi o nouă
omogenizare de 15 s. Apoi omogenizatul este agitat uşor timp de 15 minute la 4°C şi centrifugat
la 3000 rpm timp de 20 minute la 4°C. Supernatantul este păstrat 3 ore la 4°C înainte de
determinarea activităţii. El reprezintă extractul enzimatic. Se poate păstra la 4°C timp de 2 zile
fără scăderea activităţii.
2. Determinarea activităţii catalazei
Din extractul enzimatic se iau în două baloane Erlenmeyer curate şi uscate câte 20 ml. O
probă se tratează termic (se fierbe) pentru inactivarea enzimei (proba martor). În ambele probe se
adaugă 20 ml apă distilată, 3 ml apă oxigenată 1% şi se lasă la temperatura camerei timp de 30
minute. Se adaugă apoi în cele două probe câte 5 ml acid sulfuric 10% şi se titrează cu

138
302 permanganat de potasiu 0,1 N cantitatea totală de apă oxigenată luată în analiză în cazul
probei martor şi apa oxigenată rămasă nedescompusă în cazul probei cu enzimă activă.
Titrarea ambelor probe se face până la culoarea roz care persistă 30 de secunde.
Calculul şi exprimarea rezultatelor
Diferenţa dintre volumul soluţiei de permanganat de potasiu 0,1N folosit la titrarea probei
martor şi a probei în care enzima a activat, corespunde apei oxigenate descompusă de catalaza
din proba de analizat. Activitatea catalazei se poate exprima în:
1. Mililitri soluţie de permanganat de potasiu 0,1 N care corespund apei oxigenate
descompusă de catalază dintr-un gram de produs după relaţia:
(Vm – V)
Activitate catalază (ml KMnO4 0,1 N/g) = • d
M

2. Miligrame de apă oxigenată descompusă de catalaza dintr-un gram de produs:

Activitate catalază (mg H2O2 /g) = 1,7 • (Vm – V) • d / m
Se calculează titrul permanganatului de potasiu în raport cu apa oxigenată:
T K m n O 4 /H2O2 = 0,1 • 17/ 1000 = 0,0017 g/l = 1,7 mg/l
3. Micromoli de apă oxigenată descompusă de catalaza dintr-un gram de produs într-un
minut: 1 micromol H2O2 = 34-10-6 g
Activitate catalază (μmol H2O2/g, min) = 0,0017 (Vm–V) / 34 • 10-6 • 30
în care:
Vm = volumul soluţiei de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea cantităţii totale de
apă oxigenată (proba martor), ml;
V = volumul soluţiei de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea excesului de apă
oxigenată (proba cu enzimă activă), ml;
m = cantitatea de produs luată în analiză, g;
30 = timpul cât a acţionat enzima, min.

139
 8.4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII - ŞI -AMILAZEI DIN ŢESUTURI
VEGETALE

Evidenţiate în ţesuturi vegetale, hidrolazele, reprezentate de - şi -amilază, îşi

intensifică puternic activitatea în timpul germinaţiei seminţelor bogate în amidon. În cazul
gramineelor, creşterea activităţii -amilazei s-ar datora sintezei de novo a acestei enzime, în timp
ce pentru -amilază este specifică activarea zimogenului ei sub influenţa stimulatorilor naturali
de creştere (fitohormoni) reprezentaţi de gibereline şi auxine

8.4.1. Metoda Noelting-Bernfeld

Principiul metodei. Atât - cât şi -amilaza hidrolizează amidonul cu formare de maltoză

liberă. Aceasta reduce acidul 3,5-dinitrosalicilic la acid 3-amino-5-nitrosalicilic de culoare oranj,
care este determinat colorimetric la 540 nm. În paralel cu proba de analizat, se efectuează un
martor cu extract enzimatic.
Reactivi. 1. Soluţie tampon acid citric-citrat trisodic 0,1 M cu pH 5,6. Pentru prepararea
soluţiei, într-un balon cotat de 500 ml se dizolvă 2,8789 g acid citric (C6H8O7*H2O) în cca. 100
ml apă distilată şi apoi se introduc 12,9649 g citrt trisodic, folosind 200-300 ml apă distilată.
Înainte de completarea la semn se verifică pH-ul soluţiei şi dacă este cazul se corectează cu
soluţie de NaOH 1 N sau cu soluţie de acid citric.
2. Soluţie de amidon 2 %. Se prepară prin amestecarea a 2 g de amidon cu 20 ml apă
distilată, care se adaugă la 80 ml apă distilată la fierbere şi se continuă încălzirea până la
clarificarea soluţiei.
3. Soluţie de acid 3,5-dinitrosalicilic. Se amestecă 1 g acid 3,5-dinitrosalicilic cu 5-10 ml
apă distilată, peste care se adaugă, lent şi agitându-se continuu, 20 ml soluţie de NaOH 2N. După
dizolvarea completă a reactivului la temperatura camerei, volumul soluţiei se aduce la 50 ml cu
apă distilată şi se adaugă 30 g sare Seignette. Se agită până la dizolvarea tartratului dublu de
sodiu şi potasiu, se completează volumul soluţiei la 100 ml cu apă distilată şi se filtrează. Soluţia
de acid 3,5-dinitrosalicilic se conservă în flacoane brune, ermetic închise pentru reducerea
efectelor CO2 asupra alcalinităţii, ceea ce ar putea vicia rezultatele.
4. Soluţie etalon de maltoză, care se prepară prin dizolvarea, în balon cotat, a 200 mg
maltoză în cca. 50 ml apă distilată, după care se completează la semn.
Modul de lucru.
A) Extragerea -amilazei. O cantitate de material biologic bine omogenizată se extrage
cu apă bidistilată. În cazul seminţelor de cereale, leguminoase etc. 0,100-0,500 g de făină se
extrag cu 5 ml de apă bidistilată, răcită la +4C. Extracţia enzimei se face timp de 30-60 minute
prin agitare cu intermitenţă (după 10 minute de repaus se agită un minut), la temperatura camerei
sau cel mai bine pe o baie de apă cu gheaţă. Reziduul insolubil se va separa prin centrifugare la
300 rot/min. timp de 15 minute. Pentru inactivarea eventualelor molecule de -amilază se va
termostata extractul timp de 15 minute la 70C, după care se va răci imediat într-o baie cu apă
140
rece de la robinet. Se vor inactiva în acest mod doar moleculele de -amilază, rămânând complet
active moleculele de -amilază.
B) Extragerea -amilazei. Materialul biologic fin omogenizat se extrage cu o soluţie de
cisteină M/1000 în soluţie de NaCl 6 % (pH=6), în raport de 1 g la 10 ml, timp de 12 ore, la
temperatura camerei, agitându-se periodic. Extractul enzimatic se va separa prin centrifugare
timp de 15 minute la 3000 rot/min. Deoarece în extract poate fi prezentă şi -amilaza, este
necesară inactivarea acesteia, care se realizează prin aducerea pH-ului extractului enzimatic la
valoare de 3,6 cu ajutorul unei soluţii de acid acetic 1N. Adăugarea acidului acetic se va face sub
continuă agitare, iar pH-ul se va măsura la pH-metru. Amestecul va fi apoi centrifugat 15 minute
la 3000 rot/min. pentru eliminarea -amilazei denaturate ce va sedimenta sub formă de precipitat
la fundul eprubetei. Supernatantul va fi folosit drept sursă de -amilază.
C) Determinarea activităţii  sau -amilazei. Se vor utiliza eprubete curate şi uscate,
lucrându-se conform tabelului de mai jos.

Probă Martor
Tampon citrat 5 5
Amidon 2 % (ml) 2 -
Apă distilată (ml) - 2
Se agită ambele probe
Se termostatează 10 min. la 40C doar proba
Extract enzimatic (ml) 0,5-3 -
Se termostatează 30 min. la 40C doar proba, care se răceşte apoi 5 min. la jet de apă.
Extract enzimatic (ml) - 0,5-3

Martorul se va prelucra astfel să fia gata simultan cu proba, pentru a evita producerea
reacţiei pe baza amidonului şi enzimei existente în extractul enzimatic.
D) Dozarea maltozei. Se vor folosi eprubete gradate de 10 ml, curate şi uscate,
parcurgând etapele redate în continuare, în tabel. De reţinut că alcalinitatea reactivului de culoare
denaturează enzima, întrerupând reacţia enzimatică.

Probă Martor Control

Acid 3,5-dinitrosalicilic (ml) 1 1 1
Incubat (ml) 0,5-2 - -
Martor (ml) - 0,5-2
Apă distilată (ml) - - 0,5-2

Eprubetele se vor menţine la fierbere pe o baie de apă exact 5 minute din momentul
reînceperii fierberii. Se vor răci eprubetele la jet de apă, apoi se completează la 10 ml cu apă
distilată. Se agită energic, după care se citeşte la spectrofotometru la  = 540 nm faţă de control.
141
 Pentru aflarea cantităţii de maltoză, atât în probă cât şi în martor se foloseşte o curbă
etalon cu o soluţie standard de maltoză.
E) Construirea curbei etalon pentru maltoză. Se realizează o serie de probe cu cantităţi
de maltoză variind între 0,2-1,8 mg, care sunt tratate pentru obţinerea reacţiei de culoare conform
tabelului următor:

Eprubeta C 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cantitatea de maltoză (mg) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
Soluţie etalon de maltoză (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Apă distilată (ml) 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1.2 1,1
Soluţie acid 3,5-dinitrosalicilic (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Eprubetele se introduc într-o baie de apă la fierbere şi se menţin exact 5 minute din
momentul reînceperii fierberii. După aceea, eprubetele se răcesc în apă de robinet. (Atenţie la
diferenţele de temperatură !!!). Se completează volumul probelor la 10 ml cu apă distilată. Se
agită conţinutul eprubetelor şi se citesc valorile extincţiilor probelor la spectrofotometru la  =
540 nm faţă de controlul reactivilor. Cu datele obţinute se va trasa curba etalon.
Calculul rezultatelor. Cantitatea de maltoză rezultată prin acţiunea enzimei ( sau -
amilază), respectiv cea existentă în extractul enzimatic, se află din curba etalon. Din cantitatea de
maltoză a probei de cercetat se scade conţinutul de maltoză al extractului enzimatic. Activitatea
enzimei se exprimă în M maltoză formaţi sub acţiunea enzimei dintr-un gram de seminţe.

(AcerAm) . (7 + v) . V
M maltoză / 1g seminţe = în care:
n . v . p . 0,360

Acer = cantitatea de maltoză (mg) corespunzătoare extincţiei probei de cercetat;

Am = cantitatea de maltoză (mg) corespunzătoare martorului;
v = volumul (ml) de extract enzimatic folosit la determinarea activităţii enzimei;
V = volumul total (ml) al extractului enzimatic;
n = volumul (ml) de incubat luat pentru dozarea maltozei;
p = greutatea făinii (g) din care s-a extras enzima;
0,360 = greutatea unui micromol de maltoză exprimată în miligrame.

142
 8.5. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII MALTAZEI (MODIFICATĂ)

Maltaza este o enzimă din clasa hidrolazelor, care catalizează reacţia de hidroliză a
legăturilor -(1,4)-glicozidice din maltoză cu eliberarea a două molecule de glucoză. Se găseşte
în microorgansme (bacterii, drojdii, ciuperci inferioare), în organisme animale (de exemplu în
intestinul subţire) şi în organisme vegetale, în special în boabe germinate de cereale (malţ).
Principiul metodei. Activitatea maltazei se determină prin cantitatea de glucoză care se
formează ca urmare a acţiunii unui extract enzimatic asupra unei soluţii de maltoză cu
concentraţie cunoscută, în condiţii determinate de lucru.
Reactivi. 1. Maltoză 1 % la pH 4,5 ajustat cu tampon acetat
2. Soluţii necesare pentru determinarea glucidelor reducătoare după metoda Schoorl sau
Bertrand.
Obţinerea preparatului enzimatic. Se extrag, timp de 30 minute, 10 g făină de malţ (sau
alt produs cu compoziţie asemănătoare) adus la volumul de 100 ml cu apă distilată. Se filtrează
sau se centrifughează, obţinându-se astfel extractul care conţine maltază.
Modul de lucru. Într-un balon cotat de 50 ml se introduc 10 ml soluţie de maltoză 1 %,
apoi se adaugă 2 ml extract enzimatic şi se completează volumul până la semn cu apă distilată.
Se termostatează balonul cu proba la 37C timp de o oră, după care se iau 10 ml de lichid şi se
dozează zaharurile reducătoare totale.
Calculul rezultatelor. Activitatea maltazei se exprimă prin capacitatea maltazică (CM),
care reprezintă cantitatea de glucoză, în g, formată după o oră la 37C din 100 g maltoză, ca
rezultat al acţiunii unui ml extract enzimatic:

A . 10 . d . 100
CM = în care:
c.t

A = cantitatea de glucoză din 10 ml amestec de reacţie după o oră, în g;

10 = raportul între 0,1 g (cantitatea de maltoză dintr-un ml maltoză 1%) şi 1 g;
d = cifra diluţiei soluţiei de maltoză în balonul cotat;
c = cantitatea de extract enzimatic;
t = timpul de termostatare, în ore

143
 8.6. DETERMINAREA CAPACITĂŢII AMILOLITICE
(DUPĂ KLIMOVSKI ŞI RODZEVICI)

Principiul metodei. Metoda se bazează pe determinarea timpului de dispariţie a culorii pe

care o dă amidonul cu iodul, ca urmare a acţiunii amilazelor. Capacitatea amilolitică (CA) arată
cantitatea de amidon, în grame, transformată în dextrine şi zaharuri reducătoare, care nu mai dau
coloraţie cu iodul, de către 1 ml extract enzimatic după o oră de termostatare la 35C.
Reactivi. 1. Amidon 1%, preparat în soluţie de tampon acetat cu pH=4,9
2. Soluţie Lugol (1 g iod, 2 g iodură de potasiu şi 300 ml apă distilată)
3. Preparat enzimatic: 10 g făină de malţ (sau alt material care conţine amilaze) se aduce la
100 ml cu apă distilată, se agită bine şi se lasă 30 minute pentru extracţie, timp în care se mai agită de
câteva ori. Se filtrează, iar filtratul se foloseşte pentru determinarea activităţii enzimatice.
Observaţie. Se poate lucra fie cu -amilaza fie cu -amilaza din produsul vegetal.
Dacă dorim să extragem doar -amilaza, 0,100-0,500 g de făină se amstecă 5 ml de apă
bidistilată, răcită la +4C. Extracţia enzimei se face timp de 30-60 minute prin agitare cu
intermitenţă (după 10 minute de repaus se agită un minut), la temperatura camerei sau cel mai bine
pe o baie de apă cu gheaţă. Reziduul insolubil se va separa prin centrifugare la 3000 rot/min. timp
de 15 minute. Pentru inactivarea eventualelor molecule de -amilază se va termostata extractul
timp de 15 minute la 70C, după care se va răci imediat într-o baie cu apă rece de la robinet.
Pentru obţinerea -amilazei, materialul biologic fin omogenizat se extrage cu o soluţie de
cisteină M/1000 în soluţie de NaCl 6 % (pH=6), în raport de 1 g la 10 ml, timp de 12 ore, la
temperatura camerei, agitându-se periodic. Extractul enzimatic se va separa prin centrifugare
timp de 15 minute la 3000 rot/min. Pentru inactivarea -amilazei, se aduce pH-ului amestecului
la valoarea de 3,6 cu ajutorul unei soluţii de acid acetic 1N, care se adaugă sub continuă agitare.
Amestecul va fi apoi centrifugat 15 minute la 3000 rot/min. pentru eliminarea -amilazei
denaturate, care va sedimenta la fundul eprubetei, iar supernatantul va fi sursa de -amilază.
Modul de lucru. 20 ml soluţie de amidon 1 %, cu pH 4,9 se introduc într-un balon
Erlenmeyer de 100 ml cu 8 ml apă distilată şi se încălzesc pe o baie de apă la temperatura de
35C; apoi se adaugă 2 ml extract enzimatic şi se notează timpul. Amestecul se menţine la
această temperatură, iar la fiecare minut o picătură din amestec se tratează cu o picătură de
soluţie Lugol. Reacţia de hidroliză enzimatică a amidonului se consideră terminată atunci când
amestecul celor două picături devine incolor. Se notează timpul.
Calculul rezultatelor. Capacitatea amilolitică (CA) se calculează cu relaţia:

0,2 . 60
CA = în care:
a.t
0,2 = cantitatea de amidon, în grame, care se găseşte în 20 ml soluţie de amidon 1 %;
a = cantitatea de extract enzimatic, în ml, folosit la hidroliza amidonului;
t = timpul, în minute;
60 = unităţi pentru o oră.

144
 8.7. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII LIPAZEI

Lipaza (hidrolaza esterilor glicerolului, E.C. 3.1.1.3.) catalizează scindarea hidrolitică a

grăsimilor în glicerol şi acizi graşi liberi, conform următorului mecanism:

CH2 OOCR CH2OH

 
CHOCR 2 + 3 H2 O CHOH + R1COOH + R2COOH + R3COOH
 
CH2OOCR3 CH2OH

Grăsime (Gliceridă) Glicerol Acizi graşi

Lipazele sunt răspândite în organismele animale, plante şi microorganisme. În

organismele animale lipazele se găsesc în sânge, ser sanguin, sucul gastric şi pancreatic, plămâni,
rinichi, ţesuturi grase etc., iar la plante în aproape toate organele şi ţesuturile vegetale, cu o
menţiune specială pentru seminţele oleaginoaselor.
Dintre lipazele de origine animală, cea mai bine studiată este lipaza din pancreasul de
porc, iar dintre cele de origine vegetală lipaza din boabele de ricin.
Activitatea catalitică a lipazelor de diverse provenienţe diferă după pH-ul optim de
acţiune, temperatura optimă şi alte proprietăţi.
Principiul metodei. Activitatea lipazelor se determină după creşterea acidităţii în mediul
de reacţie, în urma eliberării acizilor graşi din grăsimi. Acizii graşi liberi, formaţi prin hidroliza
grăsimii sub acţiunea lipazelor, se titrează direct cu o soluţie de hidroxid alcalin:

R-COOH + KOH R-COOK + H2O

Substratul ideal pentru studiul activităţii lipazei dintr-un anumit produs este grăsimea
obţinută din acel produs, dar ca substrat pentru acţiunea lipazelor se pot utiliza şi alte grăsimi sau
uleiuri naturale de diferite provenienţe.
Reactivi. 1. Soluţie tampon de fosfaţi cu pH 7,4. Pentru prepararea acestui tampon se
amestecă 81,8 ml soluţie M/15 de fosfat disodic cu 18,2 ml soluţie M/15 de fosfat monopotasic
(se dizolvă 1,9534 g Na2HPO4.12 H2O şi 0,1713 g KH2PO4 în 100 ml apă distilată la balon cotat.
2. Ulei rafinat
3. Hidroxid de potasiu sau sodiu, soluţie 0,01 N
4. Fenolftaleină, soluţie alcoolică 1 %
5. Alcool etilic 96 %
6. Eter de petrol
Obţinerea preparatului enzimatic degresat şi uscat. Într-un vas de sticlă prevăzut cu dop se
amestecă o parte seminţe de ricin sau soia fin mărunţite, cu două părţi eter. Se lasă pentru extracţia
uleiului timp de 2-3 ore, agitând periodic. Se separă eterul şi se introduc din nou 5 părţi eter peste
produsul parţial degresat. Se mai extrage proba încă o oră, după care se separă eterul şi se usucă

145
produsul degresat într-o etuvă cu ventilator, la temperatura de 30C. Seminţele degresate conţin
lipază.
Modul de lucru. Într-un balon Erlenmeyer se introduc 1 g ulei rafinat de floarea soarelui
sau măsline şi 2 ml soluţie tampon cu pH=7,4. Se adaugă apoi 1 g de seminţe oleaginoase (ricin,
floarea soarelui etc.) degresate şi fin măcinate şi 3 ml de apă distilată la temperatura de 20 ºC. Se
închide balonul cu un dop şi se agită moderat timp de 30 de minute. După trecerea timpului
indicat, se adaugă 15 ml alcool 96 % (vol) şi 15 ml eter de petrol, iar conţinutul se agită din nou
cca. 10 secunde. Se titrează apoi acizii graşi din probă cu KOH sau NaOH 0,01 N în prezenţa
fenolftaleinei, ca indicator.
În paralel, se fac şi 1-2 probe martor, care diferă de proba de analizat prin faptul că, după
introducerea tuturor componentelor reacţiei cu excepţia uleiului, amestecul se agită bine şi se
încălzeşte timp de 5 minute pe baia de apă la fierbere, în vederea inactivării enzimei. Apoi se
răceşte, se adaugă 1 ml de ulei şi se procedează mai departe ca în cazul probelor de cercetat.
Calculul rezultatelor. Activitatea lipazei se poate exprima prin:
1. Numărul de micromoli de acizi graşi, reprezentaţi de acidul oleic, care se formează în
urma acţiunii enzimei dintr-un gram de produs, într-un minut:

(VpVm) . 0,00282
AL = în care:
282 . 10-6 . G . T

Vp = volumul de hidroxid de potasiu 0,01 N folosit la titrarea probei în care a acţionat

enzima (corespunzător acizilor graşi eliberaţi de enzimă şi a celor existenţi în substrat), în ml;
Vm = volumul de hidroxid de potasiu 0,01 N folosit la titrarea probei martor
(corespunzător acizilor graşi eliberaţi de enzimă şi a celor existenţi în substrat), în ml;
0,00282 = titrul acidului oleic corespunzător hidroxidului de potasiu 0,01 N;
282 . 10-6 = 1 micromol de acid oleic;
G = cantitatea de produs (în g sau ml) luat în lucru ;
T = timpul de termostatare (în minute);
2. Numărul de mililitri hidroxid de potasiu 0,01 N necesari pentru neutralizarea acizilor
graşi eliberaţi prin hidroliza enzimatică a unui gram de grăsime, de către lipaza dintr-un gram de
produs:

(VpVm)
AL = unde:
G

Vp = volumul de hidroxid de potasiu 0,01 N folosit la titrarea probei în care a acţionat

enzima (corespunzător acizilor graşi eliberaţi de enzimă şi a celor existenţi în substrat), în ml;
Vm = volumul de hidroxid de potasiu 0,01 N folosit la titrarea probei martor
(corespunzător acizilor graşi eliberaţi de enzimă şi a celor existenţi în substrat), în ml;
G = cantitatea de produs (în g sau ml) luat în lucru ;

146
 8.8. DETERMINAREA ACTIVITATII ENZIMELOR PROTEOLITICE
(MODIFICATA)

Principiul metodei. Pentru determinarea activităţii enzimelor proteolitice, extractul

enzimatic obţinut dintr-un produs de origine animală, vegetală sau microbiană acţionează asupra
unei soluţii de cazeină de concentraţie cunoscută, la temperatura de 37- 40C. Aminoacizii
eliberaţi se dozează după metoda Sörensen.
Reactivi. 1. Soluţie cazeină 2 %
2. Formol, soluţie 40%
3. NaOH, soluţie 0,01 N
4. Fenolftaleină, soluţie alcoolică 1 %.
Modul de lucru. Se iau într-un balon Erlenmeyer 10 ml soluţie de cazeină 2 %, 10 ml apă
distilată şi 5 ml extract enzimatic 10 %. După omogenizare, se prelevează imediat 10 ml din
amestecul din reacţie (proba martor), se adaugă 5 ml formol neutralizat, 3 picături fenolftaleină şi
se titrează cu NaOH 0,1 N până la slab roz.
Amestecul rămas se termostatează la 37- 40C timp de o oră. După termostatare, se ia 1
ml amestec, se adaugă 5 ml formol neutralizat, apoi 3 picături de fenolftaleină şi se titrează cu
NaOH 0,1 N până la slab roz.
Calculul rezultatelor. Făcând diferenţa dintre volumul de NaOH, folosit pentru titrarea
probei termostatate V1 şi volumul de NaOH folosit la titrarea probei netermostatate (Vm) obţinem
soluţia de NaOH ce corespunde aminoacizilor eliberaţi de enzimă. Activitatea enzimelor
proteolitice (aminoacizi la % ml cazeină) se exprimă astfel:

(V1Vm) . t
A% = . d . 100 în care:
10

t = titrul soluţiei de glicocol (0,075 g) în raport cu NaOH 0,1 N

d = diluţia efectuată

147
 BIBLIOGRAFIE

Artenie V., Tănase Elvira, 1980 - Practicum de biochimie generală. Centrul de Multiplicare al
Universităţii “Al. I. Cuza” Iaşi.
Bordei Despina (coord.) ş.a., 2007 - Controlul calităţii în industria panificaţiei. Metode de
analiză. Editura Academica, Galaţi.
Cunniff P. (Ed), 1995 - Official methods of analysis of AOAC International (16th ed., vol 1,2),
Association of Officinal Analytical Chemists International, Arlington, VA.
Dumitru, I. F., 1967 - Lucrări practice de biochimie. Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.
Gutt Sonia, 1997 - Analiza instrumentală. Editura Universităţii Suceava.
Sahleanu, V., Sahleanu, E., 1998 - Îndrumar pentru analiza cărnii şi produselor din carne.
Editura Universităţii Suceava.
Beschea Magda, Toma Gabriela, 1984 - Caiet de lucrări practice de chimie organică şi
biochimie specială (Fascicola 1 şi 2), Galaţi.
Fung D.Y.C., 1999 - Biochemical and modern identification techniques. Introduction. In:
Robinson RK, Batt CA, Padel PD (eds). Enciclopedia of Food Microbiology, vol. 1, Academic
Press, 218-227.
Mitrică N. 1981 - Laboratorul clinic şi biochimic, Editura Medicală, Bucureşti, 1981.
Nuţu Gh., Buşneag C., 1977 - Investigaţiui biochimice, Editura Didactică şi Pedagogică,
Bucureşti.
Pelloni Tamaş V., Johan Fr., 1971 - Cromatografia în strat subţire, Editura Tehnică, Bucureşti.
Vasu Sorin-Sabin, Segal Rodica, Muscă L., Vâţă C., 1985 - Caiet de lucrăru practice. Biochimie
şi bazele alimentaţiei. Universitatea „Dunărea de Jos”, Galaţi.
Vîţă C., Muscă Lelia, Segal Rodica, 2000 - Îndrumar de lucrări practice pentru biochmia
produselor alimentare. Universitatea „Dunărea de Jos”, Galaţi.
American Public Health Association (1992) Compedium of Methods for Microbiologica!
Examination of Food, 3rd edn. Washington, DC:APHA.
Association of Official Analytical Chemists (1977) Official Methods of Analysis, 16th edn.
Arlington, VA:AOAC International.
Bahrim G. (1999) Microbiologie tehnică, Editura Evrika, Brăila.
Bahrim G. (2003a) Analiza microbiologică a brânzeturilor în: Costin G.M. (editor) Ştiinta şi
ingineria fabricării brânzeturilor. Editura Academica Galaţi, p. 233-247.
Bibek R. (1996) Fundamental Food Microbiology. CRC Press, Boston, Londra, New York.
Blivat D. (1999) Electrical techniques. Introduction. In: Robinson RK, Batt, CA, Padel PD (eds)
Encyclopedia of Food Microbiology, voi 1, Academic Press, p. 573-578.
Bordei D. (1965) Caiet de lucrări practice pentru tehnologia panificaţiei, pastelor făinoase şi
biscuiţi, I.P.G.
Bordei D. (1980) Lucrări practice de laborator pentru tehnologia panificaţiei, Universitatea
Galaţi.
Bordei D., Burluc R. (1998) Tehnologia şi controlul calităţii în industria panificaţiei,
Universitatea „Dunărea de Jos" Galaţi.
148
Bordei D.(coord.), Bahrim G., Pâslaru V., Gasparotti C., Elisei A., Banu I., Ionescu L., Codină G
(2007) Controlul calitaţii în industria panificaţiei. Metode de analiză, Ed. Academica, Galaţi.
Buliga E., Unc R. (1996) Chimie analitică şi analiză instrumentală, Universitatea „Politehnica",
Timişoara.
Dan V. (2001) Microbiologia alimentelor. Editura Alma, Galaţi.
Delcros J.F., Rakotozafy L., Bossard A. (1998) Effect of Mixing Conditions on the Behaviour of
Lipoxygenase, Peroxidase and Catalase in Wheat Flour Doughs, Cereai Chem., 75, nr. 1, p. 85-93.
Douglas S.G. (1981) A Rapid Method for the Determination of Pentosans in Wheat Flour, Food
Chem., 7, p. 139.
Dumitrescu H., Milu C., Dumitrescu C.R., Ciubotaru-Bordeianu A., Albulescu V. (1977)
Controlul fizico-chimic al alimentelor, Ed. Medicală, Bucureşti.
Dumitriu C. (1980) Metode şi tehnici de control ale produselor alimentare şi de alimentaţie
publică, Ed. Ceres, Bucureşti.
Feng P. (2001) Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition,
http://www.cfsan.fda.qov/~ebam/bam-a1.html.
Fung D.Y.C. (1998) Handbook for Rapid Methods and Automatisation in Microbiology. Kansas
State University, Manhatan, KS, Department of Animal Science and Industry.
Fung D.Y.C. (1999) Biochemical and modern identification techniques. Introduction. In:
Robinson RK, Batt CA, Padel PD (eds) Encyclopedia of Food Microbiology, voi 1, Academic
Press, p.218-227.
Fung D.Y.C. (2002) Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews
in Food Science and Food Safety, voi. 1, p.3- 10.
Ghimicescu G. (1997) Chimia şi analiza băuturilor şi condimentelor, Ed. Junimea, laşi.
Gutt S. (1997) Analiza instrumentală, Ed. Universitatea Suceava.
Kubicka E., Grabska J., Jedrychowski L., Czyz B. (2000). Changes of Specific Activity of Lipase
and Lipoxygenase During Germination of Wheat and Barley, J. Food Sci. and Nutrition, nr. 4, p.
301-304.
Langemeier J.M., Rogers D.E. (1995) Rapid Method for Sugar Analysis of Doughs and Baked
Products, Cereai Chem., 72, nr. 4, p. 349-351.
MacRitchie F., Kasarda D.D., Kuzmicky D.D. (1991) Characterisation of Wheat Protein
Fractions Differing in Contributions to Breadmaking Quality, Cereal Chem., 68, nr. 2, p. 122-130.
Maturin L.J., Peeler J.T. (2001) Aerobic Plate Count. in: BacteriologicaI Analytical
Manual Online, Chapter 3, http://www.cfsan.fda.qov/~ebam/bam-3.html.
Moraru C., Danciu I. (1980) Metode de analiză la cereale, făinuri şi produse
derivate, vol. II, Universitatea din Galaţi.
Moraru C., Georgescu D. (1975) Metode de analiză la cereale, făinuri şi produse
derivate, vol. I, Universitatea din Galaţi
Moraru C., Georgescu D., Danciu I. (1983) Metode de analiză la cereale, făinuri şi
produse derivate, vol. III, Universitatea din Galaţi.
Popescu N., Popa G., Stănescu V. (1986) Determinări fizico -chimice de laborator
pentru produsele alimentare de origine animală, Ed. Ceres, Bucureşti.
149
Popescu S. (1964) Procedee moderne pentru controlul calităţii cerealelor, făinii şi a produselor
de panificaţie şi paste făinoase, I.D.T., Bucureşti.
Raugel N. (1993) Nouveaux outils et nouvelles methodes d'analyse rapide en agro -
alimentaire. Tech. Et Doc, Lavoisier, Paris.
Segal B., Dan V., Segal R., Teodoru V. (1985) Determinarea calităţii produselor alimentare, Ed.
Ceres, Bucureşti.
Segal B., Dan V., Segal R., Teodoru V. (1985) Determinarea calităţii produselor alimentare.
Editura Ceres, Bucureşti.
Segal B., Segal R. (1996) Metode rapide de analiză în industria alimentară, Ed Tehnică,
Bucureşti.
Simac V. (2005) Produse de panificaţie cu continut mare de fibre, Teza de doctorat,
Universitatea din Galaţi.
Tangkongchitr U., Seib P.A., Hoseney R.C. (1981) Phytic Acid I Determination of Three Forms
of Phosphorus in Flour, Dough and Bread, Cereai Chem., 58, nr. 3, p. 226-228.
Tofan C., Bahrim G., Nicolau A., Zara M. (2002) Microbiologia produselor alimentare. Tehnici
şi analize de laborator. Editura Agir Bucureşti.
Tothill I.E., Magan N. (2003) Rapid detection methods for microbial contamination. In: Tothill
IE (ed) Rapid and on-line instrumentation for food quality assurance, Woodhead Publishing
Limited, Cambridge England.
Upman M., Bonaparte C. (1999) Rapid methods for food hygiene inspection. In: Robinson RK,
Batt CA, Patel PD (eds), Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3, Academic Press, p.1887-
1895.
Vasu Sorin-Sabin, Segal R., Muscă L., Vîţă C. (1985) Caiet de lucrări practice. Biochimie şi
bazele alimentaţiei, Universitatea „Dunărea de Jos" Galaţi.
Williams M.G., Busta F.F. (1999a) Total viable count. Specific Techniques. In: Robinson RK,
Batt CA, Patel PD (eds), Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3, Academic Press, p.2160-
2166.
Williams M.G., Busta F.F. (1999b) Total viable count. Most Probable Number (MPN). In:
Robinson RK, Batt CA, Patel PD (eds), Encyclopedia of Food Microbiology, voi.3, Academic
Press, p.2166- 2167.
Zgherea Gh. (2000) Aparate şi lucrări practice de analize instrumentale, Ed Fundaţiei
Universitare „Dunărea de Jos", Galaţi.
*** (1988) Colecţia de standarde pentru industria de morărit - panificaţie, COC Bucureşti.
*** (1996-2006) Standarde de calitate (SR ISO) pentru cereale, produse de măciniş, pâine,
paste făinoase, biscuiţi, drojdie.
*** Method AACC.
*** Method AOAC.
*** Method ICC.

150