CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

Cromatografia HPLC

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă ( engl. HPLC - High

Performance Liquid Chromatography ) cunoscută în literatură şi sub denumirea
de cromatografie de înaltă presiune (High Pressure Liquid Chromatography)
este metoda cromatografică cea mai performantă care realizează separarea,
identificarea şi cuantificarea componentelor dintr-un amestec de specii chimice
cu ajutorul unor etaloane. Spre deosebire de cromatografia de gaze unde
pot fi analizate numai substanţe volatile, cromatografia HPLC permite
analiza lichidelor nevolatile. Cromatografia HPLC este folosită în separări şi
analize de substanţe imposibul de realizat prin alte metode. Pe de altă parte la
această tehnică pot fi făcute şi multe greşeli. Acesta este motivul pentru care
este nevoie de o experienţă practică bogată dar şi de cunostiinţe stiinţifice
fundamentale. Avînd în vedere că atît în cromatografia de gaze (GC) cît şi in
cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniţială a probelor este cea
lichidă trebuie luată decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel
amestec. In acest scop trebuie avute în vedere următoarele:
- cromatografia de lichide permite analiza lichidelor care nu pot fi aduse în
stare gazoasă din cauza descompunerii acestora la temperatură ridicată.
- În practică numai cca 20 % din speciile moleculare nu se descompun la
temperaturi ridicate şi ca atare pot fi analizate prin cromatografia de gaze.
[LINDSAY
- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare şi au limite
de detecţie mai bune decît la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare
cromatografică necorespunzătoare în gazcromatografie ca urmare analiza
lor trebuie făcută in cromatografie lichidă
- în cromatografia de gaze există numai o singură fază staţionară care
poate interacţiona cu moleculele probei , faza solidă sau faza lichidă,
aceasta fază poate absorbi proba gazoasă în orice raport
- în HPLC atît faza staţionară cît şi cea mobilă pot interacţiona mai selectiv cu
proba decît cromatografia de gaze. Multitudinea acestor interacţiuni
selective oferă cromatografiei HPLC un domeniu de aplicaţie mai larg
decît cromatografiei de gaze cu ea putînt fi rezolvate probleme de separare
avansată deosebit de complexe.
- În situaţiile în care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru
gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare şi sînt mai
rapide, iar dacă este vorba de determinări curente la anumite clase de
compuşi trebuie avut in vdere că un gazcromatograf este sensibil mai ieftin
decît un cromatograf pentru HPLC.
- Capacitatea de separare a cromatografiei HPLC este de cca 100 ori mai
mare decit cromatografia de lichide cu coloană clasică de joasă presiune
şi umplutură de granulaţie mare.

1
 La cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare denumită "Eluent"
împreună cu substanţele lichide de analizat este pompată cu ajutorul unei
pompe de înaltă presiune printr-o coloană cromatografică de separare ce
conţine faza staţionară sub formă de umplutură pulverulentă cu dimensiuni de
ordin micronic. În mod obişnuit înaintea coloanei de separare propriu zise se
cuplează o pre - coloană de separare pentru reţinerea impurităţilor, coloană
care este sensibil mai ieftină decît coloana de bază. O coloană de separare într-
un cromatograf HPLC are lungimea cuprinsă între 5 şi 30 cm, diametrul interior
cuprins ăntre 2- 4,6 mm iar debitul de fază mobilă este cuprins între 1-5 ml/min.
Cromatografia HPLC este folosită şi în scop preparativ pentru purifcarea
unor substanţe, situaţie în care se lucrează cu aparate cu debite şi dimensiuni
ale coloanelor mai mari .

Ca şi la celelalte metode cromatograficed dacă o specie chimică a

amestecului de substanţe supusă cromatografiei HPLC interacţionează mai
puternic cu faza staţionară ea este reţinută un timp mai indelungat în coloană
decît o specie ce interacţionează mai slab sau deloc . In funcţie de intensitatea
acestei interacţiuni speciile chimice componente ale amestecului analizat
sosesc pe rînd , la timpi diferiţi (timpi de retenţie) la capătul coloanei
cromatografice unde este poziţionat detectorul .

La ora actuală există următoarele metode de cromatografie de lichide :

- cromatografie prin absorbţie
- cromatografie prin repartiţie
- cromatografie prin schimb ionic
- cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbătoare de ioni faza stationară este este o răşină

schimbătoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea
interacţiunilor intre ionii probei şi grupele schimbătoare de ioni din răşină . In
cromatografia de excludere ca fază staţionară este folosit un gel cu pori mari
care poate separa moleculele după mărime şi formă , la acest tip de
cromatografie moleculele mari traversează cel mai rapid sistemul cromatografic.
Cromatografia cu lichide supracritice

2
 Dacă în timpul separarii cromatografice compoziţia substanţei de analizat
rămîne constantă tehnica de cromatografică este denumită eluţie izocratică.
Dacă compoziţia fazei analizate este schimbată în timpul procesului de
separare după o modalitate prestabilită, tehnica poartă denumirea de eluţie de
gradient .Cea din urmă tehnică este folosită atunci cînd domeniul timpilor de
retenţie a moleculelor din probă este atît de mare încît acestea nu pot fi eluate
într-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solvenţi.
Detectorii folosiţi în HPLC lînt detectori selectivi, ceea ce înseamnă că ei
nu răspund la toate moleculele existente înt-un amestec ci numai la anumite
molecule sau clase de compuşi. In cromatografia de lichide încă nu există un
detector universal şi de inaltă sensibilitate aşa cum este de exemplu detectorul
de ionizare cu flacără FID din cadrul cromatografiei de lichide, în schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoperă un număr mult mai mare de
substanţe decît cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe sînt
greu de detectat în HPLC şi trebuiesc aduse după părăsirea coloanei
cromatografice într-o formă detectabilă tehnică denumită derivatizare după
coloană. Ca şi la alte cromatografii în condiţii tehnice date pentru analiza
calitativă este definitoriu timpul necesar unei molecule din probă pentru a
traversa sistemul cromatografic şi a ajunge la detector, timp denumit timp de
retenţie. Dat fiind numărul extrem de mare de substanţe organice unele
substanţe au timpi de retenţie identici situaţie în care peak-urile se suprapun
putînd da naştere la erori importante de interpretare. Pentru înlăturarea acestui
neajuns se apelează la spectrometre care sînt de altfel cele mai importante
detectoare pentru HPLC. Pentru identificări avansate tot mai des ieşirile din
coloanele cromatografice se cuplează la spectrometre de masă (MS) situaţia
clasică fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaţii de aparate au
sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automată
prin compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare, în
momentul sosirii ei din coloana cromatografică la spectrometru, cu spectrele
etalon din bibliotecă electronică de spectre.

Aparatura folosită în cromatografia HPLC

Cromatografele de lichide de înaltă performanţă sînt formate dint-un sistem de

vase cu solvenţi (1) , o pompă de înaltă presiune (3), o coloană cromatografică
(6), unul sau mai mulţi detectori (8), şi un sistem de prelucrare a datelor (9), ele
mai sînt completate cu elemente de reglare automată a debitului , a presiunii şi a
temperaturii. In figura 1 este reprezentată schema de principiu a unui
cromatograf de lichide.

3
 Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide.1-recipiente de
solvent, 2-filtru, 3-pompă cu sistem de gradient, 4-sistem de măsurare a
presiunii şi a debitului, 5-sistem de introducere probă, 6-coloană cromatografică,
7- incintă de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziţie şi prelucrare
date, 10-cromatogramă.

Trebuie avut în vedere că în HPLC se folosesc solvenţi organici puternici sau

soluţii tampon care pot ataca chimic orice componentă ce se găseşte în traseul
lor de la recipientele de stocare pină la detector , ca atare toate materialele
folosite pe acest traseu trebuie să prezinte o rezistenţă chimică corespunzătoare.
O altă recomandare este aceea ca volumul mort , denumit şi volum
extracolumnar, între introducerea probei şi traversarea detectorului să fie
menţinut cît mai mic posibil prin aceasta evitîndu-se o lăţire de bandă (vezi şi
cap). Reducerea volumului mort se realizează în primul rînd prin măsuri
constructive ale furnizorului de cromatograf şi prin de alegerea corespunzătoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rînd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC

Recipientele pentru solvenţi

Solvenţii pentru HPLC sînt păstraţi în vase sticlă speciale întunecate cu volumul
uzual de 1 litru cu dop perforat pentru introducerea furtunului de absorbţie şi
după caz şi a furtunului de purjare cu gaz rar heliu. Trebuie avut în vedere că
substanţa lichidă care ajunge în pompă nu trebuie să conţină praf sau altă
substanţă în suspensie acestea putînd duce la deteriorarea pompei sau la
înfundarea iremediabilă a coloanei. In acest scop solventul se filtrează cu un
filtru intercalat în circuitul de absorbţie şi cel mai adesea se foloseşte o
precoloană care este mult mai ieftină avind atît rol cromatografic de separare cît
şi rol de filtrare şi reţine . Este important ca şi aerul dizolvat în soluţie să fie
îndepărtat deoarece acesta se poate aduna in pompă sau în detector şi poate
provoca erori sensibile de măsurare , în acest scop se practică fie o degazare
prin uşoară încălzire cuplată după caz cu realiyarea unui vacuum uşor deasupra
solventului şi tot după caz şi ultrasonarea concomitentă a solventului . Metoda
cea mai uzuală de degazare folosită este cea de inundarea continuă a spaţiului

4
liber din vas cu heliu în felul acesta aerul dizolvat şi cel liber este indepărtat
heriul nefiind absorbit de solvenţi .

Pompe de inaltă presiune

Coloane cromatigrafice
Coloanele pentru cromatografia HPLC sînt tuburi din oţel inoxidabil , umplute cu
fază staţionară, cu lungimi cuprinse între 10 şi 30 cm şi diametre interioare
cuprinse intre 3-10mm , ele prezintă la cele două capete piuliţe speciale care
permit atît închiderea etanşă a colanei cît şi racordarea ei la sistemul de
asigurare a presiunii respectiv la detector , figura .

Fig. secţiune printr-o coloană cromatografică de tip HPLC

Faza staţionară din coloane este formată din particule solide cu diametrul de 3,5
sau 10 µm. coloanele cel mai des utilizate au lungimea de 25 cm, diametrul
interior de 5 mm şi diametrul particulelor fazei staţionare solide de 5 µm, avînd
.
numărul de talere cuprins inre 40.000 – 60.000 m-1 Mai nou sînt folosite coloane
cu lungimi mai mici cuprinse între 3 şi 7,5 cm diametre interioare cuprinse între
1-4,6 mm şi diametrul umpluturii de 3 şi 5 µm [Skoog] sau chiar diametre
submilimetrice în cazul coloanelor “microbore” [Lindsay] avantajul ultimelor
constă în timpi mai mici de separare dar mai ales în consum mai redus de
solvent ultrapur scump. Pentru coloanele cromatografice clasice faza solidă
staţionară este poroase şi este formată din particule sferice sau particule
neregulate de gel de silice, oxid de aluminiu sau răşină schimbătoare de ioni cu
diametre cuprinse între 3 - I0 µm. Gelul de silice are grupe silanol ( Si-OH) care
pot fi modificate chimic în mod avansat astfel încît să poată lega chimic faze
lichide staţionare folosite în cadrul cromatografiei de repartiţie normale şi inverse
( vezi şi cap) . Clasa granulometrică în cadrul unui anumite umpluturi de coloană
trebuie să fie foarte strînsă pentru asigurarea unei calităţi înalte a separării
cromatografice. La valori de pH mari gelul de silice nu rezistă pentru aceste
domenii sînt folosite materiale de umplutură pe bază de oxid de aluminiu ,
carbon fluorocarbon, răşini polimerice. Durata de viaţă a coloanelor
cromatografice este influenţată de apariţia de fisuri, acumulări de particule de
eroziune din pompă, particule din suspensii nefiltrate necorespunzător, tasări de
material cu apariţia de volume moarte precum şi absorbţii ireversibile de
molecule din probă. Pentru mărirea duratei de viaţă a coloanei de separare
cromatografică prin reţinerea particulelor solide din faza mobilă, sînt folosite aşa
zise “precoloane” . Din punct de vedere al compoziţiei umpluturii precoloanelor
aceasta trebuie să fie asemănătoare cu cea a coloanei cromatografice singura
deosebire fiind dimensiunea particulelor care este de regulă mai mare decît cea

5
a coloanelor pentru a nu produce căderi de prensiune ridicate. Umplutura
precoloanelor cromatografice este formată din bile de sticlă sau de plastic cu un
diametru de 30 - 40 µm pe suprafaţa acestor bile se depune un strat subţire de
gel de silice, de oxid de aluminiu sau după caz de răşină schimbătoare de ioni.
Pentru cromatografia de repartiţie pe acest strat se absoarbe suplimentar o fază
staţionară sub forma unui film lichid legat prin forţe fizice sau chimice.

Detectoare folosite in cromatografia de lichide de tip HPLC

In cromatografia de lichide sint folosite urmatoarele tipuri de detectoare:

- de absorbţie în ultraviolet
- şir de fotodiode (diode - Array)
- de fluorescenţă
- electrochimic
- refractometrici

Detectoare de absorbţie în ultraviolet. Aceste detectoare sint de natură

semiconductoare şi sînt cei mai folosiţi senzori in cromatografia de lichide
datorită faptului că foarte multe molecule organice absorb in ultraviolet iar
detectorul este fiabil şi ieftin. Sensibilitatea maxima a acestor detectoare este
situată în domeniul radiatiei ultraviolete 200-300 nm. In figura 1 este
reprezentată o asemenea caracteristică.

LINSAY

Fig. Caracteristica de sensibilitate a unui detector de absorbţie în ultraviolet

Faza mobilă ce iese din coloana cromatografică este trecută printr-o

celula de masurare etanşa , figura 2, prin care trece fasciculul ultraviolet .

6
Lungimea drumului optic prin asemenea celule este de 10 mm iar diametrul
interior al tubului este de 1 mm. Selectivitatea acestui detector este dat de faptul
ca pot fi detectate calitativ si analizate cantitativ numai molecule ce absorb in
domeniul ultraviolet. Asemenea substanţe sînt alchene, hidrocarburi aromatice,
sau compusi cu legături multiple intre C, O, sau S. Faza mobila nu trebuie să
prezinte absorbţie in ultraviolet.

Fig.1. Schema de principiu a unei cuve de absorbţie dintr-un detector cu ultraviolete

Absorbţia radiatiei ultraviolete de către moleculele probei de analizat este dată

de legea Lambert - Beer şi este o funcţie de concentraţie a acestora .

Detectoare şir de fotodiode (Diode - Array) . Radiaţia policromatica,

trimisa printr-o celula speciala ermetica prin care circula faza mobila ce iese
din coloana cromatografică , figura 3, cade pe o oglinda de reflecţie totala si
de aici pe o reţea de difracţie unde este descompusă după componentele
spectrale acestea fiind reflectate pe detectorul sir de fotodiode.
( vezi şi cap….)

7
Fig. 3. Schema de principiu a detectorului cromatografic tip şir de fotodiode

În situaţia clasică se lucrează cu o singura fotodioda sau cu un fotomultiplicator

ca detector, diferitele lungimi de undă fiind aduse in dreptul fantei detectorului
prin rotaţia automata a reţelei de difracţie. Marele avantaj al detectorului cu şir de
fotodiode constă in faptul ca spectrul este obţinut instantaneu şi in mod continuu
neexistînd pericolul ca unii compusi de concentraţie mică să nu fie surprinşi de
detector. In cazul clasic al scanarii lungimilor de undă cu un monocromator si a
folosirii unui detector cu un singur canal acest pericol există deoarece in
momentul ieşirii din coloana cromatografică scanarea lungimilor de undă se
poate găsi la alte lungimi de undă decît cele unde absorbţia este maximă pentru
acea specie moleculară ea nefiind sesizată în amestecul substanţei de analizat.
Alt avantaj al folosirii detectorului şir de fotodiode constă in faptul că pentru
fiecare peak cromatografic se poate inregistra si reda ulterior spectrul fiind
posibilă compararea cu alte spectre. Este posibilă o identificare mai avansată a
peak-urilor precum şi găsirea lungimii de undă optime pentru detecţia lungimilor
de undă individuale., găsirea peak-urilor de sensibilitate maximă sau găsirea
peak-urilor ce deranjează. Rezultatele masurătorilor cu detector şir de fotodiode
pot fi redate prin curbe de contur, figura , care reprezintă secţiuni în peak-uri la
diferite absorbţii, figura 4.

8
Fig.4. Spectrogramă de absorbţie clasică pentru două substanţe x şi y - (a), cromatograma celor
două substanţe - (b) şi spectrul de absorbţie in trei dimensiuni avînd curbe de contur
pentru cele două substanţe - (c)

Reprezentarea este asemănătoare cu cea care redă prin curbe de nivel inălţimi
de dealuri sau munţi pe harţi geografice. In cazul concret al aplicaţiei
cromatografice acest tip de reprezentare este foarte sugestiv reuşind să redea o
imagine sintetică in trei dimensiuni a legăturilor dintre absorbţie , lungime de
undă şi timp cu posibilităţi largi de interpretare inclusiv privind identificarea de
impurităţi care nu pot fi evidenţiate prin alte metode. In figura 4a este
reprezentat un spectru de absorbţie clasic pentru doua substanţe x şi y, in figura
4b cromatograma celor doua substanţe a şi b , iar in figura 4c diagrama in
coordonate lungime de undă - timp avînd curbe de contur care leagă puncte ce
reprezintă aceeaşi absorbţie.

Detectoare de fluorescenţă. La iluminare cu lumină ultraviolretă unele

substanţe sint în măsură să absoarbă radiaţie ultravioletă si ca urmare a
acestei absorbtii să emită lumină vizibilă pe o lungime de undă mai mare decît
cea absorbită. Dacă emisia de lumină are loc imediat după iradiere fenomenul
poartă denumirea de fluorescenţă , iar dacă emisia are loc cu întîrziere se
vorbeşte de fosforescenţă. Raportul intre energia luminii emise si energia
radiaţiei absorbită este subunitar şi pentru majoritatea substanţelor este atît de
mic încît nu poate fi valorificat instrumental. Abia pentru substanţele la care

9
valoarea acestui raport se situează la valori intre 0,1 şi 1 este posibilă detecţia
prin fluorescenţă. Exista substanţe care prezintă în mod natural fluorescenţă.
Asemenea substanţe au o structură ciclică conjugată aşa cum prezintă de
exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substanţe ce nu prezintă în
mod natural fluorescenţă , tratate cu reactivi corespunzători pot fi transformte în
derivate fluorescente. În figura 5 este reprezentată schema de principiu a unui
detector de fluorescenţă.

Fig. 5. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip de fluorescenţă

1- sursă de radiaţie, 2- fantă, 3- lentilă , 4- filtru, 5- celulă cu soluţie de analizat, 6- lentilă, 7-
fantă, 8-filtru, 9-detector de radiaţie,

Radiaţia emisă de o sursă de radiaţie de deuteriu (1) este trecută printr-un

filtru (4) şi cade pe celula cromatografică specială cu soluţia de analizat unde
generează radiaţie de fluorescenţă pe toate direcţiile, măsurarea acesteia se
face însă la 90 0 faţă de radiaţia incidentă ea fiind trecută printr-un filtru (8)
înainte de a cădea pe detectorul (9). Avînd în vedere că măsurarea fluorescenţei
are loc la 90 0 faţă de radiaţia incidentă unele aparate permit măsurarea
concomitentă şi a absorbţiei cea din urmă fiind măsurată pe direcţia radiaţiei
incidente ( Fig. -linie punctata cu săgeată) după ce aceasta a traversat celula
de măsurare cromatografică (5). Avantajul mare al detectoarelor de fluorescenţă
faţă de alte detectoare este sensibilitatea lor deosebită. Edificatoare în acest
sens este figura 5 unde [Linsay ] este prezentată cromatograma

10
 Fig.6. Cromatograme pentru substaţe aromatice policiclice efectuate in ultraviolet (a) şi în
fluorescenţă (b)
unor substanţe aromatice policiclice, prezente ca toxine în aer in cantităţi mici ,
efectuată în UV (a) şi cromatograma pentru aceleaşi substanţe efectuată în
fluorescenţă (b). De asemenea detectoarelor de fluorescenţă au şi o selectivitate
foarte mare, deosebit de utilă în analiza urmelor, dată de faptul prin filtre
adecvate poate fi variată atît lungimea de undă incidentă cît şi lungimea de undă
detectată după generarea fluorescenţei. În condiţiile în care cantitatea de
radiaţie absorbită de probă nu depăşeşte 10% răspunsul detectorului dă un
răspuns liniar pe plaja 103-104 [ Lindsay]

Detectoare refractometrice. Acest tip de detector se bazează măsurarea

indicelui de refracţie a eluentului ce soseşte din coloana ca reprezentînd
diferenţa între indicele de refracţie a substanţei analizate şi indicele de refracţie
a fazei mobile pure. Detectoarele refractometrice au marele avantaj de a putea fi
folosite la aproape toate substanţele sînt fiabile iar indicaţiile lor nu depind de
viteza de curgere în schimb indicaţia este influenţată de variaţii de temperatură.
Detectoarele refractometrice au o sensibilitate mai mică decît detectoarele de
ultraviolete. Cele mai scăzute nivele de zgomot care se pot obţine se situează
la 10-7 unitati de refracţie ceea ce corespunde pentru majoritatea compuşilor
unei concentraţii echivalente de 10-6 g/ml [ Lindsay]. In ce priveşte liniaritatea
aceasta se situează in jurul valorii de 104. Dacă se doreşte o sensibilitate inalta
este necesara termostatarea aparatului şi un control foarte bun al compoziţiei
fazei mobile. In figura 7 este prezentata schema de principiu a unui detector
refractometric.

11
Fig.7. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip refractometric

Radiaţia luminoasă trece printr-o celulă paralelepipedică specială (1) cu două

compartimente despărţite de un geam de sticlă (2). Unul din compartimente
este pentru proba de analizat şi unul pentru soluţia etalon. După traversarea
celulei radiaţia luminoasă cade pe o oglindă semitransparentă (3) şi este
despărţită in două fascicule, unul cade pe fotocelula (4) iar celălalt pe fotocelula
(5). Atunci cînd indicele de refracţie se modifică se modifică unghiul de incidenţă
al radiaţiei ce cade pe oglinda (3) şi ca atare se modifică şi cantităţile de radiaţie
ce cad pe cele două fotocelule (4) şi (5), şi proporţional şi fotocurenţii celor două
celule. Fotocurenţii sînt trecuţi într-un amplificator diferenţial (6) ce dă un semnal
de eroare (  ) proporţional cu modificarea indicelui de refracţie. Semnalul de
eroare comandă un servomotor (7) care roteşte oglinda semitransparentă (3)
pînă cînd semnalul de eroare are valoarea zero.Oglinda semitransparentă este
legată de un ac inregistrator astfel încît deplasarea acesteia este inregistrată în
timp sub forma unei cromatograme ce are pe ordonată indicele de refracţie iar
pe abscisă timpul.
Detectoare electrochimice. Aceste detectoare există într-o varietate mare
şi se bazează pe principii electroanalitice diferite precum:
- amperometrie
- coulometrie
- conductometrie
Detectoarele electrochimice sînt simple, au limite de detecţie scăzute şi
aplicabilitate la un număr extrem de mare de substanţe. Pentru a putea fi
detectabile prin amperometrie şi coulometrie substanţele trebuie să fie uşor
oxidabile respectiv uşor reductibile. Pentru a putea fi detectate pe cale
conductometrică substanţele trebuie să existe sub formă ionică.
La metodele electrocimice de tip amperometric sau conductometric
cromatogramele au pe ordonată curentul şi pe abscisă timpul. Din punct de
vedere constructiv detectoarele amperometrice sau coulometrice sint relativ
simple, in figura 8 este reprezentată o asemenea celulă. Aşa cum se observă
detectorul nu este altceva decît o celulă electrochimică clasică cu trei electrozi
adaptată pentru condiţii de masurare sub presiune. Folosirea detecţiei

12
 Fig.8 Detector cromatografic de tip amperometric
1 - corpul celulei, 2-electrod de lucru, 3- electrod auxiliar, 4 - electrod de referinţă,

amperometrice sau coulometrice presupune cunoastera exactă a potenţialului

unde specia respectivă are activitate maximă. În acest sens de un real folos sînt
curbele curent -tensiune care se pot trasa pentru diferitele specii ionice cu celule
electrochimice cu trei electrozi. Dacă se se aplică unei asemenea celule tensiuni
progresiv crescătoare atunci prin înregistrarea parametrilor curent- tensiune intre
electrodul de lucru (2) şi electrodul de referinţă se obţine o curbă specifică ce dă
infomaţii valoroase despre activitatea electrochimică a speciei respective. In
figura 9 este reprezentată o asemenea curbă pentru trei substanţe diferite X,Y,
Z:

Fig.9. Curba curent tensiune pentru trei specii moleculare X, Y, Z active electrochimic

Dacă se pleacă din poziţia (O) de curent zero si se aplică o tensiune negative
crescătoare in poziţia (E1) se instalează un curent la care specia (Z) este

13
redusă. Din palierul crescător al curbei electrocinetice se observă creşteri mari
mari de curent la creşteri mici de potenţial. Acest lucru se manifestă pînă în
zona curentului limită -corespunzător tensiunii (E 2). După această tensiune la
creşteri relativ mari de potenţial cresterea de curent este nesemnificativă.
Situaţia se schimbă după depăşirea potenţialului (E 3) cînd din nou la variaţii
mici de potential corespund creşteri mari de intensitate, in acest caz este vorba
însă de descărcarea (reducerea) altei substanţe respectiv solventul. Acelaşi
raţionament se face pentru substanţele (X) şi (Y) care sînt oxidate atunci cînd
potenţialul se deplasează din punctul (O) spre dreapta ceea ce corespunde unui
potenţial pozitiv. Substanţa (X) este oxidată mai uşor ( oxidarea începe la E 4)
decît substanţa (Y) (oxidarea începe la E 5), oxidarea solventului necesită
potenţilaul cel mai ridicat şi începe la (E 6). Importanţa interpretării acestei curbe
constă în posibilitatea alegerii potenţialului de descărcare care dă sensibilitatea
cea mai ridicată pentru o anumită specie ionică moleculară prezentă într-un
amestec. Aşa cum se observă din figură dacă potenţialul celulei cromatografice
ar fi cel corespunzător poziţiei (O) nu ar putea fi identificata nici una din cele trei
substante deoarece peak-ul de pe cromatogramă ar avea valoarea zero. La
stînga sau la dreapta acestui punct cele trei substanţe pot fi identificate cu
sensibilităţi diferite în funcţie de valoarea potenţialului aplicat celulei. Situaţia
alegerii potenţialului de descărcare pentru obţinerea unei sensibilitati maxime
este analoga cu modificarea lungimii de undă în romatografia cu detectoare UV
pentru obţinerea sensibilităţii maxime pentru o anumită specie. Linia punctată din
figura de mai sus reprezintă curba curent- tensiune reziduală
corespunzătoare solventului atunci cînd ar lipsi cele trei substanţe (X),(Y) şi (Z)
La metoda electrochimică conductometrică este folosită o celulă cromatografică
relativ simplă, figura 10. Pentru evitarea apariţiei transportului ionic şi a

14
 Fig.11. Detector cromatografic de tip conductometric
1 celula conductometrică, 2,3- electrozi de platina, 4- generator de frecventă, 5- amplificator , 6-
inregistator

fenomenului de polarizare intre cei doi electrozi pentru alimentarea lor este
folosit un curent alternativ cu frecvenţa cuprinsă între 1000 Hz şi 5000 Hz.
Cromatogramele cu celule conductometrice au în ordonată conductivitatea
electrolitică si pe abscisă timpul. Pot fi analizate pe această cale numai
substanţe care disociază ionic.

Interpetarea cromatogramelor

Factorul de capacitate (k)

In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide cu coloană indiferent

dacă aceasta este de tip cu coloană deschisă sau sau de tip HPLC . Aşa cum se
observă amestecul de substanţe este injectat la intrarea în coloană , prin
mecanisme diverse de natură fizico – chimică are loc separarea specifică a
speciilor chimice în timp acestea sosind pe rînd la celălalt capăt al coloanei
unde sunt detectate obţinîndu-se o cromatogramă de tipul celei din figură.

15
Fig. Principiul separării cromatografice pe coloană şi cromatograma obţinută pentru un amestec
de trei specii chimice într-un solvent

Pe cromatogramă pot fi identificate trei Peak-uri:

- primul peak, de înălţime mică, este cel al unei specii chimice nereţinute
(neretardate) de umplutura coloanei , această specie traversează coloana cu
viteza fazei mobile, timpul scurs de la injecţie pînă la traversarea coloanei de
către această specie se notează cu t0
- al doilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza de traversare medie
timpul de reţinere fiind notat cu tr1
- al treilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza mică de traversare
această specie avînd timpul de reţinere tr2

Timpul de retenţie şi factorul de capacitate

Din cromatogramă se observă că natura speciilor chimice poate fi interpretată

prin prisma timpului de retenţie t acest timp depinde însă pe lîngă natura
specieiei şi de alţi factori precum : lungimea coloanei, natura şi granulaţia
umpluturii, etc, ca atare timpul de reţinere poate fi considerat specific naturii
speciilor chimice numai în condiţii precis definite neavînd un caracter universal.
Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativă este folosit factorul
de capacitate k :

t r  t0
k
t0

16
un factor de kapacitate de valoare mică indică o rezoluţie de identificare scăzută
iar un factor de capacitate de valoare mare indică un timp de separare şi de
analiză mare cu efect negativ asupra producţivităţii. Din punct de vedere al
ordinului de mărime factorul de capacitate trebuie să se situeze intre 1 şi 10.

Eficienţa unei coloane cromatografice

Ca măsură a eficenţei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie

numărul N de talere teoretice necesare separării fie înălţimea teoretică H a
talerului. Teoria talerelor se bazează pe conceptul că o coloană cromatografică
poate fi asimilată cu o mulţime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe
fiecare din aceste talere realizîndu-se echilibrul între faza mobilă şi cea
staţionară . în acest concept se ia in considerare situaţia în care un taler
realizează singur separarea cromatografică a componentelor, este evident că
pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui să fie infinit de mică iar timpul de
efectuare a unei cromatograme extrem de mare. Într-o coloană cromatografică
cu umplutură pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a
coloanei , astfel colanele comerciale conţin cca 50.000 talere pe metru dacă
este vorba de particule cu diametrul de 5 μm sau cca 25.000 talere pe metru
liniar dacă este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 μm. In general
eficienţa unei coloane cromatografice de separare creşte atunci cînd
dimensiunea particulelor de umplere scade. Numărul teoretic de talere necesar
într-o coloană cromatografică de lungime L este dat de relaţia:

L
N
H

de unde rezultă înălţimea talerului ca fiind :

L
H
N

Una din problemele de bază ale cromatografiei în general este aceea a lăţirii
benzii Peak-urilor ca urmare a călătoriei speciilor chimice prin coloana
cromatografică. In condiţii ideale o specie chimică ar trebui să se deplaseze
prin coloană fără ca banda ei să se lăţească la bază. În realitate însă are loc o
lăţire destul de pronunţată la traversarea coloanei cauzată de difuzie moleculară
longitudinală, de curgeri neuniforme prin coloană, de variaţii necontrolate ale
sorbţiei şi resorbţiei. Eficienţa unei coloane cromatografice este cu atît mai
ridicată cu cît lăţirile W1 şi W2 în condiţii date ale timpilor de retenţie tr1 şi tr2 sînt
mai mici, numărul de talere teoretice N fiind dat de relaţia:

17
 2
t 
N  16  r 
W 

Din relaţia de mai sus rezultă că numărul de talere respectiv eficienţa unei
coloane poate fi calculată din două măsurători de timpi: tr şi W.
O altă metodă pentru determinarea eficienţei, considerată de mulţi
cercetători de încredere mai mare [Skoog] o reprezintă determinare lălţimii
peak-ului la jumătatea înălţimii lui , numărul de talere teoretice rezultate fiind :

2
 t 
N  5,54 r 
 W1/2 

Dintre cele două mărimi ce indică eficienţa coloanei este preferată exprimarea
prin numărul de talere deoarece este adimensional şi poate fi folosită în
comparaţii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiţia ca eficienţa să fi
fost stabilită cu aceeaşi fază mobilă. Numărul de talere poate fi mărit foarte
simplu prin creşterea lungimii coloanei.

Gradul de separare, selectivitatea şi rezoluţia de separare

Gradul de separare a două peak-uri este dat de factorul de separare α:

k 2 t r2  t 0
α 
k1 t r1  t 0

Selectivitatea de separare β a doi componenţi este dată de raportul factorilor

lor de separare :

1

2

Măsura separării unei componente de alta este dată de rezoluţia de separare

Rs :

18
 t r2  t r1
Rs 
0,5(w 1  w 2 )

unde : w1, w2 reprezintă lăţimea bazei picurillor celor două componente.

Exprimarea pentru t şi w poate fi în unitîţi de timp, de volum, sau de lungime.
Atîta timp cît pentru cele două mărimi se folosesc aceleaşi unităţi se consideră
că două peak-uri sînt complet separate la bază dacă Rs = 1,5. In figura 2 sînt
prezentate două Peak-uri neseparate complet.

Fig.2. Situaţia unei separări incomplete a Peak-urilor

Dacă cele două peak- uri sînt apropiate şi au ariile egale , figura 3, ecuaţia ()
devine

t r2  t r1
Rs 
4σ

Fig.3 Exemplificare pentru situaţia cu două picuri apropiate de arii egale

ecuaţie ce arată influenţa termodinamică a sistemului cromatografic asupra

rezoluţieiei prin termenul de la numărător şi a eficienţei de separare prin
abaterea standard  . In situaţia in care:

19
 tr2 – tr1 = 4 

rezoluţia Rs are valoarea egală cu unu ceea ce corespunde unei separări

avansatea a celor doi componenţi de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistică
matematică este justificată de asemănarea peak-urilor cromatografice cu curbe
de tip Gauss valoarea lăţirii W fiind egală cu 4  . Forma cea mai completă şi
ecuaţia cheie în cromatografie pentru definirea rezoluţiei Rs , ecuaţie ce ţine

cont de factorul mediu de capacitate k , de factorul de separare α şi de

numărul mediu de talere N este:

  
 α  1  k  
R s  0,25   N
 α  1  k 
 

Această ecuaţie presupune îndeplinirea a trei condiţii pentru obţinerea unei

rezoluţii dorite şi anume :
- peak-urile trebuie să fie separate între ele (α >1)
- substanţele trebuie să fie reţinute pe coloană (k >1)
- coloana trebuie să conţină un anumit număr de talere (N)


Influenţa fiecărui factor (α, k , N) , asupra rezoluţiei poate fi discutată
independent de ceilalalţi doi , rezultînd situaţiile din tabelul de mai jos:

Dacă se pleacă de la o selectivitate constantă ( factorul α de

separare constant) şi un număr constant de talere, zoluţia R s
 
este proportională cu: k /(1  k ) în figura din dreapta este

reprezentată dependenţa dintre factorul de capacitate mediu k
 
şi termenul: k /(1  k ) . Valoarea limită a termenului din urmă

este 1. Dacă se măreşte în prima fază se măreşte puternic
k

rezoluţia ca ulterior la valori mai mari ale lui k acest efect să
scadă puternic. Aşa cum se observă din figura alăturată valorile

optime ale lui k se situează între 1 - şi 10, este adevărat că se
poate cîstiga o rezoluţie mai bună şi la valori mai mari de 10
însă această creştere este legată invariabil de creşteri ale
timpului de analiză.
Dacă factorul de separare α >1 valoarea limită pentru termenul
(α  1)/α este tot 1, iar valoarea acestui termen creşte încet cu
creşterea lui α , atunci cînd α =2 , ceea ce în practică

20
echivalează cu o selectivitate ridicată, abia se atinge 50% din
valoarea limită, figura din dreapta . Cea mai sensibilă rezoluţie
se obţine atunci cînd valoarea acesteia este în jurul valorii 1, (
Rs  1
) însă şi la valori mai ridicate ale Rs o creştere a
factorului de separare α este favorabilă creşterii rezoluţiei.
Factorul de separare α poate fi influenţată hotărîtor fie prin
natura fazei staţionare fie prin natura compoziţiei fazei mobile.

Dependenţa rezoluţiei de numărul de talere urmăreşte o o

funcţie radicalică care pleacă la început destul de abrupt din
zero dar care ulterior la valori mai mari ale numărului de talere
N nu mai creşte aşa de rapid, vezi figura din dreapta. Pentru a
dubla rezoluţia N trebuie crescut cu factorul 4 , lucru foarte
greu de realizat în practică. Numărul de talere poate fi variat prin
modificarea lungimii coloanei, a diametrului particulelor, sau a
curgerii . Dacă se măreşte N prin creşterea pur şi simplu a
lungimii coloanei se ajunge la timpi de analiză mai mari precum
şi la o cădere de tensiune mai ridicată pe coloană. Cu tot rolul
important pe care-l joacă coloana cromatografică este cel mai
puţin indicată mărirea numărului de talere N pentru a creşte
rezoluţia.

In figurile alăturate este prezentată evoluţia

unei cromatograme cu două peak-uri
neseparate a) atunci cînd se variază cei trei

factori α,
k , N, atfel: dacă se măreşte a)
numărul de talere N şi se menţin constanţi
ceilalţi factori cei doi componenţi 1 şi 2 apar
în acelaşi loc pe cromatogramă , se
îmbunătăţeste în schimb rezoluţia Rs deoarece
lăţimea peak-ului scade, figura b). O creştere a

factorului de capacitate mediu are ca efect
k b)

21
 îndepărtarea celor două peak-uri unul de
celălalt ceea ce înseamnă de fapt o rezoluţie
mai bună , totodată se înrăutăţeşte
productivitatea deoarece substanţele rămîn un
timp mai îndelungat în faza staţionară şi
traversarea coloanei durează mai mult, peak- c)
urile nu se mai regăsesc în acelaşi loc pe
cromatogramă, figura c. O mărire a factorului
de separare α duce automat la îndepărtarea
celor două peak-uri unul faţă de celălalt ceea
ce înseamnă tot o rezoluţie mai ridicată, d).

d)

Lăţirea de bandă

Lăţirea de bandă a unei probe în călătoria ei prin coloană este influenţată de

patru factori:
1. difuzia radială
2. difuzia longitudinală
3. efectele transportului de masă
4. efectele exterioare

Difuzia radială se bazează pe faptul că o probă datorită drumului de curgere

distribuit radial parcurge într-o coloană lungimi diferite făcînd ca ea să
sosească pe un interval mai mare de timp (bandă lăţită). Diferenţele de lungime
iau naştere ca urmare a diferitelor forme şi dimensiuni ale umpluturii coloanei
precum şi datorită golurilor neuniforme din umplutură, reprezentarea schematică
este dată în figura

. Pentru ca o coloană să prezinte o lăţire de bandă mică este nevoie ca ea să

aibe o umplutură de dimensiune cît mai mică şi de diametru cît mai uniform.
Difuzia radială este cu atit mai ridicată cu cît proba traversează mai încet
coloana.
Difuzia longitudinală se datorează pe diferenţierea axială a vitezei de
curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunţat pe măsura

22
creşterii timpului de staţionare a probei în coloană. Spre deosebire de difuzia
radială la cea axială se poate reduce efectul asupra lăţirii de bandă prin mărirea
vitezei fazei mobile. Din cauza coeficientului de difuzie mai mic cu cca 10 3-104
la lichide decît la gaze difuzia longitudinală este totuşi minoră în cadrul
cromatografiei de lichide în schimb la cromatografia de gaze ea joacă un rol
hotărîtor.
Efectele transportului de masă se manifestă asupra lăţirii de bandă datorită
faptului că cinetica de absorbţie- desorbţie a moleculelor probei între faza
staţionară şi cea mobilă este mai lentă decît viteza moleculelor în faza mobilă.
Atunci cînd o moleculă a fazei mobile intră în interacţiune cu faza staţionară
petrece pe şi în aceasta un un anumit timp pînă cînd intră din nou în fluxul de
curgere şi este ransportată mai departe de faza mobilă. In tot acest timp
molecula pierde timp faţă de moleculele care nu au interacţionat cu faza
staţionară. Un rol important la retenţia moleculelor o joacă şi structura poroasă a
fazei staţionare. Fenomenele de transport de masă devin cu atît mai pronunţate
cu cît viteza de curgere liniară este mai mare, ca atare lăţirea de bandă datorită
efectului de transport de masă poate fi redusă prin scăderea vitezei de curgere a
fazei mobile . De asemenea ea poate fi redusă prin folosirea unor particule cu
diametru cît mai mic şi neporoase pentru umplutură, precum şi folosirea de
solvenţi de vîscozitate mică.
Efectele exterioare ale lăţirii de bandă se manifestă în exteriorul coloanei şi
sînt cauzate de volume moarte în injector , în detector, precum şi în conductele
de transport. Suma efectelor enunţate mai sus se numesc “Efecte
extracolumnare „ un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor
volume moarte intercalate în circuitul de lichid iar în figura este reprezentată

23
 Fig. Laţirea de bandă: i - la o cromatogramă normală, ii- la o cromatogramă care se obţine
prin intercalarea intre detector şi ieşirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm şi diametrul
interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogramă care se obţine prin intercalarea intre detector şi ieşirea
coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm şi un diametru interior de 4,6 mm

Efectul curgerii cu viteză diferită şi a difuziei asupra lăţirii de bandă

Fig. Efectul curgerii cu viteză diferită şi a difuziei asupra lăţirii de bandă . i- la curgere a
unui lichid printr-o conductă viteza liniară se schimbă de-a lungul secţiunii în sensul că
moleculele din centru se deplaseză mai rapid decît cele din imediata vecinătater a peretelui, ii-
şi difuzia multidirecţională a probelor lichide duce la lăţirea de bandă

Analiza calitativă

Analiza cantitativă

Metoda normării suprafeţei (înălţimii)

La analiza cantitativă se are în vedere faptul că suprafaţa respectiv
inălţimea unui peak este proportională cu concentraţia componentului
reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraţia procentuală a unui
component trebuie avută în vedere înălţimea totală sau suprafaţa totală a
tuturor componentelor din amestec care este considerată ca avînd o compoziţie
de 100% . Concentraţia fiecărui component din amestec se determină pe urmă
prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se
acceptă următoarele:
1. se presupune că pe cromatogramă sînt evidenţiate toate componentele
şi că fiecare componentă apare sub forma unui peak individual bine
definit. Această presupunere nu ţine cont de faptul că două sau mai multe
componente pot parăsi în acelaşi timp coloana fiind identificate ca o
singură specie, sau unele specii pot fi reţinute total pe coloană şi iar altele
eventual nici nu sînt detectate
2. se presupune că sensibilitatea detectorului este aceeaşi pentru toate
componentele amestecului ceea ce în cele mai multe cazuri nu se
adevereşte

24
bazat pe aceste presupuneri şi efectele generate de ele se procedează la
calibrarea sensibilităţii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise în
continuare.

Metoda standardului extern

La folosirea acestei metode se prepară un standard extern care conţine

specia (speciile) urmărită , dacă se bănuieşte ordinul de mărime al concentraţiei
componentei (componentelor) urmărite este bine ca la standardul extern
concentraţia să fie în acelaşi domeniu. Faza mobilă astfel preparată se trimite
prin cromatograf şi se trasează o cromatogramă , operaţia se repetă pentru
proba de analizat. Din cromatograma standard se determină pentru peak-ul
urmărit, figura, un factor de răspuns r ca fiind raportul dintre concentraţia
componentei [Ai] urmărite şi înălţimea h sau suprafaţa S a peak-ului, :

r 
 Ai  
 Ai 
h S

Fig. Mărimi caracteristice ale peak-ului luate în calcul la

determinarea concentraţiei prin metoda standardului extern

în continuare concentraţia oricărei componente din probă se determină prin

înmulţirea factorului de răspuns r cu înălţimea h sau cu suprafaţa S peak-ului.
De fapt prin calcularea acestui factor de răspuns r se simplifică determinarea
concentraţiei prin regula de trei simple, factorul de răspuns regăsindu-se de
fiecare dată în această regulă sub forma unei constante, la calcularea
concentraţiei diferitelor componente din amestec. Acest mod de determinare a
concentraţiei unei componente presupune o dependenţă liniară între înălţimea
respectiv suprafaţa peak-ului şi concentraţie. Atunci cînd această dependenţă
este cunoscută sau bănuită ca fiind neliniară se efectuează mai multe
cromatograme etalon cu concentraţii cunoscute care includ în domeniu valoarea
concentratiei necunoscute , figura şi cu valorile obţinute se trasează o curbă de

Fig. Înălţimea şi forma peak-urilor la Fig. Curba de etalonare a componentului

calibrarea multiplă cu concentraţii urmărit oarecare
crescătoare a componentului urmărit

25
etalonare în coordonate h(S) şi concentraţie. Pe această curbă de etalonare se
extrapolează valorile înălţimii sau suprafeţei peak-ului urmărit pentru detrminarea
concentraţiei speciei pe care o reprezintă acesta. Imprecizia acestei metode este
legată de erorile de dozare ale probei de analizat avînd în vedere şi volumele
mici ce se dozează.

Metoda standardului intern

La folosirea acestei metode se obţin cele mai mari precizii deoarece sînt
evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecţie. Tehnica se
bazează pe adăugarea atit la proba standard cît şi la proba urmărită o cantitate
bine stabilită dintr-un standard intern. Raportul dintre suprafeţele peak-urilor sau
a înălţimii probei şi suprafaţa peak-ului standardului intern reprezintă parametrul
analitic urmărit respectiv factorul de răspuns r :

S
r 
Ss
factor care se poate exprima , atunci cînd se ţine cont de corespondenţa dintre
suprafaţa S a peak-ului şi concentraţia c , ca fiind [LINDSAY]:

c u Su
r
c s Ss

unde: c - concentraţia componentei care interesează

S - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului
cs - concentraţia standardului intern
Ss - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului standardukui intern
In aceste condiţii concentraţia componentei urmărite cu are expresia:

c
cu  r  s  Su
S
s

unde: cu - concentraţia componentei care interesează

Su - suprafaţa (respectiv înălţimea) peak-ului
cs - concentraţia standardului intern
Ss - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului standardului intern

Cromatografia de repartiţie , este cea mai folosită metodă

cromatografică şi constă în absorbtii si desorbţii repetate între un faza lichidă
mobilă si o fază lichidă staţionara , ultima fiind absorbită sau legată chimic de
umplutura solidă a coloanei cromatografice. Cromatografia de repartiţie era
folosită înainte numai pentru analiza substanţelor cu legături polare neionice
la substanţe cu molecule de dimensiuni mici pînă la dimensiuni medii (< 3.000g .

26
mol-1) , astăzi prin metode de derivatizare şi metode de formare de perechi
ionice [ Skoog] metoda permite şi analiza compuşilor ionici.
Cromatografia de repartiţie poate fi clasificată în cromatografie lichid-
lichid şi cromatografie cu faze legate chimic . La cromatografia lichid - lichid
faza lichidă este reţinută prin forţe de natură fizică pe suprafaţa fazei solide
staţionare. La cromatografia cu faza legată chimic faza mobilă este fixată prin
forţe de natură chimică pe suprafaţa fazei staţionare solide. Cromatografia de
tip lichid- lichid este folosită mai puţin din cauza solvirii fazei lichide staţionare de
către faza mobilă şi antrenarea acesteia spre capătul coloanei fapt ce necesită
refacerea periodică a peliculei fazei staţionare, din acelaşi motiv acest tip de
separare nu poate fi folosită la cromatografia cu gradient de eluţie. Alte
avantaje ale cromatografiei cu faze legate chimic faţă de cromatografia lichid-
lichid constau în simplitate, rapiditate , aplicabilitate universală şi o mai bună
reproductibilitate a datelor experimentale.
În cadrul cromatografiei cu faze legate chimic se folosesc două metode:
- cu fază normală
- cu fază inversă
Metoda cu fază normală foloseşte o fază staţionară polară (ex silicagel) şi o
fază mobilă nepolară . Metoda cu fază inversă foloseşte o fază staţionară
nepolară (ex hidrocarburi ) şi o fază mobilă polară cu solvent apă, metanol
sau acetonitril. Metoda cu fază inversă este folosită la scara cea mai largă în
practică, cca 70% din separările analitice sînt separări cu fază inversă. La
cromatografia cu fază normală prima dată este eluată (ajunge prima la
capătul sistemului cromatografic) componenta cu polaritatea cea mai mică

27
 Fig. Legătura între timpul de eluţie şi polaritate la cromatografia
cu fază normală şi la cromatografia cu fază inversă

iar la cromatografia cu fază inversă este eluată prima componenta cu

polaritatea cea mai mare. O ilustraţie grafică în acest sens este dată în figura
. O aplicaţie deosebită pentru metoda cu fază inversă o reprezintă
separarea de substanţe care prin metoda cu fază normală au timpi de
retenţie foarte mari. Aplicaţii specifice pentru analitica alimentară sînt
separarea , identificarea şi dozarea : indulcitorilor , aditivilor, antioxidanţi,
aflatoxine

Cromatografia de absorbţie , denumită şi cromatografia lichid-solid

reprezintă cromatografia clasică de lichide la care o substanţă din faza lichidă
mobilă care interacţionează puternic cu faza staţionară solidă rămîne un timp
mai îndelungat în coloană decît o substanţă care interacţionează mai slab cu
faza staţionară. Corespunzător substanţele din amestec ce au o comportare
absorbantă diferenţiată faţă de faza staţionară prezintă timpi de retenţie diferiţi
şi ajung pe rînd la capătul coloanei de separare locul unde se găseşte detectorul.
Acest tip de cromatografie de lichide poartă denumirea de cromatografie de
absorbţie sau cromatografie lichid- solid (LSC - Liquid Solid Chromatographie).
La acest tip de cromatografie ca umplutură pentru coloane este folosit silicagelul
şi oxidul de aluminiu iar singura variabilă accesibilă pentru optimizarea lui k şi

28
α o reprezintă compoziţia fazei mobile care poate fi modificată din fericire în
mod hotărîtor prin alegerea solventului sub aspectul naturii şi a concentraţiei lui.
Cromatografia de absobţie este recomandată pentru substanţe cu masa
.
moleculară mai mică de 5000g mol-1 solubile în solvenţi nepolari. Avantajul cel
mai mare al cromatografiei de absorbţie îl reprezintă capacitatea acesteia de a
permite diferenţierea şi identificarea componentelor unui amestec izomeric,
capacitate care nu o are nici o altă metodă cromatografică.

Cromatografia ionică constituie un domeniu important şi deosebit de

dinamic al cromatografiei de lichide. Acţiunea conjugată şi interesată a
producătorilor de aparatură cromatografică a făcut ca mult timp acest tip de
cromatografie să fie considerată ca un domeniu distinct care ar necesita o
aparatură proprie. În realitate nu este aşa , separarea prin schimb ionic a
lichidelor ionizate sau ionizabile se face pe aceeaşi aparatură ca şi a celorlalte
lichide specifică fiind numai umplutura coloanei şi detectorul care este de regulă
unul de tip conductometric, mai nou fiind folosite şi detectoare amperometrice.
La cromatografia ionică umplutura coloanei cromatografice este o răşină
schimbătoare de ioni A+R+ depusă pe o răşină sintetică cu grad mare de
polimerizare , ce se prezintă sub formă granulară, care fixează ionul B + în raport
stoechiometric :

A+R- + B+  B+R- + A B+
Ionii din soluţie înlocuiesc totdeauna ioni cu acelaşi semn din schimbătorul de
ioni. Un amestec ionic poate fi separat numai atunci cînd între ionii probei fazei
lichide mobile analizate şi grupările de schimb ionic ale fazei solide există o
interferenţă de un anumit nivel care este dat de modul cum se modifică
schimbul ionic în funcţie de pH. După fixarea ionilor din amestec pe
schimbătorul de ioni urmează eluţia acestora cu un eluent care conţine
acelaşi ion ca şi ionii fixaţi pe schimbător ( de exemplu ionii fixaţi pe o răşină ca
ioni H+ se vor elua cu un eluent ce conţine tot ioni H + , trebuie însă specificat că
că pentru eluarea componenţilor de pe răşină , concentraţia ionilor care-i
schimbă trebuie să fie mai mare decît cea a ionilor schimbaţi [ Liteanu C, s.a.
Cromatografia de lichide , Ed. St.Buc.1974]

Cromatografie de excludere cromatografie prin gel

Reprezintă o tehnică avansată în cadrul cromatografiei de lichide folosită

în principal pentru separarea compuşilor cu un număr mare de molecule .
Umplutura coloanelor este formată din granule mici de silicagel sau din
polimeri cu diametrul de cca 10 μm ce au o reţea de pori uniformi la
suprafaţă , figura . In acesti pori pot difuza atît moleculele solventului cît şi
moleculele de dimensiuni mai mici ale speciilor analizate, popri în care sînt
reţinute un anumit timp şi astfel extrase din fluxul fazei mobile find întărziate
la traversarea coloanei faţă de moleculele de dimensiuni mari care traversează
primele coloana

29
Fig. Mecanismul reţinerii fazei mobile de către umplutura poroasă la cromatografia cu gel

Cromatografia cu fluide supracritice

30
 Cromatografia cu fluide supracritice (SFC- Supercritical Fluid
Cromatography) reprezintă o tehnică cromatografică relativ nouă de înaltă
performanţă care poate fi explicată simplist ca fiind o tehnică hibridă între
cromatografia de gaze şi cromatografia de lichide cu folosirea avantajelor
ambelor metode cromatografice. Cel mai mare avantaj a acestei tehnici este
însă acela că reuşeşte să separe şi să identifice compuşi care nu pot fi
separaţi prin cele două tehnici clasice de cromatografie respectiv cea de gaze şi
cea de lichide. Asemenea compuşi prezintă următoarele caracteristici :
- fie nu sînt volatili fie se descompun la temperaturi mai ridicate astfel încît
cromatografia de lichide nu poate fi aplicată.
- Nu au grupări funcţionale care să permită identificarea lor prin metode
spectrometrice, electrochimice sau refractometrice specifice detecţiei în
cromatografia de lichide
Se apreciază [Linsay] , [ Chester T.L. , Journal Cromatogr.Sci.1986, 24, p226],
că cca 25 % din problemele de separare cromatografică a amestecurilor sînt
cauzate de acest tip de compuşi. Alte avantaje sunt legate de viteya mai mare
faţă de cromatografia HPLC clasică,
Un fluid supracritic este o stare de agregare a unui compus care-l
plasează din punct de vedere al temperaturii şi al presiunii foarte puţin peste
valoarea temperaturii la care acea substanţă nu mai poate exista în fază lichidă
indiferent de presiunea aplicată, temperatura acestei stări este denumită
temperatura critică, iar presiunea corespunzătoare poartă denumirea de
presiune critică. Perechea de valori ale temperatuii critice şi ale presiunii critice
ale unui anumit compus poartă denumirea generică de punct critic al compusului
respectiv. Expresile valorice ale unor proprietăţi fizice sau fizico-chimice
precum :densitate, viscozitate, tensiune superficială etc. ale fluidelor
supracritice se situează între cele ale compusului respectiv în stare lichidă şi
cele ale compusului în stare gazoasă. De fapt pe densitatea relativ mare a
fluidelor supracritice se bazează capacitatea acestora de solvi lanţuri moleculare
cu mulţi atomi de carbon făcînd ulterior posibilă separarea lor cromatografică.
Din gama relativ mare a fluidelor supracritice folosite în cromatografie se
remarcă bioxidul de carbon care în stare supracritică ( Teperatura critică
31,30C , presiune critică 72,9 bar, densitate la punctul critic 0,47 g/cm 3) este un
excelent solvent pentru hidrocarburi cu mulţi atomi de carbon, afară de asta este
ieftin, permeabil la radiaţie UV, nu are miros şi este netoxic. Separarea cu fluide
supracritice este folosită si ca tehnică industrială , astfel cu CO 2 supracritic se
extrage cofeina din cafea în vederea obţinerii cafelei decofeinizate sau nicotina
din tabac în vederea obţinerii ţigărilor uşoare

Aparatura folosită la cromatografia cu fluide supracritice

Trebuie remarcat faptul că atît temperaturile cît şi presiunile folosite la fluide
supracritice se situează perfect în domeniul acoperit de HPLC pentru aceşti doi
parametrii. Cu toate acestea un cromatograf pentru fluide supracritice are o
serie de particularităţi faţă de un cromatograf clasic de tip HPLC , astfel:

31
 - trebuie să dispună de un sistem de termostatare avansată a coloanei
cromatografice asemănător cu un cromatograf de gaze.
- Trebuie să dispună de un reductor de presiune reglabil cu ajutorul cărui a
presiunea în coloană să poată fi redusă şi menţinută la valoarea dorită
pentru a transforma fluidul supracritic în gaz inainte de a ajunge la
detector
- Să dispună de bucle de reglare automată a temperaturii şi a presiunii
gestionate de microprocesoare specializate
- Să dispună pe lîngă detectoare specifice HPLC precum detector UV, IR,
de fluorescenţă, flamfotometric şi de detector de ionizare cu flacără (FID)
specific gazcromatografiei precum şi de detector spectrometru de masă

In figura este prezentată schema de principiu a unui cromatograf cu fluide

supracritice

Fig. schema de principiu a unui cromatograf cu fluide supracritice

Coloanele cromatografice folosite sint atit de tip tubular fără umlplutură cît
şi de tip tubular cu umplutură , fiind preferate totuşi primele care se prezintă sub
forma unor coloane lungi de ordinul metrilor fiind uzuale şi lungimi de 25-30 m,
diametrul interior variind ăntre 0,05-0,1 mm iar grosimea filmului de siloxani
legaţi chimici variază între 0,05-1μm [Lindsay] .La coloane cu umplutură
diametrul maxim interior este de 4,6 mm iar natura şi dimensiunile umpluturii
asemănătoare la coloanele HPLC clasice folosite la cromatografia de repartiţie.
In cromatografia de gaze Faza mobilă are numai rol de transport , în
cromatografia de lichide pe lingă transport faza mobilă joacă şi rol de mediu de
interferenţă cu speciile analizate şi influenţează prin aceasta factorul de
selectivitate (α). Dacă o moleculă se găseşte într-un fluid supracritic atunci
această stare poate fi asimilată cu o evaporare la temperaturi mult mai mici decît

32
cele la care ar avea loc în mod obişnuit evaporarea acelor specii şi eluarea lor
pe coloană evitîndu-se pericolul ruperii lanţului molecular în segmente mai
scurte şi prin aceasta identificări greşite .

Electroforeza
Electroforeza reprezintă o metotă cromatografică de separarea dintr-un
amestec a particulelor încărcate electric (ioni) sub acţiunea unui cîmp electric
continuu . Cimpul electric aplicat pin intermediul a doi electrozi provoacă
migrarea electroforetică cu viteze diferite a particulelor plasate fie într-un mediu
electrolitic liber fie într-un mediu electrolitic pe un material suport sau într-un
mediu electrolitic în interiorul unei capilare. Viteza de migraţie a ionilor este
proporţională cu intensitatea cîmpului electric şi încărcărcarea electrică a
particulei şi invers proporţională cu raza particulei şi vîscozitatea substanţei de
analizat .
Electroforeza este folosită ca metodă de analiză calitativă şi cantitativă mai
ales în medicină, biologie , chimie alimentară. De asemenea electroforeza este
folosită în analiza genetică (DNA) pentru separarea genelor .
Descoperitorul electroforezei este cercetătorul suedez Arne Tiselius (1902-
1971). El a folosit pentru prima dată această tehnică analitică şi a fost
răsplătit cu premiul Nobel în anul 1948. La electroforeza clasică introdusă
de Tiselius este folosit fie un mediu de migraţie liberă fie un mediu de
migraţie stabilizant format din fîşii de hîrtie poroasă sau din geluri speciale
de puse pe plăci de sticlă sau plăci sintetice. La ora actuală bazat pe
tehnicile cromatografiei de lichide de înaltă rezoluţie (HPLC) şi tehnicile
cromatografiei cu gaze (GC) s-a pus la punct electroforeza capilară cu o
rezoluţie de separare mare .

Teoria electroforezei. Într -un cîmp electric ionii se deplasează cu o

viteză constantă. Creşterea intensităţii cîmpului electric (E), prin creşterea
tensiunii , duce la creşterea corespunzător şi a vitezei (v) de migrare a ionilor:

v= µe · E

unde: (µe) reprezintă mobilitatea electroosmotică.

Hotărîtor pentru separarea electroforetică sînt vitezele diferite de migrare a
ionilor în cîmp electric. De aici se trage concluzia că ionii se deosebesc prin
mobilitatea lor rezultînd de aici diferite viteze de migrare. Mobilitatea
electroforetică este o constantă de material, specifică pentru fiecare ion şi este
definită pentru un anumit mediu de o valoare precisă a pH-ului. Mobilitatea
electroforetică poate fi bine descrisă de forţele ce acţionează asupra substanţei
ionice de analizat care sînt pe de-o parte forţe acceleratoare pe de altă parte
forţe de frînare

33
 Forţa acceleratoare (Fe) este de natură electrică şi este dată de produsul
dintre sarcina ionică efectivă (z), constanta lui Faraday (F) şi intensitatea
cîmpului electric (E):

Fe= z · F · E

Sarcina ionică efectivă descrie sarcina ionică absolută minus componenta

sarcinii moleculelor încărcate de semn contrar din mediu.
Forţa de frînare (Ff) este dată de frecare şi se poate descrie prin legea
lui Stokes:

Ff= 6·π·η·r·v

unde: η- vîscozitatea substanţei de analizat,

r – raza ionului
deoarece aceste două forţe cea electrică de accelerare şi cea de frînare sînt în
echilibru , raportul lor este proporţional cu viteza de migrare şi cu mobilitatea ,
de unde rezultă următoarea ecuaţie:

µe=z · F/6·π·r

Din relaţia de mai sus se poate concluziona că molecule mici au o viteză de

migrare mai mare decît molecule mari

Clasificarea electroforezei

Electroforeză în mediu liber

- Electroforeză cu gradient de densitate

Electroforeză în mediu stabilizant

 Electroforeza cu hîrtie
 Electroforeză cu gel
 Electroforeză discontinuă
 Electroforeză capilară
 Electroforeză cu gradient
 Electroforeză în cîmp pulsator
 Electroforeză cu focalizare electrică

Electroforeza în mediu liber

Electroforeza în mediu liber reprezintă un procedeu electroforetic fără
fază suport staţionară solidă. Acest tip de electroforeză a fost descrisă pentru
prima dată de către Tiselius în anul 1937. Avantajul constă în simplitatea

34
constructivă a instalaţiei de separare formată dintr-un tub sub formă de “U” în
care se găseşte soluţia de analizat în soluţie de electrolit iar în cele două păhare
de la capătul tubului soluţii tampon şi cei doi electrozi , anodul şi catodul. In
figura este reprezentată schema de principiu a electroforezei cu gradient de
densitate

Fig.II 136, p.132, AI

Fig. schema de principiu a electroforezei cu gradient

de densitate la separarea unui amestec tricomponent A+B+C

După cuplarea curentuluielectric se realizează separarea bspaţiilor A, A+B,

A+B+C, B+C, C de către fronturi. Mobilităţile ionice ale speciilor descresc în
ordinea A> B >C. La analiza unui amestec din specii anionice diferite
compartimentul anodic trebuie să conţină un electrolit care să aibă în
compunere o speciae anionică cu o mobilitate superioară celei corespunzătoare
componentelor. Dezavantajul principal al electroforezei libere este formarea de
miscare termică convectivă, ca urmare a încălzirii inevitabile a electrolitului prin
efect Joule, miscare care poate rupe molecule mari în frecare cu pereţii tubului
în special la electroforeza proteinelor.

Electroforeza în medii stabilizante

Electroforeza cu hîrtie
Prin aplicarea unui curent electric la extremităţile unor fîşii de hîrtie
impregnate cu un electrolit purtător în amestec cu amestecul electrolitic al
substanţelor de analizat are loc separarea substanţelor ce au sarcină electrică
pe bază de migrare capilară a ionilor spre cei doi electrozi de semn contrar, adică
anionii spre anod şi cationii spre catod. Substanţele neutre nu sînt antrenate de
curentul electric dar suferă şi ele deplasări din cauza fluxului de curgere.
Electroforeza clasică cu gel sau cu hîrtie are două dezavantaje majore:

35
 - Interpretarea cantitativă este dificilă. De exemplu proteinele pot fi
examinate numai după colorare şi măsurări de reemisie (vezi şi
electroforeza cu gel), ca atate măsurătorile sînt grevate de erori şi de
timpi mari.
- Evaporarea prin efect Joule a soluţiei din hîrtie poate duce la uscarea lor
şi la întreruperea migrării. Creşterea de căldură depinde pătratic de
tensiunea aplicată pe electrozi din acest motiv tensiuni mici duc la timpi
de analiză foarte mari , astfel pentru separarea electroforetică completă,
în condiţii de tensiune mici, pe un strat de hîrtie de cca 20 cm lungime
se poate ajunge la timpi de ordinul orelor. In figra este redat principul
constructiv al unei celule electroforetice orizontale cu bandă de hîrtie.

Fig.II137

P133

A.I.

Fig. celulă electroforetică orizontală cu bandă de hîrtie

1- vas paralelepipedic, 2-anod, 3- catod, 4-electrolit, 5- hîrtie electroforetică,

6- suport pentru hîrtie, 7- perete separator, 8- sursă de alimentare cu curent continuu

Celula este formată dintr-un vas paralelepipedic (1) ce conţine un compartiment

anodic (a) şi un compartiment catodic (c) în care se găsesc cei doi electrozi
anodul (2) şi catodul (3). Tot în aceste compartimente se toarnă în părţi egale
electrolitul (4). Banda de hîrtie electroforetică (5) umectată uniform cu o soluţie
tampon ţi aşezată pe suportul plan (6) are ambele capete introduse în cele două
comparimente ale celulei electroforetice. Pentru reducerea la minim a efectului
produselor de electroliză care se formează asupra componentelor examinate
(electroliza produselor nu este dorită dar nu poate fi evitată în totalitate) cele
două compartimente, anodic şi catodic, sînt separate fiecare în parte de de către
un perete (7) a cărui parte superioară se situează sub nivelul lichidului din
compartiment , astfel încît să se poată realiza comunicarea între compartimente.
Alimentarea celulei se face de la o sursă de curent continuu de înaltă tensiune
(8). Pentru evitarea evaporării electrolitului celula electroforetică este acoperită
cu un capac de sticlă sau de plastic transparent. Soluţia cu amestecul de

36
analizat se pipetează de obicei în centrul hîrtiei , se acoperă celula ţi se porneşte
sursa de curent. Separarea speciilor ionice în timp pe fîşia de hîrtie este
repreezentată schematic în figura pentru trei specii cationice A,B,C, şi a unei
specii anionice D din electrolitul purtător.

Fig.II.139

Pa. 134

A.I.

Fig. principiul separării electroforetice a speciilor ionice

în timp pentru electroforeza cu hîrtie.
a) situaţia dinaintea electroforezei, b) situaţia după electroforeză

pe fîşia de hîrtie este repreezentată schematic în figura pentru trei specii

cationice A,B,C, şi a unei specii anionice D din electrolitul purtător. După
electroforeză banda de hîrtie este scoasă din celulă, uscată , colorată ţi
măsurată densitometric (vezi şi electroforeza cu gel).

Electroforeza cu gel
Electroforeza cu gel este o metodă analitică a chimiei şi biologiei
moleculare şi serveşte separării moleculelor purtătoare de sarcină electrică din
amestecuri moleculare. Un amestec de molecule migreză sub gradient de cîmp
electric printr-un gel ce se găseşte intr-o soluţie tampon ionică. După dimensiune
şi încărcare moleculele se miscă cu viteze diferite prin sită moleculară formată
de gel. Cel mai rapid se deplasează molecule mici încărcate negativ (anionii)
spre anod urmează moleculele încărcate pozitiv (cationii) care se îndreaptă spe
electrodul negativ catodul. Dezavantajele electroforezei cu gel sînt aceleaşi ca
ale electroforezei cu hîrtie.

37
 La electroforeza cu gel un rol important joacă şi raportul dintre diametrul
particulelor şi dimensiunea porilor gelului folosit ca material suport ce
acţionează ca sită moleculară. O dimensiune de particulă mai mare are
un rol de frînare a vitezei de deplasare mai puternic decît ar fi de asteptat
numai prin acţiunea vîscozităţii gelului. Prin încărcarea ionică diferită
precum şi prin diametrul diferit al particulelor diferitele substanţe se
deplasează cu viteze diferite prin materialul suport formînd benzi vizibile.
Prin aceaste electroforeza se potriveşte foarte bine pentru separarea
amestecurilor de substanţe în special amestecuri moleculare. Ca
material suport pot fi folosite soluţii, geluri ( electroforeză cu gel
( poliacrilamidă, agaroză)) sau materiale solide. O subspecie importantă
a electroforezei cu gel este electroforeza SDS-PAGE (electroforeza
dodecylsulfat de sodiu - poliacrilamidă). Prin adăugare de SDS se
compensează diferenţa de sarcină a ionilor , ei fiind separaţi astfel numai
după diametrul lor. Acelaşi efect se obţine materiale suport speciale a
căror pori se indesesc pornind de la un capăt la celălalt.
Matricea de gel. Componentele gelului , de exemplu agaroză sau acrilamidă
polimerizată, formează o reţea deasă tip sită care frînează diferenţiat, după
mărime, deplasarea moleculelor ce urmează a fi separate. Geluri de agaroză au
porii de dimensiuni relativ mari (150 nm la geluri de 1%, 500 nm la geluri de
0,16% ) şi se folosesc pentru separarea ADN precum şi pentru separarea
proteinelor cu molecule mari. Gelurile de poliacrilamidă au pori sensibili de
dimensiuni sensibil mai mici (3-6 nm), dimensiunea depinzînd de concentraţia
acrilamidei precum şi de gradul de împletire. În funcţie de destinaţie gelului i se
adaugă diferite materiale de adaus, de exemplu SDS la electroforeza cu
poliacrilamidă (SDS-PAGE) sau amfoliţi la electroforeza cu focalizarea
izoelectrică (EF). Gelurile necesare velectroforezelor pot fi preparate în
laborator. De asemenea pot fi procurate comercial geluri gata preparate
împreună cu soluţiile tampon corespunzătoare
Efectuarea electroforezei. Electroforeza clasică cu gel se efectuează ca
electroforeză zonală. O metodă pentru obţinerea unei înalte rezoluţii mai ridicate
este electroforeza discontinuă. La electroforeza cu gel ia naştere căldură care
trebuie îndepărtată pentru asigurarea condiţiilor optime . Din motive de
reproductibilitate a rezultatelor este recomandat ca electroforeza cu gel să se
execută cu aparate cu posibilitate de răcire şi menţinere constantă a
temperaturii. În cazul ideal o electroforeză se consideră încheiată atunci cînd
cele mai mici molecule ( cele mai mobile) au atins capătul plîcii cu gel. În
această situaţie s-a atins capacitatea maximă de separare.
Interpretarea . În vederea interpretării gelurilor după separare se pot
folosi tehnici care marchează substanţa de analizat înainte de separarea
moleculelorsau după separarea lor. Astfel substanţa se poat marca radioaktiv
inainte de separare şi ulterior autoradiografia sau substanţa se poate marca cu
coloranţi după separare (de exemplu cu Etiudibromură) şi analiza pe urmă su
lumină ultravioletă. Molecule identice se deplasează prin gel sub forma unor
zone discrete prin gel denumite uzual , datorită formei lor, benzi. Probe diferite se
pot deplasa paralel , în acelaşi timp, unele faţă de celelalte în acelaşi gel. Dacă

38
mărimea unor molecule este cunoscută atunci prin compararea benzilor
acestora cu benzile moleculelor necunoscute se poate aprecia mărimea
celorlalte molecule. Standarde de greutate moleculară , cu benzi de migraţie
cunoscute, pot fi achiziţionate şi comercial. Determinarea cantităţii de substanţă
dintr-o bandă se face prin colorarea gelului şi ulterior prin măsurare
densitometrică.
Măsurarea densitometrică este o măsurare cantitativă a densităţii de
culoare (D), adică a cantităţii de culoare pe unitatea de suprafaţă. Cu această
ocazie se determină diferite valori de tonalitate însă nu tonalităţi de culoare.
Densitometria se bazează pe liniaritatea dintre cantitatea de culoare şi
densitate optică, principiul de măsurare este: cu cît mai multă culoare există cu
atît mai puţină lumină se reflectă. În practică se foloseşte o sursă de lumină
monocromatică ce trimite radiaţia prin gel spre substrat. Radiaţia trece prin gelul
colorat şi este filtrată corespunzător . Anumite lungimi de undă sînt îndepărtate
complet altora li se reduce intensitatea. Lumina ce ajunge pe substrat ( de regulă
de culoare albă) este reflectată de acesta şi trece din nou prin gelul colorat
putînd fi determinată atît cantiatatea cît şi natura (lungimea de undă) a luminii pe
cale fotoelectrică şi cu ajutorul unui monocromator. Valoarea coeficientului de
reemisie (R) se determină prin relaţia :

Electroforeza discontinuă cu gel

Elecroforeza discontinuă cu gel reclamă o rezoluţie mare a benzii

electroforetice . Discontinuitatea rezultă din pH-ul diferit între soluţiile tampon
(atît a soluţiei tampon a gelului cît şi a soluţiei tampon a electrozilor) precum şi
asupra dimensiunii diferite a porilor gelului de separare şi a gelului de
colectare. Gelul de colectare cu pori mari are o valoare a pH-ului de 6,8
iar gelul de separare o valoare a pH-ului de 8,8. Din cauza matricei mari
în gelul de colectare în prima fază mobilitatea proteinelor este
dependentă numai de sarcina electrică . În zona de graniţă spre gelul cu
pori mici proteinele suferă o rezistenţă mare la frecare rezultînd o barieră
care duce la o ascuţire zonală a separării . În acesată zonă mobilitatea
este dependentă atăt de sarcină cî şi de mărimea moleculei. Prin
valoarea mai ridicată a pH-ului moleculele dobîndesc şi o încărcare
electrică mai mare. Pentru evitarea difuzării moleculelor gelului de
colectare cu cele ale gelului de separare este recomandat ca cele două
geluri să se toarne unul asupra celuilalt scurt înainte de electroforeză.
Efectul conjugat pozitiv al acestui procedeu electroforetic este acela că
se obţiene o rezoluţie la separare mai bună faţă de electroforeza clasică
cu gel.

Electroforeza cu gradient de densitate

39
 Electroforeza cu gradient de densitate, este tot un procedeu de
electroforeză liberă la care nu se foloseşte o fază suport staţionară solidă. La
electroforeza cu gradient de densitate este evitată convecţia termică prin
intermediul unui gradient de densitate creat artificial. Prin aceasta electroforeza
devine una deosebit de menajantă făcînd posibilă separare unor proteine cu
masă moleculară foarte mare întrucît moleculele nu sînt forţate să intre în
interacţiune cu o fază solidă staţionară păstrăndu-şi integritatea. La electroforeza
de gradient de densitate, în comparaţie cu electroforeza cu gel , molecule mari
nu migrează mai încet deoarece nu este prezentă o sită moleculară. Un alt
avantaj faţă de electroforeza cu gel este acela că la acest tip de electroforeză
este acela că la sfîrşitul procesului de separaţie proteinele se găsesc deja în
stare solvită. Dezavantajul acestui tip de electroforeză în comparaţie cu alte
procedee constă în durata mai mare a electroforezei şi rezoluţia mai slabă la
separare. O rezoluţie mai bună se poate obţine atunci cînd în loc să se introducă
substanţa de analizat la fundul tubului sub formă de “U” aceasta se introduce în
cantitate redusă în imediata vecinătate a părţii de sus a tubului sub un gradient
de densitate. Pentru creşterea densităţii în vederea creerii gradientului de
densitate intră în discuţie saharoza, glicerina, apa grea. Zaharoza şi glicerina mai
au avantajul de a avea o acţiune stabilizantă asupra proteinelor. Ele se folosesc
în concentraţii cuprinse intre 2-70%. La concentraţii mai mari este afectată prea
puternic conductivitatea. În curbura de jos a tubului sub formă de “U” se
introduce o “ pernă de densitate” prin folosirea concentraţiei celei mai ridicate .
Concentaţiile de electrolit folosite trebuie să se situeze între 0,02 und 0,05 M , la
concentraţii mai mari apare o conductivitate prea ridicată“U”. La rîndul ei
creşterea încălzirii, prin convecţia ce o însoţeşte, duce la distrugerea
gradientului de concentraţie. Pentru evitarea acestui fenomen nedorit se
realizează termostatarea tubului . Termometrul de control al temperaturii este
situat în punctul cel mai scăzut al tubului “U”. În acest loc diferenţa de
temperatură între “ pernă de densitate” şi temperatura apei din cămaşa de răcire
nu trebuie să depăşescă două grade Celsius. Spre deosebire de substanţele
formatoare de gradient de densitate , concentraţia electrolitului în întregul sistem
este constantă.
Ca electroliţi deosebit de favorabile sînt soluţii tampon formate din săruri
rezultate din baze slabe cu acizi slabi deorece prin descompunere la cei doi
electrozi ei nu provoacă valori de pH extreme. Electrozii folosiţi sînt din platină
sau grafit. Prin alegerea valorii pH - ului soluţiei tampon şi prin poziţia
electrodului negativ şi pozitiv se poate influenţa dupădorinţă viteza de migrare a
proteinelor. Suplimentar, prin folosirea de substanţe ce măresc gradientul de
densitate, este posibil să se introducă amestecul de proteine cercetat în locul
gradientului de densitate dorit.

Electroforeză Capilară

40
 Electroforeza capilară este o technică de separare a sustanţelor lichide
sub gradient de cîmp electric , amestecul sustanţelor de analizat deplasîndu-se
într-un tub capilar a cărui capete sînt scufundate în două cuve în care se
găseşte electrolitul purtător precum şi cei doi electrozi , anodul şi catodul.
Principial tehnica electroforezei capilare se deosebeşte de cromatografia de
lichide HPLC şi de cromatografia de gaze numai prin faptul că la ultimele două
deplasarea amestecului de substanţe prin tuburile capilare se realizează sub
gradient de presiune, iar la prima prin gradient de potenţial electric.
Primele cercetări în vederea introducerii electroforezei capilare ca
tehnică avansată de separare s-au făcut în scopul înlăturării a două
dezavantaje majore a electroforezei cu gel şi cu hîrtie şi anume calitatea redusă
a detecţiei şi încălzirea probei prin efect Joule ca urmare a trecerii curentului
electric prin ea. Adevăratul succes l-a cunoscut electroforeza capilară însă numai
atunci cînd s-a trecut la capilare cu diametre interioare cuprinse între 50 şi 200
µm cu o eficienţă a separării foarte mare. La ora actuală electroforeza capilară a
evoluat foarte mult, ea fiind rapidă , de înaltă rezoluţie, uşor adaptabilă condiţiilor
concrete de separare şi complet automatizabilă.
Deoarece încărcarea electrică la suprafaţa peretelui interior al capilarei este
puternic dependentă de pH, fluxul electroforetic se schimbă cu valoarea pH-
ului. La valoare redusă a pH-ului el scade iar la valoare ridicată devine mai
mare. Intensitatea fluxului este dependent şi de temperatură şi de concentraţia
electrolitului. Dacă creşte concentraţia electrolitului scade intensitatea fluxului
electroforetic şi invers. Şi prin adăusul de solvenţi organici precum metanol,
intensitatea fluxului electroforetic scade. La HPLC prin presiunea aplicată apare
un profil de curgere hidrodinamică sau un profil laminar destul de pronunţat.
Profilul de curgere ce rezultă în schimb în urma fluxului electroforetic este
destul de plat. Acest lucru are avantajul unei lăţiri mici a benzi şi prin aceasta
determină o rezoluţie mai ridicată a Peak-ului.

Aparatura folosită la electroforeza capilară. Aparatul de electroforeză

capilară este relativ simplu. Elementul principal îl constituie o capilară de silice
(capilară fused – silica) cu diametru de 50- 250 µm şi lungimea de 30 şi 100 cm,
protejată pentru mărirea rezistenţei mecanice de un inveliş subţire poliamidic,
scufundată cu ambele capete în două vase umplute cu electrolit purtător.
Capilară la rîndul ei este umplută cu faza mobilă constituită din electrolit purtător
şi din amestecul electrolitic al sustanţelor de analizat . Pentru umplerea capilarei
se introduce un capăt al capilarei într-un vas ce conţie electriolit purtător în care
se găseste solvit amestecul de substanţe de analizat şi prin technici de presiune
sau de vacuum se umple capilara ale cărei capete se introduc ulterior în cuvele
ce conţin numai electrolit purtător precum şi pe cei doi electrozi, anodul şi
catodul. Celor doi electrozi din cuve li se pot aplica tensiuni continue de pînă la
30 kV în vederea creerii gradientului de potenţial sub acţiunea căruia migrează
atît speciile cercetate cît şi ionii electrolitului purtător . În figura este prezentată
schema de principiu a electroforezei capilare

41
 Fig. Schema de principiu a electroforezei capilare

în urma separării componentelor se obţine o cromatogramă care ereprezintă o

distribuţie în timp a picurilor ce apar atunci cînd un anumit component trece prin
drepul fotobarierei ( analiza calitativă parţială). Înălţimea picurilor, mai precis
suprafaţa de sub Peak-uri este proporţională cu concentraţia componentului din
electrolit (analiză cantitativă)
Prin folosirea de capilare de cuarţ este posibilă detecţia fotometrică în
domeniul ultraviolet. În acest caz în dreptul ferestrei de detecţie trebuie înlăturat
învelişul poliamidic deorece frînează trecerea radiaţiei ultraviolete. Pe lîngă
detectoarele de ultraviolete pot fi folosite şi alte detectoare precum cele de:
fluorescenţă, conductivitate, electrochimice, radioactive. Alte posibilităţi de
detecţie sînt legate de combinaţia electroforezei capilare (EC) cu un
spectrometru de masă (MS).

Tehnici folosite în electroforeza capilară. În electroforeza capilară sînt

folosite diferite tehnici precum:
- Electroforeza capilară zonală. – Aplicarea probei se face pe o bandă
subţire. După aplicarea cîmpului electric fiecare componentă se mişcă pe
baza mobilităţii ei , astfel încît în caz ideal se formează o zonă curată cu o
singură componentă . separarea are loc pe baza sarcinii şi a mobilităţii.
- Electroforezei micelară electrocinetică. La În electroforeza capilară
moleculele neutre, cu toată că nu sînt purtătoare de sarcină electrică, sînt
antrenate şi ele spre catod datorită fluxului electroosmotic dar nu sînt
separate între ele pe componente. Prin introducerii electroforezei micelare
electrocinetice pot fi separate şi molecule neutre. În cazul acestei
cromatografii miceliile sînt transformate cu ajutorul unor detergenţi în
electroliţi, după care în mod clasic are loc separarea moleculelor neutre
între micelii.
- Electroforeza capilară cu gel foloseşte o capilară umplută cu gel polimeric
, de ex. Poliacrilamidă. La acest tip de electroforeză în scopul unei
separaări şi mai avansate se foloseşte pe lîngă efectul electroosmotic şi

42
 efectul de sită moleculară capilară formată prin prezenţa gelului în
capilară.
- La electroforeză cu focalizare izoelectrică componente amfotere ale
probei se separă de-a lungul unui gradient de pH. Se ajunge la o separare
, aşa de exemplu aminoacizii se deplaseză sub formă de legături
amfoterice numai pînă cînd este atins punctul lor izoelectric, deci punctul
în care ele se manifestă spre exterior neutru.
- Electroforeza izotachică (ITP) foloseşte un sistem tampon discontinuu
format din electrolitul de conducţie şi electrolitul final. Dat fiind faptul că
mobilitatea electrolitului conducător (cea mai înaltă mobilitate) şi
mobilitatea electrolitului final ( cea mai scăzută mobilitate) la aplicarea
unui curent constant şi respectarea legii lui Ohm se formează un gradient
de potenţial care duce la separare avansată.

43