BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE

A SUBSTANŢELOR BIOLOGIC
ACTIVE
METABOLIȚI SECUNDARI

BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE
A ANTIBIOTICELOR
Metaboliţi secundari microbieni:

Antibiotice
Alcaloizi
Hormoni de creştere (giberiline)
Toxine

Microorganismele produc metaboliţii secundari pe

parcursul unei faze de sinteză (idiofaza) când
creşterea este încetinită, procesele celulare
limitându-se la sinteza idiolitului.
 BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE
A ANTIBIOTICELOR

Termenul a fost introdus de

Waksman în 1942 pentru a
defini “substanţe chimice
produse de microorganisme
care au proprietatea de a inhiba
dezvoltarea sau distrugerea
bacteriilor sau a altor
microorganisme, în soluţii
diluate in vitro sau in vivo”.

Reprezintă probabil cele mai importante

produse comerciale obţinute prin biosinteză.
Importanţa antibioticelor a
crescut după producerea
pe scară industrială a
penicilinei în 1943, motivul
fiind iniţial dictat de motive
militare.

În 1946 se
produce la
scară
industrială
streptomicina.
 Antibiotice produse
Antibioticele industrial
folosite ca agenţi Antibioticul Microorganismul producător Tipul de
în combaterea microorganism
Bacitracină Bacterii sporulate
maladiilor Cefalosporină
Bacillus licheniformis
Cephalosporium sp. Fungi
infecţioase au Cloramfenicol Sinteză chimică (obţinut la Actinomicete
început cu Streptomyces
produs un impact venezuelae)
deosebit asupra Cicloheximidă Streptomyces griseus Actinomicete
Cicloserină Actinomicete
practicii Eritromicină
S.orchidaceus
S.erythreus Actinomicete
medicale, Griseofulvină Penicillium griseofulvina Fungi

neputând fi Kanamicină S. kanamyceticus O

Actinomicete
comparate cu nici Lincomicină S. lincolnensis Actinomicete

un alt produs Neomicină S.fradiae Actinomicete

Nistatină Actinomicete
terapeutic
S. noursei
Penicilină Penicillium chrysogenwn Fungi
existent până în Polimixină B Bacillus polymyxa Bacterii sporulate

prezent. Streptomicină S. griseus Actinomicete

Tetraciclină S. rimosus Actinomicete
 Calităţile unui antibiotic

Acţiune asupra unui număr cât mai mare de

microorganisme
Absenţa toxicităţii
Solubilitate în apă la un pH convenabil
Stabilitate
Bună toleranţă
Absenţa compuşilor histaminei
Absenţa efectelor secundare asupra ţesuturilor,
serului, hematiilor şi leucocitelor
Din numărul total de antibiotice naturale şi substanţe
asemănătoare 98% sunt produse de microorganisme
şi numai 2% sunt produse de animale: protozoare,
moluşte, insecte sau forme superioare ale
organismelor animale.

Dintre microorganisme, cei mai activi producători sunt

bacteriile – actinomicetele (Streptomyces sp.) şi
micromicetele (Penicillium sp.).
Antibioticele pot fi clasificate după structura
lor chimică şi proprietăţile antibacteriene în
familii.

Antibiotice ce conțin glucide

Aminoglicozide: Streptomicina
N-Glicozide: Streptotricina

C-Glicozide: Vancomicina

Glicolipide: Moenomicina
 Lactone macrociclice

Macrolide: Eritromicina
Poliene: Candicidina

Quinone
Tetracicline: Tetraciclină

Antracicline: Adriamicin

Naftochinone: Actinorhodin
Benzochinone: Mitomicin
 Aminoacizi şi peptide
Derivaţi de aminoacizi: Cicloserine

Antibiotice β-lactam: Penicilinele

Peptide: Bacitracina
Cromopeptide: Actinomicina
Peptide chelatate: Bleomicina

Antibiotice heterociclice conţinând azot

Antibiotice nucleosidice: Polyoxine
 Antibiotice care conţin oxigen
Antibiotice polieter: Monensin

Derivaţi alifatici

Derivaţi cicloalcanici: Cicloheximida

Antibiotice steroidice: Cicloheximida
 Antibiotice aromatice
Derivaţi benzenici:
Cloramfenicolul
Derivaţi cu nucleu aromatic
condensat: Griseofulvina
Eteri aromatici: Novobiocina

Quinolone
4-Quinolona: Acid nalidixic
Fluoro 4-quinolona: Norfloxacina
Clasificarea după biogeneză permite explicarea
mai uşoară a mecanismului biochimic de formare
a antibioticelor:

antibiotice derivate din aminoacizi:

cloramfenicol, penicilină, bacitracine,
actinomicine;

antibiotice derivate total sau parţial din glucide

simple: streptomicină, kanamicină, neomicină;

antibiotice diverse: novobiocină, vancomicină.

 Antibiotice cu nucleu ß - lactam

Cele mai importante antibiotice din punct de

vedere istoric şi medical sunt antibioticele cu
nucleu ß-lactam: penicilinele, cefalosporinele
şi cefamicinele.

Se numesc antibiotice β-lactam deoarece

conţin în structura lor un nucleu β-lactam.
 Tipuri de peniciline

Primul antibiotic descoperit a fost penicilina G

activă faţă de bacteriile Gram +, nu și față de cele
Gram -.

În structura de bază a penicilinelor intră acidul 6 -

aminopenicilanic (A-6-AP) care este format dintr-
un inel tiazolidinic, condensat cu un inel β - lactam.
La acidul 6 - aminopenicilanic se ataşează diferite
catene laterale în poziţia 6.

Penicilinele naturale se formează în fermentaţii fără

adaos de precursor.

Fermentaţiile pot fi controlate riguros numai prin

adăugarea în mediu a catenei laterale ca precursor,
pentru a produce penicilina dorită.

Pe această cale au fost obţinute peste 100 de

peniciline de biosinteză din care numai penicilinele G
şi V sunt obţinute în scopuri comerciale.
Pentru producerea industrială a unor peniciline active
faţă de bacteriile Gram - s-a folosit o combinaţie dintre
procesul fermentativ şi chimic care a condus la
obţinerea de peniciline de semisinteză.

Materialul de pornire este penicilina G, care serveşte

ca sursă de A6AP.

Penicilina G este scindată chimic sau enzimatic

(folosind penicilinacilaza), iar A6AP obţinut este
condensat chimic la o altă catenă laterală.

Penicilinele de semisinteză au îmbunătăţit semnificativ

proprietăţile terapeutice ale acestora.
 Producţia antibioticelor cu structură
lactam

Producerea penicilinei este un proces puternic

aerob, fiind necesară o aeraţie eficientă.

Penicilina este un metabolit secundar tipic, în

timpul fazei de creştere producându-se
cantităţi foarte mici de penicilină.
Odată cu epuizarea sursei de carbon începe faza
de producere a penicilinei, care poate fi extinsă
până la câteva zile, prin adaos de diferite
componente din mediul de cultură.

Sursa de carbon este lactoza - viteză de consum

mai mică în comparaţie cu cea a glucozei şi nu
induce represie catabolică.

Sursă de azot şi factori de creştere - extractul de

porumb care permite randamente ridicate de
obținere pentru majoritatea penicilinelor.
Se poate folosi şi glucoza ca sursă de carbon,
dar în acest caz fermentaţia va fi alimentată cu
glucoză treptat, pentru a evita represia
catabolică.

Catena laterală a penicilinei G este radicalul

fenil → se adaugă în mediu în mod continuu
acid fenoxiacetic ca precursor.

Dacă se urmăreşte obţinerea altor peniciline în

mediu, se va adăuga ca precursor un alt tip de
catenă laterală acilată.
Penicilina va fi excretată în mediu, 1% din
aceasta rămânând ataşată de filamentele
fungice.

După înlăturarea miceliului prin filtrare, filtratul

va fi acidulat, iar antibioticul va fi extras cu
acetat de amil sau acetat de butil.

În primii ani de producţie preţul penicilinei era

foarte crescut, dar în prezent se spune că
“preţul penicilinei este dat de ambalaj şi nu de
conţinutul flaconului”.
Tehnologia obţinerii penicilinelor
presupune:

pregătirea mediilor şi sterilizarea lor;

fermentaţia propriu-zisă;

filtrarea soluţiilor native;

separarea şi purificarea penicilinelor.

 Pregătirea mediilor și sterilizarea

Constă în dizolvarea în apă a componentelor

mediilor conform reţetei pentru fiecare fază a
procesului de fermentaţie.

Pregătirea mediilor şi sterilizarea lor pentru

inocul (i) şi intermediar (I) se poate realiza
direct în fermentatoarele respective.
 Compoziţia Inoculator (i) Intermediar (I) Regim (R)

Extract de porumb 2 2-3 2,5 - 2,8

Lactoză 0,5 - 0,6 3 - 3,5 6-7
Glucoză 2-3
3 - 3 ,5 1,2
Făină de soia 0,3

CaCO3 0,7 - 0,8 0,7 1,2 - 1,3

KH2PO4 0,7 0,2 - 0,3 0,5 - 0,6
NH4NO3 0,12 0,3
Na2SO4
0,06 0,06
ZnSO4 0,002

MnSO4
0,002
Fenilacetat amidă 0,7
0,2

Tiosulfat de Na
0,016 0,8
Apă Adaos până la 100 ml
Pregătirea mediilor pentru bioreactorul de regim
are loc într-un aparat prevăzut cu un agitator,
conductă pentru abur viu necesar încălzirii şi
serpentină de răcire.

În aparat se introduce apa conform reţetei, se

încălzeşte la 60 - 70°C, se adaugă extractul de
porumb şi se fierbe timp de 0,5 - 1 ore.

Soluţia se răceşte la 60 - 70°C, iar restul

componentelor se adaugă în următoarea ordine:
carbonat de calciu, azotat de amoniu, sulfaţi,
fosfat, lactoză, glucoză.
Sterilizarea mediului se realizează pe coloană
şi în menţinător, prin încălzire cu abur direct la
124 - 126°C şi menţinere la această
temperatură 10 - 20 min, după care urmează
răcirea la 60 - 65°C şi trimiterea acestuia în
bioreactorul de regim, unde se continuă răcirea
până la temperatura de 27°C - temperatură
optimă pentru biosinteză.
 Fermentaţia

Se realizează în 3 trepte:

1. inoculator - se produce aclimatizarea

microorganismelor la noile condiţii de dezvoltare.

2. intermediar - începe creşterea exponenţială

3. regim - se continuă creşterea

microorganismelor şi se elaborează penicilina
Eficienţa procesului de biosinteză este determinată
de caracteristicile microorganismului producător.

Tulpina utilizată Penicillium chrysogenum, a cărui

capacitate productivă a fost ridicată foarte mult prin
procese de mutaţie, se caracterizează prin:

rată mare de multiplicare;

utilizarea rapidă a azotului şi a precursorului;
lipsa pigmenţilor în biomasă;
miceliu fibros.
 Procesul de fermentaţie cuprinde 3 faze
metabolice distincte:

1. faza de creştere a microorganismului;

2. faza de producere a antibioticului;

3. faza autolitică a microorganismului.

 1. Faza de creştere a microorganismului

Se caracterizează prin acumulare de biomasă

miceliană şi utilizarea intensivă a componentelor
mediilor de cultură.

Glucoza este asimilată rapid pentru formarea

materialului celular şi pentru furnizarea energiei
necesare bioprocesului.

Necesarul de oxigen este maxim, iar activitatea

respiratorie, caracterizată prin degajarea de
dioxid de carbon este ridicată.
 2. Faza de producere a penicilinelor

Se caracterizează prin încetinirea creşterii

miceliului, scăderea consumului de oxigen,
menţinerea pH-ului la valoarea de 6,8 - 7,5 şi
acumularea penicilinei.

în această fază lactoza este folosită lent de

către miceliu şi furnizează energia necesară
proceselor de biosinteză sau pentru formarea
constituenţilor celulari.
 3. Faza autolitică

Microorganismul se epuizează datorită activităţii

metabolice prelungite, iar sursele de carbon sunt
consumate.

Scade conţinutul în N al mediului, începe procesul de

autoliză cu eliberare de amoniac şi creşte pH-ul (>8).

Încetează producerea de peniciline şi apare procesul

de hidroliză alcalină a penicilinelor formate.

Această fază nu este permisă la nivel industrial.

Cantitatea de peniciline formate este rezultatul
îmbinării următorilor factori:

potenţialul productiv al tulpinii;

folosirea unor constituenţi adecvaţi în mediu şi

un echilibru corect în proporţiile acestora;

menţinerea pH-ului optim;

un raport corect între diferitele surse de carbon;

adăugarea de precursori care vor decide natura
catenei laterale şi tipul de penicilină produsă;

asigurarea necesităţilor în substanţe minerale;

menţinerea temperaturii optime.

Pentru faza de creştere a biomasei, pH-ul optim
este de 4,5 - 5,0, iar pentru biosinteză este de
7,0 - 7,5.

Peste pH - 7,5 începe procesul de autoliză

însoţit de degradarea penicilinei.

Temperatura optimă este de 25°C.

Aerul necesar este de 1-1,5 1 mediu /min.

Biosinteza unei molecule atât de complexe ca
penicilina necesită un flux de energie exterior,
→ biosinteza se poate realiza numai dacă se
desfăşoară simultan şi procese de oxidare ale
glucidelor, care constituie sursa principală de
energie.

glucoza → acid lactic → lactoză

În faza de creştere a microorganismelor se

consumă glucoza, iar în faza de producere a
penicilinei se consumă lactoza.
Sursele de azot sunt necesare pentru formarea
grupărilor aminice şi pentru obţinerea
aminoacizilor.

Se utilizează azot mineral din săruri de amoniu şi

azot organic furnizat de aminoacizi şi peptide din
extractul de porumb.

Substanţele minerale sunt vitale afectând

permeabilitatea membranei celulare, echilibrul
ionic și activează sistemele enzimatice sau intră
în structura sistemelor enzimatice.
Controlul fermentaţiei se realizează prin
determinarea:

sterilităţii mediului;

gradului de dezvoltare morfologică a producătorului;

pH-ului mediului;

concentraţiei de penicilină din mediul de cultură;

consumului de glucide.
 Obţinerea de substanţe
antifungice
Substanţe antibiotice, cu acţiune asupra fungilor.

Deşi numărul de fungi patogeni este în continuă

creştere, substanţele antifungice sunt relativ
limitate.

Caracteristic pentru molecula lor este prezenţa

unui anumit număr de duble legături.
 Microorganisme producătoare de
substanţe antifungice

Actinomicete:

- Streptomyces noursei - nistatina

- Streptomyces griseus -
ciclohexamidele

Micromicete:
- Penicillium griseofulvum – griseofulvina