INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURI

VEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a biotehnologiei

în viaţa omului, în toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au
făcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu însuşiri
favorabile şi cu randamente sporite faţă de materialul de la care s-a plecat.
Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumătate de secol s-a făcut, în principal,
pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organisme
unicelulare. Odată cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunile
acumulate anterior erau valabile şi dacă existau şi alte procese specifice modului complex de
organizare. Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să se
gândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar celule. Problema
care a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de la prelevarea de pe planta
mamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe până la regenerarea
(refacerea) unei noi plante.
Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar
mult timp şi multe cercetări, la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat.
În 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizează
substanţele ce determină formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primele
încercări de culturi de ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire, fără
rezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să apară din anul
1922, când Knudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in vitro iar Robbins obţine
prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale.
Pe baza conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţine
informaţia genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, în
anul 1952 Morel şi Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe medii
aseptice a explantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in vitro a acestora
plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze.
În acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritm
imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitându-
se şi degenerarea soiurilor din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.
În anul 1962, după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit să
elaboreze un mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate fi
utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi.
Reuşita experienţelor lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor din
mezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producerea
de hibrizi somatici.
Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a cercetărilor privind cultura
de explante vegetale in vitro. Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea de
tehnici eficiente în generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul
protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmiţători
de gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi:
pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.
Atât pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt
folosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea
speciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru realizarea de noi genotipuri sau
mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetică.
 CAPITOLUL I

1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI

APLICABILITATE

1.1.1 Definiţie

În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în

condiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de
organe, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este
vizibilă în momentul în care explantul creşte.
Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se
desprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu
artificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit.
Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin
stimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma
calus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor.
Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a
plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante
identice cu planta donor.
Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a
forma o plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în
practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită
pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de
specializare al acelor celule.
Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care
constituie ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care
lipseşte citoplasma şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul
că întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.
La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd
capacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care
activitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi
celule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă
mică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu
denumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime
a plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.

1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro

Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni

mari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de
ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii
normale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi
sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate
următoarele condiţii:
-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului,
prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor;
-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele
optime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul
urmărit;
-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea
corespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere;
-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia
materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor
operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro

Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt
utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară,
etc. În agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt
folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea
speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi
secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind
de la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, prin
care în circa 6 luni se pot obţine 1 milion de plante;
-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros,
precoce şi productiv;
-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe
verticală pe 3-5 nivele suprapuse;
-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturi
generative (cu n cromozomi);
-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care
în condiţii normale sunt imposibil de obţinut;
-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;
-se evită efectul sezonier de pepinieră;
-se pot obţine seminţe artificiale;
-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;
-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale
de cultură;
-asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi
ferme de multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care,
deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.
Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în
masă a plantelor, cum ar fi:
-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile
activităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de
producţie;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund
la metodele cunoscute de multiplicare;
-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii
soiurilor;
 -riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care
se comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele
specii.

1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL

EXPLANTELOR CULTIVATE IN VITRO

Explantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică, se vor
integra noilor condiţii de viaţă, îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un
nou ciclu de viaţă. În dependenţă de mediul de cultură, de natura inoculilor, de seria de
operaţiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculări, de condiţiile de cultură şi de scopul
urmărit, după dediferenţierea celulelor şi regenerarea de noi celule, evoluţia acestora poate fi
dirijată. Inoculii pot fi menţinuţi într-o stare primară de organizare cum ar fi: culturi de celule
în suspensie (fără a intervenii formarea de agregate celulare) sau de calus, ori pot fi induse
procese de citodiferenţiere, de morfogeneză sau organogeneză.

1.2.1 Diferenţierea

Celulele meristematice, divizându-se continuu, dau naştere la noi şi noi celule care,
treptat, cresc şi suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere.
În procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip
embrionar specifice celulelor meristematice, evoluându-se spre calităţi proprii specializării
funcţionale a diferitelor tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor
intra. În primele faze de diferenţiere se remarcă o modificare ultrastructurală şi funcţională a
celulelor, fenomen denumit citodiferenţiere.
Pe măsura diferenţierii, volumul celulei creşte, scade raportul nucleoplasmatic,
citoplasma devine peliculară şi parietală, se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi
nucleul la periferia celulei.
Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, în funcţie de
rolul îndeplinit de celule.
Odată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări
secundare de genul depunerilor de celuloză, lignină, mineralizare, gelificare sau chiar
lichefiere, care conduc treptat la o îngreunare a comunicării intercelulare, intervenind cu
timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim).
Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Celulele care compun un ţesut sau organ
nu posedă acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal.
Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate exercitând un
anumit rol în dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie, şi care stă la baza interrelaţiilor
dintre ţesuturi, ce servesc la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale, respectiv la
organogeneză.
După diferenţiere şi generarea de noi celule se ajunge la situaţia în care celulele
neoformate tind să se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere,
histodiferenţiere, cu organizarea de ţesuturi (histogeneză), de organe (organogeneză) şi în
final regenerarea unei noi plante. Diferenţierea celulară in vitro nu este foarte variată, unele
funcţii sunt reduse sau simplificate în timp ce altele sunt amplificate.

1.2.2 Dediferenţierea celulară

Dediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă

specializată în celulă meristematică, recâştigând aptitudinea de a se divide.
 Dediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau
în cazul traumatizării organelor şi al generării, la locul rănirii, de calus. Procesul de
dediferenţiere este complex şi se instalează în momentul în care celulele primesc un impuls
inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declanşează transformări la nivel molecular.
În cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază, puţine celule devin centrii
generatori de noi şi noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de
restituţie. În caz de traumatism organele din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor
substanţe cu rol esenţial în inducerea şi stimularea proceselor de dediferenţiere.
Deci, fitohormonii, condiţiile de cultură, natura ţesuturilor implicate, starea lor
fiziologică şi vârsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de
regenerare.
Aptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul
plantelor şi chiar şi în cadrul subunităţilor structurale, morfofuncţionale, care alcătuiesc un
organism, existând diferenţe mari în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia, la celule
aparţinând aceluiaşi organ sau chiar ţesut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea să-şi reorganizeze un
mod de viaţă, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi
funcţional în celule meristematice, apte de multiplicare.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte
inegal răspândită la specii, organe şi ţesuturi variate.
Fazele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel:
1.prima faza de dediferenţiere:
-amorsarea proceselor de dediferenţiere;
-producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice
specifice unui ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect
şi structură cu cambiul.
2.a doua fază de dediferenţiere:
- dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de
meristem primar;
-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante;
-generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate, a unui calus neorganizat,
structurat omogen. La nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri
embriogeni.

1.2.3 Regenerarea

Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost
distrusă. Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, ţesuturilor sau celulelor
vegetale se exploatează la maxim capacitatea regenerativă a celulelor explantelor, respectiv se
pune în valoare manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare. Teoretic, toate celulele vii
ale plantelor sunt totipotente. Din celule somatice sau obţinut plante diploide, iar din celule
generative, prin androgeneză şi ginogeneză, sau regenerat plante haploide.
Ca şi în cazul dediferenţierii celulare, se poate spune că şi în regenerare există o mare
variabilitate în ceea ce priveşte reactivitatea celulară, capacitatea regenerativă este manifestată
sau nu de către o celulă vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori
endogeni şi exogeni. Factorii endogeni ce joacă un rol esenţial în regenerare sunt: vârsta
celulelor, gradul de diferenţiere, capacitatea de a se dediferenţia, conţinutul în hormoni, natura
balanţei hormonale şi echipamentul enzimatic. Factorii exogeni implicaţi în regenerare
sunt:traumele şi natura acestora (stresul datorat introducerii unui explant în cultura in vitro),
precum şi condiţiile de mediu.
Totipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar exprimarea sa aparţine
numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente
morfogenetic în a răspunde la variaţi stimuli şi care, în condiţii specifice, pot da naştere la
tulpini, rădăcini sau embrioni.
Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul
organogen sau embriogen se află sub controlul mai multor factori.
Specia. Există specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii
care regenerează prin embriogeneză, dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni
in vitro.
Genotipul. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au
potenţial regenerativ. Astfel, s-au evidenţiat genotipuri „culturabile”, ce au permis o
regenerare uşoară din orice tip de ţesut, dar şi genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui
protocol de regenerare s-a făcut cu mare dificultate şi cu rezultate slabe.
Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează
calus regenerativ. La altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea
anumitor explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte
tinere şi microsporii generează calusuri regenerative.
Vârsta explantelor. Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine
decât cele provenite din explante mature. În embriogeneza somatică directă, exprimarea
totipotenţei depinde de stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurgă
embriogeneza directă celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei şi
sinergidele.
Alţi factori care influenţează regenerarea sunt: starea fiziologică a plantei donor,
compoziţia mediului de cultură, vârsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea şi
calitatea luminii, stresul (biotic sau abiotic).

1.2.4 Morfogeneza in vitro

Întrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare, specifice acestui

tip de cultură, vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest context, vom
descrie procesele de morfogeneză sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv
organogeneza şi embriogeneza.
Bibliografia existentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice
de natura explantelor; pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază
relaţia care există între genotip şi competenţa morfogenetică a explantelor cultivate in vitro.
Vasil (1984) a considerat ca factor decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice, starea
fiziologică şi de dezvoltare a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei
donatoare condiţionează regenerarea şi reacţia explantului , altfel spus un răspuns
morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci când explantul a prezentat un anumit
stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai avansate în dezvoltare, faţă
de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.
Morfogeneza la culturile in vitro este influenţată, în mare măsură de anumiţi factori:
-conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul exogen de regulatori de creştere;
-sărurile minerale prezente în mediul de cultură (mai ales natura sursei de azot);
-natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură;
-prezenţa în substrat a unor compuşi organici, în special al unor aminoacizi;
-prezenţa, natura şi concentraţia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate în mediu sau
existente în atmosfera din recipientele de cultură;
 -prezenţa în substrat a unor extracte complexe, de origine biologică, sau a cărbunelui
activ;
-factorii fizici (lumina, temperatura).
Deci lumina, temperatura, potenţialul osmotic al mediului, starea fizică a acestuia,
tipul vaselor de cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza.
Nu se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură, de substanţele
introduse iniţial în mediul de cultură sau de către complexul ionic, format în substrat, ca o
consecinţă a autoclavării, sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului,
sub acţiunea inoculilor, afectează morfogeneza.

1.2.4.1 Organogeneza in vitro

Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o
serie întreagă de fenomene biologice, aflate în antecedenţa momentului explantării ţesuturilor.
Până în momentul explantării ţesuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, împreună cu
sistemul cărora le aparţineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte în care diferitele cerinţe
fiziologice au fost satisfăcute, mai mult sau mai puţin. Dintre aceste cerinţe amintim raportul
endogen în fitohormoni şi conţinutul endocelular în nutrienţi, ambele fiind dependente de
iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu săruri minerale.
De modul în care au fost asigurate aceste cerinţe, prealabile explantării, vor depinde, în mare
măsură, reacţia explantelor, capacitatea regenerativă şi mai ales organogeneza la nivelul
inoculilor, derivaţi din acestea. Aspectele menţionate au fost foarte clar relevate, mai ales în
cazul studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a tulpinilor recalcitrante în a
genera rădăcini adventive. De exemplu, pentru inducerea înrădăcinării tulpinilor de Sequoia
sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă durată, a lor
cu soluţie nutritivă, conţinând 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpină nu a înrădăcinat
dacă tulpinile au fost păstrate, pe o durată lungă de timp, în acest mediu; rădăciniţe s-au
diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi reinoculate pe un
alt mediu, lipsit de auxină (Teixeira, 1981).
Din cele prezentate, s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în
obţinerea unei anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare
ale inoculilor, alegerea explantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in
vitro, în procesele de morfogeneză.

A.Rizogeneza in vitro

Un anumit fragment explantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş. El diferă de

un butaş normal, întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene, are muguri şi eventual
frunze. Mugurii şi frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să
sintetizeze anumiţi compuşi hormonali.
Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale, nu mai
beneficiază de susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în
totalitate dependent de mediul de cultură. În acest caz factorul genetic, mărimea explantului
vârsta plantei mamă, starea fiziologică a celulelor pe care le deţine, sunt tot atâţia factori care
concură la evoluţia ulterioară a inoculului.
Uneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacităţii rizogene, mai ales ca urmare
a practicării unor repicări (subculturi) succesive. Se pune problema păstrării sau a
redobândirii capacităţii rizogene. Factorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales,
cei care cauzează pierderea aptitudinii rizogene sunt în mică măsură cunoscuţi.
 Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate
slabă sau în urma unei perioade scurte de acţiune (600 lucşi mai puţin de o oră/zi).
Temperatura optimă pentru rizogeneză este aceea de 26 oC. Uneori, însă, se recomandă
practicarea unei alternanţe între o temperatură scăzută (5-15 oC) şi ridicată, în prezenţa
luminii, a auxinei şi a unui mediu bogat în glucide.
În cele mai multe cazuri, formarea rădăcinilor este localizată polar. Rădăcinile se
formează la polul radicular al explantului, în timp ce generarea mugurilor este localizată la
polul foliar. Aportul de auxină, în concentraţie ridicată, poate perturba polaritatea. În
concentraţii optime auxina stimulează rizogeneza.

B.Caulogeneza in vitro

Formarea de muguraşi in vitro, denumită şi caulogeneză, respectiv formarea de centri

vegetativi, este esenţială atunci când se urmăreşte, de exemplu, multiplicarea sau
„reconstituirea” unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatică. Inducerea
caulogenezei, a formării de muguraşi şi tulpiniţe, la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro, este
stimulată de prezenţa în mediul de cultură a citochininelor, adeseori, în condiţiile asocierii
acestora cu auxinele. De asemenea trebuie menţionat şi faptul ca formarea de muguraşi la
nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii celor două categorii de fitohormoni.
Reuşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor două tipuri de fitohormoni, ci
şi a realizării unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în funcţie de specie, de
provenienţa şi natura inoculului. Se poate spune deci, că nu este important doar raportul
fitohormonal, ci şi natura şi concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. Uneori,
se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia de auxină. Alteori, cel mai mare număr
de muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ ridicate de citochinină. Dar
nu există reguli general valabile. Adeseori fiecare experienţă reprezintă un caz aparte, iar
reacţia explantelor, la balanţa hormonală din substrat, variază mult, în dependenţă de tipul
materialului vegetal.
La calus, în inducerea caulogenezei, se obţin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea
succesivă a acestuia, într-o primă etapă, pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de
2,4D, fie în prezenţa unei auxine mai slabe ca eficienţă, dar administrată în concentraţie mare,
asociată eventual cu o citochinină, în concentraţie moderată. Acest calus subcultivat pe un
mediu cu aport scăzut în auxină şi cu un conţinut ridicat în citochinină, ar putea conduce cu
succes la declanşarea procesului de înmugurire.
Factorii externi (lumina, temperatura, calităţile fizice ale mediului) sunt controversaţi
în ceea ce priveşte efectele lor asupra caulogenezei. Acţiunea acestora depinde foarte mult de
tipul inoculilor şi de etapele parcurse anterior.
Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală,
în general se apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă.
Temperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză
este aceea de 25 oC.
Folosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate exercita un efect benefic
asupra producerii proceselor de morfogeneză. Astfel, la orhidee, se cunoaşte că menţinerea
protocormilor în stare submersă favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată
organogeneza. Trecerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declanşează
organogeneza. Dacă după o perioadă de menţinere a protocormilor pe mediu agarizat (câteva
săptămâni) se submersează protocormii, prin acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată, sau cu
apă distilată sterilă, se reuşeşte o stimulare a proceselor de organogeneză (Cachiţă, 1983).
La monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată. Aptitudinea cerealelor
de a forma muguri in vitro este foarte variabilă. Adeseori această capacitate, la nivelul
calusului, se pierde în timp, pe măsura practicării unor subcultivări succesive (mai ales la
grâu).

1.2.4.2 Embriogeneza somatică

Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare

celulară şi de histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză.
Indiferent de tipul embriogenezei, punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică
celulă.
Embriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere
embrioni. Aşadar dintr-o celulă a sporofitului, pe cale sexuată se pot genera embrioni care se
aseamănă foarte mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al
multiplicării repetate a unei celule somatice şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor
generative.
Embriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către Steward şi colab.
(1958) şi de către Reinert (1958, 1959). În inducerea embriogenezei somatice un rol important
l-a avut adăugarea în mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor
naturale, aflate din abundenţă în acest produs natural.
Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în
cercetările de embriologie experimentală. Astfel, s-a putut stabili:
-capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă, aparent banală şi că această
aptitudine nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare;
-embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de
prezenţa unui anumit mediu constituit din albumen, aşa cum este cazul la embrionul zigotic;
-atât embrionul zigotic, cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice
cunoscute în embriogeneza clasică şi anume: celula generatoare dă naştere la un masiv celular
care, treptat suferă o succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular, stadiul
cordiform, stadiul de torpilă sau torpedo.
În embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea explantelor se realizează
eliberarea celulelor din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate, prealabil
desprinderii lor din corpul plantei, moment în care se rup nu numai legăturile trofice şi
fitohormonale avute, ci se sistează şi eventuala prezenţă a factorilor inhibitori endogeni care
prin represie biochimică controlau şi blocau dezvoltarea haotică a celulelor unui organism.

1.2.5 Habituaţia sau anergismul

Habituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea

schimbărilor ereditare survenite spontan, la un moment dat, în raport cu cerinţele de
aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacţie, de
răspuns, a materialului biologic, la anumiţi fitoefectori, regulatori de creştere sau vitamine,
prezenţi în mediul de cultură.
Habituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii exogeni, ci
priveşte o gamă mai largă de probleme, unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie
de manifestări fiziologice. Astfel, explantul detaşat, lipsit de punctul vegetativ (dominanţa
apicală), trece prin transformări particulare, specifice noii stări fiziologice. Celulele sale,
devenind autonome, pot prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980).
Mecanismul habituaţiei este încă necunoscut. Se ştie doar că, există anumiţi factori de
mediu care favorizează instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales
2,4D) şi temperaturile ridicate.
 1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea

Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor

şi tulpinilor şi a fost semnalat la culturile de salată în seră (Gautheret, 1980). Se apreciază că,
în cazul acestui fenomen, în anumite condiţii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene
ale plantelor devin translucide ca o consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare,
înlocuindu-se aerul din ele.
În condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară brusc. Ele suferă transformări
morfofiziologice, frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori
ondulate şi casante, prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. Aspectul general este
degenerat.
Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele
diferenţiate în cele două ţesuturi, palisadic şi lacunar. Meristemele lăstarilor vitrificaţi sunt
mai mici decât la cei normali. Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină.
S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se
reduce foarte mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraţiei de agar la 1-
1,1% reduce vitrificarea (Orlikowska, 1985). Concentraţii mai mari de 0,8% de agar duc însă
la scăderea ratei de multiplicare şi de aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.

CAPITOLUL II

2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA

UNEI CULTURI IN VITRO

Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante,

pornesc de la aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu
(temperatură, lumină, compoziţia mediului de cultură, pH, umiditate) necesari fragmentului
de plantă inoculat în condiţii artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale
fiziologice sau de a-l conduce într-o anumită direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari
(micropropagarea).
Tehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui
număr de probleme:
-menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură organizată
(meristem, vârf de creştere sau mugure);
-inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea
de organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor explante formate din celule
diferenţiate (fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.) rezultând o nouă organizare
tisulară;
-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de
creştere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor,
citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. Aceste
substanţe par a determina orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care
li se acordă prima atenţie atunci când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice.
 2.1.1 Regulatorii de creştere

Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut.

Numeroase lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu le-
au putut identifica decât mult mai târziu. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din
clasa auxinelor, în jurul anului 1934, giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu,
în anii ’50. Aceste trei tipuri de regulatori de creştere exercită o acţiune stimulativă asupra
metabolismului celular. Există şi substanţe cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării
celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice
identificate câţiva ani mai târziu. De asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscută
ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a acesteia au permis detectarea sa
în organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra
plantelor.
Aceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. Există
şi fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali,
prezentând o acţiune fiziologică similară. Toate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt
numite regulatori de creştere şi au anumite caracteristice comune:
-acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt toxice, de aceea
unele dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de
balanţa hormonală stabilită între ei;
-intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de
acţiune astfel încât noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost
abandonată.
O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă
în faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind
eliminaţi suficient de repede, pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori
preferaţi aplicaţiilor practice.

2.1.1.1 Auxinele

Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la

Gramineae. Numele de auxine provine din grecescul auxein – a creşte, determinând elongarea
celulelor (auxesis – creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de
celule).
Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut
sub numele de acid β- indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul β- indolil acetic

A. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor
 Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor
şi de interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut
concluziona că:
-exercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii
plasticităţii peretelui celular şi penetrării apei în celulă. Apoi rezistenţa peretelui scade şi
celula creşte în lungime;
-modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de
H+, determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular
şi o absorbţie de ioni de K+;
-influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal
(ribozomii participă la sinteza proteinelor);
-stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat
insuccesele din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca
histogenic deoarece conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus;
-acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb
în reglarea nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare;
-acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular
asupra fenomenelor de dominanţă apicală;
-determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor;
-au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale
destinate comerţului de flori tăiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a auxinei deoarece
concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie
de concentraţia celorlalţi fitoregulatori.
Modul de acţiune al auxinelor. Nu se poate da un răspuns precis, dar cercetările în
domeniu au evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici
auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat următoarele concluzii:
-în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie
în concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon;
-în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât
alţii.
Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se
poate extinde ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.

B. Auxinele în plante

Toate plantele sintetizează auxine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora.
Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere.
Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în
organele tinere, dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce
înseamnă că auxinele sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză.
Astfel, auxinele sunt prezente într-o concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în
mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea şi elongarea celulelor.

C. Auxinele sintetice

De când au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora,
care au generat în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirmă
existenţa receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxin-
enzimelor , vor putea avea un efect prelungit în plante.
Printre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA – Fig.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic (ANOA) şi
naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen α-acetic

În practică, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin
eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor. De
aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.
În aplicaţiile agricole, compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor
rezultate în urma tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea fructelor partenocarpice sau
pentru întârzierea căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului
invers exercitat de acidul abscisic.
Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în
principal efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează.

2.1.1.2 Giberelinele

Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie

identificate. Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă
(Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Extractul
apos din ciupercă a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea
existenţei unei substanţe responsabile de aceste efecte.
Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în
1939 şi numit „giberelina A”). Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor
gibereline până când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci
de gibereline. Aceştia sunt toţi compuşi endogeni. În practică, giberelinele folosite sunt
extracte purificate.
Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul
GA4+GA7 sau GA7. Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având
în vedere că primele gibereline sintetice au fost obţinute prin anii ’80.
 Fig.3 Acidul giberelic

Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate
şi poziţia substituenţilor în nucleu.

A. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor

Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3).

Nu toate giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare,
ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline.
Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt:
-acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate spectaculoase
(ex: s-au obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar
unele dintre varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3,
în general varietăţile pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul
giberelic acţionează şi asupra pedunculilor florali, împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până
la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate (ex: la viţele de vie
cu ciorchini denşi, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe);
-în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa
acestora, prezintă un aspect globular;
-stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice.
S-a dovedit că la seminţele de orz, acumularea α-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea
amidonului în zaharuri solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau
după asocierea cu un receptor. Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa auxinelor, şi
sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi
cazul pomilor fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute
pentru a înflori, astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi
scăzute (morcov). La alte specii, ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire,
prezenţa giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fără formarea florilor (sfeclă). Aceste
contradicţii în aparenţă au o explicaţie simplă: în plantele prezentate mai sus frigul acţionează
doar asupra creşterii tulpinii, pe când în celălalt caz asupra procesului de înflorire. Astfel,
giberelinele, îşi exercită doar rolul de stimulatori ai elongaţiei neinfluenţând, în acest caz,
procesele fiziologice normale;
-acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun;
-exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a
mugurilor dorminzi, atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest
lucru, inducând şi ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea;
-în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. Par a se opune
fenomenului de dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă
asupra meristemelor apicale sau axilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi
dezvoltării acestora.

B. Giberelinele în plante

Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală.

Unele gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe
(acizii giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află
şi acţionează mai multe tipuri de gibereline.
Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii
foliari şi florali, în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni.
Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori
zaharurilor, eliberându-se în situsurile ţintă.

2.1.1.3 Citochininele

Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor

vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte
de nucă de cocos în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării
celulare şi în lăstărire. Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste
efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de natură purinică, care nu a putut fi
iniţial identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor
şi în 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substanţă activă numită „chinetina”.
Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi
endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –Fig.4) (6-
furfurilaminopurina) şi benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina

Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu

zaharuri.

A. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor

Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de

fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. În acest proces citochininele sunt
indispensabile, dar ineficiente fără acţiunea auxinelor, cele două complementându-se reciproc.
Auxinele favorizează duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă
antagonice rizogenezei;
 -exercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza
proteinelor, prin rolul ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii
de acţiunea enzimelor hidrolitice. Acest efect determină întârzierea senescenţei până la
punctul în care frunzele mature tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din
punct de vedere metabolic;
-exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară;
Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au
permis obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. Proprietăţile
citochininelor permit rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea
viabilităţii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre
dediferenţiere.

B. Citochininele în plante

Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb,

de unde şi numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina (IPA), descoperită puţin mai
târziu în plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conţin
citochinine sintetizate în special în rădăcini şi în embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze
determină atragerea substanţelor nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a
metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor
şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor endogene localizate în aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se
presupune ca ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde
vor fi activate ulterior, ca în cazul aplicaţiilor pe frunze.

2.1.1.4 Etilena

Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de
depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată
până în momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Etilena se află în plante în
cantităţi infime şi poate fi produsă de toate părţile acesteia.

Fig.5 Etilena

Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt:

-determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosită la început
pentru coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor
la măr şi cireş;
-accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se
urmăreşte recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate
folosită în horticultură;
-modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii
transportului auxinelor;
-are acţiune favorabilă asupra tuberizării.
Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea Bromeliaceaelor,
corelaţii de creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea).
Acţiunea antagonică a etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce
pot controla sinteza, concentraţia şi circulaţia lor.
Aplicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut
progrese doar după descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin
pulverizare penetrează ţesuturile, unde se eliberează etilena.
Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare
se sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.

2.1.1.5 Inhibitori ai creşterii

Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele

endogene enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.

A. Inhibitorii fenolici

Inhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în

multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor
metabolice. Ei intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin
încetinirea creşterii acestora urmată de stoparea totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi
mecanismul lor în inducerea stării de latenţă.
În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de
cultură, unde se oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea
explantelor, de aceea în unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau
adsorbanţi pentru a detoxifia mediul.
Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro,
cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.

B. Acidul abscisic

Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate
plantele. Acest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor
condiţii stresante (lipsa apei, rănire, căldură excesivă). Existenţa acidului abscisic în celule
este una din cauzele cărora plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea
metabolică. Încetinirea activităţii plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt
trecătoare şi poate induce starea de latenţă sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile
nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic

Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici.

Astfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt:
 -acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor;
-determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu, ceea ce poate
influenţa închiderea stomatelor;
-acţionează asupra înfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă
cultivate în condiţii perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis)
sau inhiba parţial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). În cazul în
care plantele de zi scurtă sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora
dintre specii şi inhibarea altora. Aplicat asupra plantelor de zi lungă, acidul abscisic poate
inhiba înflorirea atunci când plantele sunt supuse unor condiţii normale de fotoperiodism
(spanac, Lolium temulentum). Aceste observaţii pot conduce la supoziţia că nopţile lungi
favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este prea simplă pentru explicarea
modului diferit de acţiune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile
folosite şi de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de
interpretat.

Concluzii

Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora,
dar prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor
stagii fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică.
Variaţia continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate
de alegerea momentului de recoltare a explantului.
Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care
cele mai importante sunt auxinele şi citochininele.
Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante,
determinând evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi
fitohormoni. Astfel, după Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi:
-dacă raportul auxine – citochinine este mare, se induce rizogeneza;
-dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, explantele tind spre o funcţionare
caulogenică;
-dacă raportul este apropiat de unitate, explantele au tendinţa să genereze formaţiuni
calusare.
Această schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă există variaţii în funcţie
de tipul de explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. Pe lângă aceşti
fitoregulatori principali există şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili,
dar în cele mai multe cazuri aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce

un individ întreg similar plantei donor. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”,
indică faptul că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi,
proprietate ce este tot mai mult exploatată în culturile in vitro.
Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se
folosească în practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul
acestora va creşte.
Este mai uşor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil să reacţioneze
în condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai
puţin semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. Micropropagarea face posibilă obţinerea
de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de
variabilitate genetică atunci când explantul este supus anumitor condiţii.
Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea
evoluţiei fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor
unui segment de plantă atunci când este detaşat de planta mamă.

2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante

În contextul reproducerii sexuate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul

de viaţă al unei plante se împarte în patru stadii principale.

A. Embriogeneza

Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. Oul astfel

format este protejat de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o
masă sferică (faza globulară a embrionului), apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând
cotiledoanele rudimentare (faza cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se
dezvoltă structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula şi radicula (stadiul de torpedou al
embrionului). De la acest stadiu începe diferenţierea celulară. Specializarea celulelor este încă
foarte puţin datorată unei funcţionări programate şi mai mult datorită unui program genetic ce
se va păstra şi în celulele mature ce în anumite condiţii se vor comporta similar unor celule
gametice, dând naştere unor organe sau embrioni, de această dată somatici.
În momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se
presupune că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar şi cu mediul de cultură,
determină un schimb de semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule.
În contextul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a
două cauze: pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi
echipament informaţional genetic), în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă
parte, datorită poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile
membranare. Aceste structuri filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia
sau altui semnal capabil să modifice programul informaţional spre un anumit tip de celulă.
Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt
depozitate în albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea
embrionului în starea de latenţă. Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista
condiţiilor nefavorabile din mediul înconjurător.

B. Stadiul vegetativ

Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele
germinează şi din embrion ia naştere o nouă plantă. De creşterea plantelor sunt responsabile
două tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi
meristemul radicular, ce determină creşterea părţii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte externă,
epiderma de două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. Într-o secţiune
transversală se poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă,
înconjurată de un inel de celule aflate în diviziune activă, celule responsabile de creşterea
tulpinii. Diviziunea începe de la inelul iniţial: zona epidermală diferenţiază în frunze
rudimentare spre exterior, iar spre interior în parenchim cortical şi vase conducătoare. Centrul
este umplut de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcţionare ritmică programată
genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie
corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii) şi, în al doilea rând, în forma
frunzelor. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi clasificarea plantelor se bazează
aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentată mai sus privitoare la
diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar celei
privitoare la meristeme.
La început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei,
primele frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte,
fiind cunoscute sub denumirea de frunze juvenile. Planta creşte şi devine capabilă să se
hrănească singură, rădăcinile transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici
odată cu regulatorii de creştere. În schimb, rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive
bogate în glucozide, vitamine şi de asemenea în regulatori de creştere. Aceste schimburi stau
la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi
cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical

Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure
caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore, tufiş,
tulpini întortochiate sau împrăştiate, etc). Această arhitectură poate fi modificată prin
curăţarea de uscături sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea
regulatorilor de creştere. În contrast frunzele îşi menţin forma.

Fig.8 Meristem radicular

 Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii
despre întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative
decât de moştenirea genetică.
Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe
an, un an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. În ultimul caz, sistemul
vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu
cele de repaus. Această succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului
înconjurător, este determinată de stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile
condiţiilor de mediu (temperatură, lumină, secetă, umiditate, etc). Plantele ce intră în perioada
de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar
frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene ale plantelor ierboase se usucă. Atunci
când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă de obicei de temperaturile
scăzute) reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene.

C. Stadiul reproductiv

Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului

caulinar. Inelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele
centrului latent intră în diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei.
Diferenţierile încep la margini unde se formează staminele şi părţile fertile ale plantei:
staminele şi pistilul. Florile angiospermelor sunt considerate lăstari modificaţi constituite
dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele şi pistilul).
Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că
mecanismele de diferenţiere sunt similare. Instalarea stării generative este progresivă şi la
început poate fi reversibilă, în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.
Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii
variaţiile climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice (temperatură, lumină,
umiditate), caz în care planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor
direcţiona meristemul spre stadiul reproductiv. La unele specii, existenţa un timp îndelungat
a condiţiilor nefavorabile de mediu poate duce la împiedicarea înfloririi. Floarea constituie
ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin fertilizare, continuitatea speciei. La
unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor.
Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani (Saintpaulia, cerenţel-
Geum urbanum, căpşun, etc). Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să înflorească,
plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale.
Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt
concludente, ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita
câteva modele de culturi in vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi
proporţia fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare, radiculare sau
chiar reproductive.

D. Stadiul de senescenţă

Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece

meristemele sunt la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai
hrănesc planta în mod normal, schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se
pregătesc de iernare. La speciile perene, această etapă începe prin încetinirea funcţiilor
rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante, ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de
atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor să intervină cel puţin la începutul acestui
stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena, alături de alţii).
 Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei
plante ne permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor.
Astfel, interacţiunile pe distanţă scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi
al meristemelor vegetative şi regenerative. Alt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre
organe ce permit plantelor să recunoască mediul înconjurător şi variaţiile ce intervin la nivelul
acestuia. Planta va putea să se adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub
forma fitohormonilor sintetizaţi în anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce
răspunde la acel stimul. În cursul deplasării lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele
enzimatice existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de aşa natură încât de-a lungul unui
ciclu de viaţă al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de creştere evoluează
continuu şi reflectă la un moment dat, nu doar starea prezentă a mediului înconjurător al
celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. Datorită acestui fapt, la recoltarea
unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul
fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă, precum şi de
mărimea şi natura fragmentului excizat.

2.2.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă

În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la
condiţiile culturii in vitro. În general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante,
potenţialul de adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu
vârsta plantei mamă.
În cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de
cultură dacă se află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet.
Această tehnică prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea
(potenţialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu excepţia cazului strict de
autogamie). Pe de altă parte, această tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare
unui embrion izolat. În unele cazuri, de încrucişare interspecifică sau intergenerică, când
embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul, această tehnică permite creşterea şi
dezvoltarea normală a acestor embrioni.
Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane
s-au obţinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura
ţesuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro
iniţiate din explante bătrâne. În unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută.
După germinarea în stadiul juvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in
vitro şi este sursa multor succese în domeniu. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor,
potenţialul de cultură in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. Acest
fenomen este specific mai ales plantelor perene, şi în mod deosebit la arbori. La aceste specii,
calitatea tehnică a lemnului nu este măsurabilă, cu excepţia arborilor adulţi. În acest stadiu,
totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii doar din butaşi nu mai este posibilă, deoarece în
stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică ridicată.
Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole:
-una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. În acest
caz lăstarii par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi
eucalipt). La aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de
stadiul juvenil, probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor;
-a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole
tropicale şi a coniferelor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. Un
altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. Altoiul
creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul
începe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă
ce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are
caracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele
dezvoltă, în cultura in vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea
observată este deseori obţinută din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe
subculturi pentru a obţine aceste efect, în funcţie de specie.
Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice
sau datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de
noi celule. Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin
cunoscute. Se pare că citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu
acţionează singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când
plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de
funcţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii
in vitro.
Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă,
dar rezultatele sunt în general slabe sau incomplete.

2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului

Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate

distinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel,
primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci
când s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în
vegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri
dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara
organele cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor,
giberelinelor şi citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se
diminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul
că explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da
răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu.
De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere
micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci
când sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de
vegetaţie, când concentraţia de auxină este maximă.
La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea
rejuvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu
temperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru
modificarea echilibrului lor intern în vederea stimulării rizogenezei.

2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor

După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul
de organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două
cazuri:
 1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor,
apexurilor caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea
unei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme,
generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de
exemplu, organe). Dacă mediul de cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantului
şi conduce la dediferenţierea celulelor, generând calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel
mai des folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii.
Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de
creştere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase.
La mai multe plante la care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din
ramuri laterale au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante
culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această „memorie”
aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină,
frunze, flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă
cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou
capacitatea organogenică.
Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt
capabile să urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar,
în acest caz, diferenţele între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma,
sunt capabile să regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine,
polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate
notabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii sunt total recalcitrante,
nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-a
reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane.
În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din
fragmente de limb foliar şi tulpini tinere.

2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora

Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât
explantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi
mediul de cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici
direcţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece explantul este receptiv la
substanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii de creştere existenţi.
Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii
protectori sunt înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza
creşterea, sau în cazul diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce
trebuie să aibă dimensiuni foarte mici, există o mărime minimă ce conţine domul
meristematic cu două primordii foliare. Sub această mărime supravieţuirea explantului este
foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro
este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor.
Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei
manipulări uşoare a materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi
inoculării acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe
fragmente de peţiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de
peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri de
rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără îndoială, în
ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol, pe când în cazul
fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim
medular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal.
Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în
stadiul de calus. Parenchimul medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer
o armonizare perfectă între regulatorii de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a
folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi citochinine.
Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării
spre stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest
experiment confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de
dimensiuni reduse.
Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor
izolaţi mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante,
dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ

Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este
menţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa,
după fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct
cu mediul de cultură, fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu,
oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau
anula schimburile dintre explant şi mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de
brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia
explantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de
0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a
unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau
polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).
Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de
natura sa, în direcţia dorită de operator.

2.3.1 Explante cu structură rudimentară

Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.

Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a
fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi
citochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică.
După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la
baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece
dacă acest calus creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui
dezechilibru între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea
calusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se formează prima
frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea tulpinii (axului
principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele specii
ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile lemnoase. Primul
mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un
nod (microbutăşire). Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil
acetic), serveşte ca mediu de înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).
 A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea
şi dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu
citochinină (de la 1 la 10mg/l). Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru
creştere, fără hormoni sau cu acid giberelic în concentraţie mică. În unele cazuri este nevoie
de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor, mediu adiţionat în general cu
auxine.
Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea
efectuării unui număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de
variabilitate.

2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut

Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare
structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini)
sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).
Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere,
adică sa se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. Acest tip de reversie este mai uşor de
obţinut la celulele vegetale şi mai greu la cele animale.
Observaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în
procesul dediferenţierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul
se măreşte, citoplasma devine mai densă. După realizarea acestor modificări celulele încep să
se dividă, stadiu denumit histogeneză, uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a
auxinelor. În al doilea stadiu, numit organogeneză, citoplasma celulară devine şi mai densă,
cu vacuole mici şi nucleu voluminos. Celulele păstrează capacitatea de a se divide, dar
celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o masă meristematică ce se va dezvolta într-
un nou individ.
Observând un explant în cultură se observă formarea, mai întâi, a unei formaţiuni
calusare cu rol protector. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce
încep să se dividă şi să se dediferenţieze.
Dacă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică, nu se mai formează calus şi deci
tot explantul moare. Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă, de exemplu la
Begonia rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor
glandulari. În general celulele ţintă, adică celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial,
sunt cele epidermale, în special cele provenite din tunică, dar pot avea şi alte origini. Aceste
celule se vor organiza într-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantulă întreagă cu tulpini
şi rădăcini, cum este cazul la Begonia şi Saintpaulia.
La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observă în primul stadiu formarea de calus
(calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, şi doar în al doilea stadiu, ce poate
avea loc pe acelaşi mediu de cultură sau pe alt mediu, se dezvoltă meristemul ce va da naştere
noii plantule. Când se formează meristemul prezintă, în funcţie de specie, acelaşi mod de a se
dezvolta ca şi explantele organizate, doar că se cere un mediu mai complex pentru a asigura
elementele nutritive necesare dezvoltării complete până la stadiul de plantulă.
Al doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele
se vor comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de
embrioni sau embriogeneză somatică. Acest fenomen, descris pentru prima dată la celule de
morcov, a fost descoperit la mai multe specii, atât anuale cât şi perene.
Ca o trăsătură generală, inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de
compoziţia mediului de cultură, dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare.
În multe cazuri embriogeneza somatică, este precedată de formarea de calus, în acest caz
izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv (Fig 9).
 În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul
globular, apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi
într-un embrion capabil să genereze o plantulă (Fig 10).
Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de
cultură. Primul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare, iar
al doilea va induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce
germinarea embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări are loc
diluţia fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus

Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de explante

este nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. În funcţie de răspuns,
aceste explante prezintă unele dezavantaje la nivel genetic.
În primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există
probabilitatea ca celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.

a b c

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular, b) în stadiul cordiform, c)

generând o plantulă

În al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din
calus, caz în care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta
modificări la nivel genetic (modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau
modificări citoplasmatice). Această variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a
fost chiar folosită pentru inducerea de mutanţi, prin stimularea formării calusului pe medii
adecvate fitohormonal şi chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creşterea
probabilităţii mutaţiilor. După fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii pentru
regenerare, s-a observat că printre plantulele neoformate unele prezentau modificări
morfologice evidente mai ales citoplasmatice. În consecinţă, de fiecare dată când propagarea
unei specii necesită trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calităţii genetice a
plantelor obţinute.
Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetările asupra culturilor ce au pornit de la
explante diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere,
a căror echilibru în mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să
funcţioneze într-un ritm ales de operator, ţinând cont de echilibrul endogenic. Nu se ştie nici
în prezent care este modalitatea de a determina exact concentraţia şi balanţa hormonală atunci
când se apelează la fitoregulatori exogeni, dar pe de altă parte, aceştia din urmă permit
cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul dorit.
Aceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor
aplicaţii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a
început să fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III

3.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE

CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE

Încăperile destinate cultivării in vitro a explantelor vegetale trebuie să fie: luminoase,

lipsite de igrasie, să prezinte instalaţii de iluminare, canalizare, curent electric, toate în
perfectă stare de funcţionare. Orice defecţiune poate perturba desfăşurarea normală a
lucrărilor efectuate în acest laborator.
În toate compartimentele laboratorului trebuie asigurată o curăţenie perfectă, praful şi
murdăria constituind surse de infecţii. Toate operaţiunile, cum ar fi: repartizarea mediilor de
cultură, prelevarea, dimensionarea şi inocularea explantelor vegetale se realizează în condiţii
aseptice.
O condiţie esenţială în reuşita unei culturi in vitro constă în realizarea unei asepsii
perfecte, atât a materialului biologic cât şi a mediului de cultură. În cazul în care această
asepsie nu este asigurată, în mediul de cultură pot apărea infecţii microbiene şi fungice în
circa 2-5 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietăţilor substratului de
cultură, eliberarea de toxine, modificarea pH-ului şi astfel dezvoltarea explantelor este
inhibată.

3.1.1 Organizarea spaţiilor într-un laborator de culturi in vitro

Laboratorul de culturi in vitro trebuie să cuprindă mai multe încăperi, grupate în

funcţie de lucrările care se execută în ele, în două zone:
-zona nesterilă – cuprinde: spălătorul, camera de distilare a apei, laboratorul de
preparare a mediilor, laboratorul de testare a infecţiilor, camera pentru sterilizarea sticlăriei şi
a mediilor de cultură, camera de creştere, camera frigorifică, camera de aclimatizare, seră şi
solarii;
-zona sterilă – este constituită dintr-o cameră sau incintă sterilă.
Dimensionarea încăperilor şi dotarea lor cu aparatură depinde de specificul muncii
prestate (cercetare, producţie sau miniproducţie).
 A. Zona nesterilă

1.Spălătorul
Destinaţie: este încăperea în care are loc spălarea sticlăriei şi recipientelor destinate
culturilor in vitro.
Această încăpere trebuie să fie organizată astfel:
-să fie prevăzută cu ciment pe jos şi cu canalizare în pardoseală;
-spălarea sticlăriei se va face în bazine de capacitate corespunzătoare, în funcţie de
volumul de muncă existent în laborator;
-să fie dotat cu o chiuvetă cu apă caldă şi rece, suporturi pentru uscarea sticlăriei,
dulapuri pentru depozitarea sticlăriei, coşuri pentru gunoi;
-poate să fie dotată şi cu un distilator pentru apă.
Modul de spălare:
-se pregăteşte sticlăria care urmează a fi spălată;
-se elimină resturile de mediu şi resturile vegetale din vasele de cultură;
-mediile de cultură cu agar se colectează şi se aruncă la gunoi;
-în cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte de a
fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator;
-se pune sticlăria la înmuiat în apă caldă cu detergent, în bazinele destinate spălării;
-se efectuează spălarea propriu-zisă folosind perii utilizate în spălarea sticlăriei;
-se clăteşte sticlărie în apă de robinet şi apoi în două reprize de apă distilată;
-se aşează sticlăria pe suporturile speciale destinate uscării acesteia.
Se consideră sticlăria curată atunci când la suprafaţa acesteia nu mai aderă nici o
picătură de apă.

2.Camera pentru sterilizare

Destinaţie: este locul în care se efectuează sterilizarea mediilor de cultură, a apei
distilate şi a vaselor de cultură.
Organizare:
-trebuie să fie prevăzută cu pardosea din ciment şi instalaţie de canalizare, sa fie
racordată la reţeaua de gaze, conectată la curent electric şi să posede o sursă de apă;
-este dotată cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate;
trebuie să existe două tipuri de autoclave: unul conectat la reţeaua de curent electric (fig. 1) iar
celălalt având ca sursă de energie gazul metan; sterilizarea vaselor cu mediu de cultură se
realizează în casolete metalice sau coşuri de sârmă;
-în unităţile cu activitate mai redusă sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate
se poate face şi în kukte;
-este dotată cu etuve pentru sterilizarea sticlăriei.

3.Camera pentru prepararea mediilor de cultură

Destinaţie: este încăperea în care se realizează prepararea mediilor de cultură.

Organizare:
-trebuie să fie spaţioasă şi iluminată corespunzător;
-trebuie să fie dotată cu instalaţii de canalizare, curent electric, gaz, apă curentă;
-pardoseala trebuie să fie acoperită cu un material uşor lavabil, iar mesele să fie
placate cu faianţă sau folie melaminată pentru a fi uşor de întreţinut;
-această încăpere va fi dotată cu etuve, pupinele pentru presterilizarea
instrumentarului, agitatoare magnetice, băi marine, pH-metru (Fig.2), frigider, congelator,
distilator (Fig.3), balanţă tehnică şi balanţă analitică (Fig.4), precum şi un variat sortiment de
sticlărie.
4.Camera de creştere
Destinaţie: este destinată păstrării inoculilor în condiţii optime în vederea creşterii şi
dezvoltării acestora.
Organizare:
-trebuie să fie perfect curată, faianţată, bine izolată de mediul extern, dotată cu
instalaţie de curent electric, sistem de climatizare;
-camera va fi ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură, având poliţe
situate la distanţe de 40-50 cm, fiecare poliţă având sistem de iluminare ce poate fi întrerupt
separat;
-iluminarea se realizează cu tuburi fluorescente, realizând o intensitate luminoasă de
3000-4000 lucşi;
-fotoperioada în camera de creştere trebuie să fie, de regulă, de 16 ore lumină şi 8 ore
întuneric; studii recente (Teodorescu Al. şi colab., 1994,1995) reliefează că durata “zilei”
poate fi redusă fără probleme la 10-12 ore realizându-se astfel importante economii de
energie;
-nivelul temperaturii trebuie să fie, în general, între 22-24oC; în funcţie de specie,
scopul urmărit şi tipul de cultură aceasta poate varia între 15-30oC;
-umiditatea din camera de creştere trebuie să fie cuprinsă între 70-75%; reducerea
umidităţii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultură cu consecinţe
grave asupra plantelor;
-pentru culturile pe mediu lichid, în camera de creştere trebuie sa existe unui sistem de
agitare, pentru asigurarea oxigenării ţesuturilor explantului inoculat.

B. Zona sterilă

Camera sterilă
Destinaţie: în această încăpere se execută repartizarea mediului de cultură precum şi
prelevarea, sterilizarea şi inocularea explantelor sau subcultivarea materialului biologic
crescut in vitro.
Organizare:
-trebuie să fie cât mai izolată de restul încăperilor din zona nesterilă pentru a
preîntâmpina vehicularea germenilor;
-trebuie să fie prevăzută cu instalaţii de gaz, curent electric, dar fără apă curentă şi
canalizare;
-pardoseala va fi placată cu gresie, iar pereţii cu faianţă;
-cea mai importantă dotare din camera sterilă este hota cu flux de aer steril; sunt două
tipuri de hote – cu flux de aer orizontal şi flux de aer vertical, ambele fiind dotate cu baterii de
filtre ce permit reţinerea particulelor mai mari de 0,2 micrometri; ele trebuie să permită lucrul
a două persoane concomitent; cele mai folosite sunt hotele cu flux de aer orizontal;
-hota cu flux de aer steril trebuie să posede sistem propriu de iluminare şi posibilitatea
ataşării a 1-2 becuri de gaz;
-înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20 minute hota se porneşte pentru a se
realiza sterilizarea incintei de lucru; în acelaşi timp se pune în funcţiune lampa UV şi se
pulverizează alcool în interiorul hotei;
-alte dotări în camera sterilă sunt: scaune rotative pentru personalul care lucrează la
hotă, dulapuri pentru sticlăria sterilă, cuptor cu microunde, măsuţe pentru depunerea vaselor
cu medii şi a celorlalte materiale folosite în perioada de lucru;
 -înainte de începerea lucrului personalul se va spăla pe mâini în antecameră, iar în
camera sterilă se va clăti cu alcool şi va purta echipamentul specific: halat alb, boneta şi
mască pe figură.

3.1.2 Dotările necesare într-un laborator de culturi in vitro

Sticlăria
Se utilizează toate tipurile de recipiente de sticlă, folosite într-un laborator de chimie-
biologie. Este bine ca vasele să fie din sticlă termorezistentă de tip Pyrex sau din silicat de
bor.
Într-un laborator sunt necesare pipete, cilindri gradaţi, baloane cotate, pahare
Berzelius, pahare Erlenmayer, pâlnii, vase Petri, sticle şi borcane pentru reactivi.
Se are în vedere tipul de vase utilizate pentru inocularea materialului biologic, pentru a
evita pasarea repetată a plăntuţelor chiar dacă mediul de cultură nu a fost epuizat, ceea ce
conduce la risipă de substanţe chimice.
De reţinut: orice recipient nou din sticlă eliberează, cu ocazia primei utilizări, compuşi
toxici în mediul de cultură. De aceea, se recomandă ca sticlăria nouă să fie spălată cu apă şi
detergent şi apoi limpezită, după care se umple cu apă bidistilată şi se autoclavează de 2-3 ori
câte 30 minute. După această operaţiune se poate utiliza în inoculări.
Din ce în ce mai des, pentru inoculări, se folosesc vase speciale din material plastic
autoclavabile şi cutii Petri din material plastic de unică folosinţă, care sunt livrate steril.
Aparatura şi dispozitivele
Dotările necesare într-un laborator de culturi in vitro sunt (Fig.11):
-hota cu flux de aer steril;
-autoclav;
-aparat de distilat şi bidistilat apa;
-frigidere de mare capacitate;
-agitatoare magnetice;
-balanţe analitice şi tehnice;
-pH-metru;
-etuve;
-microscoape şi lupe binoculare;
-centrifugă;
-aparat pentru repartizarea mediului de cultură;
-aparat de fotografiat.

Instrumentar
În lucrările de culturi in vitro se lucrează cu instrumentar de tip chirurgical:
-pense de diferite forme şi mărimi;
-foarfeci;
-bisturie, cuţite, lame de ras;
-ace, anse, seringi.

Substanţe necesare
În laboratorul de culturi in vitro se utilizează o serie de substanţe:
-săruri anorganice;
-compuşi organici;
-reactivi de uz comun;
-substanţe indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal;
-alte materiale chimice: detergenţi, săpunuri, praf de curăţat, alcool, amestec cromic.
 c
a b

d f
e

g i
h

Fig.11 Dotările necesare într-un laborator de culturi de celule şi ţesuturi vegetale

a) etuvă; b) pH-metru; c) microscop binocular; d) lupă binoculară; e) distilator; f) balanţă
analitică; g) centrifugă; h) balanţă tehnică; i) autoclav
 CAPITOLUL IV

4.1 CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE

CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE

4.1.1 Mediul de cultură

Explantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au nevoie
de condiţii speciale de cultură, să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie totală) şi să aibă ca
sursă de hrană o soluţie nutritivă complexă, formată din apă, săruri minerale, substanţe
organice şi fitohormoni. Pentru menţinerea explantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu
fie asfixiate, mediul de cultură se solidifică cu un agent de solidificare. Soluţia nutritivă
complexă lichidă sau solidă se numeşte mediu de cultură sau substrat de cultură. Acest mediu
de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie complexă deoarece explantul nu are
capacitate de a se hrăni autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza substanţelor existente în mediu.
În funcţie de scopul urmărit, evoluţia explantului poate fi dirijată prin modificarea
compoziţiei mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de
dezvoltare, cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit, momentul de prelevare şi
zona din care s-a prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi. În prezent se cunosc şi se utilizează o
serie de medii de cultură ce poartă numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog,
Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul 4.1).
Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât şi
prin studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi desorbţia,
schimbul ionic care există între plantă şi mediul înconjurător. În prezent se cunosc destul de
bine modificările pe care le suferă plantele când elementele chimice sunt în exces sau în
deficit. Trebuie evitate pe cât posibil aceste stări de stres pentru plante atât la cultura în câmp,
cât mai ales la culturile in vitro.

4.1.1.1 Compoziţia chimică

A. Compuşii anorganici şi rolul lor

Apa
Apa reprezintă componentul esenţial al vieţii, al materiei vii. Este utilizată în tot
„fluxul tehnologic” de producere a plantelor in vitro, de la spălarea materialului vegetal şi a
vaselor de cultură, până la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente şi elemente de
diluţie până la concentraţia dorită. Pierderea apei din ţesuturi provoacă perturbări metabolice
direct proporţionale cu cantitatea de apă pierdută. Stresul hidric este suportat de plante dacă
este de scurtă durată şi dacă nu se atinge nivelul de veştejire. În această ultimă fază plantele
sunt capabile de rehidratarea ţesuturilor puse în condiţii favorabile de umiditate, dacă deficitul
de apă se menţine plantele mor.
La culturile in vitro există momente când explantele pot să-şi piardă turgescenţa prin
pierderea apei, momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită, pentru asigurarea
succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere,
deoarece soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni. Trebuie
corelate foarte bine timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiilor utilizate în funcţie de starea
de vegetaţie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoză. Prelevarea
explantelor trebuie făcută repede, altfel datorită dimensiunilor mici pierd repede apa prin
transpiraţie, prin rănile care sunt mari comparativ cu mărimea lui. Manipulările sub hotă
trebuie făcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidratează relativ uşor explantele
care stau descoperite.
Pe timpul creşterii explantelor în camera de creştere, vasele trebuie să fie închise
pentru a evita pierderea apei prin transpiraţie, ce ar determina concentrarea mediului în
elemente nutritive, ar provoca crăparea mediului şi ca atare slaba creştere a culturilor. Pentru
respectarea strictă a concentraţiilor soluţiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilată, deci
eliberată de ionii minerali pe care îi conţine. La spălarea materialului vegetal după sterilizare
se foloseşte apă sterilă, sterilizare ce se face în autoclav odată cu sterilizarea mediului sau
separat.

Sărurile anorganice
Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri. Cele mai utilizate
sunt: azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc.
Absorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni, utilizarea uneia sau alteia din
săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie. În funcţie de cantitatea
de elemente ce se foloseşte în mediu, elementele se împart în:
-macroelemente - utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor – C, O, H, N, K, Ca,
P, S, Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate în concentraţii de micromoli.

Tabelul 4.1
Principalele medii de cultură utilizate în culturi
in vitro (după Street, 1977)
Constituenţi Heller White Nitsch Murashige Gamborg
Skoog
mg/l
Macroelement

KCl 750 65 - - -
NaNO3 600 - - - -
MgSO4 x 7H2O 250 720 185 370 250
NaH2PO4 x H2O 125 16,5 - - 150
CaCl2 x 2H2O 75 - - 440 150
CaCl2 - - 166 - -
KNO3 - 80 950 1900 2500
Na2SO4 - 200 - - -
(NH4)2SO4 - - - - 134
NH4NO3 - - 720 1650 -
KH2PO4 - - 68 170 -
Ca(NO3)2 x - 300 - - -
4H2O

Microelemente
FeSO4 x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8
Na2EDTA x - - 37,3 37,3 -
2H2O
MnSO4 x H2O - - - - 10,0
MnSO4 x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -
KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75
NiCl2 x 6H2O 0,03 - - - -
CoCl2 x 6H2O - - - 0,025 0,025
ZnSO4 x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0
CuSO4 x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025
 H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0
FeCl3 x 6H2O 1,0 - - - -
Na2MoO4 x - - 0,25 0,25 0,25
2H2O
AlCl3 0,03 - - - -
Fe(SO4)3 - 2,5 - - -
Constituenţi
organici
Inozitol - - 100 100 100
Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0
Piridoxină HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0
Tiamină HCl - 0,01 0,5 0,1 10
Glicină - 3,0 2 2,0 -
Acid folic - - 0,5 - -
Biotină - - 0,05 - -
Zaharoză - 2% 2% 3% 2%
Diferenţele ce există între diferite reţete de mediu, constau în raportul dintre diferiţi
ioni. Rolul fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte în
mediu, de concentraţia lui, de natura explantului. În prezent se cunosc principalele reţete
utilizate pentru speciile cultivate care se pretează la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a
experimentat încă, trebuie făcute tatonări pentru găsirea celei mai adecvate compoziţii pentru
mediu. Carenţele pentru elementele minerale in vitro se manifestă după 2-3 subculturi, deci
târziu, când nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. De exemplu N are rol
important în embriogeneza somatică, în funcţie de forma lui nitrică sau amoniacală
influenţează vitrificarea. Carenţa de N duce la acumulări de antociani în vacuolele celulelor,
iar dacă aceasta persistă provoacă dereglări în metabolismul glucidelor şi proteinelor.
Potasiul influenţează creşterea ţesuturilor, carenţa determină o dezvoltare slabă.
Împreună cu calciul, reglează permeabilitatea membranelor celulare, a fluidităţii
protoplasmei, intervine în schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul întră în compoziţia clorofilei, carenţa provocând dereglări grave în
structura frunzei.
Microelementele exercită roluri metabolice şi fiziologice diferite de cele ale
macroelementelor. Intră în compoziţia multor combinaţii organo-metalice complexe, cu
valoare biologică ridicată de tipul enzimelor, care controlează întreg procesul metabolic al
plantelor.

B. Compuşii organici

Sursele de carbon
Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă, în special în primele faze ale
existenţei, până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare plantulă sau
lăstar. Datorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus care
să asigure carbonul organic necesar în metabolism. Principalele surse de carbon sunt
glucidele. Acestea sunt substanţele cele mai utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă
energetică. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% în funcţie de faza de vegetaţie şi tipul de explant
folosit. Dintre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor culturilor in vitro.

Aminoacizii
Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi,
faşă de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaugă în mediu sub formă de compuşi
simpli sau complecşi. Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic,
cisteina, alanina, glutamina etc.
 Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu şi
ţesuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi plantulele
răspund favorabil la adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici. Majoritatea vitaminelor
sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavării, dar s-a
observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,1-10
mg/l; stimulează creşterea vegetativă, sporirea biomasei produsă in vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, catalizând reacţii de
baza în metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistentă la temperaturi ridicate (280oC);
inhibitor al creşterii rădăcinilor, rol în metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puţin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu
se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosită, stimulează sinteza nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate
(234-237oC); rol în metabolismul intermediar;
-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi
proliferarea celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină; la
întuneric are efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a
biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge în bună parte;
este activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), măreşte sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l;
este considerat atât vitamină cât şi glucid; stimulează diviziunea celulară.

Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe
organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice
de creştere şi dezvoltare. Există fitohormoni endogeni, sintetizaţi de plante şi fitohormoni
exogeni sau de sinteză.
Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au
nevoie, fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună creştere a
explantelor. Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele, citochininele şi
giberelinele.
Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de
citochinine. Auxina naturală descoperită este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce şi
prin sinteză pe cale industrială. Cele mai folosite auxine de sinteză sunt:
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4
diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Acţiunea auxinelor este foarte complexă datorită intreacţiunii pe care o are cu alte
substanţe regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi
redat astfel:
-stimulează diviziunea celulară;
- influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui celular;
 -modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni;
-rol important în dominanţa apicală;
-inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri, frunze, fructele tinere
şi bobocii florilor de unde circulă în toată planta. Cel mai mult se folosesc ANA şi 2,4D care
sunt mai stabile, nu se oxidează în prezenţa luminii. 2,4D este mult utilizată pentru inducerea
şi creşterea calusului şi pentru rizogeneză. La calus asigură friabilitate mare uşurând separarea
calusului pentru cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza somatică.
Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe, seminţe,
etc., iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic.
Prima citochinină izolată a fost chinetina, experimentată cu succes la culturile in vitro.
La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). În prezent se folosesc pentru culturile
de ţesuturi patru citochinine dintre care două naturale (2 IP şi zeatină) şi doua de sinteză
(chinetina şi BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor constă în:
-acţionează asupra diviziunii celulare alături de auxine;
-stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus;
-stimulează formarea lăstarilor laterali;
-stimulează sinteza proteică;
-inhibă formarea rădăcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni, iar migrarea este
dependentă de cea a glucidelor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor autoclavarea.
Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra
celulei, cu rol în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării. Cea mai utilizată giberelină este
acidul giberelic (GA3) fiind şi cea mai activă.
Acţiunea fiziologică este următoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
-stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor.
Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere, în mugurii activi, în embrioni
şi vârful rădăcinilor, circulând în plante prin vasele liberiene. Pentru meristeme giberelina este
indispensabilă în vederea alungirii lor. La alte tipuri de explante nu se recomandă giberelina
deoarece inhibă dediferenţierea celulară.
Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în
culturile in vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel:
-exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor;
-induce senescenţa ţesuturilor;
-are rol în transportul auxinei;
-se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite;
-inhibă extensia celulară.
Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor. Poate fi
utilizat pentru:
-inducerea latenţei embrionilor somatici;
-inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o perioadă mai lungă;
-inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării;
-are rol antagonist cu auxinele şi giberelinele.
Agenţii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid,
utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de suspensii
celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele
caracteristici:
 -formează cu apa un gel care se topeşte la 100oC şi se solidifică la 45 oC, rămânând
solid în condiţii normale de cultură;
-nu este toxic pentru plante şi nu este asimilat de plante;
-nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în mediul de
cultură, faţă de reţeta de mediu folosită;
-nu reacţionează cu constituenţii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită, între
0,5-1%.
Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc:
-agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura
protoplaştilor şi în prepararea gelului pentru electroforeză;
-acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor celulare şi pentru
încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale;
-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se foloseşte în concentraţii de 1,5-2,0 %
şi se gelifica la 27-31oC. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un pH mai acid,
asigurând solidificarea mediului şi în aceste condiţii.

C. Alte substanţe utilizate

Adenina are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor

adventivi, stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare. Se pare că
are o acţiune sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. De regulă se
foloseşte sub formă de sulfat de adenină, în doză de 40-80 mg/l.
Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea, creşterea
lăstarilor şi a ratei de multiplicare. Are o acţiune sinergică cu a auxinelor, în special cu AIA.
După unii autori are rol în prevenirea degradării auxinelor. Dintre compuşii fenolici cel mai
utilizat este fluoroglucinolul şi procaina.
Floroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi arborilor,
se găseşte în seva brută, mai ales la măr.
Procaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor, stimulează creşterea biomasei
explantelor, a conţinutului în pigmenţi, stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea
plantelor. Dozele utilizate sunt cuprinse între 0,1-10 mg/l.
Substanţele antioxidante se utilizează pentru prevenirea brunificărilor explantelor şi
a mediului, în special, la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari, evitând
oxidarea lor. Se folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea prelevării
explantelor, fie se adaugă în mediul de cultură. Dintre substanţele antioxidante, cele mai
folosite sunt: acidul ascorbic (50-100 mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).
Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea
fenolilor, împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului. Se foloseşte
în concentraţii de 250-1000 mg/l.
Cărbunele activ este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu
scopul de a absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu. Poate avea acţiune şi asupra
fitohormonilor (auxine), blocându-le parţial efectul, are acţiune de inhibare a formării
calusului, stimulează embriogeneza, favorizează formarea rădăcinilor.
Uneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii, de a completa
compoziţia mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. Prezenţa
acestora în mediul de cultură este facultativă.
 4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultură

Metabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa

mediului de cultură. Rădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu mediu lichid
pot produce doar lăstari vegetativi, în timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera
muguri florali. Alegerea tipului de mediu de cultură, lichid sau solid, prezintă o importanţă
deosebită.
La mediul solid, concentraţia de agar-agar, precum şi calitatea acestuia au un efect
distinct. Masa calusului de cartof se dublează atunci când concentraţia de agar-agar din mediu
creşte de la 0,8 la 1%, iar microbutaşii de anghinare prezintă fenomenul de hiperhidricitate pe
mediu cu o concentraţie de agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci când concentraţia agarului
creşte la 1,1%.
Concentraţia optimă de agar variază în funcţie de tipul de organ cultivat, de calitatea
agarului folosit şi de pH-ul mediului. În general, consistenţa mediului de cultură creşte odată
cu pH-ul acestuia.
Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o fază necesară în procesul de
micropropagare, ca în inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus în
mediu lichid. În cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate în mediu lichid cu agitare
pentru a induce lăstărirea axilară multiplă. Viteza de agitare a mediilor lichide este în general
scăzută atunci când se cultivă organe (cca 1rpm) şi ridicată în cazul culturii de suspensii
celulare (cca 100 -150rpm).
Dacă în alte tipuri de culturi nu se acordă o mare importanţă schimbului de gaze, la
culturile in vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezintă o mare importanţă pentru inoculi.
Schimburile de gaze se realizează prin difuzie, diferenţele de concentraţie între gazele din
interiorul containerelor şi cele din mediul ambiant exterior, precum şi variaţiile de
temperatură influenţând aceste schimburi. Organogeneza indirectă la morcov este stimulată de
reducerea concentraţiei de oxigen, pe când înrădăcinarea lăstarilor a fost stimulată de
creşterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit că difuzia liberă a oxigenului în ţesuturi
a afectat semnificativ capacitatea organogenică a acestora. Alte studii au demonstrat că
intervenirea unei modificări în schimburile de gaze dintre ţesuturile cultivate in vitro şi mediu
a indus apariţia unor modificări în morfologia plantulelor. De aceea, este demn de luat în
considerare şi tipul de vas de cultură folosit pentru culturile de celule şi ţesuturi, precum şi de
capacele utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.
Un alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele
regenerate in vitro este pH-ul. În practică, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 în timpul
preparării mediului de cultură. Totuşi, în dese cazuri pH-ul mediului scade în timpul
autoclavării sau chiar în timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului
vegetal. Se ştiu încă foarte puţine despre efectele acestor variaţii ale pH-ului şi despre cauzele
determinante.

4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZĂ CULTURILE DE

ŢESUTURI

Principalii factori ai mediului înconjurător sunt lumina şi temperatura. Umiditatea

relativă este irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge valori de
aproximativ 100%.

4.2.1 Lumina

Cerinţele faţă de lumină pot fi divizate în mai mulţi parametri:

 -intensitatea luminii pe unitatea de suprafaţă exprimată în W/m2 (unitatea lux nu ar
mai trebui folosită ca unitate de măsură a intensităţii luminoase, deoarece depinde de
fiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesităţilor unei plante);
-durata iluminării, exprimată în ore/zi;
-calitatea spectrală a luminii primite de plante.
Pentru culturile de ţesuturi, fotosinteza nu este o activitate necesară atâta timp cât
energia este furnizată sub forma carbohidraţilor. Totuşi, unele cercetări au evidenţiat că
fotosinteza nu este eliminată în totalitate din culturile de ţesuturi vegetale, dar este
considerabil redusă probabil datorită prezenţei zaharurilor în mediu.
Numeroase studii au dovedit că lumina este indispensabilă reglării multor procese
morfogenetice.

A.Intensitatea luminoasă

O intensitate luminoasă foarte mare poate duce la pierderi importante în culturile in

vitro. Utilizarea unei intensităţi luminoase de 50 W/m 2 (aproximativ 10000lucşi) în camerele
de creştere, intensitate folosită în mod obişnuit în fitotron, duce la încetinirea creşterii şi
scăderea capacităţii de regenerare la multe specii vegetale. Intensitatea luminoasă optimă
culturilor in vitro variază între 5 şi 25 W/m2 (1000-5000 lucşi) cele mai folosite valori fiind de
10 până la 15 W/m2. deseori, în faza a treia a micropropagării, se urmăreşte creşterea treptată
a intensităţii luminoase în vederea aclimatizării plantulelor la condiţiile de lumină din fitotron.

B.Durata iluminării

Nu există multe date cu privire la influenţa fotoperiodismului asupra morfogenezei

ţesuturilor in vitro, aşa cum există dovezi clare ale influenţei acestui parametru asupra
plantelor donor, in vivo. Se pare că în medie, calitatea luminii (intensitatea × durata luminii)
este importantă dezvoltării armonioase a plantulelor în condiţii aseptice de cultură.
În practică, marea majoritate a camerelor de creştere au o durată a iluminării de 16-18
ore/zi.
Cerinţele faţă de durata de iluminare, din camerele de creştere sunt diferite în funcţie
de natura explantului, scopul urmărit dar şi de specia la care se experimentează. Astfel, la
grâu, în cazul culturii de antere, în vederea obţinerii de produşi androgenetici, s-a dovedit că,
anterele cultivate în primele şase săptămâni la întuneric, vor forma un procent mai ridicat de
produşi androgenetici. După această perioadă, culturile vor fi incubate în condiţii normale de
fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.

C.Calitatea luminii

Numeroase studii au evidenţiat că spectrul luminos influenţează procesele fiziologice

şi morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina albastră (cca 467nm) sau violetă (cca
419nm) induce formarea de lăstari din calus de tutun, iar cea roşie (cca 660nm) induce
rizogeneza. Aceste rezultatele asemănătoare altora indică faptul că procesele morfogenetice
par a fi reglate de pigmenţii fotoreceptori, cum ar fitocromul. În mod normal, lumina „de zi”
conţine radiaţii în principal albastre, iar lumina numită „lumină albă” conţine radiaţii roşii, dar
nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale de emisie ale acestora. În general, tuburile
fluorescente albe aflate în comerţ sunt adecvate culturilor de ţesuturi.
În ultimul timp au apărut în comerţ două tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu
„lumină caldă” şi tuburi cu „lumină rece”, astfel că, o combinaţie între cele două tipuri de
tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivită pentru culturile incubate în camerele de creştere.
 4.2.2 Temperatura

În general, temperatura folosită în camerele de creştere este de 22-24oC. Aceste

temperaturi sunt la pragul critic, deoarece în interiorul vaselor de cultură temperatura poate fi
cu 2 până la 4oC mai mare decât în camera de creştere. Practic, temperatura din camera de
creştere trebuie să fie cu 2 oC mai mică decât cea necesară speciei cultivate in vitro. Speciile
provenite din climatul temperat sunt obişnuite la temperaturi mai scăzute decât speciile
tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate să se seteze
temperatura în camera de creştere la 20±1 oC , iar pentru cele tropicale la 25±1 oC.
De asemenea, temperatura în camera de creştere va fi diferită şi în funcţie de scopul
urmărit în cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat că o temperatură de cca 19 oC,
influenţează pozitiv formarea minituberculilor, în timp ce la grâu, cultura de antere necesită o
temperatură de cca 27oC.
De aceea, se recomandă ca fiecare unitate de cercetare să beneficieze de cel puţin două
camere de creştere, în care temperatura să poată fi reglată în funcţie de necesităţile explantelor
şi tipurilor de culturi existente.
În natură, plantele sunt supuse unor fluctuaţii de temperatură, iar reproducerea lor în
camera de creştere ar fi fără îndoială avantajoasă. Totuşi, prea puţine studii au fost făcute în
aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevantă.

CAPITOLUL V

5.1 ASEPSIA ŞI ASEPSIZAREA

O condiţie esenţială, în realizarea culturilor de celule şi ţesuturi vegetale, este

asigurarea unei perfecte sterilizări, nu doar a mediului de cultură şi a recipientelor, ci şi a
tuturor celorlalte componente unei culturi in vitro, cum ar fi materialul biologic, instrumentar
dar şi a suprafeţelor în care se desfăşoară astfel de activităţi.
Căile posibile de infecţie trebuie excluse cu rigurozitate. Contaminarea cu
microorganisme a recipientelor, mediului de cultură şi materialului biologic se poate produce
foarte uşor, atât în faze incipiente, în momentul inoculării, cât şi în momentul repicării
culturilor; alteori infecţiile se produc în mod pasiv, datorită ineficienţei sistemului de
închidere a vaselor de cultură, a manipulării lor neatente, sau a dezvoltării întârziate a unor
germeni care au stat în stare latentă în ţesuturile profunde ale inoculilor.

5.1.1 Sterilizarea recipientelor de cultură

Întrucât, o serie de microorganisme au spori rezistenţi la temperaturi ridicate şi la

diferiţi agenţi sterilizanţi, se recomandă presterilizarea prin căldură uscată, a sticlăriei, în
etuve, prealabil introducerii mediului de cultură în recipiente. Apoi se va proceda la o
resterilizare a recipientelor cu medii, prin căldură umedă, respectiv, prin autoclavare.
Sterilizarea prin căldură uscată se va face la 160 oC, timp de 2-3 ore, întrucât există anumite
forme de bacterii termorezistente. Durata expunerii sticlăriei la temperatură ridicată depinde şi
de modul în care aceasta a fost spălată, dacă a fost sterilizată prin autoclavare, prealabil
deschiderii flacoanelor infectate, precum şi în dependenţă de gradul de infectare al atmosferei
din laborator. Dacă însă se depăşeşte temperatură de sterilizare a sticlăriei, peste 180 oC se
poate produce degradarea calităţii acesteia şi eliberarea de compuşi toxici în mediul de
cultură.
 Pentru a preîntâmpina infecţiile rebele se recomandă, în primul rând o corectă curăţire
a sticlăriei, prin menţinerea acesteia minim patru ore în amestec cromic. Spălarea se va face
cu multă atenţie, întrucât o spălare incorectă poate reprezenta primul pas în realizarea unei
infecţii în masă a flacoanelor cu pierderi uriaşe de material biologic şi mediu de cultură.
Sticlăria nouă va fi folosită abia după spălarea şi autoclavarea acesteia, umpluta fiind
cu apă distilată, pentru a preîntâmpina trecerea unor ioni din sticlărie în mediul de cultură. În
unităţile cu activitate intensă se recomandă spălarea mecanică a sticlăriei, întrucât astfel creşte
operativitatea muncii, beneficiind astfel şi de o temperatură mai ridicată a apei de spălare, faţă
de spălarea manuală. O foarte bună curăţire a recipientelor poate fi asigurată prin spălarea
acestora cu ajutorul ultrasunetelor.
Obiectele din sticlă, cutiile Petri, pipetele, lamele de microscop, se împachetează în
hârtie, iar pachetele se aşează în tăvi metalice şi se sterilizează în etuvă, în condiţii de căldură
uscată, la 120 oC, timp de 1-2 ore.
Asepsizarea aparatelor introduse în hota cu flux de aer steril (microscop, lupă
binoculară, etc.) se va face prin ştergerea lor periodică cu alcool 70 o.
Preîntâmpinarea infecţiilor derivate din incorecta pregătire a recipientelor de cultură se
face, în primul rând, prin manipularea corectă a acestora, avându-se în vedere şi faza de
transport a lor de la autoclav până la hota cu flux de aer steril. În condiţii de producţie se
recomandă chiar utilizarea autoclavelor cu deschidere dublă. În acest caz, recipientele de
cultură se introduc în autoclav dintr-o încăpere situată în afara perimetrului steril şi se vor
scoate printr-o a doua uşă, direct în camera sterilă, ele fiind transportate cu un risc minim de a
mai putea fi contaminate.
Metodele moderne utilizate în ultimul timp presupun utilizarea recipientelor de cultură
din material plastic, fie de unică folosinţă, livrate steril de către furnizor, fie reutilizabile care
pot fi sterilizate prin autoclavate.

5.1.2 Sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate

După prepararea mediilor de cultură, în cel mai scurt timp se va proceda la

autoclavarea acestora. În vederea autoclavării, vasele prevăzute cu dopuri înfiletante nu vor fi
închise etanş pentru a permite astfel accesibilitatea aburului încălzit în recipientele cu mediu;
în caz contrar, sterilizarea mediilor se produce defectuos, doar căldura nefiind suficientă în
sterilizarea substratului de cultură folosit in vitro, căldura umedă fiind aceea care distruge
germenii.
Există diferite tipuri de autoclave, electrice sau folosind gazul ca sursă de energie, cu
orientare verticală sau orizontală, de capacitate mare sau mică. Esenţial este ca autoclavul să
funcţioneze la parametri stabiliţi, care să asigure asepsizarea corectă a mediilor de cultură,
distrugând germenii, fără a altera şi degrada substanţele încorporate în substratul de cultură.
În general se recomandă autoclavarea mediilor şi a apei distilate, la temperatura de 121 oC
(echivalentă cu presiunea de 1 atmosferă); durata menţinerii recipientelor cu medii în autoclav
depinde de volumul de lichid, respectiv de mediul introdus în flacoane, după cum urmează:
-vase de mediu conţinând între 20-50 ml – 20 minute la 121oC ;
-vase de mediu conţinând între 50-500 ml – 25 minute la 121oC ;
-vase de mediu conţinând între 500-5000 ml – 35 minute la 121oC.
Supraautoclavarea mediilor de cultură conduce la o alterare a proprietăţilor şi
calităţilor acestora şi la o deteriorare a raportului ionic. Subautoclavarea mediilor duce la
dezvoltarea de colonii de microorganisme şi care fac ca mediul să fie inutilizabil. Pentru a ne
asigura că nu ratăm o serie experimentală este indicat să amânăm inocularea şi câteva
recipiente cu mediu să le ţinem 2-3 zile într-un incubator la 37 oC. În acest mod ne vom
convinge de calitatea sterilizării substratului de cultură.
 În laboratoarele de mică capacitate, care nu deţin în dotarea lor autoclave, sau pentru
sterilizarea unor cantităţi reduse de mediu de cultură, se pot utiliza kukte în care se va
introduce apă, astfel încât să se asigure umiditatea necesară formării vaporilor. Durata
sterilizării va fi de 15-25 minute, în funcţie de volumul de mediu, din momentul în care a
început să se evacueze aburul prin supapă. Deschiderea kuktei se va face după depresurizarea
acesteia.
Mediile de cultură lichide pot fi sterilizate şi la rece, prin filtrare. Pentru acest mod de
sterilizare sunt preferate nucile filtrante din sticlă cu porozitatea de 1 micron. Avantajul
acestor nuci filtrante este ca se pot refolosi.
Substanţele termolabile folosite la prepararea mediilor de cultură (zeatina, acidul
giberelic, tiamina, piridoxina ) se sterilizează prin filtrare folosind filtre de unică folosinţă
(Millipor) şi se adaugă în mediul de cultură la o temperatură a acestuia cuprinsă între 45-50oC.
Filtrele Millipor au porozitatea cuprinsă între 0,5-0,2 microni, fiind livrate steril de
către producători, ceea ce presupune utilizarea lor numai în hota cu flux de aer steril.
Sterilizarea la rece a unor substanţe termolabile se mai poate face şi prin dizolvarea lor
în alcool, eter etilic sau acetonă, acestea evaporându-se uşor, după care substanţa solidă
solubilizată se va dizolva în apă distilată sterilă şi apoi în condiţii aseptice se va adăuga
mediului de cultură aseptic.

5.1.3 Sterilizarea materialului biologic

Provenienţa materialului vegetal va constitui un prim reper în alegerea modului de

sterilizare a organelor donatoare de explante. Substanţele alese pentru asepsizarea materialului
biologic, concentraţia acestora şi durata sterilizării vor fi selecţionate în funcţie de calitatea
materialului biologic. Estimările de acest tip se fac fie prin aprecieri de ordin subiectiv, fie pe
baza executării unor experimente de tatonare. Gradul de infecţie şi procentul de viabilitate
realizat în cultură ne ajută în adoptarea celei mai bune metode de sterilizare. De regulă,
rădăcinile sau organele subterane sunt purtătoare de nenumăraţi germeni, iar sterilizarea lor
poate ridica probleme. Mugurii şi tulpinile cu lenticele, precum şi organele cu pilozitate
ridicată prezintă inconvenientul aderării sporilor şi a germenilor la nivelul formaţiunilor
epidermale, ceea ce creează serioase impedimente în sterilizare cu atât mai mult cu cât, în
momentul imersiei lor în soluţia dezinfectantă, se interpune, între suprafaţa epidermei şi
soluţie, un strat de aer, peliculă care împiedică accesibilitatea dezinfectantului la epidermă.
Pentru micşorarea tensiunii superficiale în soluţia de sterilizat se vor adăuga câteva picături de
Tween 20 sau Tween 80.
Dezinfectantul trebuie să fie suficient de puternic încât, în scurt timp, să distrugă
microorganismele aderente la suprafaţa organelor dar, totodată, să nu pătrundă prea mult în
profunzimea acestora.
O altă condiţie pe care trebuie să o îndeplinească agenţii dezinfectanţi este aceea de a
putea fi îndepărtaţi cu uşurinţă de pe materialul biologic, prin spălări succesive cu apă
distilată sterilă.
Dezinfectanţii utilizaţi frecvent asigură o sterilizare de suprafaţă, dar foarte multe
bacterii, virusuri sau micoplasme sunt localizate în celule situate în profunzimea organelor,
ceea ce ridică probleme deosebit de complicate privind depistarea şi prevenirea dezvoltării
lor. Pentru a reduce posibilitatea apariţiei unor astfel de infecţii, dar şi pentru a cunoaşte cu
exactitate natura lor, este obligatorie efectuarea unui control fitopatologic sever al plantelor
donatoare de explante.
La unele plante (muşcate, kiwi) se pot lua măsuri mai speciale de dezinfectare. Astfel
materialul se introduce în alcool (96 o) după care acesta va fi trecut rapid trecut prin flacără,
iar după aprindere va fi plonjat în apă distilată sterilă.
 Un dezinfectant cu utilizare frecventă, cu acţiune rapidă şi eficientă este alcoolul etilic.
Trebuie avut în vedere faptul că alcoolul este liposolubilizant, coagulează proteinele, după
pătrunderea lui în celule şi cauzează o deshidratare puternică a ţesuturilor. Ca atare,
fragmentele de organe vor fi plonjate un timp foarte scurt în alcool (30-60 secunde) după care
vor fi introduse rapid în apă distilată sterilă.
Materialul biologic puternic infectat, după spălare în apă, imersie în alcool şi apoi în
apă distilată sterilă, necesită o continuare a sterilizării cu unul dintre agenţii de sterilizare
utilizaţi frecvent (tabelul 5.1).
Obişnuit se utilizează soluţiile de hipoclorit de calciu şi sodiu în concentraţii variabile.
De regulă, se procedează la imersia în dezinfectant a unor fragmente mult mai mari, ca
dimensiune, decât viitorul inocul (pentru a proteja celulele explantului de necrozele provocate
de către agentul sterilizant). La nivelul suprafeţelor secţionate, hipocloritul cauzează o albire a
zonelor traumatizate, sub acţiunea directă a clorului, ceea ce ne dă şi o certitudine privind
eficacitatea dezinfectantului.
Întrucât zonele albite sunt traumatizate, respectiv distruse de către agentul sterilizant,
ele vor fi îndepărtate, în momentul delimitării şi fasonării explantelor.

Tabelul 5.1
Agenţii de sterilizare utilizaţi frecvent în
culturile in vitro (după Street, 1977)
Uşurinţa Durata
Nr. Compus Concentraţia
de sterilizării Eficacitate
crt. chimic utilizată
înlăturare (minute)
Hipoclorit
1. 9-10 % +++ 5-30 f. bună
de calciu
Hipoclorit
2. 2-5 % +++ 5-30 f. bună
de sodiu
Apă
3. 10-12 % +++++ 5-15 f. bună
oxigenată
Apă
4. 1-2 % + 2-10 f. bună
bromată
Azotat de
5. 1% + 5-30 f. bună
argint
Clorură
6. 0,1-1 % + 2-10 Satisfăcătoare
mercurică
Destul de
7. Antibiotice 4-50 mg/l ++ 30-60
bună

Hipocloritul este puternic alcalin şi, în unele cazuri, se recomandă ca în prima

clătire cu apă distilată sterilă să se adauge câteva picături de acid clorhidric diluat, acidulând
astfel uşor apă distilată sterilă; operaţiunea are drept scop extragerea clorului prezent în
straturile superficiale de celule. Pentru îndepărtarea soluţiei dezinfectante se recomandă
clătirea repetată, în cinci reprize, cu apă distilată sterilă, a câte 10-15 minute fiecare. Atât în
cursul sterilizării cât şi al clătirii, materialul vegetal trebuie agitat continuu.

5.1.4 Sterilizarea încăperilor şi a suprafeţelor

O primă măsură, cu caracter preventiv, constă în menţinerea unei curăţenii exemplare

în încăperile destinate laboratorului de culturi de celule şi ţesuturi vegetale.
Înainte de efectuarea tuturor operaţiunilor dintr-un astfel de laborator, se impune
sterilizarea cu radiaţii UV a încăperilor şi mai ales a camerei sterile, unde se execută cea mai
importantă etapă – inocularea pe medii aseptice.
 Radiaţiile UV vor fi întrerupte, cu aproximativ 30 minute înainte de începerea
operaţiunilor în zona sterilă, întrucât periclitează sănătatea operatorilor. Ozonul acumulat în
încăperi, în cursul iradierii va fi lăsat să difuzeze pasiv din zonele sterilizate.
Casoletele cu recipiente, conţinând mediile sterile sau flacoanele după inoculare, vor fi
stocate în apropierea surselor de UV. În cazul în care mediile, după autoclavare, nu sunt
utilizate imediat, ele pot fi păstrate pentru câteva zile în camerele frigorifice, la 4 oC.
Înainte de începerea activităţilor de inoculare în hota cu flux de aer steril, se şterge
suprafaţa de lucru cu alcool 70 o, iar incinta sterilă se pune în funcţiune cu 20-30 minute
înainte de orice activitate pentru ca fluxul de aer steril să baleeze suprafaţa de lucru. Dacă se
lucrează şi se inoculează la cca 20 cm de flacără, pericolul de contaminare cu germeni este
minim.
În perioada executării operaţiunilor în hota cu flux de aer steril, este indicată
îndepărtarea bijuteriilor, a ceasului şi brăţărilor de pe mâini şi sterilizarea cu alcool 70 o a
degetelor, insistând la unghii.
Instrumentarul cu care se va lucra în camera sterilă, este bine să fie presterilizat, fie în
baia electrică de aseptizat instrumentar chirurgical fie în pupinel, timp de cca o oră, sau prin
menţinerea acestora sub acţiune directă a razelor UV. Înainte de începerea operaţiunilor,
instrumentele vor fi introduse în alcool şi flambate, apoi vor fi aşezate pe diverse suporturi
(cutii Petri sterile, tăviţe folosite doar în hotă, etc.) pentru a se răci. Ele vor fi utilizate pentru
dimensionarea explantelor abia după răcire, în caz contrar, temperatura ridicată a acestora
poate traumatiza profund explantul. Instrumentele tăioase, după introducere în alcool, se trec
prin flacără, timp de o fracţiune de secundă, iar apoi vor fi plonjate într-un recipient cu apă
distilată sterilă.
Flacoanele cu medii, atunci când modul de obturare îl permite, prealabil deschiderii
lor vor fi trecute prin flacără, rotindu-se gâtul acestora astfel încât flacăra să ajungă în contact
cu toată circumferinţa deschiderii. După scoaterea dopurilor, sau capacelor, flacoanele vor fi
flambate din nou, apoi se execută inoculare urmând ca la final operaţiunea de flambare să se
repete.
Operatorii care execută lucrări în camera sterilă, la hota cu flux de aer steril, trebuie să
fie bine instruiţi din punct de vedere teoretic, să fie echipaţi corespunzător, cu halate albe,
bonetă şi mască pe figură, pentru a evita expirarea direct pe materialul vegetal. De asemenea,
la hotele care permit lucru a două persoane concomitent, acestea vor evita discuţiile între ele,
rezumându-se la strictul necesar. Este indicat ca personalul să-şi spele mâinile cu apă şi
săpun, înainte de începerea activităţii, după care atât înainte cât şi în mod repetat, în timpul
operaţiunilor efectuate, să se clătească cu alcool 70 o.

CAPITOLUL VI

6.1 INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

6.1.1 Aspecte generale privind condiţiile aseptice de cultură

Prima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este
asepsia. Mediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor,
creşterea cărora este mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea
proceselor fiziologice ale ţesuturilor cultivate. De aceea un laborator de culturi de ţesuturi este
organizat şi păstrat într-o asepsie strictă asemeni unei săli de operaţie.
Principalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt:
1) Aerul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau
fungilor.
 2) Ţesuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şi/sau bacterii. Cele mai
infectate organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ (rădăcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile şi
ciupercile se dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor, în vasele conducătoare libero-lemnoase sau
în spaţiile intercelulare, caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor, iar folosirea
antibioticelor nu este recomandată.
3) Corpul uman, care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie.
Metodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt:
a) Produsele chimice, care distrug microorganismele:
-hipoclorit de sodiu;
-hipoclorit de calciu;
-mercurobutol;
-cloridă mercurică;
-produse bactericide şi fungicide;
-etanol 70-80%.
b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare.
c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), căldură umedă pentru
sterilizarea mediilor de cultură şi a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, căldură uscată (etuvă)
pentru sterilizarea sticlăriei.
d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.
e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea
particulelor mai mari de 0,22µm. Filtrarea este realizată de un ventilator-extractor ce asigură o
ventilaţie constantă cu o viteză optimă şi are avantajul de a menţine steril aerul din incinta
hotei cu flux laminar. În momentul de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt
prevăzute cu hote cu flux laminar de aer steril.

6.1.2 Prepararea mediului de cultură

Datorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este
necesară alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul
preparării se vor bifa, pe rând, toate elementele măsurate şi introduse, ţinându-se seama cu
stricteţe de volumul final al mediului.
Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a
soluţiilor stoc, erorile, corecţiile, provenienţa agarului, calitatea apei. În aparenţa sunt factori
ce nu prezintă o mare importanţă, dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte
mare măsură de calitatea mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus.
Etapele preparării unui mediu de cultură sunt:
1)Diluţia sărurilor minerale: macro- şi microelemente, apoi ajustarea la volumul final.
2)Măsurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; în general pH-ul este de 5,5-5,8.
3)Adiţia zaharurilor (sucrozei) urmată de adiţia agarului, care se adaugă în ploaie în
timp ce mediul este amestecat tot timpul.
4)Sterilizarea mediului de cultură la 120oC între 20-30 minute, în funcţie de cantitatea
de mediu din recipient.
5)Adăugarea vitaminelor şi hormonilor (sterilizaţi prin filtrare) în mediu se face atunci
când temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.
6)Repartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după adiţia
vitaminelor şi fitohormonilor.

Observaţii
Mediile de cultură pot fi preparate în vase Erlenmeyer, dacă se prepară cantităţi mici
(mai puţin de un litru), iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în kuktă.
Pentru cantităţi mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac
termorezistent.
Dacă mediul conţine substanţe labile termic, substanţele vor fi dizolvate separat, apoi
sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil. Acest procedeu se
execută în hota cu flux laminar de aer steril.
Dacă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate, adiţia
mediului de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile, la gura becului de gaz
unde temperatura este de aproximativ 40oC, după ce gura vasului Erlenmeyer în care se află
mediul s-a trecut prin flacără pentru flambare.
Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul înainte de sterilizarea mediului. A
se evita hârtia de pH deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui pH
corect se reflectă în succesul culturii in vitro. Agarul şi zaharoza nu schimbă pH-ul mediului,
de aceea ajustarea acestuia se face înainte de adiţia celor două componente.
Pentru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente
auxiliare, în care se va goli o cantitate aproximativ egală cu cea necesară preparării mediului
de cultură, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optimă.

6.1.3 Izolarea şi inocularea explantelor

Din punct de vedere teoretic, toate părţile unei plante pot constitui explante pentru
iniţierea unei culturi de ţesuturi, datorită totipotenţei celulare, proprietate a celulei vegetale de
a regenera în mod normal un individ întreg, identic cu planta donor.
Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse două tehnici obligatorii:
-stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă întreagă cultivată
în condiţii nesterile (prima etapă a micropropagării vegetale);
-menţinerea asepsiei unei culturi deja iniţiate prin transplantarea inoculilor în condiţii
aseptice pe alte medii de cultură (etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare
vegetativă).
Prima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei
sterilizări corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură.

A.Sterilizarea ţesuturilor
Sterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro este dificilă
deoarece gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare
trebuie utilizate diferite substanţe chimice, în diferite concentraţii cu durate diferite de timp
pentru imersarea ţesuturilor. În general, părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin
infectate cu bacterii şi fungi decât cele subterane. Dificultatea sterilizării constă în necesitatea
absolută de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel încât
să nu se distrugă şi celulele vegetale (care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile
sau fungii). De aceea, este absolut necesară stabilirea unui timp optim de imersare a
ţesuturilor în soluţiile sterilizante.
Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime
sunt:
-fasonarea peţiolului în fragmente de aproximativ 1cm lungime;
-imersia fragmentelor de peţiol în etanol 70% timp de 20 secunde;
-imersia în hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continuă a vasului
în care se realizează imersia;
-efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului
de sterilizare.
 Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu
penetrează ţesutul vegetal. Este totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie
preparat imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin
agitare continuă timp de aproximativ 10 minute, după care, soluţia formată se filtrează, iar
filtratul se utilizează imediat. Concentraţiile standard folosite sunt de 4% şi 8%, iar timpul de
imersie variază între 5 şi 30 de minute.
Alţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt:
Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat în pungi de plastic cu
titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraţii între 5% şi 20% v/v. Timpul necesar pentru
realizarea unei sterilizări optime la o diluţie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest
produs penetrează ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea
capacităţii regenerative a ţesuturilor cultivate in vitro.
Biclorura mercurică (otravă puternică), HgCl2 – este un sterilizant foarte eficient,
folosit în doze mici de ordinul 0,01% până la 0,05%. Este dificil de înlăturat deoarece are
aderenţă crescută la ţesuturi, necesitând clătiri repetate, fiind recomandate cinci-şase clătiri
comparativ cu trei în alte cazuri.
Mercurobutol – este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii.
Conţine un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa, dar este foarte dificil de
înlăturat necesitând efectuarea a două, trei clătiri cu alcool etilic de 70%.
Trebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează
numai la suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă
sterilizarea lor.
În unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesară, cum ar cazul meristemelor
bine protejate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor protejate în spic.

B.Pregătirea echipamentului necesar sterilizării şi lucrului la hota cu flux laminar

steril
Înainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de
fasonare şi inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal, activităţi ce se
realizează în condiţii sterile, este necesară pregătirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul
unde se vor realiza etapele precizate.

Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape:

- se şterg, cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de 70%, toate suprafeţele orizontale şi
verticale din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru;
- se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei;
- se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei;
- se porneşte lampa UV, iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia.
În cazul hotelor cu flux de aer laminar (alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele)
steril este suficient, ca înainte de utilizare, să se şteargă cu alcool etilic 70% toate suprafeţele
interioare, în special suprafaţa de lucru. La acest tip de hotă, filtrul de aer nu trebuie
pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil.
Pregătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului:
- se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz, după înmuierea în alcool
90%; este recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument;
- instrumentele se imersează în alcool etilic 70% în vase de sticlă dacă nu se foloseşte
flambarea şi în alcool de 90-96% dacă se doreşte flambarea acestora;
- hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se
sterilizează prin autoclavare;
- vasele Petri sterilizate în prealabil în etuvă la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de
hârtie sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate, doar în hota sterilizată;
- mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil
doar la hotă, când aceasta este pornită;
- se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu;
- se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă, pentru clătirea materialului vegetal, sau a
instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool, fără flambare.

C.Operaţiunile ce se execută la hota cu flux de aer steril

Menţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi necesare:
- înainte de a începe lucrul la hotă, operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun (preferabil
cu mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă), să-şi suflece mânecile halatului până mai sus
de coate, să-şi frece palmele, încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool 70% sau cu
mercurobutol şi să se clătească cu apă distilată sterilă;
- mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dată când vin în contact
cu materiale nesterile (păr, haine, etc);
- instrumentarul se schimbă des, după două până la maximum cinci explante, şi se sterilizează
prin flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă;
- explantele se fasonează cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină, mai ales
când se doreşte obţinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau
extrase cu ajutorul pensetelor cu vârf subţire, în cazul anterelor, ovulelor, etc;
- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în
contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro;
- orice explant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de
lucru sterilă, va fi eliminat;
- dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu
gura în jos;
- gâturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra
becului de gaz;
- odată cu terminarea lucrului, alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise, pentru
siguranţă.

6.1.4 Menţinerea culturilor

În general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu
o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-25o şi un
fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.
Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd în general
după câteva zile.

6.1.5 Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora

Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. După simptomele
manifestate putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie.
Dacă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textură
mată sau pufoasă, de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. Penicillium generează un
miceliu de culoare gri mat, pe când Rhizopus nigricans, care se şi multiplică foarte repede şi
care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau aruncare,
formează miceliu de culoare închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră.
 Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase
în interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. Această pastă este uneori colorată roz sau
galben.
Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de
cultură, şi dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi explantul. Dacă
infecţia porneşte din alt punct al mediului de cultură, sursa poate fi aerul, sterilizarea
ineficientă a mediului sau din apa condensată pe capacul recipientului de cultură. În unele
cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavării, de aceea este necesară
clătirea sticlăriei în clorură lichidă. Atunci când se observă dezvoltarea unui miceliu de
Penicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a operatorului. Manipularea
necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de cultură in
vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la hota cu
flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului,
transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.
Se poate ca, în cursul culturii, să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii, caz în
care mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totuşi, culturile pot fi infectate
şi cea mai sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu 2g/l peptonă (un component
obligatoriu în mediile de creştere ale bacteriilor). Prin această metodă se testează culturile şi
de elimină vasele de cultură infectate, obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii.

6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi în culturile in vitro

Se poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii, iar
alteori, în aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. Problema poate fi dată de condiţiile de
cultură, care sunt rareori identice, condiţiile climaterice din camera de creştere se pot
schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu
minor în aparenţă, poate schimba întreaga evoluţie a culturii, de aceea atenţia şi
meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui operator in vitro.
În continuare se prezintă câteva exemple concludente:
- creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce
duce la încetinirea creşterii inoculilor;
- utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica
funcţionarea ţesuturilor;
- unele capace căptuşite conţin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare în apa
condensată, să otrăvească ţesuturile; de aceea, este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli
înainte de folosirea capacelor;
- condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din exteriorul vasului este
cu câteva grade mai mică decât cea din interior, cauza putând fi expunerea directă a culturilor
la aerul rece suflat de aparatele de climatizare.

6.1.7 Metode de iniţiere a unor tipuri de culturi din diferite explante

6.1.7.1 Cultura de rădăcini

Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate.

Tehnicile de cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a
cercetărilor efectuate în această direcţie. Astfel, White a dovedit că rădăcini detaşate de la
plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate.
În general, se utilizează rădăcina primară, embrionară, prelevată de la plantulele
formate prin germinarea seminţelor în condiţii aseptice. Principala problemă care se ridică, în
acest caz, este aceea a realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. Sămânţa sănătoasă, cu
tegumentele întregi, nelezate, are ţesuturi embrionare neinfectate. Seminţele pot fi
dezinfectate folosind agenţi puternici de sterilizare întrucât prezenţa tegumentului protejează
formaţiunile embrionare de toxicitatea soluţiei de sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare a
sterilizării, izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei rădăcini primare prelevate de la o
plantulă de mazăre. Aproximativ 20 seminţe de mazăre, cu tegumentul întreg, se introduc într-
un vas Erlenmayer, în aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agită seminţele, iar după cca 10
secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de hipoclorit de calciu
10%, timp de 20 minute, toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. După cele 20
minute se decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de
apă distilată sterilă. După clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide, ca urmare a
infiltrării apei sub tegument, iar seminţele întregi se inoculează, tot în condiţii sterile, în vase
Petri, în care a fost repartizat un mediu de cultură MS (Murashige-Skoog) simplu constituit
din soluţia stoc de macroelemente şi agar 6,5%. Seminţele se incubează la întuneric, în
condiţii controlate, timp de 48 ore, după care, când rădăciniţa plantulei atinge lungimea de
aproximativ 20 mm, în condiţii aseptice, se detaşează vârful rădăciniţei (cca 5-10 mm) şi se
inoculează tot în vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un mediu de cultură constituit din
macroelemente şi zaharoză, pH-ul fiind 5,8 (Reinert şi Yeoman, 1982).
Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de
microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza şi medii mai complexe, clasice, iar ca
sursă de carbon organic poate fi folosită glucoza în loc de zaharoză. Creşterea rădăcinilor in
vitro are loc pe medii de cultură lichide neagitate. Zilnic se poate urmări dezvoltarea
radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia Petri a unei hârtii milimetrice.
De obicei, după 21 zile de cultură se constată o plafonare a creşterii, moment în care
se recomandă subcultivarea rădăcinilor, prin excizarea apexului şi transferarea lui pe mediu
proaspăt. Subcultura se poate face şi la interval de 7 zile. După aproximativ două subculturi,
este oportună introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic, în dozele
normale, utilizate pentru alte tipuri de explante.
Prin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare.
Street precizează că auxina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de
tomate cât şi diviziunea celulelor meristemului apical. Utilizând culturi de rădăcini, pe diferite
tipuri de medii, ca şi compoziţie şi consistenţă, s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni
de creştere, al elementelor chimice sau al unor substanţe organice, în formarea rădăcinilor, în
creşterea lor, precum şi urmările carenţării celulelor lor în anumite elemente. Prin
extrapolarea acestor rezultate, s-a reuşit îmbogăţirea, an de an, a cunoştinţelor privind
funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general.
De asemenea, din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus, mai ales din cele
principale sau din cele îngroşate secundar. Procesele de organogeneză, la nivelul rădăcinilor
netransformate în calus, se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. Geneza de
muguraşi şi tulpiniţe are loc la nivelul ţesutului calusal, provenit din rădăcini, sau pe explante
radiculare.

6.1.7.2 Cultura de meristeme

Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-şi menţin, în tot cursul
vieţii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formând
mereu noi celule. Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor (tulpini sau
rădăcini), fiind meristeme apicale, de tip primar, cu rol în creşterea în lungimea organelor;
meristeme primare găsim şi în straturile profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. La organele ce
suferă procese de modificare secundară morfo-anatomică, îngroşări, întâlnim meristeme
secundare, respectiv cambiul şi felogenul. De regulă, prin termenul de cultură de meristeme se
înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.
Masivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară
maximum 500 µ (Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru şi 0,25-0,30 mm
lungime (Kartha, 1981). În cazul în care se depăşeşte această dimensiune, vorbim despre o
cultură de apex.
Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare, ce le conferă
capacitatea de a se menţine într-o continuă stare de proliferare, cum ar fi:
-au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar;
-sunt bogate în citoplasmă, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli
bine reliefaţi;
-vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.
În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele
meristematice sunt mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare. Meristemele primare
au celule de forma poligonală iar meristemele secundare au formă tabulară. Celulele derivate
din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziţie radială, respectiv toate celulele
generate dintr-o celulă meristematică mamă sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a
dat naştere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic,
dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi
corpusul.
La meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă
la tulpină.
Forma, mărimea şi conformaţia meristemului apical, caulinar variază mult la diferitele
specii dar, în mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor
vasculare, meristemul la gimnosperme şi meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă, este
protejat în mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, în apexul căruia se află meristemul. Prin
diviziunea continuă a meristemului rezultă celule care, pe măsură ce se îndepărtează de apex
se diferenţiază funcţional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de creştere sau
vârf vegetativ) se pliază, iar protuberanţele rezultate constituie primordiile. Cu timpul,
primordiile se diferenţiază în primordii foliare sau florale. De regulă, în primordiile florale se
produce o creştere a intensităţii ratei de multiplicare celulară, aceşti muguri devin mai
bombaţi, mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se diferenţiază în xilem, floem şi ţesut
parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se întâlnesc primordii
transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai mari, fie în boboci, respectiv în componente
florale. Mugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată, graţie faptului că deţin ţesuturi
tinere, slab diferenţiate şi celule meristematice. Meristemele apicale posedă o relativă
autonomie, fapt încă insuficient argumentat şi dovedit experimental. În evoluţia in vitro a
explantelor meristematice, un rol important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor.
Primordiile florale recoltate în faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se
transformă în floare. Adeseori, funcţie de specie, la nivelul învelişurilor florale se poate
induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive.
Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în
cele metamorfozate (rădăcini tuberizate). De regulă, cambiul constituie o principală zonă
regenerativă.
Ţesuturile inoculate pe medii aseptice, de regulă, diferenţiate morfofuncţional, trebuie
să se dediferenţieze, fenomen ce se petrece în etape succesive, până la reîntoarcerea lor la
starea de meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dediferenţiere
celulară se produce şi spontan, de exemplu în cazul iniţierii unor meristeme, sau al genezei de
rădăcini secundare din celulele periciclului radicular.
Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus,
dediferenţiere primară, din care se poate ajunge la un stadiu de dediferenţiere secundară, când
o parte din celulele calusului se transformă în meristeme, generatoare de rădăcini sau tulpini.
Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de
promeristeme şi de iniţiere a organogenezei.
În cultura de meristeme, meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare
subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de Lupinus albus şi
Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenţialitatea
organogenetică a diferitelor părţi ale apexului.
În prezent, o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei
meristemului cultivat in vitro, în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ, precum
şi a rolului primordiilor. Este evident faptul că un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice,
îşi poate manifesta totipotenţialitatea sa reală; în condiţiile inoculării lui împreună cu
primordiile, ori in situ, această capacitate este mascată de corelaţiile existente ca urmare a
prezenţei alături de meristem şi a celorlalte ţesuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului
solitar, sau a celui însoţit de primordii, este dependentă de fitohormonii de creştere prezenţi în
mediul de cultură. Se pare că primordiile, chiar în faza în care frunzele sunt abia schiţate, se
pot transforma fie în frunze, fie în muguri floriferi. Experienţele de microchirurgie ale lui
Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight şi Koehnert (1969), precum şi ale altor autori, au
permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă
morfofuncţional. Problema transformărilor morfologice şi structurale, în cadrul proceselor de
tranziţie care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală, precum şi a
celor legate de reversia meristemelor iniţial florale, în meristeme vegetative constituie punctul
de plecare în multiplicarea vegetativă in vitro, pornind de la explante constând din boboci sau
din învelişuri florale. La conopidă, în faza de preinflorescenţă, Margara (1982) se pot distinge
trei categorii de meristeme: vegetativ, de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor.
Definitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical, din vegetativ în floral,
depinde de o serie de factori exogeni – fotoperioadă, temperatură – sau endogeni – specie,
hormoni.
În condiţiile cultivării unor explante in vitro, celulele ţesuturilor inoculate pe medii
aseptice suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme. Din aceste meristeme,
prin rediferenţiere, vor lua naştere organe. Organogeneza constituie momentul de bază în
asigurarea multiplicării vegetative.
De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice, aflate într-
un stadiu tânăr, nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini, sau în meristem
generator de tulpini, fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematică
incipientă, există şi un alt termen, întâlnit în literatura de specialitate – meristemoid (Torrey,
1966). Această noţiune se referă la formaţiuni meristematice, abia schiţate, cu direcţie de
dezvoltare nedeterminată, aparent identice din punct de vedere morfologic.
Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al
tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate că axa caulinară şi cea radiculară, în evoluţia
filogenetică, au o origine comună. Diferenţierea funcţională a meristemului se face, probabil,
în stadiul de promeristem; în cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de
meristeme ce evoluează în: meristem proliferativ, meristem generator de rădăcini şi meristem
de tip caulogen. Dar nu se cunoaşte dacă aceşti meristemoizi sunt identici sau prezintă deja
amprenta determinismului lor funcţional, radicular şi caulinar.
Meristemele radiculare, funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii:
 -meristem apical – situat în vârful rădăcinilor;
-meristem lateral – format pe rădăcina principală;
-meristem adventiv – provocat în a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor
organe, care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. Inducerea formării acestor
meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi, marcote
sau organe de rezervă;
-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv.
Meristemele caulinare pot fi împărţite astfel:
-meristeme apicale (terminale) – derivate din muguraşul embrionului;
-meristeme axilare – aflate la axila frunzelor;
-meristeme adventive – formate pe diverse organe;
-meristeme neoformate – generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.
Formarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control
genetic şi hormonal. Factorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a
proceselor de organogeneză. Hormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori
cu rol hotărâtor în direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor, în meristeme
radiculare sau caulinare. Auxinele intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar
citochininele în neogeneza de muguraşi.
Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi
de micropropagare a o serie de specii de interes economic.
Astfel, se poate concluziona faptul că, la plantele superioare există o diversitate de
meristeme clasificate, după localizarea lor în plantă. Meristemele mai pot fi clasificate şi în
alte două categorii:
-meristeme histogene – care produc obişnuit numai ţesuturi;
-meristeme organogene – care dau naştere la ţesuturi ce formează organe;
Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structură şi
funcţiune, meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural şi funcţional. Ele
variază ca aspect şi potenţialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale,
constituie, în fapt, un microbutaş, întrucât vârful vegetativ al plantei, inoculat in vitro îşi
formează un propriu sistem radicular, în partea sa bazală. În consecinţă, acest tip de meristem
este frecvent folosit în tehnicile de multiplicare şi de propagare accelerată a plantelor, pe
medii aseptice.
Potenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este, de regulă, extrem de mare. Ele se
adaptează bine la condiţiile in vitro, suportă uşor traumatismul provocat de explantare,
reluându-şi activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice, generând plante. Acest fapt
presupune atât creşterea axei mugurelui şi a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzuliţelor, cât
şi neogeneza de rădăcini. În final, meristemul terminal, apical sau axial generează una sau mai
multe plante, în funcţie de balanţa hormonală prezentă în mediul de cultură. Meristemele
terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridică probleme speciale, întrucât ele aparţin unor
plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce îngreunează o alimentare optimă a lor cu
apă, cu nutrienţi şi hormoni. Acest lucru constituie impedimente fiziologice care, pe plan
funcţional, se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative a celulelor lor, soldată cu o
scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme.
Meristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în
tot cursul vieţii plantei. Excepţie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul
apical în decursul sezonului de iarnă se află în stare de latenţă.
Prin intermediul culturii de meristeme – apicale, terminale sau laterale, se poate
realiza o rapidă multiplicare clonală a plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii
silvice.
 Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din
punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare, fapt deosebit de important în horticultură,
asigurându-se astfel o multiplicare clonală.
Un alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor,
este acela al obţinerii de material săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de
atac fitopatogen. Plantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de prima pereche
de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de
combătut în condiţiile înmulţirii vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin
seminţe poate asigura, într-o oarecare măsură, eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut
fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie de viroze. Dar nenumărate plante
horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau, la unele soiuri, multiplicarea prin seminţe este
dificilă (orhidee), ori seminţele nu sunt fertile, ceea ce a făcut ca înmulţirea acestora pe cale
vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. Pe de altă parte, multiplicarea
plantelor pe cale asexuată, prin metode de înmulţire vegetativă clasică, a condus la
degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării, an de an, a infecţiilor virale. Astfel,
o cultură sănătoasă de garoafe (Rudelle, 1977), înmulţite timp de cinci ani prin butăşire
clasică, a prezentat o răspândire în masă a virozelor, multe din ele, cauzând degenerări.
Totodată, multiplicarea vegetativă, prin metode tradiţionale, are drept consecinţă şi o
perpetuare a unor mutaţii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, în floricultură şi în
arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora,
producţia realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a
calităţii lor. Butaşii obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi
realizează un procent scăzut de prindere. Pe de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a
unor plante virozate se creează pericolul transmiterii virusurilor şi la alte plante, prin vectorii
biologici prezenţi în cultură.
Primele încercări de cultivare a extremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca
fiind realizate încă din 1922, de către Kotte şi de către Robbins, la mazăre şi porumb, dar fără
mare succes. Ulterior, în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice la
Lupinus albus şi la Trapaeolum majus. Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de
meristeme nu era cunoscută, abia începând din anul 1949, prin lucrările lui Wetmore şi Morel
s-au pus bazele cercetărilor sistematice privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice
la condiţii de cultură, precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor
diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate în condiţii variate de mediu.
Dacă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball,
în schimb prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase, devirozate, prin cultura
in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960).
Inspirat fiind de rezultatele obţinute între anii 1949-1950 de către Limasset şi Cornuet, Morel
a avut intuiţia de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 µm lăţime şi 150-
200 µm înălţime, cu 1-2 primordii foliare.
Experienţele efectuate de Limasset şi Cornuet au constat în urmărirea, prin analize
serologice, a gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative
aeriene a plantelor la diferite distanţe de apex. Ei au constatat o distribuţie inegală a
virusurilor în corpul plantelor şi au observat un gradient mai scăzut de infecţie virală, pe
măsura apropierii de vârful vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redusă infecţie
virală a fost semnalată în sucul extras din frunzele aflate încă în mugur. Pornind de la aceste
fapte, Limasset şi Cornuet au extirpat, aseptic o calotă de ţesut apical sau meristem şi câteva
primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun, lezată printr-o scarificare
superficială. După trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de tutun,
pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematică, au fost virozate în proporţie de 60%, în
timp ce frunzele pe care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai
îndepărtate de meristem) s-a infectat în procent de 100%. Aceste experienţe ia condus pe
Limasset şi Cornuet la concluzia că în apexul caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este
oprită.
Încă din 1952, Morel şi Martin au intuit faptul că, pornind de la plante virozate, prin
explantarea şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obţine o plantă
sănătoasă, conservând, în acelaşi timp, caracterele genetice ale plantei mamă. Această ipoteză
a fost atestată de către Morel şi Martin prin experienţe efectuate cu plante de dalie. Cultura de
dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat şi pus în practică de
către Morel şi Martin. Tulpinile generate in vitro, neposedând rădăcini, au fost transformate în
minibutaşi. Aceştia au dat naştere la plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii şi
orhideele. În 1957, Quak a remarcat că metoda lui Morel şi Martin este posibil de aplicat, cu
aceleaşi rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat cercetările în scopul stabilirii
unor metode intensive, industriale, de controlare şi producere a unui material săditor sănătos,
cu randament economic asigurat, având ca obiectiv obţinerea de flori de calitate superioară.
În acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la
atacul viral. Dacă prelevarea se face de la o plantă neinfectată, sau care prezintă o infecţie
virală slabă, atunci cresc şi mai mult şansele de a preleva explante meristematice, lipsite de
infecţii virale.
Din păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot îmbolnăvi tot atât
de repede ca şi oricare altă plantă. De regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură
multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii de
propagule, sau se constituie o plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de butaşi,
plantaţie executată în condiţii speciale de protecţie, încât plantele să fie ferite de atac
zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante
meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. Astfel, la
garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium şi
Diffenbachia eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetările recente au dovedit însă, că nu toate meristemele sunt libere de infecţii
virale. Invazia meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul meristemului, al virusului şi
de specia plantei parazitate. Cu cât explantele meristematice sunt mai mici, cu atât şansa
prelevării de celule lipsite de virusuri este mai mare, dar cu cât inoculul meristematic este mai
mare, cu atât este mai ridicată capacitatea lor regenerativă.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică (Martin,
1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai
în procent de 1%. Unele virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de
combatere a infecţiilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborată de către Kunkel, în
1936. Aceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între 35-39oC,
timp de 2-4 săptămâni. În cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică; ele rămân
la nivelul celulelor în care au fost surprinse în momentul declanşării tratamentului
termoterapeutic.
Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu şanse foarte mari
de reuşită, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. În consecinţă, mersitemele
sunt prelevate de la plante supuse, prealabil explantării, tratamentului termoterapeutic. Dar, în
această situaţie, descreşte vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scăderea capacităţii
de supravieţuire şi de regenerare a celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se
alungeşte iar virusurile, nemultiplicându-se, rămân în celulele bazale ale conului vegetativ,
ceea ce înlesneşte prelevarea unor explante apicale mai mari de până la 1 mm, micşorând
pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului, infectate cu germeni fitopatogeni.
În consecinţă, explantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai
mari, capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată, ceea ce compensează
epuizarea fiziologică, cauzată de termoterapie.
Kassanis (1950) a dovedit că unul din virusurile cartofului, localizat în frunze, poate fi
inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat că la
tomate există virusuri a căror activitate este suprimată abia la 80oC. acesta a fost unul dintre
motivele care i-a determinat pe cercetători să prelungească durata termoterapiei, de la câteva
zile la câteva luni şi să ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart şi Quak (1964), experimentând cu meristeme excizate de la crizanteme, de
până la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat că prelungirea duratei de
termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la
9 la 90% dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp (până la
50-60 zile)nu a condus la depăşirea procentului de plante devirozate.
În unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în
decursul cultivării ţesuturilor in vitro. Astfel, Hollings şi Stone (1964), au reuşit această
performanţă la garoafe, iar Walkey şi colab. (1969) la cireş. Această eradicare endogenă a
virozei, în interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces
metabolic dereglat, ca o consecinţă a traumatizării celulelor excizate. Cu cât a fost mai mic
fragmentul de ţesut excizat, cu atât traumatismul a fost mai puternic şi efectul endogen,
distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980). De regulă însă, este
imposibil să regenerăm anumite specii de plante din fragmente atât de mici de ţesuturi; ori în
alte condiţii, nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare încât să se producă o disturbare
a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldată cu suprimarea atacului viral.
Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre
justificări de ordin molecular. Una din ipoteze susţine că există o competitivitate între celula
gazdă şi parazit, în ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie;
altă ipoteză, susţine că celula meristematică utilizează ARN viral, sau că substanţele generate
în urma traumatizării celulelor ar suprima virusurile prezente în celule.
În anul 1978, Walkey, a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro
a ţesutului gametofitic femel, respectiv ovare sau ţesut nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat şi marele merit pe care Morel l-a avut în intuirea importanţei
deosebite a descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave, precum şi
a direcţiilor aplicative pe care le-a deschis această tehnică, efectuată în condiţii aseptice. Cele
mai mari realizări le-a avut Morel în multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, în anul 1963,
Morel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de
orhidee. Acestea se refereau la faptul că meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice,
generează un glomerul de 1-2 mm, de culoare verde, numit protocorm. Prin ruperea şi
cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă globuloasă, un glomerul de cca 3-4 mm
slab diferenţiat histologic, constituită dintr-un parechim, cu celule mari, sărace în citoplasmă
şi cu vacuole întinse. În partea centrală a glomerulului se disting câteva fascicule vasculare.
Fragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare
capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. În anul 1978, Murashige afirma că,
dintr-un meristem de orhidee, în decursul unui an, prin fragmentări şi subcultivări repetate ale
protocormilor, se pot obţine cca 4 milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in
vitro este asemănător cu protocormul de germinaţie, rezultat din embrionii seminţelor.
În 1959, Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante, în care să fie
conservat materialul biologic meristematic sănătos. Prin această tehnică, astăzi, materialul
vegetal generat in vitro este uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor
capacitate regenerativă.
 Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în:
-asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in vitro;
-eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni;
-creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui
exemplar vegetal;
-obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode
tradiţionale de înmulţire vegetativă;
-conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici, pentru o lungă
perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce să
asigure, oricând, necesarul de material săditor solicitat pe piaţă;
-conservarea germoplasmei în bănci de gene.
În extinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a predominat factorul
economic rezultat, în primul rând, din aspectele fitosanitare, respectiv din obţinerea unor
culturi viguroase, sănătoase. Astfel, cartoful, plată extrem de importantă atât în hrana omului
şi pentru industrializare dar şi în hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea
metodelor de redresare a vigurozităţii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivând in vitro
meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumărate virusuri care, de cele mai multe ori,
pot fi prezente concomitent în ţesuturi, ceea ce epuizează planta şi scade, considerabil recolta.
Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate tipurile de virusuri pot fi în egală
măsură combătute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des în cultură (A,
Y, M, S, X) virusul A este mai uşor de îndepărtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in
vitro prin meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. Astfel, în Franţa, cifra de afaceri
realizată, în categoria florilor tăiate, prin vânzarea garoafelor, ocupă locul doi iar exportul
horticol francez este reprezentat în proporţie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea
provenind din mutaţii de culoare, practicate la tipul american de garoafă creat de William
Sim, în 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de exemplare. Conservarea
calităţilor sale genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in vitro a
meristemelor caulinare, apicale. Infecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor, ci
reduce foarte mult şi capacitatea de înrădăcinare a butaşilor. În laboratoarele unei singure
unităţi se produc anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. Înmulţirea meristematică a permis
vindecarea garoafelor şi de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de Phialophora
cinerescens, Fusarium oxysporum, şi a bacteriozelor Pseudomonas caryophylli şi
Pectobacterium parthenii. De o mare importanţă este cultura orhideelor, obţinerea de material
săditor devirozat la garoafe, căpşun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori şi arbuşti.
Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea, ca scop în sine, numai
eradicarea bolilor ci pur şi simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase.
Această metodă este cu atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat.
Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de
tip caulinar şi anume:
-unele procedee vizează cultivarea exclusivă a celulelor conului meristematic, fără
primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, în dependenţă de dimensiunea
redusă a explantelor şi de consecinţele traumatismelor provocate;
-altele privesc obţinerea de material săditor devirozat, explantele constând din
meristeme recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor
fiind de până la 500 μm, respectiv 0,25-0,7 mm;
-altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule, în timp scurt
utilizând explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme axilare şi
de muguri adventivi pe apexul iniţial.
În oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea, cu mare atenţie şi pricepere,
a plantelor mamă, donatoare de explante. Este de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într-
o perioadă de creştere activă. Latenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică
aplicarea unor tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergenţa meristemelor.
Alegerea explantelor, sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultură folosit, regimul din
camerele de creştere influenţează supravieţuirea explantelor. Restabilirea proceselor
biologice, de diviziune şi de regenerare precum şi sensul desfăşurării histo şi organogenezei,
diferenţierea de plante, dezvoltarea lor şi apoi capacitatea adaptativă a acestora la mediul
normal sunt influenţate atât de factori endogeni, cât mai ales de cei exogeni, în special de
balanţa hormonală şi de regimul de lumină, respectiv de temperatură.
De regulă meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapidă creştere.
Cu toate acestea şi meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite în
culturile de meristeme. La crizanteme din 5000 de vârfuri meristematice, 32% din mugurii
apicali, terminali, au crescut, generând plante mature, în timp ce numai 18% din mugurii
laterali au format noi plante.
Mărimea explantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. Când se are
în vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie să depăşească
0,5 mm dar nici să fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, în acest caz, este dificilă înrădăcinarea
plantulelor generate din meristeme. În cazul în care s-a aplicat corect termoterapia explantul
poate fi mai mare, de până la 1 mm. În camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă
să fie de 2400-2600 lucşi, în regim de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. În alte
cazuri, lumina trebuie intensificată la 3500-4000 lucşi, iar la conifere se poate ajunge chiar la
o intensitate de peste 10 000 lucşi. Temperatura trebuie să fie stabilizată între 22-25oC. Uneori
există indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de iluminare, cerute de un anumit tip de
cultură, potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei anumite etape de dezvoltare a
inoculilor.
În literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit
pentru prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specifică că
meristemele de garoafe supravieţuiesc, în proporţie mai mare, dacă sunt recoltate primăvara
sau toamna devreme; meristemele recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate
vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof,
meristemele recoltate primăvara sau vara, de timpuriu, înrădăcinează mult mai repede în
raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului.
În ceea ce priveşte substratul de cultură, de cele mai multe ori, se utilizează medii de
cultură solide. La cartof, garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. PH-ul
mediului de cultură poate constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului
cultivat in vitro. Astfel, de regulă, pH-ul de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; după
autoclavare, pH-ul scade, iar în decurs de o săptămână de la cultivarea ţesuturilor, pH-ul
descreşte până aproape de 5,4. Un pH iniţial scăzut inhibă formarea rădăcinilor.
În compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente, FeEDTA,
vitamine, aminoacizi şi o sursă de carbon organic, reprezentată, de regulă de zaharoză în
concentraţie de 2-3%. Natura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta,
în funcţie de scopul urmărit. Astfel, pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere ANA şi
AIA, care însă folosite timp îndelungat pot duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. În acest caz,
se recomandă subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. Citochininele stimulează
creşterea meristemelor, mai ales în cazul în care ele se fală în latenţă, precum şi formarea de
nenumăraţi muguraşi. Concentraţia fitohormonilor de creştere variază în diferitele faze de
evoluţie ale meristemelor.
Plantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile
in vitro, fiind trecute în condiţiile mediului septic. Ele vor fi transferate în ghivece mici, în
amestec de perlit cu pământ. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic,chiar
neînrădăcinaţi, această operaţiune putând determina înrădăcinarea lor. Buys (1969)
recomandă transferarea timpurie în sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, întrucât
rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură folositoare în sol, iar prelungirea duratei de
menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură, ridică nejustificat costul materialului plantat
rezultat. Atunci când plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic, eventuala prezenţă
a virusurilor şi gradul de infecţie.
Metodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta. În
1977, Clark şi Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenţei
virusurilor, iar în 1973, Derrick, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode
de mare sensibilitate în determinările de virusologie vegetală. Pentru a uşura exactitatea
investigaţiilor este de dorit să se facă o analiză a infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de
meristeme, precum şi în cultura, sau culturile apropiate. După stabilirea unei culturi lipsite de
germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie menţinute în condiţii speciale fie că ele
sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute, în recipientele lor de cultură, pe medii
aseptice, fie că sunt cultivate în teren, într-un perimetru ferit de infecţii, metodele fiind menite
să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor.
Metodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi
indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum şi a unei cantităţi
limitate de material iniţial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi extrem
de scăzute. În aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. Primele
încercări de crioconservare au fost făcute de către Seiberg în anul 1976, la garoafe. Ulterior s-
a reuşit şi conservarea altor tipuri de inoculi: calus, celule sau protoplaşti. Tehnicile de
crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare, cu rol în prevenirea
daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor, respectiv formarea cristalelor de gheaţă.
Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) şi glicerolul
(Kartha, 1981, citată de Cachiţă, 1984). Meristemul este ţesutul cel mai potrivit pentru a fi
conservat la temepraturi scăzute, graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el îşi poate
păstra întreaga capacitate regenerativă, întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime
de mediu, celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. Meristemul se
pretează cel mai bine conservării prin crioconservare, celulele lui fiind sărace în vacuole şi
având o citoplasmă densă.
Pentru executarea operaţiunilor de congelare, îndeosebi pentru coborârea gradată a
temperaturii, există dispozitive speciale. O metodă accesibilă preconizează introducerea
flacoanelor cu inoculi într-o baie de alcool, mediu în care se produce descreşterea gradată a
temperaturii.
În anul 1980, Dale şi colab. Au pus la punct o metodă de stocare la temperaturi
scăzute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constând în conservarea îndelungată a
plantelor, generate in vitro, prin menţinerea lor la temperaturi de 2-4oC, în regim de 8 ore
lumină pe zi si o intensitate de 300 lucşi. Cultura poate fi menţinută astfel 10-11 luni, după
care se recomandă ca aceasta să fie transferată pe mediu proaspăt.
O altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro.
Plantele provenite atât din meristeme cât şi din explante de altă natură, prezintă un grad de
juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. Astfel, materialul de plantat,
generat in vitro, este superior celui obţinut prin metodele tradiţionale: butăşire, marcotaj,
altoire.
Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic, de exemplu la
plantulele de căpşun, diferenţiate din meristeme. La căpşun, frunzele tinere sunt întregi, în
timp ce frunzele plantelor bătrâne sunt trifoliate. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la
inoculi în momentul în care se depăşeşte faza de morfogeneză, constând în proliferarea a noi
muguri axilari, prin repicări repetate şi cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină.
 Un caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie
prelevate meristeme apicale. Un exemplu îl constituie plantele lemnoase, multianuale.
Explantele sau butaşii prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. La
aceste plante se practică diferite metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri
sau microbutăşiri in vitro, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule.
Sfecla constituie un alt exemplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte
scăzută capacitate organogenetică. De aceea se recomandă inducerea formării de meristem
prin repicări succesive.
O problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ, inoculat
pe medii aseptice, într-o stare primară, întrucât în cazul în care se inoculează un meristem
vegetativ, prelevat de pe o tulpină floriferă, există pericolul ca anumiţi factori de mediu să
inducă formarea florilor sau invers, să grăbim, prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de
mediu, transformarea unui mugur vegetativ, în mugure florifer. Reglarea fotoperioadei şi
sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par să determine
transformarea apexului vegetativ în florifer.
La numeroase plante, detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă
ţesuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, generând muguraşi. Adeseori, se
formează muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui să se formeze
boboci. Inocularea in vitro, pe medii, cu sau fără fitohormoni, a unor fragmente desprinse din
inflorescenţe tinere conduce la formarea a numeroşi muguri. La conopidă, prelevarea unui
mic explant din apexul preinflorescenţei şi cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxină (AIA),
provoacă reveria ţesuturilor din florifere în vegetative. Astfel, poate fi înmulţită planta pe cale
vegetativă (Crisp şi colab., 1974, citat de Cachiţă,1984).
Originea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea, în
direcţia diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă, într-o anumită fază de
dezvoltare a plantelor sau a organelor. Reuşita este dependentă de vârsta ţesutului, de specie şi
de condiţiile de mediu.
Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor
plante.

6.1.7.3 Cultura de calus

Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule

deţinând o structură histologică uniformă. De regulă, când este tânăr, posedă celule
nediferenţiate, care se divid activ. Un anumit tip de calus se produce şi în mod natural, fie la
nivelul zonelor traumatizate, având rol în cicatrizarea rănilor, fie se formează la baza butaşilor
plantaţi pentru înrădăcinare, constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive. În funcţie de
obiectivul urmărit, obţinerea de calus poate constitui un scop în sine, alteori apariţia şi
dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formării de calus cât mai friabil constituie
scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei
culturi de protoplaşti. Instabilitatea genetică a celulelor sale şi poliploidizarea facilă a lor, în
anumite condiţii de cultură, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros
asupra căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări, selectându-se linii cu
calităţi speciale. Multiplicarea clonală, via calus nu este posibilă tocmai din cauza facilei
poliploidizări a celulelor sale. Pe această cale se practică însă înmulţirea regenerativă, rapidă a
unei specii, fără a avea siguranţa conservării genotipului. La unele specii: morcov, tutun,
crizanteme din calus se pot obţine uşor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante
lemnoase (stejar), geneza de plante din calus este extrem de dificilă.
Atunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă, formarea de calus în porţiunea
bazală a explantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un
fenomen care perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză. Astfel, administrarea unei balanţe
hormonale neechilibrate, face ca la baza explantului să se genereze calus, cauzând dezvoltarea
preponderentă a rădăcinilor, în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers, se formează
unul sau mai mulţi muguraşi, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat
şi subcultivat pe un mediu cu sau fără auxină. Această metodă se practică cu succes, atunci
când se procedează la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia şi
Gerbera), constând în desprinderea de propaguli, de pe un ţesut calusal comun de dimensiuni
minime generat din inoculul iniţial, situat în porţiunea bazală a coloniei de propaguli.
Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi
cultivat la nesfârşit, atunci când, periodic, se procedează la repicarea, respectiv la
fragmentarea lui. Fiecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. Calusul crescut
la 25oC se recomandă a fi repicat la un interval de 4-6 săptămâni, în dependenţă de natura
ţesuturilor din care a provenit şi de condiţiile în care a fost cultivat. Numai prin subcultivări
repetate poate fi conservată vitalitatea celulelor sale. Dacă calusul nu este subcultivat în timp
util, se produce o îmbătrânire a celulelor sale, masa tisulară îşi schimbă culoarea, din gălbui,
galben-verzui ori verde, devenind cenuşie sau galben-brună; uneori culoarea calusului devine
roşiatică sau vişinie, datorită formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar.
Provenienţa calusului şi natura inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. Street
(1973) precizează că trecerea calusului în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a
cantităţii de antociani. De altfel, s-a constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor
(Gautheret, 1959, citat de Cachiţă, 1984). În general, prezenţa luminii şi natura acesteia
intensifică acumularea în celule a antocianilor. Antocianii sunt sintetizaţi însă şi la întuneric.
Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultură de celule de Haplopappus cu raze UV, a izolat o
linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de antociani. Fitohormonii de creştere şi natura
acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. Astfel, auxina inhibă, iar citochininele
stimulează formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981). Temperatura scăzută, carenţa
de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide stimulează sinteza de antociani.
Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o creează, întrucât şi un
conţinut ridicat de NaCl stimulează formarea acestor pigmenţi.
La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă, decât la
gimnosperme sau la monocotiledonate.
Pe măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură, în profunzime se
diferenţiază centri vasculari, ori noduli organoformatori. În morfo şi organogeneza calusului
un rol determinant îl au mediul de cultură şi condiţiile de cultură, natura ţesuturilor din care a
provenit calusul şi vârsta acestora.
Formarea, creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia
fitohormonilor de creştere, prezenţi în mediile de cultură. De regulă, concentraţiile ridicate de
auxină conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine în inducerea de calus s-au
dovedit a fi acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T),
folosite în concentraţii cuprinse între 1-10 mg/l.
În general, calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă
diferită, chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. Astfel, prin inocularea de liber secundar,
muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat în 2,4D, se ajunge uşor la
formarea de calus.
Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte, legate între ele, sau pot fi mai laxe,
formând un calus friabil, grunjos, separabil în fragmente granulate, de mărimi diferite, mai
greu dezagregabile, sau spumos, ce se separă în formaţiuni tisulare fine, adecvat pentru
iniţierea unei culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie,
de natura organelor din care au fost detaşate explantele generatoare de calus, de tipul
fitohormonilor de creştere prezenţi în substratul de cultură şi uneori de condiţiile de cultură.
Capacitatea organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal este dependentă atât de factorii
endogeni şi exogeni, de numărul repicajelor făcute, de condiţiile de cultură şi de vârsta
calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar şi după cinci ani, îşi
menţin o potenţialitate ridicată de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din plantele
monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativă scăzută, evaluată la câteva săptămâni
(Conger, 1981).
Dintr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar, ce conţine un număr de
aproximativ 50 000 celule. După cca şase săptămâni, calusul primar este suficient de bine
dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspăt,
se numeşte calus secundar.
Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un
calus de tip neregenerativ ce prezintă, de regulă, o creştere luxuriantă, din el diferenţiindu-se
rădăcini, şi uneori muguraşi, dar niciodată plante (Nabors, 1982). Aceste două tipuri de calus
au mai fost denumite calusuri embriogene şi neembriogene. Calusul embriogen este dens,
translucid sau opac de culoare albă-lăptoasă, spre galbenă, ori galbenă-verde. Citologic se
remarcă zone compacte, cu celule nediferenţiate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din
care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o
masă cristalină, transparentă, de culoare albă, brunie sau verde. Acest tip de calus prezintă o
consistenţă mai laxă, fiind mai friabil, desfăcându-se uşor în pachete de celule. Regiunile
friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. Aceste regiuni generează rădăcini şi mai rar
muguraşi dar niciodată plante. Nabors a fost primul care a dovedit că cea mai ridicată
capacitate regenerativă, menţinută timp îndelungat o prezintă calusul embriogen, denumit de
tip regenerativ. Tot Nabors a observat că acest calus regenerativ tinde să devină
neregenerativ; după producerea acestei reversibilităţi procesul este definitiv, întrucât cele
două forme sau tipuri de calusuri, diferite funcţional, nu sunt interconvertibile. De altfel, cele
două tipuri de calusuri necesită fitohormoni diferiţi, în doze variate, atât pentru impulsionarea
şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. De regulă, calusul neregenerativ creşte
abundent, în timp ce calusul regenerativ are o creştere mult mai lentă, chiar şi pe medii
potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a acestuia. Pentru a preîntâmpina
dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus regenerativ omogen sau
cel puţin predominant ca masă, într-o populaţie de celule calusale. Nabors a remarcat şi faptul
că ceea ce la un anumit moment, într-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului, pare să fie
ţesut de tip neregenerativ, poate genera, în continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate şi
subcultivate (Cachiţă, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultură, adecvate creşterii optime a ţesutului calusal,
nu constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. În general, mediul
Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziţie similară, respectiv sărace în azot cu pH-ul 5,5
sunt de preferat. La cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului 2,4,5
triclorfenoxiacetic, având efect pozitiv în susţinerea creşterii calusului. Acest mediu însă nu
este cel mai potrivit pentru inducerea şi menţinerea proceselor regenerative.
În general, calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe
regiuni cu calus de tip regenerativ, în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar şi la
calusul bogat în zone regenerative acestea reprezintă numai cca 1-10% din totalul masei
calusale. Dacă regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să
impulsioneze şi să susţină procesele regenerative, celulele lui vor da în final naştere la plante.
Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar, prin menţinerea
calusului regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante,
intervenindu-se periodic, prin subcultivări de întreţinere. Pe altă cale se pot identifica şi izola
insulele de calus regenerativ, pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ,
realizându-se transferarea lor pe un mediu de creştere adecvat.
 În decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la
întuneric decât din cei crescuţi la lumină. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu
depistabile pe calusurile crescute la întuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ
creşte însă la calusul crescut în condiţii de întuneric. La grâu, calusul trebuie transferat la
interval de cinci săptămâni, pe mediu potrivit inducţiei diferenţierii de plante. La calusul de
grâu, regenerarea se realizează pe un mediu lipsit de fitohormoni de creştere; astfel din calusul
de tip regenerativ, în cca 2-5 săptămâni după transferarea pe mediu adecvat proceselor
regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu
va mai creşte. Dacă calusul este mixt, componenta neregenerativă continuă să crească mult;
concomitent, însă, din porţiunile de calus de tip regenerativ, în cultură se diferenţiază şi
plante. După două subcultivări ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni
de creştere, potrivit inducerii neoformării de plante, se recomandă transferarea calusului
rămas, pe un mediu conţinând auxină, pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia.
Plantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise, conţinând
perlit, care va fi udat cu apă de la robinet, urmând ca după 1-2 săptămâni, plantele bine
înrădăcinate, să fie transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule, cultivându-l pe medii
lichide, obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri.
În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul
poate fi obţinut din explante provenite din diverse surse: seminţe, embrioni, rădăcini, ţesut de
rezervă, frunze, ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de
scopul propus. Atunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de
cultură oarecare, conţinând substanţe anorganice (macro şi microelemente) şi substanţe
organice (sursă de carbon organic, vitamine, aminoacizi şi fitohormoni), iar solidificarea
mediului se realizează cu agar;
-sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură;
-pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării explantelor. Se realizează
curăţirea organelor şi dezinfectarea lor, folosind diverse procedee în funcţie de tipul de
explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de
tipul de organ folosit ca sursă de explante;
-inocularea explantelor se realizează în condiţii aseptice, la hota cu flux de aer steril,
fie pe mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării
culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la întuneric, fie la lumină, de regulă la temperatura de
o
25 C;
-observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face
periodic, la diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea
fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectuează la cca 4-6 săptămâni, fiind
obligatorie pentru menţinerea viabilităţii calusului. Este importantă ţinerea unei evidenţe
stricte a numărului de subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal;
-urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în
care a fost cultivat calusul, de provenienţă şi de vârsta acestuia.
Ţesutul calusal are o utilizare variată. El constituie unul din materialele biologice
asupra căruia se pot aplica diferiţi agenţi selectivi, în scopul obţinerii de linii rezistente, pentru
selecţionarea de plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit
factor de stres. Nabors (1982) a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii
ridicate de NaCl, substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. Astfel, a
raportat obţinerea de plante de Triticum, Orisa şi Pennisetum tolerante la concentraţii ridicate
de NaCl (0,6-0,9%), precum şi la Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la
0,03%. La grâu, cel mai bun calus, care răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela
obţinut din rădăciniţa embrionară, dezvoltat în condiţiile germinării cariopselor pe medii
aseptice.
Atunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de grâu se
sterilizează, după care, la microscop, se detaşează embrionii, evitându-se lezarea acestora şi
inoculându-i pe mediu de cultură.
Mediul de cultură recomandat pentru grâu (cariopse sau embrioni imaturi) este
Linsmaier-Skoog, conţinând macro şi microelemente, vitamine, sursă de carbon (zaharoză),
fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) şi agar.
Agenţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de
cultură, preparat pentru inducerea formării de calus, fie se adaugă în substratul de cultură
destinat repicării calusului. În cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a
culturii de calus, o varietate în mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului
selectiv în cauză, se realizează o reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente, cu
caracterele dobândite stabilizate, transmisibile descendenţilor. S-a constatat că stabilitatea
caracterelor dobândite este dependentă de durata în care s-a petrecut imprimarea acestor
caractere, respectiv durata de timp în care s-a operat selecţia. Pentru a fi atinsă o stabilă
toleranţă, chiar şi în condiţiile absenţei îndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt
necesare cel puţin şase luni de călire şi selecţie, prin subcultivări repetate. Menţionăm că şi în
situaţia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenţierii
capacităţii regenerative a calusului, în calus de tip regenerativ şi neregenerativ. Numai din
calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ
este inutilizabil în acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite experimente de
fiziologie, în studierea problemelor de morfogeneză, în urmărirea unor modificări
ultrastructurale, în analize de ordin biochimic, sub acţiunea unor anumiţi factori, administraţi
exogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul.
În concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reacţiei celulei vegetale la o serie
de substanţe sau condiţii de cultură, permiţând efectuarea unor experimente de fiziologie
privind: creşterea, reacţia la pesticide, noxe, ioni grei, respiraţia, morfo şi organogeneza,
testarea viabilităţii celulare, a biogenezei unor produşi primari sau secundari de metabolism.

6.1.7.4 Cultura de embrioni şi endosperm

Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practică în diferite scopuri, atât

pentru cercetări de fiziologie a seminţei cât şi în experienţe de hibridări intersoiuri, interspecii
şi intergenuri.
Încă din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivării pe medii aseptice a
embrionilor de Raphanus şi Cachlearia pe soluţii minerale cu adaos de zaharoză, obţinând
plantule transferabile în sol.
Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecţionate continuu.
Van Qverbeek şi colab. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) şi
Morel (1956) să efectueze experienţe de multiplicare in vitro folosind ca material iniţial
embrioni extraşi din seminţe coapte. Seminţele au fost sterilizate, după care au fost îmbibate
în apă, 12-24 ore, şi apoi, în condiţii aseptice a fost izolat embrionul.
Embrionii pot fi cultivaţi in vitro, ca atare sau se operează detaşări de fragmente
embrionare, sau sunt cultivaţi în scopul obţinerii de calus, care este utilizat ulterior în alte
experimente. Există şi practici constând în grefarea de embrioni pe endospermul aparţinând
altor specii sau genuri, operaţie denumită hibridare in vitro.
Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de explante,
complexe. Un rol deosebit revine momentului în care se execută explantarea embrionului,
respectiv timpul scurs după fecundare, din clipa formării zigotului şi până la inocularea lui in
vitro, perioadă care exprimă vârsta embrionului în zile. Ovulul fertilizat adăposteşte zigotul
care, după formare, începe să se dividă şi se hrăneşte din rezervele endospermului. În această
fază celulele embrionului sunt heterotrofe; pentru creşterea şi dezvoltarea lor ele au nevoie de:
glucide, aminoacizi, vitamine şi hormoni. În această etapă explantarea embrionului şi
inocularea lui pe medii aseptice creează probleme deosebite pentru realizarea cadrului
fiziologic optim, adecvat continuării proceselor de creştere şi de dezvoltare.
De regulă, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice în
momentul în care sunt formate cotiledoanele, respectiv când începe diferenţierea internă a
celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogenă a structurii embrionare variază
de la specie la specie şi uneori este dependentă de condiţiile meteorologice. În unele cazuri,
când este importantă izolarea timpurie a embrionului de sub acţiunea plantei mamă, poate fi
realizată o creştere corespunzătoare a acestuia numai dacă embrionul este izolat împreună cu
nucela sau cu ţesutul nutritiv, sau dacă se detaşează ovulul în întregime realizându-se astfel
inocularea lui pe medii aseptice, corespunzătoare ca şi compoziţie.
Prin cultura in vitro de embrioni se poate preîntâmpina avortarea sau dezvoltarea
anormală a embrionilor ca urmare a instalării unei incompatibilităţi între embrion şi ţesutul
nutritiv, aşa cum este cazul hibrizilor sexuali intervarietăţi interspecii şi intergenuri, sau al
formării de hibrizi sterili.
Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridică mari probleme, cultura de
embrioni maturi este mult mai uşor de realizat.
Embrionii maturi necesită un mediu de cultură simplu, care are în compoziţia sa săruri
minerale şi o componentă glucidică. Adăugarea la mediul de bază a vitaminelor (acidul
nicotinic, acidul ascorbic, piridoxină) impulsionează creşterea ţesuturilor, iar adăugarea
fitohormonilor de creştere are drept scop urmărirea evoluţiei embrionilor în prezenţa acestora,
pentru a asigura stimularea creşterii unui anumit organ sau pentru inducerea formării de calus.
În mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomandă adiţionarea
unor extracte naturale: hidrolizat de caseină, lapte din nucă de cocos, suc din fructe de tomate
sau extract de endosperm.
În general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiţia ca ei să fie
explantaţi în acea fază de formare care să le permită, în continuare parcurgerea evoluţiei
fireşti a proceselor de ontogeneză şi să se respecte integritatea lor morfoanatomică; cu cât
stadiul în care au fost prelevaţi a fost mai timpuriu cu atât şi factorii de care depinde
dezvoltarea lor sunt mai complecşi şi greu de reprodus. În timp ce plantulele provenite din
embrionii maturi au o dezvoltare similară cu cei dezvoltaţi în condiţii naturale, sau prezintă
chiar un uşor avans în creştere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt plăpânde, iar
în sol dovedesc o creştere mai lentă şi sunt mai firave. Cultura de embrioni imaturi, recoltaţi
foarte tineri, uneori conduce la obţinerea de plantule malformate, chiar dacă mediile de
cultură au o compoziţie adecvată dezvoltării acestora.
În unele cazuri, după polenizarea interspecifică sau intergenerică, dezvoltarea
embrionilor a fost extrem de lentă, ceea ce a făcut ca explantarea embrionilor şi cultivarea lor
in vitro, să fie imposibilă. Taira şi Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-
n-caproic, facilitând astfel, creşterea embrionilor hibrizi, realizaţi între grâu şi secară,
depăşind barierele fiziologice care împiedicau creşterea acestora. Deci, pretratamentul florilor
femele cu anumiţi regulatori de creştere, după polenizare, impulsionează creşterea
embrionilor până la faza în care ei pot fi extraşi şi cultivaţi, cu succes, pe medii aseptice.
 Prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x
4n, îmbinându-se caracterul de perenitate cu cel al calităţii furajului realizat (Evans, 1962).
Rezultate bune s-au obţinut şi în regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere,
obţinându-se hibrizi interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, şi Medicago.
Tot prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante la specii ale căror seminţe
nu germinează (banane) sau a celor care se înmulţesc greu prin seminţe (specii forestiere). În
unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de latenţă, prin cultivarea lor pe medii aseptice a
constituit o metodă eficientă în scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.
De asemenea, embrionii pot să servească şi ca ţesuturi de plecare în multiplicarea şi
propagarea rapidă a unor plante (la specii ornamentale) atunci când acest lucru este dificil de
realizat prin utilizarea altor tipuri de explante.
O atenţie deosebită trebuie acordată aspectelor teoretice şi practice pe care le ridică
problemele de embriologie experimentală la gimnosperme. Cea mai veche cultură de
embrioni la gimnosperme este citată ca fiind efectuată de către Schmidt în anul 1924, când a
cultivat pe un mediu organic embrioni de Pinus sylvestris. Mai târziu, în 1936 Rue a reuşit
cultivarea in vitro a embrionilor proveniţi de la câteva specii: Pinus resinosa, Picea
canadensis, Tsuga canadensis şi Pseudotsuga menziensii şi a demonstrat, totodată, că
embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi cultivat pe medii aseptice, până la
stadiul de plantulă. Experimentele ulterioare au reliefat faptul că embrionii de gimnosperme
pot fi crescuţi in vitro, în lipsa megagametofitului (Cachiţă, 1984).
La cultura de embrioni, presiunea osmotică, sau sursa de carbon organic, joacă un rol
important în evoluţia acestora, atunci când embrionii sunt excizaţi şi sunt cultivaţi in vitro. De
exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un conţinut de 3-6%
zaharoză şi hormoni, vor genera plantule, în timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoză, se
constată o serioasă limitare a dezvoltării primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuşit scoaterea acestora
din starea de latenţă, odată cu detaşarea şi desprinderea lor de sub acţiunea
megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor
de morfogeneză şi se referă la cultura endospermului de tip secundar, derivând din diviziunea
nucleului secundar al sacului embrionar, având celule triploide, gimnospermele având un
endosperm de tip primar. Ambele tipuri de endosperm deţin un rol important în alimentarea şi
susţinerea creşterii embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regulă endospermul este
consumat în primele faze ale dezvoltării embrionului, rolul de depozitare a rezervelor
nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constând în proliferarea endospermului imatur de porumb au fost
efectuate încă din anul 1933 de către Lampe şi Mills. La Rue, în anul 1947, a realizat
creşterea nelimitată a endospermului de porumb. Cercetările menţionate au deschis calea unor
experimente prin care s-a dovedit că acest ţesut iniţial are o capacitate ridicată de proliferare,
formează uşor rădăciniţe, muguraşi şi chiar plantule. În această direcţie, Straus şi La Rue în
1954, au obţinut rezultate excelente cultivând endosperm de porumb, la 12 zile de la
polenizare. Cele mai bune varietăţi, potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat.
Endospermul de porumb, la 8 zile după polenizare, nu creşte pe medii aseptice. Deci, pentru
reuşita iniţierii culturii este important stadiul în care se află diferenţierea celulelor
embrionului.
Endospermul matur, doar la câteva specii sau varietăţi, corespunde scopului inducerii
formării de calus şi anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton,
Petroselinum hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifestă procese de
organogeneză. Endospermul de porumb, de ricin, precum şi la alte specii, generează o masă
de calus în continuă creştere, fără organogeneză, în timp ce la nivelul valusului de
Petroselinum se observă embriogeneza.
Cultura de embrioni oferă un important instrument în cercetările de embriologie şi în
embriogeneza experimentală, constituind un sistem de tip monitorial în redarea fazelor de
creştere ale diferitelor părţi componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate în
dependenţă de natura substratului de cultură, de vârsta embrionului, în funcţie de condiţiile de
mediu, oferind importante informaţii privind interferenţa diferitelor etape metabolice cu
regulatorii de creştere, procesele de depozitare ale substanţelor de rezervă în ţesuturi, cu
factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, în formarea şi creşterea embrionilor.

6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule şi de ţesut nucelar

În hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate între partenerii sexuali. De

aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul
polenului la ovul, fie acceptarea de către ovule a autopolenizării ori a polenizării încrucişate,
învingându-se astfel barierele de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la
încrucişări, operaţiunile fiind făcute în scopul obţinerii de seminţe viabile.
Incompatibilitatea dintre ovule şi polen este provocată de către diferite cauze, de ordin
endogen şi anume: o primă selecţie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate
prezenta o conformaţie morfologică necorespunzătoare, împiedicând angrenarea
ornamentaţiilor exinei polenului pe vilozităţile stigmatului; pe de altă parte, natura umedă sau
uscată a suprafeţei stigmatului poate constitui un impediment în reţinerea polenului pe stigmat
şi în crearea mediului optim; substanţele secretate de către celulele epiteliale ale stigmatului
pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum şi creşterea tubului polinic.
În unele cazuri există o autoincompatibilitate naturală, generată de faptul că plantele
care trebuie încrucişate prezintă diferenţe morfologice constând în mărimea polenului,
amplasarea anterelor în floare etc. Alteori, maturitatea organelor sexuale se face în momente
diferite, caz în care se impune ca, în prealabil, polenul să fie recoltat şi să fie conservat, pentru
o anumită perioadă de timp.
Experimentele de polenizare şi fecundare artificială in vitro trebuie precedate de o
cunoaştere a bilogiei florilor cu care se doreşte efectuarea experienţelor, atât în ceea ce
priveşte morfologia, etapele de morfogeneză cât şi a compatibilităţii şi a incompatibilităţii, a
antezei şi a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective.
Pe de altă parte trebuie făcute testări prealabile cu privire la mediile de cultură adecvate
menţinerii microsporilor la un potenţial biologic şi într-o stare optimă de viabilitate, pentru
asigurarea creşterii tubului polinic, pentru menţinerea viabilităţii părţilor componente ale
pistilului.
Polenizarea şi fecundarea artificială in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului
unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea în contact a polenului, respectiv a
tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele excizate.
Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practică în
cazul speciilor compatibile sexual, când nu există impedimente morfofiziologice, privind
fixarea şi germinarea polenului la nivelul stigmatului. Prin această metodă s-a reuşit
autopolenizarea la Antirrhinum majus (Usha, 1965), în schimb la Petunia violacea, specie
autocincompatibilă s-a constatat că autopolenizarea in vitro a fost urmată de o creştere a
pistilului dar după un timp acesta s-a brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachiţă, 1984).
Deseori, însă, polenizarea şi fecundarea in vitro a ovulelor au eşuat, în condiţiile
utilizării tehnicilor constând în folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a
trecut la reproducerea aceloraşi încrucişări, dar operând cu ovare sau ovule.
 Meritul primei culturi de ovare îi revine lui La Rue (1942), care a reuşit cultivarea in
vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobţinând, însă în final seminţe viabile. În
această perioadă, Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum,
Cucumis angeria, Phaseolus vulgaris şi Nicotiana tabacum. Mediile de cultură au fost
complexe şi au conţinut ca fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic şi acidul 2,4,5
triclorfenoxiacetic. Ovarele au fost recoltate fie înainte de polenizare fie după ce polenizarea
s-a petrecut în mod natural. In vitro ele au crescut, dar în final nu au format seminţe.
Prin tehnicile de cultură in vitro a ovarelor au fost obţinuţi hibrizi din încrucişarea
hibrizilor diploizi de Brassica chinensis şi autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata,
1968). Hibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare între cei doi părinţi.
La Oryza sativa şi la Haworthia turgida, Majumdar a obţinut, în anul 1970, plantule
din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice.
Mitra (1972) a reuşit obţinerea de embrioizi din pereţii ovarelor nepolenizate de
Citrus aurantifolia şi Citrus sinensis, cultivate in vitro. În general cultura de ovare serveşte la
inducerea artificială a poliembrioniei, la seminţele care, normal, sunt monoembrionare.
Există numeroase cercetări care atestă rolul deosebit pe care îl joacă părţile florale în
dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari şi Lal (1961, citaţi de Cachiţă, 1984)
experimentând cu flori excizate, cultivate in vitro, au constatat la Iberis amara formarea unor
fructe normale, numai dacă, în condiţiile inoculării lor la o zi după polenizare, acestea
prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi suplinită prin adăugarea în mediul de cultură a unui
surplus de zahăr. În cazul în care florile au fost excizate şi inocularea s-a făcut la opt zile după
polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimţită.
Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct între
polen şi ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic până la sacul embrionar. În
acest mod, s-a realizat actul de fecundare între indivizii îndepărtaţi filogenetic, înlăturându-se
barierele incompatibilităţilor genetice şi obţinerea, în final, de seminţe viabile.
Încă din anul 1932, White a încercat să cultive ovule de Antirrihinum, dar a obţinut
calus, generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivând in vitro ovule de
Erythronium americanum, observat o creştere a acestora fără ca să obţină maturizarea lor.
În anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, în condiţiile cultivării in
vitro a acestora, s-a observat apariţia fenomenelor de poliembrionie. Embrionii izolaţi au
continuat să prolifereze numeroşi alţi embrioni (Zatyko, 1975).
S-a constatat că ţesutul placentar exercită un efect pozitiv asupra creşterii ovulelor
cultivate in vitro, favorizând formarea şi maturarea seminţelor. Se presupune că ţesutul
placentar cedează ovulelor anumite substanţe stimulatoare. Substanţele respective nu prezintă
o specificitate, întrucât ovule fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost
grefate, cu rezultate favorabile, pe placentă de Capsicum. În condiţiile cultivării acestora in
vitro, ovulele s-au maturizat şi au format seminţe viabile.
Pot fi cultivate in vitro atât ovule fertilizate cât şi ovule nefertilizate. Ovulele pot fi
recoltate ca fiind fertilizate în condiţiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor,
cultivate fiind pe un mediu aseptic.
Există perspective mari în ceea ce priveşte realizarea prin culturi in vitro a unor
polenizări încrucişate, interspecifice şi intergenerice care în condiţiile obişnuite, în natură duc
fie la incapacitatea embrionului format în a-şi menţine viabilitatea, fie sămânţa rezultată se
dovedeşte inaptă în a suporta dezvoltarea embrionului.
În literatură se citează hibridul realizat între Lolium perene şi Festuca rubra,
utilizându-se ovule detaşate din floare, la cinci zile de la polenizare. Plantele rezultate au fost
asemănătoare cu Festuca rubra.
 Învingerea barierelor morfo-fiziologice creează posibilitatea realizării de hibrizi
interspecifici care, în viitor, pot prezenta un interes economic major şi care în mod natural nu
pot fi obţinuţi prin hibridare sexuată.
S-au reuşit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei.
Pornind de la acest tip de ţesut, in vitro se poate induce poliembrionia. Astfel, în 1976,
Mullins şi Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera –
Cabernet Sauvignon, specie în mod normal monoembrionară. Din ovulele nefertilizate s-a
format un calus nucelar, din celulele căruia s-au diferenţiat embrioizi, ceva mai mari decât
embrionii zigotici. Plantulele rezultate au fost viabile.
La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspăt, recoltat în perioada iniţierii
culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales în cazul urmăririi
realizării de polenizări interspecifice sau intergenerice. În ambele cazuri este necesar ca
prealabil inoculării, polenul să fie testat în ceea ce priveşte capacitatea germinativă, creşterea
tubului polinic şi să se studieze comparativ eficienţa câtorva reţete de medii de cultură, în
vederea asigurării unei creşteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea şi susţinerea
întregului potenţial biologic al celulei generative şi a celei vegetative.
În cazul în care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar să se
aproximeze dacă tubul polinic are o lungime corespunzătoare pentru a fi asigurată
accesibilitatea lui la ovule; în caz contrar se renunţă la cultura de pistile şi ovulele vor fi
excizate şi cultivate ca atare. În acest mod, va fi facilitată fecundarea şi se preîntâmpină
epuizarea celulei generative, în decursul parcurgerii traseului de la stigmat, până la sacul
embrionar (Cachiţă, 1984).
Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor şi a altor părţi florale, precum şi a
ansamblelor de componente florale a permis completarea cunoştinţelor actuale privind
funcţionarea organelor respective şi privind biologia fecundării, a formării embrionului, a
seminţei şi a fructului. Aceste cunoştinţe servesc la obţinerea de noi succese în învingerea
barierelor incompatibilităţilor existente în hibridarea sexuată, fapt deosebit de important,
întrucât prin înmulţirea sexuată se poate reînnoi continuu, potenţialul biologic al plantelor,
îmbogăţindu-se zestrea ereditară, cu caracterele moştenite de la doi părinţi, posedând
acumulări genetice diferite.

6.1.7.6 Cultura de celule

Poate fi definită ca o creştere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un
mediu de cultură lichid. În funcţie de momentul în care se face aprecierea acestui aspect,
gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus în momentul
iniţierii culturii şi mult mai accentuat în perioada optimă de creştere. Agregatele celulare pot
fi datorate unei ineficiente dezmembrări a celulelor inoculate, a separării şi individualizării
parţiale a acestora. De asemenea ele pot fi şi rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fără
separarea celulelor, iar în astfel de cazuri frecvenţa agregatelor creşte pe măsura atingerii
perioadei maxime de diviziune celulară. Ulterior deşi frecvenţa diviziunilor scade, mărirea
agregatelor celulare se datorează creşterii în volum a celulelor.
Cea mai perfectă cultură de celule nu este alcătuită numai din celule libere. Pentru a
reduce numărul de agregate se practica filtrarea culturii. Agregatele care persistă şi după
filtrare vor deţine maximum 4-10 celule, uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976).
Gradul de dispersare a celulelor, într-o suspensie celulară, depinde de durata creşterii
celulelor în cultură, originea acestora, compoziţia mediului şi condiţiile de cultură (Street,
1977). Mediul de cultură optim, de cultivare la celulele de gimnosperme diferă de mediul de
folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate, dar şi faţă de mediul folosite
la dicotiledonate. Unul din constituenţii mediului de cultură de care depinde menţinerea
celulelor în suspensie sunt fitohormonii de creştere care pot influenţa cultura celulelor in vitro
prin natura lor şi concentraţia folosită. Astfel un conţinut ridicat de auxină determină creşterea
numărului de celule în suspensie, iar reducerea conţinutului în acest fitohormon, descreşte
capacitatea celulelor de a se separa (Torrey şi Reinert, 1962). De asemenea s-a constatat că
procesele de agregare celulară sunt influenţate şi de prezenţa în mediul de cultură a etilenei
dar şi de creşterea concentraţiei în glucide.
O cultură celulară ideală trebuie să fie omogenă din punct de vedere morfologic şi
biochimic. Numai o cultură de celule individualizate, obţinute prin clonarea unei singure
celule, menţinută în condiţii care să păstreze stabilitatea nucleară, constituie un material
biologic valoros pentru operaţiunile de mutageneză, în izolarea de linii celulare, în selectarea
de mutanţi, de un anumit tip. Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate
genetică în cadrul populaţiei de celule (Cachiţă, 1984).
Pentru menţinerea celulelor într-o stare activă de diviziune şi astfel creşterea gradului
de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp.
Din momentul iniţierii unei culturi celulare şi până în momentul practicării unei
subculturi se parcurge un interval de timp care se numeşte ciclu de creştere a culturii. În
decursul acestui ciclu se produc schimbări în ceea ce priveşte viteza de diviziune şi de creştere
a celulelor. Se distinge o fază incipientă de creştere a vitezei de multiplicare celulară, urmată
de o perioadă de plafonare a frecvenţei diviziunilor, după care, fără o subcultivare a celulelor,
apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate într-un volum finit de
mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse în acelaşi flacon de
cultură. În aceste condiţii creşterea încetează atunci când nutrienţii de bază din mediu s-au
redus sau au fost epuizaţi. Există şi sisteme închise de cultură care asigură reîmprospătarea
continuă a mediului consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de
cultură acţiune care asigură funcţionarea sistemului şi recoltarea biomasei produse. În acest
sistem se realizează un echilibru între cantitatea de mediu introdusă în sistem şi mediul
evacuat.
Durata menţinerii în condiţii de viabilitate a unei culturi, fără a se produce modificări,
depinde de specie, de condiţiile de cultură, de epuizarea din mediu a constituenţilor, care pot
limita diviziunea şi creşterea, de pH.
Dea asemenea oxigenul şi glucidele din mediu pot influenţa creşterea, astfel că o
reducere a celor două componente determină reducerea sau chiar stoparea creşterii celulelor.
Subcultivarea celulelor înainte de finalizarea perioadei exponenţiale de creştere a celulelor
permite obţinerea unor populaţii de celule mai stabile.
Prin încorporarea în mediul de cultură a unor concentraţii reduse de enzime se poate
realiza separarea celulelor, întrucât enzimele, în diluţii adecvate, nu influenţează negativ rata
de creştere, permiţând obţinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de
vedere morfologic şi metabolic.
Rata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de creştere a culturii se
modifică din momentul iniţierii culturii, până la oprirea diviziunilor. O primă fază, imediat
după inoculare, constă într-o întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere,
dar în următoarele 10 zile numărul de celule per unitatea de volum creşte exponenţial, urmând
apoi faza de staţionare şi apoi faza de declin. Faza exponenţială de creştere se caracterizează
ca o perioadă finită de timp, în care rata de creştere a biomasei, raportată la unitatea
concentraţiei de biomasă este constantă. Faza de creştere exponenţială este extinsă în
condiţiile în care cultura este iniţiată cu o densitate redusă a celulelor per unitatea de volum
(Cachiţă, 1984).
Pentru a menţine culturile într-o fază de creştere exponenţială trebuie prevenită
situaţia limitării nutrienţilor din mediu ca o consecinţă a epuizării acestora. În acest sens se
impune subcultivarea frecventă a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus
gracilis şi la un interval de 48 ore. La o cultură de Acer pseudoplatanus, Dorre şi colab.
(1971) au realizat subculturile la un interval de 7 zile, obţinând o densitate iniţială de 2 x 105
celule/ml.
Pentru culturile de celule se pot folosi următoarele tipuri de dispozitive:
-fermentatoare – de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate şi în cultura cu volum de
mediu limitat, stabilit iniţial;
-chemostate – pentru cultura continuă, deschisă;
-fitostate – chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate în care rata de
creştere şi densitatea celulară sunt menţinute constante, prin fixarea unei rate de introducere a
factorilor nutritivi şi hormonali;
-turbiostate – sistem deschis de cultură continuă, în care mediul proaspăt se adaugă în
momentul creşterii turbidităţii culturii şi a eliberării, prin spălare şi eliminare a excedentului
de celule.
O cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi. Cea mai folosită metodă constă
în realizarea în mediul de cultură lichid a unei suspensii utilizând ca material iniţial calus,
pentru ca să se realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de calus,
condiţie ce poate fi îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu
balanţă hormonală adecvată scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4
diclorfenoxiacetic, în diferite concentraţii. În cazul în care gradul de dispersie al calusului este
redus, chiar şi în condiţiile agitării mediilor de cultură lichide, se vor efectua subculturi prin
recoltarea supernatantului şi diluarea agregatelor celulare mici în mediu de cultură proaspăt.
De asemenea, în acelaşi scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din
mediul lichid şi recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel că, coloniile de celule formate
vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci când se reiniţiază suspensia celulară
(Street, 1976).
O altă metodă constă în omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderată, în
omogenizator de sticlă şi apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate.
În acelaşi scop se pot utiliza protoplaşti obţinuţi prin digestie enzimatică.
Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei cantităţi de mediu, dintr-
o cultură deja existentă, având o densitate cunoscută de celule, diluând-o cu mediu proaspăt.
Densitatea celulelor în subcultură nu trebuie să depăşească iniţial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. În
decurs de 15-25 zile densitatea va creşte până la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachiţă,
1984).
Cultura de celule prezintă foarte multe avantaje. Există specii care constituie modele
în ceea ce priveşte reacţia la condiţiile create şi la care procesele de citodiferenţiere, de
organogeneză şi embriogeneză pot fi controlate şi dirijate în sensul dorit (morcov, tutun).
Astfel, cultura de celule prezintă avantaje deosebite în efectuarea unor studii la nivel celular,
privind aspecte ale creşterii, citodiferenţierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura
de celule, fiind constituită într-o populaţie omogenă de celule se poate folosi în vederea
inducerii variabilităţii genetice şi selecţiei de mutanţi, prin expunerea culturii la acţiunea unor
anumiţi agenţi fizici sau chimici.
Unul din marile obiective urmărite prin culturile de celule îl constituie acela al
selectării de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale
grele, săruri, etc. Prin astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar
modificările genetice operate la nivel celular pot fi regăsite în plantele regenerate pornind de
la celula care a suferit un proces de mutaţie. Selectarea liniei celulare se poate face uşor prin
etalarea suspensiei pe medii de cultură solide, recoltarea efectuându-se în perioada creşterii
exponenţiale (Cachiţă, 1984).
Capacitatea regenerativă depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea
acestora, vârsta culturii, compoziţia substratului şi de condiţiile de cultură.
 Întrucât experienţele de ameliorare şi genetică din câmp sunt costisitoare, necesitând
multă forţă de muncă şi suprafaţă mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste
experimente se simplifică, reducându-se activitatea, în prima fază, doar în laborator, astfel că
se reduc atât suprafeţele de lucru cât şi timpul necesar obţinerii rezultatelor dorite. În plus
materialul biologic valoros obţinut, prin cultura de celule se poate păstra timp îndelungat prin
crioconservare, în azot lichid.
O problemă deosebită este aceea a obţinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele
cultivate pe medii aseptice deşi au clorofilă nu pot supravieţui în lipsa zahărului din mediul de
cultură. În încercările făcute pe medii aseptice s-a constatat că succesul cultivării ţesuturilor şi
celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim, înregistrându-se o rată scăzută a creşterii
acestora. Vigurozitatea slabă a celulelor crescute în astfel de condiţii a fost explicată printr-o
activitate fotosintetică scăzută, datorată unor deficienţe de cultură, care împiedică dezvoltarea
cloroplastelor şi a fotosintezei. Yamada şi colab.(1978) s-au ocupat de această problemă şi au
ajuns la concluzia că în realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie să se aibă în vedere
selectarea de celule care produc multă clorofilă. Lumina puternică stimulează sintetizarea
clorofilei, dar numai la o concentraţie scăzută de zaharoză. Prezenţa în mediul de cultură a
unor concentraţii ridicate de zaharoză inhibă sinteza clorofilei.
Culturile de celule au implicaţii practice deosebite în industria aşa zisă de tip
fermentativ, după modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele în scopuri
industriale. Şi în culturile de celule s-a asimilat şi adoptat termenul de fermentatoare pentru
recipientele în care se cultivă celule. La plantele superioare, spre deosebire de
microorganisme, produşii secundari de metabolism sunt depozitaţi în vacuole, nefiind
excretaţi în mediul de cultură. La suspensiile celulare, derivând din plantele superioare, durata
de fermentaţie este de cca 10 ori mai mare decât la culturile de tip microbian.
Un aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma
precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de cultură. Biotransformarea poate fi
utilizată pentru diferite tipuri de reacţii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare,
adiţia de carbon, ruperea lanţului de carbon.
Culturile în mediu lichid prezintă avantajul unui contact mai bun al celulelor cu
nutrienţii, se asigură un schimb de gaze optimizat, se evită neajunsurile provocate de o
eventuală orientare polară neadecvată, precum şi depozitarea şi concentrarea în jurul celulelor
a produşilor de metabolism, eliminaţi în mediu.

6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante

Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosită ca explant pentru iniţierea culturilor
in vitro. Inducerea neoformării de ţesuturi este dependentă de specie, de natura organului, de
mărimea explantului, natura ţesuturilor prezente în explant, sezonul în care s-a recoltat
organul, modul de sterilizare, compoziţia mediului de cultură, orientarea lor pe mediu precum
şi balanţa hormonală folosită în mediul de cultură.
De regulă, în afară de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al
inflorescenţelor, cotiledoanelor şi mai rar, în porţiunea internodală a tulpinilor se constată
existenţa unei capacităţi regenerative, a cărei intensitate depinde de specie, de vârsta
organului din acre se prelevează ţesuturile, mărimea explantului, orientarea lui pe mediu de
cultură, de compoziţia mediului sau de condiţiile din camera de creştere.
Într-un experiment efectuat de Lazăr şi Cachiţă (1980-1982), cu explante de
crizantemă de natură diferită, cultivate pe mediu de bază cu adaos de AIA (2 mg/l) şi BA
(2mg/l) s-a constatat că, în afară de meristeme, alte tipuri de explante folosite – de la peduncul
floral, peţiol, inflorescenţa, minibutaşi – frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a
observat inducerea proceselor de organogeneză, pe suprafaţa superioară, formare de muguraşi
iar pe cea inferioară, generarea de rădăciniţe. Din meristemele apicale, după două luni de
cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. Din meristemele axilare,
diferenţierea plantelor s-a făcut mai lent. Plantele formate din meristeme au avut o
conformaţie proporţionată şi s-au adaptat bine la viaţa mediului septic. Explantele nodale şi
cele constând din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un număr variabil de muguraşi.
Dintre aceştia unul până la trei s-au dezvoltat, ceilalţi rămânând în diferite faze de creştere.
separaţi şi subcultivaţi pe medii proaspete au format rădăciniţe şi s-au dezvoltat normal.
Inoculii constând din explante de formă cilindrică (ex. internod), au prezentat o pregnantă
polaritate morfogenetică, chiar dacă explantul a fost acoperit de calus.
Procesul de organogeneză a fost şi mai scăzut la fragmentul desprins din mijlocul
peţiolului frunzelor. În general, inoculii constând din internod şi mai ales cei dimensionaţi din
peţiol au generat mult mai mult calus decât cei de formă şi mărime similară, obţinuţi din
peduncul floral.
Explantele dimensionate din porţiunea limbului foliar, în care nervura principală a
frunzei era bine reprezentată, au generat o cantitate mai redusă de calus, în schimb au dat
naştere la muguraşi, din care s-au format plante (Lazăr şi Cachiţă, 1982). În general, lăstăraşii
formaţi la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpiniţelor formate din
meristeme, ceea ce atestă că din celulele calusului se pot diferenţia plantule cu o conformaţie
particulară, diferită de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurată, pe această cale
înmulţirea clonală.
Concluzia finală a constat în aceea că regenerarea şi diferenţierea rapidă a noi plante s-
a realizat din inoculii meristematici. Lăstarii pot fi transformaţi în minibutaşi şi prin aceasta se
ridică coeficientul de multiplicare a clonei respective.
Se poate deci concluziona că, în funcţie de specia la care se doreşte experimentare, dar
ţinând cont şi de scopul urmărit, natura explantului este diferită, iar rezultatul preconizat a se
obţine este influenţat de o serie de factori, de la compoziţia mediului de cultură, natura
fitohormonilor de creştere şi concentraţia acestora, până la vârsta organului donor sau
condiţiile din camerele de creştere. Există, aşadar, o „gamă” variată de posibilităţi de inducere
a unei culturi in vitro, astfel că se pot depista pentru fiecare specie de cultură, ornamentală sau
forestieră, sursele de explante cele mai potrivite în vederea realizării unor astfel de experienţe.
Iar acolo unde literatura nu oferă posibilităţi de inducere a culturilor de celule, experienţa
cercetătorului poate permite depistarea prin tatonări a celor mai bune metode în vederea
realizării obiectivelor în acest domeniu.