Proprietăți potențiale antidiabetice ale

extractului de tescovină de struguri

Merlot: un studiu in vitro , in silico și in
vivo al inhibării α-amilazei și α-
glucozidazei
Linkurile autorului deschid panoul de suprapunereCamila
Gabriel Kato-Schwartz  ,Rúbia Carvalho Gomes Corrêa  ,Diego de
a b e

Souza Lima  ,Anacharis Babeto de Sá-Nakanishi  ,Geferson de

c a

Almeida Gonçalves  ,Flavio Augusto Vicente Seixas  ,Charles

a c

WI Haminiuk  ,Lillian Barros  ,Isabel

d e

CFR Ferreira  ,Adelar Bracht  ,Rosane Marina Peralta 

e a a

Afișați mai multe

Adaugă la Mendeley
Acțiune
Cita
https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109462Obțineți drepturi și conținut
Sub un Elsevierlicență de utilizator
acces deschis

Repere
•
Extractul de tescovină de struguri Merlot (MGPE) a fost investigat pentru
potențialul său antidiabetic.
•
Au fost efectuate teste cinetice enzimatice și simulări de andocare moleculară.
•
MGPE a inhibat α-amilazele pancreatice și salivare in vitro, dar nu și α-
glucozidaza.
•
MGPE a inhibat eficient hidroliza amidonului într-un model de șobolan.
•
Peonidin-3- O - acetilglucozida este probabil să fie cel mai puternic inhibitor
de α-amilază.

Abstract
O abordare practică pentru controlul glicemiei în diabet este utilizarea produselor
naturale din plante care întârzie hidroliza zaharurilor complexe și favorizează
diminuarea eliberării de unități de glucozil în plasma sanguină. Polifenolicii au fost
descriși ca fiind eficienți în inhibarea amilazelor și a-glucozidazelor. Tescovină de
struguri este un subprodus important al industriei vinului, încă bogat în mulți
compuși precum polifenolici. În acest context, scopul acestui studiu a fost să caute
posibilele efecte ale unui extract de tescovină de struguri asupra α-amilazelor și α-
glucozidazei salivare și pancreatice, precum și asupra absorbției intestinale a
glucozei. Extractul de tescovină de struguri Merlot (MGPE) a fost preparat folosind
un amestec hidroalcoolic (40% etanol + 60% apă). In vitroinhibarea a fost
cuantificată folosind amidon de cartof (pentru amilaze) și maltoză (pentru α-
glucozidază) ca substraturi. Inhibarea in vivo a fost evaluată prin efectuarea de teste
de toleranță la amidon și maltoză la șobolani cu sau fără administrare de
MGPE. Clasificarea compușilor extracti în funcție de afinitatea lor față de α-amilaze a
fost realizată prin simulări pe computer folosind trei programe diferite. Ambele α-
amilaze, pancreatice și salivare, au fost inhibate de MGPE. Cu toate acestea, nu a fost
detectată nicio inhibare a α-glucozidazei. Valorile IC50 au fost 90 ± 10 μg/mL și 143 ±
15 μg/mL pentru amilazele salivare și, respectiv, pancreatice. Din punct de vedere
cinetic, această inhibare a arătat un model complex, cu legare multiplă a
constituenților extractului de enzime. În plus, in silicoSimulările de andocare au
indicat că mai multe substanțe fenolice, de exemplu, peonidin-3- O - acetilglucozidă,
quercetin-3- O - glucuronida și izorhamnetin-3- O -glucozida, pe lângă catechina, au
fost cei mai probabil polifenoli responsabili pentru inhibarea α-amilazei cauzată. de
MGPE. Explozia hiperglicemică, un fenomen obișnuit care urmează administrării
amidonului, a fost substanțial inhibată de MGPE. Rezultatele noastre sugerează că
MGPE poate fi adecvat pentru menținerea nivelurilor normale din sânge după
ingestia de alimente.

Abstract grafic

1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (173KB)

2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă

 Articolul anterior în ediție
 Următorul articol în ediție 
Cuvinte cheie
Enzime hidrolizatoare de carbohidrați
Diabet
Simulări de andocare
Flavonoide
Controlul glicemiei
Polifenoli
Subprodus de vinărie

1 . Introducere
Diabetul este o boală cronică binecunoscută care provoacă hiperglicemie și modifică
metabolismul într-un mod dezordonat. Prevalența diabetului zaharat crește constant
la nivel mondial și are consecințe de amploare asupra calității vieții umane. Diabetul
zaharat de tip 2 (DM2) afectează aproximativ 90% dintre pacienții diagnosticați cu
boală din țările cu venituri mari ( Ma et al., 2019 ). Hiperglicemia, cea mai vizibilă
consecință a diabetului zaharat, provoacă mai multe tulburări metabolice
( Giovannini, Howes și Edwards, 2016). Multe medicamente antidiabetice orale sunt
utilizate pentru controlul glicemiei. Aceste antidiabetice pot fi împărțite în diferite
clase în funcție de mecanismele lor de acțiune: (1) secretagogi de insulină (de
exemplu, sulfoniluree și regulatori de glucoză postprandiali), (2) compuși capabili să
reducă rezistența la insulină (de exemplu, metformină și tiazolidindione), (3)
inhibitori ai enzimelor digestive carbohidrați (de exemplu, acarboză) ( Campbell,
2007 ). Utilizarea acestor medicamente poate prezenta mai multe grade de eficiență,
în funcție de fiecare caz în parte. Câteva dintre ele acționează prin diferite
mecanisme, cum ar fi izoflavonele din soia , care se comportă ca secretagogi ai
insulinei și, în același timp, sunt inhibitori ai enzimelor digestive carbohidrate
( Hamden, Jaouadi, Carreau, Aouidet și Elfeki, 2011).). Pe de altă parte, utilizarea lor
nu este lipsită de mai multe efecte secundare. Acestea din urmă includ hipoglicemia,
creșterea în greutate, edemele, acidoza lactică, colestaza, malabsorbția de folat și
B 12 etc. Acarboza, care acționează prin inhibarea α-glucozidazei și α-amilazei
(respectiv, EC. 3.2.1.20 și EC. 3.2.1.1). ), provoacă disconfort abdominal, flatulență,
meteorism și diaree moderată. Acestea pot fi rezultatul unei fermentații crescute și
anormale a carbohidraților semi-digerați ca urmare a acțiunii microbiotei intestinale
( Sales, Souza, Simeoni, Magalhães, & Dâmaris, 2012 ). Astfel de reacții nedorite
determină foarte adesea întreruperea terapiei. Din acest motiv, introducerea de noi
inhibitori este foarte de dorit.
În ciuda efectelor secundare negative ale acarbozei, întârzierea absorbției glucozei în
timpul digestiei a fost considerată pe scară largă o manevră utilă și practică pentru
controlul concentrației de glucoză din sânge ( Lalegani, Gavlighi, Azizi și Sarteshnizi,
2018 ). Acesta este încă un motiv pentru interesul remarcabil actual pentru
medicamentele derivate din plante și aditivii alimentaricare conțin amestecuri de
inhibitori capabili să inhibe enzimele de hidroliză a carbohidraților fără a provoca
efectele secundare ale acarbozei. Ideea se bazează pe speranța că, dacă sunt ingerate
ca aliment sau în timpul meselor împreună cu alimente, acțiunea lor ușoară și
întreruptă poate preveni acumularea de carbohidrați nedigerați. Acest lucru, la
rândul său, ar reduce riscul unei fermentații bacteriene excesive. Polifenolici, inclusiv
taninuri de diferite tipuri, flavonoide, catechine și acid galic printre altele, au fost
denumiți ca antioxidanți și inhibitori ai enzimelor hidrolitice, în special ai α-
amilazelor și α-glucozidazei ( Silva și colab., 2014 , Martinez-Gonzalez și colab . .,
2017 , Kato et al., 2017 , Kato-Schwartz et al., 2018 ,Shanmugam și colab.,
2018 , Gutiérrez-Grijalva și colab., 2019 , Li și colab., 2019 , Cardullo și colab.,
2020 , Zhu și colab., 2020 ).
Dintre struguri, Vitis vinifera este una dintre cele mai frecvent cultivate specii pentru
producția de vin ( Barba et al., 2016 , Dulf et al., 2020 ). Ramura de activități
vitivinicole generează multe produse secundare, de exemplu, drojdie, rahis și
tescovină. Când cantitățile lor sunt însumate, acestea corespund aproximativ 30% din
strugurii vinificați ( Drevelegka & Goula, 2020 ). Acest material este încă subexplorat
și este aruncat frecvent în mediu, indiferent de impactul său negativ ( Beres et al.,
2017 ). Tescovină de struguri, cel mai masiv subprodus, cuprinde tulpini, coji și
semințe. După cum este ușor de dedus, acest material conține încă cantități
apreciabile de compuși fenoliciși alte principii active ( Corrêa și colab., 2017 , Peixoto
și colab., 2018 ).
S-a afirmat că compușii fenolici posedă proprietăți antioxidante, antiradicale,
antitumorale, antimicrobiene, anti-îmbătrânire, antiinflamatorii și antitumorale și,
de asemenea, că pot exercita activitate cardioprotectoare ( Corrêa et al., 2018 , Jara-
Palacios). și colab., 2015 , Ribeiro și colab., 2015 , Zhao și colab., 2020 ). Investigațiile
anterioare ale grupului nostru, de exemplu, au identificat mai multe molecule cu
potențiale proprietăți funcționale într-un extract hidroalcoolic de tescovină de
struguri Merlot ( Vitis vinifera L.) (MGPE). Compușii descriși includ non-
antocianine fenolice, cum ar fi diverse catechine, precum și antocianine fenolice
( Corrêa și colab., 2017 , Gonçalves și colab., 2017).) ( Tabelul 1 ). MGPE studiat a
suferit modificări calitative și cantitative mai mult sau mai puțin drastice ale
conținutului său fenolic la digestie, așa cum este indicat de un studiu de digestie in
vitro ( Corrêa et al., 2017 ). Cu toate acestea, este încă în mod semnificativ capabil să
amelioreze starea oxidativă și să atenueze inflamația șobolanilor artritici ( Gonçalves
și colab., 2017 ).
Tabelul 1 . Doze zilnice de compuși fenolici, non-antociani și antociani, administrate animalelor*.

Celulă goală Doza zilnică din fiecare compus (mg/kg)

Compus doza de 50 mg/kg doza de 250 mg/kg
Compuși fenolici non-antociani
Acid galoilshikimic 0,17 0,84
Dimeri de (epi)catechină de tip B (4 izomeri) 1.28 6.36
Acid digaloilchinic 0,12 0,58
(+)-catechină 0,36 1,82
Acid digaloilshikimic 0,09 0,47
(−)-Epicatechina 0,37 1,83
Trimeri de (epi)catechină de tip B (2 izomeri) 0,43 2.13
Tretramer (epi)catechină de tip B 0,16 0,8
Miricetin - O -hexozidă 0,07 0,36
Quercetin-3- O - glucuronid 0,03 0,14
Quercetin-3- O -glucozid 0,03 0,13
Laricitrină- O -hexozidă 0,02 0,09
Quercetin - O -pentozidă 0,02 0,10
Quercetin - O -rhamnozid 0,02 0,10
Isorhamnetin-3- O -glucozidă 0,03 0,13
Derivat de metilizormnetină 0,02 0,08
Antocianine
Petunidin-3- O -glucozid 0,03 0,15
Peonidin-3- O -glucozid 0,08 0,39
Malvidin-3- O -glucozidă 0,17 0,85
Peonidin-3- O - acetilglucozidă 0,04 0,17
Celulă goală Doza zilnică din fiecare compus (mg/kg)
Compus doza de 50 mg/kg doza de 250 mg/kg
Malvidin-3- O - acetilglucozidă 0,04 0,19
*Valorile au fost calculate din conținutul corespunzător al extractului apos de tescovină de
struguri raportat într-o lucrare anterioară ( Corrêa et al., 2017 ).

Recent, s-a raportat că extracte din mai multe fructe native braziliene, cum ar
fi Campomanesia phaea, Eugenia dysenterica , Myrciaria dubia și Myrciaria
cauliflora , inhibă eficient α-amilazele in vitro și in vivo (experimente pe animale și
studii clinice) ( Balisteiro, de Araujo, Giacaglia). , & Genovese, 2017 ). Rezultate
similare au fost obținute cu extracte de orez roșu ( Oryza sativa ) ( Liu et al., 2017 ),
frunze de smochin ( Ficus benjamina ) ( Mumtaz et al., 2018 ) și fructe de măr ( 
Malus domestica ) ( Li, Sun, et al., 2019). Polifenolii au fost în general considerați
cele mai importante molecule implicate în aceste efecte ( Sun și colab.,
2019 , Tresserra-Rimbau și colab., 2018).). Pe de altă parte, atâta timp cât am putut
afla, nu s-au făcut încercări de investigare a posibilelor activități inhibitorii ale
extractelor de tescovină de struguri asupra enzimelor responsabile de hidroliza
carbohidraților care sunt importanți în diabetul de tip 2. Având în vedere acest
decalaj, scopul prezentei lucrări a fost de a investiga extractul de tescovină de struguri
Merlot pentru acțiunile sale asupra a trei enzime hidrolizatoare de carbohidrați, mai
precis α-amilaze și α-glucozidaze salivare și pancreatice, precum și evaluarea
acțiunilor sale asupra intestinului. absorbția glucozei. Trebuie remarcat faptul că
potențialele beneficii pentru sănătate pentru tescovină de struguri Merlot prezintă, de
asemenea, o alternativă durabilă pentru utilizarea sa. Odată ce a fost detectat un efect
inhibitor,
2 . Material si metode
2.1 . Materiale
Enzimele și cele mai multe substanțe chimice specifice au fost obținute de la Sigma-
Aldrich (St. Louis, SUA): α-amilază pancreatică (porcină; Tip VI-B; A3176), α-
amilază salivară (uman; A1031), maltoză (M5885), glucoză ( G8270 ), amidon de
cartofi (85642) şi acarboză ( C25H43NO18 , mw 645; A8980) . Gold Analisa a fost achiziționat
de la Labtest Brazilia. Mostre de tescovină de struguri Merlot ( Vitis vinifera ) au fost
obținute de la companii stabilite în statul Paraná, Brazilia. Strugurii fuseseră recoltați
și presați în 2013. În laborator, uscarea s-a făcut într-un cuptor cu convecție (Marconi
MA 035, Brazilia) la 80 °C timp de 36 de ore. După măcinare, materialul a fost
ambalat în pungi de folie de polietilenă sub vid, cu depozitare ulterioară la -20 °C
până la utilizare ( Ribeiro et al., 2015).).
2.2 . Preparat cu extract de tescovină de struguri Merlot
Extractul de tescovină de struguri Merlot (MGPE) a fost preparat așa cum a fost
descris anterior ( Gonçalves și colab., 2017 ). O caracterizare completă a extractului în
ceea ce privește non-antociani și constituenții săi antociani prin analiza HPLC-DAD-
MS a fost deja raportată ( Gonçalves și colab., 2017 ). Numele și cantitățile
compușilor identificați sunt date în Tabelul 1 . În această listă au fost adăugați
împreună dimerii de (epi)catechină de tip B (4 izomeri) și trimerii de (epi)catechină
de tip B (2 izomeri).
2.3 . Vitezele de reacție inițiale ale α-amilazelor
Ratele de reacție inițiale catalizate de ambele α-amilaze, salivare umană și
pancreatică porcină, au fost măsurate la temperatură (37 ° C) și pH (6,9) aproape de
optima raportată anterior ( Silva și colab., 2014 ). Substratul a fost amidon de cartofi
până la 1,0 g per 100 ml preparat în 20 mmol/L tampon fosfat plus 6,7 mmol/L
NaCI. Cantitatea de enzimă adăugată la fiecare amestec de reacţie a fost de 1 unitate
(activitate specifică 500 unităţi/mg proteină). După 10 minute de reacţie, cantitatea
de zaharuri reducătoare din mediul de reacţie a fost cuantificată utilizând procedeul
acidului 3,5-dinitrosalicilic ( Miller, 1959 ). Curba standard a fost construită cu
maltoză. Nu s-au observat modificări ale pH-ului de-a lungul timpului de incubare. În
diferitele teste au fost utilizate concentrații de MGPE de până la 250 μg/mL.
2.4 . Izolarea și analiza α-glucozidazei intestinale
A-glucozidaza intestinală (EC. 3.2.1.20) a fost izolată din intestinul subțire al
șobolanului așa cum s-a descris anterior ( Kato-Schwartz și colab., 2020 ). Pentru
determinarea activității a-glucozidazei a fost utilizat un kit de diagnosticare a glucozei
bazat pe reactivul glucozooxidază așa cum este descris ( Kato-Schwartz și colab.,
2020 ). Definiția unității enzimatice sa bazat pe regulile universal acceptate.
2.5 . Evaluarea cinetică a acțiunii inhibitoare a MGPE asupra α-amilazelor
Concentrațiile inhibitorilor care provoacă o inhibiție de 50% (IC 50 ) au fost obținute
prin interpolare numerică folosind programul Scientist (MicroMath Scientific
Software (Salt Lake City, UT). Potrivirea ecuațiilor de viteză la ratele inițiale
experimentale ale activității enzimatice s-a făcut folosind metoda tradițională.
algoritm neliniar al celor mai mici pătrate. Ecuația cea mai adecvată a fost dedusă din
abaterile standard și criteriile de selecție a modelului (MSC). Criteriul de selecție a
modelului este de obicei definit ca ( Akaike, 1974 ):(1)MSC=ln∑�=1���(�ob��-
�¯obs)2∑�=1���(�ob��-�ca��)2-2��
Da , obs ,�¯obsși Y  cal sunt, respectiv, vitezele de reacție experimentale, experimentale

medii și calculate. Numărul de observații este reprezentat prin n și numărul de

parametri prin p . Mecanismul cinetic cu cea mai mare valoare MSC a fost considerat
cea mai bună descriere a datelor experimentale.
2.6 . Bioinformatica
Structura 3D a α-amilazei pancreatice de la porc la o rezoluție de 1,38 Å legată de
fragmentul de acarboză (pseudotrizaharidă), a fost preluată din Protein Data Bank
(PDBid 1hx0) [PMID 11412124]. Apoi, α-amilaza pancreatică umană legată de
acarboză pentazaharidă (ARE) (PDBid 1xd0) ( Li și colab., 2005 ), a fost obținută și
suprapusă pe α-amilaza pancreatică porcină folosind software-ul Coot ( Emsley,
Lohkamp, Scott, & Cowtan, 2010). Coordonatele ligandului ARE au fost apoi
transferate în α-amilaza pancreatică (docking geometric), astfel încât complexul de
structură rezultat a fost utilizat ca țintă principală în simulările de screening
virtuale. α-amilaza salivară umană (rezoluție 1,5 Å; pdbid: 3dhp) a fost utilizată ca
țintă secundară în studiile de andocare pentru a evalua cei mai buni compuși selectați
prin screening virtual. Toate moleculele de solvent (apă) și ionii au fost eliminați din
structuri înainte de a trece la andocare și screening virtual.
În simulări au fost utilizate trei programe: Autodock-v4.2.3 ( Morris et al., 2009 ),
implementat în interfața grafică PyRx-0.9 ( Dallakyan & Olson, 2015 ), Molegro-v6.0
Virtual Docker ( Thomsen & Christensen, 2006 ) și Gold-v5.4.0 ( Jones, Willett, Glen,
Leach și Taylor, 1997). Alegerea funcțiilor de căutare și punctare în fiecare program a
fost realizată prin redocarea ligandului ARE pe complexul de α-amilază pancreatică
porcină modelat anterior. Protocolul a fost considerat a fi validat atunci când poza cel
mai bine clasată a furnizat o abatere pătrată medie sub 2,0 Å în toate
repetările. Pentru Molegro, scorul Moldock [grid] și Iterated Simplex au fost selectate
ca algoritmi de punctare și, respectiv, de căutare. Căutarea a fost ajustată la 10 rulări,
în timp ce alți parametri au fost setați implicit. A fost utilizată o rază de căutare de 12
Å centralizată la ligand de referință (ARE). Pentru Autodock, caseta de căutare a fost
centrată la ligand, cu  x, y și zaxele având dimensiunile grilei de 50. Numărul de
rulări a fost crescut la 50 și numărul de evaluări energetice a fost setat la 2.500.000
(medie). Acesta din urmă este justificat de numărul mare de legături rotative ale
liganzilor. În cele din urmă, pentru Gold, funcția de punctare selectată a fost Chemplp
(cu ASP ca rescore), eficiența căutării a fost ajustată la 200% și locul de legare a fost
definit ca toți atomii în 10 Å de ligand de referință.
O bibliotecă virtuală de compuși a fost construită folosind moleculele identificate prin
HPLC-DAD-MS în MGPE ( Gonçalves și colab., 2017 ). Structurile lor tridimensionale
au fost obținute din bazele de date PubChem ( Kim și colab., 2019 ) sau Zinc15
( Sterling & Irwin, 2015 ). Au fost descărcate structurile a 19 compuși,
inclusiv procianidina B2, dimerul [epicatechin-(4β→8)-epicatechină], care a servit
drept bază pentru desenarea trimerului (epi)catechinului de tip β și a (epi)catechinei
de tip β. compuși tetrameri folosind programul Marvin Sketch. Biblioteca finală care
conține 21 de molecule a fost apoi verificată virtual folosind protocoalele validate
stabilite prin redocking.
2.7 . Experimente pe animale
În toate experimentele au fost utilizați șobolani masculi Wistar (200-250 g). Pe tot
parcursul experimentului animalele au fost ținute în cuști individuale, cu acces liber
la apă și hrană peletizată standard. Experimentele au fost precedate de o perioadă de
post de 18 ore. Experimentele au fost aprobate de Comitetul de Etică pentru
Experimentarea Animală al Universității din Maringá (număr de protocol 067/2014-
CEUA-UEM), care respectă regulile universal recomandate pentru experimentarea pe
animale și este în deplină conformitate cu reglementările braziliene în materie.
2.7.1 . Evaluarea glucozei din sânge
Concentrația de glucoză din sânge a fost măsurată la momentul zero și la diferite
momente după administrarea de carbohidrați și inhibitori. Carbohidrații au fost
amidon, maltoză și glucoză. Inhibitorii au fost acarboză și extract de
tescovină. Sângele a fost colectat din vena cozii la timpi 0, 15, 30, 45 și 60
min. Glucoza a fost cuantificată cu ajutorul unui glucometru activ Accu-Chek®.
2.7.2 . Concentrația glucozei din sânge după administrarea amidonului
Administrarea intragastrică a fost utilizată pe tot parcursul. Au fost utilizate
următoarele condiţii experimentale: (1) martori, şobolani care au primit amidon de
porumb (1 g per kg greutate corporală); (2) martori negativi, animale care primesc
apă de la robinet; (3) martori pozitivi, 4 animale care au primit amidon de porumb
plus acarboză (50 mg/kg); (4) animale de testare care au primit amidon de porumb
plus 50 mg/kg MGPE; (5) animale de testare care au primit amidon de porumb plus
250 mg/kg MGPE. Patru șobolani au fost utilizați pentru fiecare protocol
experimental (n = 4). Decizia privind dozele de acarboză și MGPE sa bazat pe
experimente anterioare. Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată așa
cum este descris la punctul 2.7.1.
2.7.3 . Concentrația glucozei din sânge după administrarea de maltoză
Au fost utilizate următoarele condiţii experimentale: (1) martori, şobolani care au
primit maltoză (1 g per kg greutate corporală); (2) martori negativi, animale care
primesc apă de la robinet; (3) animale de testare care primesc maltoză plus 250
mg/kg MGPE; (4) animale de testare care au primit maltoză plus 500 mg/kg
MGPE. Patru șobolani au fost utilizați pentru fiecare protocol experimental (n =
4). Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată așa cum este descris la
punctul 2.7.1.
2.7.4 . Nivelul glicemic după hrănirea cu glucoză
Au fost utilizate următoarele condiţii experimentale: (1) martori, şobolani care au
primit glucoză (1 g per kg greutate corporală); (2) martori negativi, animale care
primesc apă de la robinet; (3) animale de testare care primesc glucoză plus MGPE în
doză de 100 mg/kg; (4) animalele de testare care primesc glucoză plus MGPE în doză
de 500 mg/kg. Patru șobolani au fost utilizați pentru fiecare protocol experimental (n
= 4). Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată așa cum este descris la
punctul 2.7.1.
2.8 . analize statistice
În calcule a fost utilizat software-ul GraphPad Prism (versiunea 8.0). S-au dedus
diferențe semnificative din testul Tukey pentru date omogene și din testul Kruskal-
Wallis pentru date eterogene după ANOVA unidirecțional. Semnificația a fost
acceptată când p  ≤ 0,05.
3 . Rezultate și discuții
3.1 . Inhibarea in vitro a activității enzimelor digestive carbohidrate de
către extractul de tescovină de struguri
Acțiunile extractului de tescovină de struguri asupra activităților diferitelor enzime
investigate în această lucrare sunt prezentate în Fig . Dependențele de concentrație de
inhibitor au fost determinate prin fixarea concentrației de amidon la 1 g/100 mL și
prin variarea concentrațiilor de MGPE în intervalul de până la 250 pg/mL. În Fig. 1 A,
activitățile enzimatice reziduale au fost reprezentate grafic în funcție de concentrația
inhibitorului. Ambele amilaze au fost inhibate de extractul de tescovină de struguri cu
dependențe clare de concentrație. Inhibarea amilazei salivare a fost mai pronunțată
decât cea a amilazei pancreatice; valorile IC50 au fost de 90 ± 10 μg/mL pentru prima
și 143 ± 15 µg/mL pentru cea din urmă. Efectele MGPE asupra α-glucozidazei
intestinale sunt de asemenea prezentate în Fig. 1A. În experimentele pertinente,
dependența de concentrație a fost determinată prin fixarea concentrației de maltoză
la 25 mM și prin variarea concentrației extractului de tescovină de struguri în
intervalul de până la 250 µg/mL. În mod clar, nu a fost observată nicio inhibiție (p ≥
0,05).
 1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (279KB)
2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 1 . Dependența de concentrație a efectelor extractului de tescovină de struguri
asupra activităților α-amilazei pancreatice porcine, α-amilazei salivare umane și α-
glucozidazei. Fiecare punct de referință este media a patru determinări. Ratele de
reacție (v; panoul A) și reciprocele viteze de reacție (1/v; panoul B) au fost
reprezentate față de concentrația de extract de tescovină de struguri ([I]).
Reprezentarea 1/v față de concentrația inhibitorului din Fig. 1 B a fost făcută pentru a
deduce într-un mod preliminar ecuația cinetică care descrie inhibiția cauzată de
MGPE. Cu ambele enzime s-a găsit o relație parabolică, indicând faptul că ecuația
ratei trebuie să conțină cel puțin un termen patratic [I] ( Plowman, 1972 ). Este demn
de menționat că acest fenomen nu reflectă eterogenitatea MGPE cu condiția ca
proporția dintre diferiții compuși să nu fie modificată ( Plowman, 1972 ). Având în
vedere această noțiune preliminară și pentru extinderea analizei, vitezele de reacție
inițiale au fost cuantificate prin variarea simultană a concentrațiilor de inhibitor și de
substrat. Fig. 2A afișează rezultatele utilizând α-amilaza salivară umană. Au fost
testate două concentrații diferite de inhibitor, așa cum este indicat pe grafic. S-au
găsit curbele obișnuite de saturație. Acestea din urmă nu converg la cele mai mari
concentrații de substrat, observație care exclude inhibiția competitivă. În consecință,
ecuațiile care descriu inhibiția mixtă au fost ajustate la curbele
experimentale. Potrivirea a fost simultană, aceasta include relația v × [S], precum și
relația v × [I]. Ecuația ratei care dă cea mai bună potrivire la curbele experimentale a
fost una care conține un singur termen patratic pentru [I]:(2)�=�max[�]��1+
[�]��1+[�]2��1��1′+[�]1+[�]��2

1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (252KB)

2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 2 . Viteze de reacție ale α-amilazei salivare umane obținute prin variarea
simultană a concentrațiilor de substrat (amidon) și a extractului de tescovină de
struguri. Fiecare punct de referință este media a patru determinări. Liniile care trec
prin punctele experimentale au fost calculate folosind parametrii optimizați obținuți
prin potrivirea Eq. (2) la datele experimentale printr-o procedură neliniară a celor
mai mici pătrate. Valorile parametrilor optimizați și indicatorii de bunătate a
potrivirii sunt K M , 0,321 ± 0,040 g/100 mL; V max , 0,703 ± 0,032
μmol/min; Ki1 , 30,75 ± 6,65 μg/mL; Ki2 , 217,43 ± 129,05 μg/mL;��1′, 244,71 ± 86,91
μg/mL; suma abaterilor pătrate, 0,0104; MSC, 3,893.
În Ec. (2) K  M și V  max reprezintă, ca de obicei, constantele Michaelis-Menten și,
respectiv, viteza maximă de reacție. Constantele aparente de inhibiție
sunt K  i1 ,��1′și K  i2 , a căror semnificație este cu siguranță foarte complexă, dar care
au legătură cu adevăratele constante de disociere ale complexelor EI, EI 2 și, respectiv,
ESI. Legenda din Fig. 2 enumeră valorile optimizate ale fiecărui
parametru. Complexul ESI 2 nu a putut fi detectat, deoarece procedura de ajustare a
returnat invariabil valori K  i2 ′ depășind cu câteva ordine de mărime celelalte
constante și cu o abatere standard depășind cu mult valoarea sa optimizată. Liniile
care trec prin punctele experimentale din ambele panouri din Fig. 2sunt curbele
calculate. Există un acord bun între teorie și experiment, inclusiv relația v × [I]. Dacă
parametrii optimizați afișați în legenda din Fig. 2 sunt înlocuiți în ecuația (2) , va fi
posibil să se prezică vitezele de reacție pentru orice combinație de concentrații de
amidon și extract. Comparația valorilor optimizate ale lui Ki 1 , Ki  2 și��1′indică faptul
că formarea complexului EI este fenomenul cel mai probabil la concentrații scăzute
ale inhibitorului sau amestecului de inhibitori, deoarece raportul Ki1 / Ki2  este egal cu
0,141. Formarea complexelor ESI și EI 2 este mai puțin probabilă, dar va avea loc cu
siguranță la concentrații de peste 100 μg/mL.
Vitezele inițiale ale reacției catalizate de α-amilaza pancreatică porcină la diferite
concentrații de substrat și inhibitor sunt prezentate în Fig. 3 A. Modelul general este
similar cu cel obținut pentru enzima salivară. Încercările de ajustare a Eq. (2) la date
au eșuat, totuși, deoarece încercările eșuate de a se potrivi mai multe ecuații care
conțin constante de inhibitor individualizate. Singura ecuație care a putut fi ajustată a
fost una care conține constantele medii de inhibiție compozite,��1¯și��2¯, în
combinație cu termeni patratici [I] ( Desseaux, Koukielkolo, Moreau, Santimoni și
Marchis-Mouren, 2002 ; Silva și colab., 2014 ):(3)�=�max[�]��1+[�]2(��1¯)2+
[�]1+[�]2(��2¯)2
 1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (295KB)
2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 3 . Viteze de reacție ale α-amilazei pancreatice porcine obținute prin variarea
simultană a concentrațiilor de substrat (amidon) și a extractului de tescovină de
struguri. Fiecare punct de referință este media a patru determinări. Liniile care trec
prin punctele experimentale au fost calculate folosind parametrii optimizați obținuți
prin potrivirea Eq. (3) la datele experimentale printr-o procedură neliniară a celor
mai mici pătrate. Valorile parametrilor optimizați și indicatorii de bunătate a
potrivirii sunt K M , 0,171 ± 0,017 g/100 mL; V max , 0,663 ± 0,017 μmol/min;Ki1¯,
72,99 ± 29,00 μg/mL;Ki2¯, 187,0 ± 84,8,1 μg/mL; suma abaterilor pătrate,
0,0107; MSC, 4,105.
Indicatorii de bunătate a potrivirii și valorile optimizate ale diferiților parametri sunt
dați în legenda din Fig. 3 . Comparația dintre experiment și teorie este permisă de
panourile A și B din Fig. 3 deoarece liniile continue au fost calculate după înlocuirea
parametrilor optimizați în Ec. (3) . Ca și în cazul precedent al enzimei salivare, există
un acord relativ bun între teorie și experiment, inclusiv relația v × [I]. Predicția
gradului de inhibiție la diferite concentrații de substrat și inhibitor prin intermediul
Eq. (3) este, astfel, o posibilitate reală. Constantele de inhibiție
compozite��1¯și��2¯au un sens complex ( Desseaux et al., 2002 ; Silva et al.,
2014 ). În principiu, ele pot fi considerate ca indicând faptul că complecşii de tip
EI2 , ESI2 sau de ordin superior predomină amplu atunci când MGPE este prezent în
mediul de reacţie. Așa cum a fost cazul enzimei salivare, complexarea cu α-amilaza
pancreatică liberă are loc, de asemenea, mai ușor decât legarea la complexul enzimă-
substrat, deoarece��1¯/��2¯este egal cu 0,39. Pe de altă parte, valorile
constantelor inhibitoare obținute cu ambele enzime sunt compatibile cu inhibiția mai
puternică observată cu α-amilaza salivară. Legarea componentelor extractului de
enzima salivară liberă, de exemplu, este (72,99/30,75 = ) de 2,37 ori mai probabilă
decât același fenomen cu enzima pancreatică.
Chiar și având în vedere eterogenitatea preparatului care a fost utilizat aici, trebuie
remarcat că acest fapt nu invalidează utilizarea ecuațiilor. (2) , (3) , cu condiția ca
proporțiile dintre concentrațiile compușilor activi să nu fie modificate, condiție care
se menține ori de câte ori se folosesc diferite cantități dintr-un anumit preparat
( Cleland, 1963 , Plowman, 1972).). Constantele de inhibiție în astfel de circumstanțe
vor avea însă o semnificație destul de complexă. Ele sunt de fapt funcții complexe ale
mai multor constante de disociere individuale și factori care relaționează greutatea
totală a extractului și conținutul său în principii active. Chiar și așa, ele sunt încă o
măsură a puterii unui preparat dat exprimată în termeni de masă de extract care a
fost adăugată, așa cum se poate deduce cu ușurință prin intermediul algoritmilor
generali ai cineticii enzimatice la starea de echilibru ( Chou și Talalay,
1977 , Cleland ). , 1963 , Ploughman, 1972 ). În acest moment, merită să comparăm
rezultatele studiului de față cu cele raportate de grupul nostru despre acarboză, un
inhibitor bine descris al α-amilazelor ( Silva et al., 2014).). Acarboza este un inhibitor
mult mai puternic al α-amilazelor salivare și pancreatice, cu constante de inhibiție în
intervalul de până la 10 μg/mL. Cu toate acestea, se leagă și de enzima liberă și de
enzima deja complexată cu substratul și, în cazul enzimei pancreatice, inhibarea este
parabolică cu formarea de complecși EI 2 , ESI 2 sau mai mari.
3.2 . Studii in silico
Așa cum sa menționat la Introducere, compoziția chimică a MGPE este destul de
complexă ( Tabelul 1 ) și izolarea diferiților compuși pentru testarea activității lor
inhibitorii asupra a-amilazelor poate fi destul de laborioasă. O abordare cea mai
convenabilă ar fi să deducem inițial din simulările computerizate care sunt cei mai
probabili compuși (sau compuși) să acționeze ca inhibitori ai α-amilazelor.
Ca strategie de pornire au fost utilizate simulări de redocking pentru selectarea
programelor și protocoalelor de andocare. Această procedură constă în andocarea
unui ligand care este deja prezent într-o structură cristalografică sau modelată. Dacă
programul reușește să „înțeleagă” forțele care conduc interacțiunile dintre proteină și
ligand, rezultatele vor fi cea mai bună poziție care se potrivește cu cea
modelată/cristalografică în toate repetițiile. O simulare de redocking de succes
sugerează că protocolul de andocare poate fi utilizat pentru a evalua liganzii
necunoscuți dintr-o bibliotecă virtuală. În această lucrare, metoda de redocking a fost
repetată de patru ori în fiecare program, iar rezultatele sunt rezumate în Tabelul
S1. Toate cele trei programe au reușit să reandoeze ligandul de pentazaharidă
acarboză pe locul de legare a α-amilazei pancreatice porcine ( Fig. S1).). Astfel,
protocoalele de andocare au fost aplicate pentru a evalua moleculele de extract de
struguri prezente în biblioteca noastră virtuală compusă din 21 de molecule. Pentru a
selecta cei mai promițători liganzi, am luat în considerare nu numai valorile scorului,
ci și reproductibilitatea în toate repetițiile folosind fiecare program. Deoarece fiecare
folosește un set distinct de algoritmi pentru a prezice pozițiile și scorurile de legare,
atunci când programe diferite pot reproduce un rezultat similar în mod repetat, este
mai probabil ca acestea să fie adevărate pozitive. Cele mai bune rezultate găsite în
urma screening-ului virtual sunt afișate în Tabelul 2 , iar structurile lor sunt
reprezentate în Fig. S2 . Ar trebui făcută o remarcă cu privire la dimerii, trimerii și
tetramerul (epi)catechinei de tip B din extract ( Tabelul 1 ).). Grupul de farmacofor
(epi)catechină nu a fost selectat prin screening virtual ca un potențial candidat pentru
inhibitor. În consecință, nu a existat nicio justificare pentru explorarea diferitelor
posibilități pentru aranjarea oligomerilor de tip B.
Tabelul 2 . Molecule selectate din screening virtual după patru repetări folosind trei programe pe
două ținte de α-amilază.

Compuși selectați Scorul Autodock Scorul Molegro Scorul de aur

Andocare folosind α-amilaza pancreatică porcină
Peonidin-3- O - acetilglucozidă (P3A) −8,40 ± 0,14 a −156,00 ± 1,90 a 81,46 ± 0,84 a
Isorhamnetin-3- O -glucozidă (I3G) −7,26 ± 0,27 b −131,12 ± 0,20 b 74,83 ± 1,98 b
Quercetin-3- O - glucuronid (Q3G) −7,07 ± 0,18 b −137,70 ± 0,42 c 70,47 ± 0,41 c
Catechina (KTC) −7,44 ± 0,02 c −102,17 ± 0,10 d 66,12 ± 1,05 d
Andocare folosind α-amilaza salivară umană
Peonidin-3- O - acetilglucozidă (P3A) −8,46 ± 0,09 a −172,95 ± 4,06 a 84,89 ± 1,53 a
Isorhamnetin-3- O -glucozidă (I3G) −7,09 ± 0,10 b −144,49 ± 0,17 b 72,27 ± 2,80 b
Quercetin-3- O - glucuronid (Q3G) −7,38 ± 0,20 c −142,11 ± 0,06 c 70,91 ± 1,94 b
Catechina (KTC) −7,17 ± 0,02 b −98,88 ± 0,18 d 63,24 ± 0,41 c
Litere diferite din aceeași coloană înseamnă diferență statistică (p < 0,05).

Molecula care a dat cele mai promițătoare scoruri a fost peonidin-3- O -

acetilglucozida (P3A, Fig. S3 - A), o antocianină care aparține clasei de compuși
fenolici cunoscuți de obicei ca flavonoide ( Ghosh & Konishi, 2007 ). Antocianinele
sunt pigmenți solubili în apă cu proprietăți antioxidante puternice care oferă beneficii
pentru sănătate în cazurile de inflamație, obezitate și diabet zaharat ( Gowd, Jia, &
Chen, 2017 ). Există rapoarte din literatură că alte antocianine, cum ar fi cianidin-3-
glucozida (C3G) și peonidin-3-glucozida (P3G), ar putea inhiba competitiv α-amilaza
pancreatică porcină in vitro , cu IC 50valori de 24 uM și, respectiv, 75 uM ( Sui, Zhang
și Zhou, 2016 ). Atât P3G, cât și C3G au aceeași schemă antocianică ( Fig. S3 - B),
diferind doar în grupul R de pe C3′ (inelul B), în timp ce P3G și P3A diferă doar în
grupul acetil de pe C6′' (glucozid).
Pe baza acestor observații, am decis să investigăm în continuare dacă C3G (care nu a
fost identificat în extractul de Merlot de struguri), precum și P3G, care este prezent în
extract, ar prezenta rezultate similare cu P3A folosind simulări de
andocare. Structurile au fost evaluate folosind protocoalele validate descrise mai
devreme, iar rezultatele calculelor sunt afișate în Tabelul S2. În toate simulările, P3A
a arătat cel mai mare scor și cea mai bună poziție a fost similară cu C3G și P3G ( Fig.
S4 ). Faptul că toate cele trei antociani își asumă practic aceleași poziții din toate cele
trei programe care au fost utilizate, sugerează că acestea sunt stabilizate prin aceleași
interacțiuni în locul activ, cunoscut și sub numele de fisură de legare, care se află în
apropierea centrului proteinei și poate fi caracterizată prin reziduurile catalitice
Asp197, Glu233 și Asp300 (Larson, Day și McPherson, 2010 ). Fig. 4 prezintă P3A
andocat în situsul activ al a-amilazei pancreatice porcine, înconjurat de reziduuri de
lanțuri laterale. Toate programele au arătat că P3A a fost înconjurat de aceleași trei
reziduuri catalitice și, de asemenea, în apropierea lanțurilor laterale ale Lys200,
Arg195, Gln63 și His305.

1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (195KB)

2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 4 . Cea mai bună poziție a peonidin-3- O - acetilglucozidei (P3A) fixată pe locul
de legare catalitică al α-amilazei pancreatice porcine. Reziduurile catalitice Asp197,
Asp300 și Glu233 sunt în contact strâns cu P3A.
α-amilaza pancreatică este o țintă mai bună pentru dezvoltarea inhibitorilor cu
activitate antihiperglicemică în ceea ce privește α-amilaza salivară ( Qin și colab.,
2011 ), având în vedere timpul de înjumătățire/activitate mai mare în lumenul
duodenului. În plus, nu există nicio structură cristalografică a α-amilazei salivare
legată de inhibitorul nostru de control ACA depus în PDB. Prin urmare, în simulările
noastre virtuale de screening, am folosit α-amilaza pancreatică ca țintă principală. Cu
toate acestea, după screening-ul virtual, liganzii cel mai bine clasați au fost în mod
egal ancorați pe α-amilaza salivară unde prezentau poziții destul de apropiate de cele
observate în α-amilaza pancreatică, cu un grup caracteristic de conformație ( Fig.
S5 ).
Pe baza simulărilor noastre de andocare, se poate deduce că antocianii sunt capabili
să blocheze situsul catalitic al α-amilazei. În principiu, totuși, acest lucru este la fel de
valabil pentru catechină, care este considerabil mai abundentă în MGPE decât orice
antocianin individual ( Tabelul 2 ). Deși afinitatea unei proteine pentru un ligand
poate fi estimată cu precizie doar prin metode de calcul mai sensibile, cum ar fi
Linear Interaction Energy (LIE) ( Gutiérrez-de-Terán & Åqvist, 2012 ) sau Molecular
Mechanics Poison-Boltzmann Surface Area (MM-PBSA) ) ( Kumari et al., 2014),
simulările de andocare oferă indicii importante pentru a găsi locul de legare a
proteinei și pentru a înțelege interacțiunea acestuia cu liganzii. Simulările de
andocare contribuie, de asemenea, la elaborarea celei mai probabile conformații pe
care un anumit ligand o poate asuma la legarea. Scorurile obținute pentru diferiții
liganzi descriși în Tabelul 2 sunt relativ apropiate. Aceasta sugerează competiție între
ei sau cu substratul pentru situsul activ al enzimei. Deși legarea este la fel de posibilă
în prezența substratului, așa cum indică datele cinetice care au evidențiat un tip mixt
de inhibiție, legarea în absența substratului este considerabil mai puternică, așa cum
demonstrează faptul că constantele de disociere aparente pertinente pentru
complexele EI ( K  i1 și��1¯) sunt mai mici pentru ambele enzime decât constantele
aparente de disociere pentru complexele ESI (vezi legendele din Fig. 2 , Fig. 3 ).
Interacțiunile descrise până acum ar putea, astfel, să explice activitatea inhibitoare a
extractului de tescovină de struguri Merlot asupra α-amilazelor și să ofere informații
utile pentru dezvoltarea de noi inhibitori. Chiar dacă P3G, C3G și P3A au structuri
chimice similare și au arătat poziții de legare suprapuse, P3A pare să aibă un scor de
andocare semnificativ mai mare pentru legarea la site-ul activ, pe baza rezultatelor de
la trei software-uri diferite. Catechina, pe de altă parte, prezintă scoruri de andocare
relativ mai mici în comparație cu cele trei antocianine ( Tabelul 2 ), dar abundența sa
relativă în MGPE ( Tabelul 1 ) nu permite excluderea participării sale la activitatea
inhibitoare.
3.3 . Inhibarea in vivo a activităților enzimelor digestive carbohidrate de
către extractul de tescovină de struguri
Este important să aflăm dacă efectele MGPE asupra α-amilazelor au relevanță
fiziologică, adică dacă apar și in vivo . O abordare experimentală care ar putea
produce un răspuns la această întrebare este cuantificarea apariției glucozei în sânge
după hrănirea animalelor cu amidon. În mod similar, datorită absenței virtuale a
efectelor asupra α-glucozidazei, nu ar trebui să apară modificări ale nivelurilor de
glucoză din sânge la administrarea de maltoză. Acest raționament se bazează pe
noțiunea general acceptată că acțiunea enzimelor hidrolitice în tractul intestinal este
esențială pentru absorbția constituenților moleculari individuali ai di-, oligo-
și polizaharidelor . tabelul 1arată dozele zilnice de non-antociani fenolici și compuși
antociani care au fost administrați automat ca parte a extractului de 50 sau 250 mg
per kg greutate care au fost administrate animalelor.
Fig. 5 , Fig. 6 , Fig. 7 ilustrează rezultatele experimentelor care au fost făcute în
căutarea răspunsurilor la întrebarea formulată mai sus. Administrarea numai de
amidon ( Fig. 5A) a produs curba de control în care concentrația de glucoză din sânge
a crescut până la o valoare maximă (la 30 min) care a fost cu 90% peste concentrația
bazală. Tendința de scădere nu a fost încă completă la 60 de minute, deoarece
concentrația de glucoză era încă considerabil peste linia bazală. Administrarea apei
nu a perturbat concentrațiile de glucoză din sânge în mod semnificativ în perioada de
60 de minute. O creștere mai mică a nivelului de glucoză din sânge a fost găsită
atunci când amidonul și 50 mg/kg de MGPE au fost administrate simultan (p ≤
0,05). Când doza de MGPE a fost crescută la 250 mg/kg, evenimentele au fost
oarecum modificate cu o întârziere inițială și niveluri mai mici la sfârșit (60
min). Efectele acestei doze au fost apropiate de modificările cauzate de
acarboză. Panoul B din Fig. 4prezintă zonele sub diferitele curbe timp-răspuns
obţinute după administrarea amidonului în diferite condiţii, diminuate faţă de zona
de sub curbă atunci când s-a administrat numai apă. Ambele doze de MGPE au redus
semnificativ zonele de sub curbe. Scăderile la dozele de 50 și 240 mg/kg au realizat,
respectiv, 37,1 și respectiv 71,4%.
 1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (204KB)
2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 5 . Influența administrării de MGPE și acarboză asupra nivelurilor glicemice ale
șobolanilor aflați a jeun timp de 60 de minute după administrarea
amidonului. Probele de sânge din vena cozii au fost analizate cu ajutorul unui
glucometru după administrarea de amidon intragastric (1 g per kg greutate
corporală). Fiecare punct de referință reprezintă media ± erorile standard medii a trei
experimente. (●,1) Amidon singur; (○) apă singură; (▲, 4) amidon plus 50 mg/kg
acarboză; (□,2) amidon plus 50 mg/kg MGPE; (■,3) amidon plus 250 mg/kg
MGPE. Detaliile experimentale sunt date în secțiunea Materiale și metode. În B, toate
valorile sunt diferite statistic unele de altele (p ≤ 0,05).

1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (181KB)

2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 6 . Influența administrării de MGPE asupra nivelurilor glicemice la șobolanii a
jeun timp de 60 de minute după administrarea de maltoză. Probele de sânge din vena
cozii au fost analizate cu ajutorul unui glucometru după administrarea de amidon
intragastric (1 g per kg greutate corporală). Fiecare punct de referință reprezintă
media ± erorile standard medii a trei experimente. (●,1) Doar maltoză; (○) apă
singură; (□,2) maltoză plus 250 mg/kg MGPE; (■,3) maltoză plus 500 mg/kg
MGPE. Detaliile experimentale sunt date în secțiunea Materiale și metode. În B, toate
valorile nu sunt diferite statistic unele de altele (p ≤ 0,05).

1. Descărcare: Descărcați imaginea de înaltă rezoluție (185KB)

2. Descărcare : descărcați imaginea la dimensiunea completă
Fig. 7 . Influența administrării de MGPE asupra nivelurilor glicemice la șobolanii a
jeun timp de 60 de minute după administrarea de glucoză. Probele de sânge din vena
cozii au fost analizate cu ajutorul unui glucometru după administrarea intragastrică
de glucoză (1 g per kg greutate corporală). Fiecare punct de referință reprezintă media
± erorile standard medii a trei experimente. (●,1) Glucoză singură; (○) apă
singură; (■) glucoză plus 100 mg/kg MGPE; (■,2) glucoză plus 500 mg/kg MGPE
(□,3). Detaliile experimentale sunt date în secțiunea Materiale și metode. În B, toate
valorile nu sunt diferite statistic unele de altele (p ≤ 0,05).
Spre deosebire de ceea ce sa observat cu amidon, administrarea simultană de MGPE
și maltoză nu a provocat nicio reducere a nivelurilor de glucoză din sânge ( Fig.
6 ). Această observație este în concordanță cu testele in vitro , în care activitatea a-
glucozidazei nu a fost afectată negativ de extract ( Fig. 1 ). În cele din urmă, Fig.
7 arată că MGPE nu a avut efect inhibitor atunci când a fost administrat simultan cu
glucoză. Aceste studii in vivo întăresc ideea că extractul de tescovină de struguri
acționează prin inhibarea activității amilazei, dar nu prezintă nicio acțiune
inhibitoare asupra alfa-glucozidazei și nici nu interferează cu absorbția glucozei.
Compoziția fenolică a extractului de tescovină de struguri utilizat în această lucrare a
fost deja descrisă de Corrêa et al., 2017 , Gonçalves et al., 2017 . Cei mai abundenți
compuși fenolici au fost epicatechina, catechina, quercetina, miricetina, derivații
glicozidici de izorhamnetin, malvidin-3- O -glucozida și peonidin-3- O -
glucozida. Participarea probabilă a catechinei și a mai multor antociani la inhibarea
α-amilazelor a fost deja discutată mai sus. Având în vedere tipul de molecule găsite în
extract, rezultatele obținute în acest studiu diferă parțial de conceptul general
conform căruia compușii fenolici, precum flavonoidele și polifenolii, au capacitatea
de a inhiba activitatea α-glucozidazei ( Ishikawa et al., 2007)., Hargrove et al.,
2011 , Kumar et al., 2011 , Yin et al., 2014 , Kadouh et al., 2016 , Martinez-Gonzalez et
al., 2017 , Li et al., 2019 , Zhu et al., 2020 ). Trebuie subliniat, totuși, că există
rapoarte care arată că enzima intestinală și enzima drojdiei prezintă în general
sensibilități diferite la flavonoide și polifenoli ( Babu și colab., 2004 , Tadera și colab.,
2006 ). Tadera și colab. (2006) , de exemplu, raportează că α-glucozidaza intestinală
de șobolan este ușor inhibată de un număr mare de flavonoide și doar minim de
antocianidine și izoflavonegrupuri. Enzima drojdiei, dimpotrivă, este puternic
inhibată de grupările izoflavone, antocianidine și flavonoli. Se pare, astfel, că
extractul de tescovină de struguri utilizat în lucrarea de față prezintă o combinație de
constituenți care sunt inactivi asupra α-glucozidazei intestinale în intervalul de
concentrație care a fost utilizat. Mai mult, există rapoarte că substratul poate
influența în mod egal gradul de inhibiție ( Tadera și colab., 2006 ). În studiul de față a
fost utilizată maltoza deoarece acesta este substratul fiziologic. În multe studii din
trecut, totuși, au fost folosite substraturi sintetice, cum ar fi p -nitrofenil-α-D-
glucopiranozida, fapt care ar fi putut influența gradul de inhibiție.
Rezultatele studiului de față adaugă dovezi atât in vitro , cât și in vivo despre
acțiunea flavonoidelor și a altor polifenolici de diferite tipuri asupra glicemiei
postprandiale după ingestia de amidon, dar nu de maltoză sau glucoză ( Silva și
colab., 2014 , Kato și colab . ., 2017 , Martinez-Gonzalez et al., 2017 , Kato-Schwartz et
al., 2018 , Shanmugam et al., 2018 , Gutiérrez-Grijalva et al., 2019 , Li et al.,
2019 , Cardullo et al. 2020 , Zhu şi colab., 2020 ). Că flavonoidele și polifenolicii în
general pot afecta glicemia prin inhibarea enzimelor de hidroliză a amidonuluiin
vivo este o noțiune larg răspândită ( Sun și colab., 2019 ). Un mecanism alternativ
sau complementar care a fost sugerat implică inhibarea transferului de glucoză din
lumenul intestinal la celule, care este realizat de transportorii de glucoză din
enterocitele intestinului subțire ( Sun și colab., 2019 ). O acțiune inhibitorie directă
asupra acestor transportatori a fost exclusă de experimentele de toleranță la glucoză
din prezenta lucrare, care nu au evidențiat nicio diminuare a ratei de apariție a
glucozei în sânge după administrarea MGPE. Mai rămâne posibilitatea unei inhibari a
exprimării transportatorilor de glucoză ( Sun et al., 2019).). În lucrarea de față, totuși,
au fost examinate doar efectele pe termen scurt, iar expresiile genelor sunt fenomene
pe termen mediu sau lung. În mod clar, aceasta este o întrebare la care trebuie să se
răspundă prin experimente specifice viitoare.
4 . Concluzie
În concluzie, MGPE poate fi considerat un inhibitor atât al α-amilazelor salivare, cât
și al pancreatice, dar nu și al enzimei α-glucozidaze. Din punct de vedere cinetic,
inhibarea a arătat un model complex, cu legare multiplă a constituenților extractului
de enzime. Mai mult, studiile de andocare in silico au indicat că unii compuși
antociani, cum ar fi peonidin-3- O - acetilglucozida, quercetin-3- O - glucuronida și
izoramnetin-3- O -glucozida, pe lângă catechina, au fost cei mai probabil polifenoli
responsabili. pentru inhibarea α-amilazei cauzată de MGPE. În cele din urmă, MGPE
a avut, de asemenea, un efect negativ asupra hidrolizei amidonului in vivo, deoarece
a diminuat creșterile nivelului de glucoză care au urmat administrării
amidonului. Aceste constatări susțin ipoteza că MGPE ar putea fi adecvat ca adjuvant
pentru menținerea glicemiei normale și poate servi drept bază pentru studiile clinice.
Declarație de contribuție a autorului CRedit
Camila Gabriel Kato-Schwartz: Metodologie, Investigație. Rúbia Carvalho
Gomes Corrêa: Metodologie, Investigare. Diego de Souza Lima: Metodologie,
Investigație. Anacharis Babeto de Sá-Nakanishi: Investigație,
Supraveghere. Geferson de Almeida Gonçalves: Metodologie,
Investigație. Flavio Augusto Vicente Seixas: Conceptualizare,
Supraveghere. Charles WI Haminiuk: Conceptualizare, vizualizare. Lillian
Barros: Conceptualizare, vizualizare. Isabel CFR Ferreira: Conceptualizare,
vizualizare. Adelar Bracht: Scriere - recenzie și editare. Rosane Marina
Peralta:Conceptualizare, scriere - revizuire și editare.
Mulțumiri
Autorii doresc să mulțumească Fundação Araucária (Brazilia), Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brazilia), Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazilia), Cesumar Institute of
Science Technology and Inovation (ICETI, Brazilia) și FEDER-Interreg España-
Portugalia pentru ajutorul financiar acordat.