UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

LOREDANA FLORINA LEZEU (LEOPOLD)

MARKERI DE CALITATE I AUTENTICITATE A ULEIURILOR, SUCURILOR I CEREALELOR DETERMINAI PRIN HPLC I SPECTROSCOPIE IR/RAMAN

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCTOR TIINIFIC Prof. Dr. HORST DIEHL

Cluj-Napoca 2010

II

CUPRINS
INTRODUCERE .........................................................................................................................................III I. EVALUAREA CALITII ULEIURILOR VEGETALE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR I RAMAN ...................................................................................................................................VIII MATERIALE I METODE .............................................................................................................VIII REZULTATE I DISCUII .............................................................................................................. IX Spectrele FTIR ale uleiurilor vegetale ............................................................................................ IX Amprenta spectral Raman comparativ a uleiurilor vegetale .........................................................X Amprentele spectrale Raman specifice uleiurilor de palmier, msline i floarea-soarelui. ............ XI Amprentele spectrale Raman specifice uleiului de ctin ............................................................XIII Clasificarea uleiurilor vegetale folosind spectroscopia FTIR i analiza PCA ............................... XV CONCLUZII ................................................................................................................................... XVI II. EVALUAREA CALITII SUCURILOR DE FRUCTE FOLOSIND SPECTROSCOPIA FTIR I METODE CHEMOMETRICE ..................................................................................................... XVIII II.1 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI I ZAHAROZEI N SUCURI DE MERE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR CUPLAT CU METODE CHEMOMETRICE ............... XVIII MATERIALE I METODE .......................................................................................................... XVIII REZULTATE I DISCUII ........................................................................................................... XIX Amprenta spectral ATR-MIR a principalilor carbohidrai ........................................................ XIX Predicii cantitative bazate pe analiza PLS a concentraiilor de carbohidrailor din sucuri comerciale i autentice .................................................................................................................. XX CONCLUZII .................................................................................................................................. XXII II.2 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI I A ZAHAROZEI N SUCURILE DE FRUCTE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR I ANALIZA STATISTIC MULTIVARIAT ............XXIV MATERIALE I METODE ..........................................................................................................XXIV REZULTATE I DISCUII .........................................................................................................XXVI Analiza de tip Principal Component Analysis (PCA) ...............................................................XXVI Regresia de tip Partial Least Squares (PLS) ............................................................................ XXVII Evaluarea capacitii antioxidante a sucurilor prin FTIR i PLS ..............................................XXXI CONCLUZII .............................................................................................................................. XXXIII III. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR N GRU ........................................................... XXXV MATERIALE I METODE ........................................................................................................ XXXV Purificarea SPE (extracie n faz solid) ................................................................................ XXXV REZULTATE I DISCUII ...................................................................................................... XXXVI Separarea cromatografic a carotenoidelor prin HPLC din probele de gru nesaponificate .. XXXVI Analiza cantitativ a carotenoidelor din varietile de Einkorn, Rosadur, Kamut i Toronit nesaponificate ....................................................................................................................... XXXVII Separarea cromatografic a carotenoidelor din gru, folosind extracia n faz solid . ..... XXXVIII Distribuia carotenoidelor n fraciunile de gru .................................................................... XXXIX CONCLUZII .................................................................................................................................... XLI IV. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR I ANTOCIANILOR DIN ORZ ........................ XLIII MATERIALE I METODE .......................................................................................................... XLIII REZULTATE I DISCUII ......................................................................................................... XLIV Analiza cantitativ a carotenoidelor n genotipurile de orz ....................................................... XLIV Analiza probelor de orz negru .................................................................................................... XLV Separarea cromatografic a antocianilor din probele de orz prin metoda HPLC ..................... XLVII Analiza cantitativ a antocianilor din probele de orz negru, albastru i purpuriu .................. XLVIII CONCLUZII ........................................................................................................................................ L BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................................................... LII

INTRODUCERE
Scopul prezentului studiu a constat n caracterizarea unor produse alimentare, cum ar fi uleiuri vegetale, sucuri de fructe i cereale, folosind cromatografia HPLC precum i metode spectroscopice FTIR/Raman, n vederea determinrii calitii i autenticitii acestora. Biomarkerii selectai pentru evidenierea calitii i autenticitii acestor produse alimentare sunt n principal componente minore, provenind din plante (numite fitochimicale). Astfel, obiectivele sunt legate de metoda analitic, de tipul alimentului i markerul de calitate /autenticitate utilizat. FTIR i FT-Raman reprezint metode spectroscopice rapide de evaluare a calitii i autenticitii uleiurilor vegetale. Probele de ulei pot fi investigate n mod direct, fr nici o pregtire a probei n prealabil. Astfel, analiznd amprenta spectral FTIR i FTRaman, uleiurile vegetale au fost comparate pe baza coninutului n acizi grai saturai/nesaturai. Mai mult, profilul acizilor grai a fost utilizat ca marker de autenticitate pentru uleiurile vegetale. Determinarea calitii i autenticitii sucurilor de fructe reprezint un domeniu de cercetare aplicat cu impact relevant n industrie, sigurana alimentar i protecia consumatorului. Spectroscopia FTIR combinat cu metode de analiz statistic multivariat, cum ar fi cele de tip Principal Component Analysis (PCA) sau Partial Least Squares (PLS), au fost utilizate pentru determinarea coninutului de glucoz, fructoz i zaharoz n diferite sucuri de fructe, ca markeri de calitate i autenticitate. Astfel, a fost implementat o procedur rapid pentru evaluarea carbohidrailor din sucurile de fructe, confirmnd autenticitatea pentru majoritatea probelor analizate, dar i adaosul de zaharoz n unele probe. Abordnd o tematic modern de cercetare, am urmrit extinderea potenialului metodei spectroscopice FTIR combinat cu regresie de tip PLS, n vederea determinrii capacitii antioxidante a sucurilor de fructe. S-a obinut astfel o bun corelaie ntre valorile determinate prin predicie n urma regresiei PLS i valorile msurate prin metoda de referin TEAC pentru capacitatea antioxidant total (TAC).

III

Cerealele reprezint un produs alimentar din dieta zilnic. n ultimele decenii au fost cultivate specii de gru cu un coninut sczut n carotenoide, n vederea obinerii unei fini ct mai albe. Astzi, efectele benefice al aportului de carotenoide din consumul zilnic de cereale sunt unanim recunoscute. Acum cercettorii, sunt n cutare de specii de cereale cu coninut ct mai ridicat n carotenoide. n aceast lucrare, este prezentat metodologia de determinare a carotenoidelor i antocianilor prin cromatografie HPLC din diverse specii de gru i orz Structura tezei. Teza este structurat n dou pri principale, i anume, studiu de literatur i contribuii originale. Partea de studiu de literatur cuprinde trei capitole. Capitolul I introduce metodele spectroscopice de absorbie UV-Vis, de absorbie n infrarou (FTIR) i mprtiere Raman, precum i potenialul de aplicabilitate al acestora n chimia alimentului. De asemenea, n acest capitol sunt discutate pe scurt metodele statistice multivariate de tip PCA i PLS. Capitolul II prezint metoda HPLC, i cuprinde principiile, instrumentaia i aplicaii generale n determinarea compuilor minori din uleiuri, sucuri i cereale. Capitolul III este dedicat fitochimicalelor din produsele alimentare studiate. Prin utilizarea metodelor HPLC, FTIR i Raman n aceast lucrare au fost evaluate calitatea i autenticitatea uleiurilor vegetale, a sucurilor de fructe i a cerealelor (gru i orz), pe baza profilului de acizi grai saturai/nesaturai, carbohidrai i a coninutului de carotenoide. Astfel, prezena i proprietile chimice ale fitochimicalelor monitorizate sunt prezentate n detaliu n acest capitol. Cercetarea original este organizat n patru capitole. n capitolul IV, au fost nregistrate spectrele FTIR i FT-Raman a 13 tipuri de uleiuri vegetale i identificate benzile marker pentru acizii grai. Pe baza benzilor marker Raman a fost comparat gradul de saturare al acizilor grai pentru diferite tipuri de uleiuri. Spectrele FTIR a 25 uleiuri vegetale au fost supuse analizei PCA, permind astfel gruparea uleiurilor n funcie de originea lor biologic. n acest fel, este prezentat

IV

posibilitatea discriminrii FTIR/PCA ntre uleiurile de msline, floarea soarelui, susan i diferite uleiuri din smbure de fructe. De asemenea, coninutul ridicat de carotenoide din uleiul de ctin este clar evideniat de benzi marker Raman. Capitolul V prezint determinarea coninutului de carbohidrai (glucoz, fructoz i zaharoz) n 13 sucuri de mere i 33 sucuri de fructe, prin combinarea metodelor FTIR i chemometrice (PCA i PLS). Valorile concentraiilor prezise prin regresie PLS au fost validate prin metoda HPLC. Astfel, calitatea i autenticitatea sucurilor a fost evaluat pe baza concentraiilor de carbohidrai. Spectrele FTIR a 22 sucuri de fructe au fost analizate prin metoda PCA, permind astfel gruparea acestora n funcie de originea lor biologic. Astfel, este demonstrat posibilitatea discriminrii ntre sucurile de mere, portocale i piersici prin spectroscopie FTIR i analiz PCA. De asemenea, a fost determinat capacitatea antioxidant total (TAC) a sucurilor de fructe prin combinarea metodelor spectroscopice FTIR i regresie PLS, valorile prezise fiind n bun concordan cu valorile determinate prin metoda de referin TEAC. Capitolul VI prezint determinarea autenticitii a patru varieti de gru prin realizarea amprentei carotenoidice. A fost optimizat protocolul de extracie i determinat eficiena saponificrii. Ca i metod alternativ de purificare i ndeprtare a lipidelor, s-a utilizat extracia n faz solid (SPE). Coninutul de carotenoide a fost evaluat n funcie de varietate i anul recoltei. De asemenea, n acest capitol s-a evaluat distribuia carotenoidelor n fraciunile de mcini. Capitolul VII trateaz autenticitatea a patru genotipuri de orz (negru, galben, albastru i purpuriu) folosindu-se ca i markeri coninutul de carotenoide (luteina i zeaxantina) i antociani (cianidin glucozid, pelargonidin glucozid, delfinidin, peonidin glucozid i cianidin). Capitolul trateaz pe larg variaia concentraiilor de xantofile i antociani n funcie de genotip, varietate i condiii climaterice.

Scopul acestei teze a fost: Determinarea calitii i autenticitii uleiurilor vegetale, sucurilor de fructe i cerealelor, utiliznd cromatografia HPLC, metode spectroscopice FTIR i Raman, precum i metode chemometrice de tip PLS i PCA. Elaborarea unei metode simple i rapide pentru discriminarea uleiurilor vegetale i sucurilor de fructe n funcie de originea lor biologic. Elaborarea unei metode simple i rapide n vederea determinrii capacitii anioxidante a sucurilor. Determinarea calitii diferitelor varieti de gru i orz pe baza amprentei specifice de carotenoide i antociani.

Obiectivele acestei lucrri au fost: Identificarea benzilor marker IR i Raman ale acizilor grai din uleiurile vegetale. Identificarea benzilor marker Raman ale carotenoidelor din uleiul de ctin. Evaluarea comparativ a raportului de acizi grai saturai/nesaturai din uleiurile vegetale, ca marker al originii biologice. Discriminarea uleiurilor vegetale n funcie de originea biologic folosind metodele FTIR i analiza statistic PCA. Determinarea benzilor marker FTIR ale glucozei, fructozei i zaharozei din sucurile de fructe. Cuantificarea simultan a glucozei, fructozei i zaharozei din sucurile de fructeutiliznd spectroscopia FTIR i regresia PLS. Discriminarea sucurilor de fructe n funcie de originea biologic folosind metodele FTIR i analiza statistic PCA. Determinarea capacitii antioxidante totale a sucurilor de fructe utiliznd spectroscopia FTIR i regresia PLS.

VI

Determinarea amprentei HPLC a carotenoidelor lutein, zeaxantin, - i caroten din fracii lipidice ale extractelor de gru Einkorn (Ei), Rosadur, Kamut i Toronit din recoltele 2004-2007. Distribuirea carotenoidelor lutein i zeaxantin n fraciuni de mcini de diferite mrimi. Determinarea, cuantificarea i compararea xantofilelor lutein i zeaxantin, din patru genotipuri de orz decorticat negru, galben, albastru i purpuriu cultivate in anul 2007 i 2008. Elucidarea i cuantificarea antocianilor din genotipuri de orz decorticat negru, albastru i purpuriu.

VII

REZULTATE EXPERIMENTALE

I. EVALUAREA CALITII ULEIURILOR VEGETALE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR I RAMAN

MATERIALE I METODE Uleiurile vegetale au fost achiziionate de la diferii furnizori locali. O scurt descriere a probelor de ulei caracterizate prin spectroscopie IR/Raman este prezentat n Tabelul I.1.

Tabel I.1 Uleiuri vegetale analizate prin metode spectroscopice FTIR i FT-Raman Table I.1 Different vegetable oils analyzed by FTIR and FT-Raman spectroscopic methods
Prob Nr. Ulei Tip Prepararea probei Analiza Raman Raman analysis + +++ + + +++ + + ++ + + + + + Analiza FTIR FTIR analysis + + + + + + + +

Sample Oil Type Preparation of sample Nr. 1 Armurariu crud presat la rece 2a, 2b, 2c Ctin* crud Extras cu solveni organici 3 Floarea soarelui refinat presat la rece 4 Porumb crud presat la rece 5a, 5b, 5c Msline* crud presat la rece 6 ofran crud presat la rece 7 Rapi crud presat la rece 8a, 8b Soia** crud presat la rece 9 Cnep crud presat la rece 10 Palmier crud presat la rece 11 Dovleac crud presat la rece 12 Nuci crud presat la rece 13 Susan crud presat la rece *-3 productori diferii, **-2 productori diferii, +-msurtori efectuate

Spectrele FTIR au fost obinute n intervalul numerelor de und 650-3500 cm-1, cu un spectrometru Bruker Equinox 55 cu o rezoluie spectral de 2 cm-1. Probele au fost nregistrate cu ajutorul unei uniti Attenuated Total Reflectance (ATR), prin coadugarea de 32 de scanri. Spectrele FT-Raman (50 la 3500 cm-1) au fost nregistrate cu

VIII

un accesoriu Raman Bruker FRA 106/S ataat la spectrometrul FTIR Bruker Equinox 55 echipat cu un detector Ge de nalt sensibilitate, rcit cu azot lichid. Analiza tip Principal Component Analysis (PCA) este utilizat pentru a gsi sursele principale de variabilitate ntr-un set de date i relaia dintre / ntre obiecte i variabile (Esbensen, KH et al., 2002). Programul Unscrambler (CAMO, Norvegia) a fost utilizat pentru a analiza componentelor mutiple prin utilizarea analizei de rutin PCA. Pentru analiza PCA, au fost nregistrate spectrele FTIR a 9 uleiuri de msline, 10 de floarea-soarelui, 2 de susan i 4 de smbure (2 de prune, 1 de caise, 1 de piersici), obinute de la furnizori locali. Spectrele de absorbie mid-IR (MIR) au fost nregistrate folosind un spectrometru FTIR (IR-Prestige, Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Germania), echipat cu un detector DLATGS. Rezoluie spectral a fost de 4 cm-1 iar pentru fiecare spectru s-au mediat 128 scanri. Accesoriul ATR utilizat const dintr-o plac ZnSe cu reflexii multiple (10 reflexii) (Pike Technology, Madison, SUA). Ca referin, s-a nregistrat spectrul de fond al aerului. Probele de suc au fost msurate direct pe cristalul ATR din ZnSe fr a fi necesar o pregtire a proei n prealabil. ntre msurtori cristalul ATR a fost curat cu ap distilat i apoi uscat.

REZULTATE I DISCUII Spectrele FTIR ale uleiurilor vegetale Spectrele FTIR a uleiurilor vegetale (probele 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a din Tabelul I.1) sunt prezentate n Figura I.1. Spectrele acestor uleiuri prezint forme spectrale foarte asemntoare, datorit structurii chimice apropiate ale acizilor grai constitueni. Benzile IR sunt dominate de o vibraie de ntindere C=O la 1744 cm-1 foarte intens. Vibraile de deformare C-H sunt prezente n spectrele FTIR la 1466 cm-1, n timp ce vibraile de ntindere C-C i C-O sunt prezente la 1097 i respectiv 1161 cm-1. Spectrele FTIR conin benzi caracteristice de absorbie a acizilor grai constitueni a uleiurilor vegetale, dar din cauza polaritii slabe a legturilor, benzile de absorbie IR sunt relativ slabe, cu excepia legturii polare C=O. Prin urmare, pentru evaluarea calitativ i cantitativ exact, se recomand implementarea unor algoritmi chemometrici.

IX

Figura I.1. Spectrele FTIR ale probelor de Figura I.2. Spectrele Raman ale uleiurilor uleiuri vegetale 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a din vegetale 6, 1, 11, 12, 4 i 13 din Tabelul I.1 Tabelul I.1, n domeniul spectral 650-1800 n domeniul 800-1800 cm-1. cm-1. Figure I.1. FTIR spectra in the 650-1800 Figure I.2. Raman spectra of vegetable oil cm-1 spectral range of vegetable oil samples samples 6, 1, 11, 12, 4 and 13 from Table 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a from Table I.1.

I.1, in the 800-1800 cm-1 range.

Amprenta spectral Raman comparativ a uleiurilor vegetale Spectroscopia Raman reprezint o tehnic mai potrivit pentru analiza uleiurilor, deoarece legturile nepolare, C=C, apar foarte intens n spectrul Raman la aproximativ 1657 cm-1 (Figura I.2).

Figura I.2 prezint amprenta spectral Raman ale probelor de ulei vegetal 6, 1, 11, 12, 4 i 13, descrise n Tabelul I.1. Vibraile de deformare C-H sunt de asemenea evideniate de ctre o band intens la 1439 cm-1. Caracteristic pentru spectrele Raman ale uleiurilor sunt i dou benzi de la 1264 i 1301 cm-1 datorit deformrilor -CH2 i respectiv =C-H. Vibraiile de ntindere C=O ale acizilor grai apar de obicei ca o band mediu-slab n spectrul Raman la 1747 cm-1. Atribuirea benzilor marker este prezentat pentru fiecare ulei investigat n Tabelul I.2.

Tabel I.2 Date cumulate identificarea benzilor Raman marker a uleiurilor investigate Table I.2 Cumulative data identification of Raman marker bands for the investigated oils
Mod de vibraie Nr. Crt Ulei ntindere (C=C) Crt. Nr. 1 2 3 4 5 6 Oil Armurariu Porumb ofran Dovleac Nuci Susan stretching (C=C) 1657 s 1657 s 1657vs 1657 s 1657 vs 1657 s deformare (=C-H) (-C-H)

Vibration mode (cm-1) bending (=C-H) 1301 m 1302 m 1302 m 1302 m 1302 m 1302 m (-C-H) 1264 w 1265 m 1264 m 1265 m 1265 ms 1265 m

Amprentele spectrale Raman specifice uleiurilor de palmier, msline i floareasoarelui. Figura I.3 prezint spectrele Raman ale uleiurilor de floarea-soarelui, msline i de palmier n intervalul 800-1800 cm-1. Comparnd intensitile vibraiilor de ntindere a

XI

C=C la 1657 cm-1 din aceste uleiuri, poate fi observat c cea mai mic intensitate corespunde uleiului de palmier. De asemenea, pentru uleiul de palmier, vibraiile de deformare a legturilor C-H a atomilor de carbon cu o singur legtur au intensitatea cea mai mic n comparaie cu celelalte dou uleiuri.

Figure I.3. Raman spectra of sunflower (sample 3), olive (sample 5a) and palm oil (sample 10) in the 800-1800 cm-1 range. Figura I.3. Spectrele Raman ale uleiului de floarea soarelui (proba 3), msline (proba 5a) i de palmier (proba 10) n domeniul spectral 800-1800 cm-1.

Aceste rezultate sunt n excelent concordan cu compoziia cunoscut de acizi grai a uleiului de palmier. Uleiul de palmier conine 45% acid palmitic (C16: 0), 40 % acid oleic i 10% acid linoleic; coninutul ridicat de acizi grai saturai conducnd la intensiti medii-slabe ale vibraiilor atomilor de carbon dublu legai.

XII

Cea mai intens vibraie de ntindere C=C a fost observat n spectrul de ulei de floarea-soarelui. De asemenea, vibraiile de deformare C-H ale carbonilor dublu legai arat cea mai mare intensitate, comparativ cu uleiurile de palmier i de msline. Aceste rezultate pot fi explicate prin coninutul de acizi grai al uleiului de floarea-soarelui. Uleiul de floarea soarelui conine 68% acid linoleic (C18:2), 19% acid oleic (C18: 1) i numai 12% acizi saturai (C16:0 i C18: 0). Uleiul de msline prezint caracteristici spectrale fa de uleiurile de palmier i floarea-soarelui. Intensitiile vibrailor de ntindere a legturii C=C i de deformare a legturii =C-H a atomului de carbon dublu legat sunt mai mari dect cele ale uleiului de palmier, dar mai slabe dect cele ale uleiului de floarea-soarelui. Aceste caracteristici pot fi explicate prin coninutul ridicat de acid oleic n uleiul de msline (71%), acid linoleic (10%) i coninut de acizi grai saturai (16%).

Amprentele spectrale Raman specifice uleiului de ctin Figura I.4 prezint spectrul Raman a trei uleiuri de ctin obinute de la trei productori diferii. Spectrul uleiului de floarea-soarelui a fost introdus pentru compararea amprentelor spectrale a acizilor grai. Dup cum se poate observa n Figura I.4, uleiul de ctin conine toate caracteristicile spectrale ale unui ulei vegetal. n plus, apar mai multe benzi noi n spectru la 1523, 1190, 1156 i 1005 cm-1, atribuite coninutului de carotenoide a uleiului de ctin.

XIII

Figura I.4. Spectrele Raman ale uleiurilor de ctin de la trei productori diferii (probele 2a, 2b i 2c) i comparativ uleiul de floarea soarelui (proba 3) n domeniul 800-1800cm-1. Figure I.4. Raman spectra of seabuckthorn oil from three different producers (samples 2a, 2b and 2c) and comparatively of sunflower oil (sample 3) in the 800-1800 cm-1 range.

Compoziia acizilor grai din uleiul de ctin este descris n literatura de specialitate dup cum urmeaz: acizi grai saturai 35%, acizi grai mononesaturai 57%, i acizii grai polinesaturai 9%. Amprenta spectral a acizilor grai din cele trei uleiuri de ctin din Figura I.4, difer foarte mult, dezvluind raporturi diferite de acizi grai saturai /nesaturai. Este cunoscut faptul c uleiul de ctin conine diveri carotenoizi, cum ar fi licopen sau -caroten. Analiznd intensitile benzilor atribuite coninutului de carotenoide, pot fi obinute evaluri calitative privind uleiurile de ctin. De exemplu, lund ca benzi marker benzile de la 1523 i 1156 cm-1, atribuite vibraiilor de ntindere a

XIV

legturilor C=C i respectiv C-C este evident c uleiul de ctin obinut de la productorul al treilea (Figura I.4) are coninutul cel mai ridicat de carotenoide .

Clasificarea uleiurilor vegetale folosind spectroscopia FTIR i analiza PCA Pentru spectrele FTIR a 9 uleiuri de msline, 10 de floarea-soarelui, 2 de susan i 4 de smbure (2 de prune, 1 de caise, 1 de piersici), regiunea spectral caracteristic, cu informaii structurale moleculare utile, a fost identificat n intervalele spectrale 6401840 i 2770-3070 cm-1. Prin analiza PCA a diferenelor ntre profilurile spectrelor s-a obinut gruparea uleiurilor dup originea biologic a acestora. Figura I.5 prezint rezultatele obinute.

kernel olive sesame

sunflower

Figura I.5. Gruparea uleiurilor de msline, floarea soarelui, sesam i diferite uleiuri din smburi de fructe Figure I.5. Grouping of olive, sunflower, sesame and fruit kernel oils by PCA. . Uleiurile de msline i de floarea-soarelui pot fi observate n grupuri total distincte (Figura I.5), permind astfel o discriminare excelent dup originea vegetal. Cu toate acestea, una dintre probele de ulei de msline este n afara grupului caracteristic. Astfel, autenticitatea acestei probe nu poate fi confirmat prin spectroscopie FTIR/analiz PCA.

XV

O grupare satisfctoare a fost obinut pentru uleiurile din smburi (caise, piersici i dou uleiuri din smburi de prune). Cele dou uleiuri de susan reprezint un grup distinct.

CONCLUZII Spectroscopia FTIR i FT-Raman reprezint metode viabile, rapide i de analiz nedistructiv pentru evaluarea calitii i autenticitii uleiurilor vegetale. Au fost investigate 13 tipuri de ulei vegetal provenite de la diferii productori far a fi necesar prelucrarea probelor. Astfel, amprentele FTIR ale diferitelor uleiuri vegetale au fost comparate folosind benzile specifice, caracteristice acizilor grai saturai i nesaturai. Profilul acestora a fost folosit ca i marker de autenticitate. Combinnd spectroscopia FTIR i analiza statistic PCA, 25 de uleiuri vegetale de floarea soarelui, msline, susan i smburi de fructe au fost grupate cu succes, permind discriminarea uleiurilor n funcie de originea lor biologic. Amprenta spectral FT-Raman a uleiurilor prezint raportul acizilor grai saturai i nesaturai, comparnd intensitile relative ale benzilor marker, cum ar fi banda de vibraie =C-H de la 1302 cm-1, banda de vibraie -CH2 de la 1264 cm-1, precum i vibraia de ntindere C=C de la 1657 cm-1. n domeniul numerelor de und mari, pot fi menionate urmtoarele benzi marker: banda de la 2851 cm-1, datorat vibraiei de ntindere -CH2, precum i banda de la 3010 cm-1 atribuit vibraiei de ntindere =C-H. Aa cum era de ateptat, spectrul Raman al uleiului de palmier, prezint concentraia cea mai mare n acizi grai saturai. Spectroscopia FT-Raman, a fost aplicat cu succes n evaluarea calitii uleiului de ctin, analiznd nu doar coninutul n acizi grai, dar i coninutul n carotenoide a uleiului. Astfel, au fost identificate benzi marker ale uleiului de ctin: 1523 cm-1, 1156 cm-1, 1004 cm-1. Utiliznd aceste benzi, a fost evaluat coninutul n carotenoide al uleiurilor de ctin provenite de la trei productori diferii, putnd fi observate diferene de pn la 100%.

XVI

Pe bazat profilului spectral i intensitatea benzilor marker s-a putut identifica etichetarea greit a unui ulei de soia ca fiind de rapi.

XVII

II. EVALUAREA CALITII SUCURILOR DE FRUCTE FOLOSIND SPECTROSCOPIA FTIR I METODE CHEMOMETRICE
II.1 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI I ZAHAROZEI N SUCURI DE MERE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR CUPLAT CU METODE CHEMOMETRICE MATERIALE I METODE Probe. Un numr de 11 sucuri de mere au fost achiziionate de la diferite supermarket-uri. Sucuri de mere autentice (100% naturale) au fost obinute prin stoarcerea unui mr de tip Golden Delicious i a unui mr de tip Jonagold. Cele 13 probe sunt descrise n Tabelul II.1, conform cu etichetarea acestora. Tabel II.1 Notaia i descrierea probelor de sucuri folosite n analiza FTIR Table II.1 Notation and short description of apple juice samples used for FTIR analysis Nr. Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Prob Sample A1_100% A2_100% A3_100% A4_100% A5_100% A6t_100% A7t_100% A8t_100% A9c_100% A10c_100% A11_50% Golden Jonagold Descriere prob Description suc de mere 100%, mr verde suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, din concentrat suc de mere 100%, din concentrat suc de mere 50% suc autentic suc autentic Provenien Provenience comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial stors din mr Golden Delicious stors din mr Jonagold

Pentru prepararea a 24 amestecuri de glucoz, fructoz i zaharoz (codificate g_f_s) au fost folosite soluii standard de diferite concentraii (g/100 ml) de glucoz (g) (1.0, 1.25, 2.0, 2.5, 4.0 i 5), fructoz (f) (3.25, 3.5, 6.0, 6.5, 7.0, 9.0 i 13.0) i zaharoz

XVIII

(e) (0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0). Soluiile standard pregtite au acoperit intervalele minime i maxime de concentraie, reprezentative pentru probele naturale i au fost utilizate pentru dezvoltarea modelului de calibrare. Instrumentaia. Spectrele din domeniul mid-IR (MIR) au fost nregistrate folosind o unitate ATR (Attenuated Total Refelectance) la temperatura camerei cu ajutorul unui spectrometru FTIR (Bruker, Germania), echipat cu un detector rcit cu azot lichid de tip cadmiu-telur mercur (MCT). Rezoluia spectral a fost de 4 cm-1, iar pentru fiecare spectru au fost acumulate 32 scanri. Analiza cantitativ. Pentru analiza cantitativ a fost folosit programul Unscrambler (Camo, Norvegia). Modelele de calibrare au fost elaborate folosind prima derivat a spectrelor celor 24 soluii standard de glucoz, fructoz i zaharoz. Domeniul spectral al carbohidrailor a fost identificat ntre 885-1500 cm-1, acesta fiind utilizat pentru procesele de calibrare i predicie.

REZULTATE I DISCUII Amprenta spectral ATR-MIR a principalilor carbohidrai Pentru a gsi amprentele spectrale specifice pentru glucoz, fructoz i zaharoz au fost nregistrate spectrele de absorbie ATR-MIR, a soluiilor individuale, la diferite concentraii, de exemplu, glucoz (5%), fructoza (13%) i zaharoz (3%), aa cum este prezentat n Figura II.1. Toate spectrele MIR, ale acestor soluii sunt dominate de o band puternic datort absorbiei apei, centrat la 1650 cm-1. Cu toate acestea, rmne disponibil o fereastr spectral ntre 885 i 1500 cm-1 pentru observarea benzilor caracteristice absorbiei carbohidrailor. n aceast regiune au fost identificate benzile caracteristice glucozei (maxime specifice la 991, 1034, 1080, 1107, 1151, 1367 i 1460 cm-1), fructozei (maxime specifice la 966, 1063, 1155, 1254,1346, 1416 i 1456 cm-1) i zaharozei (maxime specifice la 995, 1055, 1113, 1138, 1338 i 1464 cm-1).

XIX

Benzile din regiunea 904-1153 cm-1 sunt atribuite vibraiilor de ntinde C-O i CC, n timp ce benzile din domeniul 1474-1199 cm-1 sunt datorate vibraiilor gruprilor OC-H, C-C-H i C-O-H al carbohidrailor (Irudayaraj i Tewari, 2003).

Figura II.1. Spectrele specifice ATR-MIR ale soluiilor standard de glucoz (5%), fructoz (13%) i zaharoz (3%). Figure II.1. Specific ATR-MIR spectra of standard solutions of glucose (5%), fructose (13%) and sucrose (3%).

Predicii cantitative bazate pe analiza PLS a concentraiilor de carbohidrailor din sucuri comerciale i autentice Calitativ se pot identifica benzi caracteristice pentru glucoz, fructoz i zaharoz la 1034, 1063 i 995 cm-1, n conformitate cu Figura II.1. Prin utilizarea doar aceste benzi marker, o evaluare cantitativ a carbohidrailor din sucuri este extrem de dificil sau chiar speculativ, avnd n vedere suprapunerea acestor benzi, cu intensiti diferite de absorbie.

XX

Folosind spectrele FTIR ale soluiilor standard, cu concentraii de glucoz, fructoz i zaharoz cunoscute, a fost elaborat un model pe baza regresiei de tip PLS. Apoi, aplicnd acest model elaborat la spectrele cu concentraii necunoscute, a sucurilor de mere comerciale i autentice, programul chemometric a prezis concentraia de glucoz, fructoz i zaharoz din probele sucurilor comerciale i autentice, aa cum este prezentat n Figura II.2.

(a)

(b)

(c)

Figura II.2. Valori ale concentraiilor prezise pentru glucoz (a), fructoz (b) i zaharoz (c) n sucurile de mere comerciale i cele autentice folosind modele de regresie PLS. Figure II.2. Predicted values for glucose (a), fructose (b) and sucrose (c) concentrations in the commercial and genuine apple juices using the PLS regression models.

Valorile maxime pentru glucoz (3.166%) i fructoz (9.344%) au fost obinute pentru sucul autentic obinut din mr stors Golden Delicious, sucul de mr stors Jonagold

XXI

prezentnd de asemenea valori similare. Concentraiile de zaharoz n probele Golden Delicious i Jonagold au fost 1.393% i respectiv 1.381%. Sucurile A2_100% i A3_100% etichetate "100% naturale" prezint concentraii de carbohidrai comparabile cu cele din sucurile de mere stoarse indicnd autenticitatea acestora. Autenticitatea probelor A4_100% i A5_100% nu a putut fi confirmat prin analiza ATR-MIR. Concentraiile de glucoz (1.664%) i fructoz (4.374%) sunt mult mai mici dect a sucurilor etichetate "100% naturale". Proba A1_100% prezint o deviere standard (SD) relativ mare la determinarea glucozei i fructozei, dar rezultatele indic n mod clar o concentrare ridicat de zaharoz. De regul, coninutul ridicat de zaharoz indic o adaosul acestei substane pentru ndulcire, astfel c acest suc nu poate fi catalogat 100%, aa cum este trecut pe etichet. Sucurile de mere comerciale obinute din concentrat (A9c_100% i A10c_100%), precum i sucurile tulburi A6t_100%, A7t_100% i A8t_100% prezint o calitate bun n ceea ce privete coninutul de glucoz, fructoz i zaharoz, datorit valorilor aproapiate de sucurile autentice. Turbiditatea sucurilor nu a influenat absorbia IR, astfel sucurile tulburi au putut fi de asemenea clasificate cu succes. Sucul de mere A11_50% (50% coninut suc de fructe) prezinta glucoz (1.999%) i fructoz (3.701%) aproximativ 60% din coninutul unui suc de mere natural autentic, n timp ce concentraia de zaharoz (3.518%) este aproape de dou ori mai mare dect n sucul de mere pur, probabil datorit adaosului de zaharoz suplimentar , necesare pentru a menine intensitatea gustului dulce.

CONCLUZII Metodele combinate, spectroscopie FTIR i analiz statistic multivariat (chemometrie), au fost aplicate pentru evaluarea calitii i autenticitii sucurilor de mere, prin determinarea concentraiilor de glucoz, fructoz i zaharoz n 11 de sucuri de mere comerciale i compararea cu valorile a dou 2 sucuri autentice obinute prin stoarcerea merelor.

XXII

n vederea determinrii acurate a concentraiilor de carbohidrai din sucurile de mere au fost analizate n prealabil un numr de 24 soluii de amestecuri de glucoz, fructoz i zaharoz (soluii standard), la diferite concentraii, pentru elaborarea unui model de calibrare. Concentraiile de glucoz prezise, utiliznd regresia PLS, pentru sucurile comerciale, au variat ntre 1.664 i 3.133% (w/w) fa de 3.1% pentru sucurile pure, autentice. Concentraiile de fructoz prezise pentru sucurile comerciale au variat ntre 3.701 i 6.941 fa de 9.2% pentru sucurile proaspete, autentice, n timp ce concentraiile de zaharoz prezise pentru sucurile comerciale au variat ntre 0.746 la 5.795 fa de 1.38% pentru sucurile autentice. Majoritatea sucurilor au prezentat un coninut de carbohidrai n conformitate cu valorile din literatur pentru sucuri autentice, cu o medie de 2.8, 6.5 i 1.5% pentru glucoz, fructoz i respectiv zaharoz. Cu toate acestea, mai multe probe au prezentat discrepane fa de valorile medii, astfel autenticitatea acestor sucuri nu a putut fi confirmat. De asemenea, concentraia ridicat de zaharoz indic adulterarea sucului, aa cum s-a observat pentru proba A1_100%, sau adaosul zaharozei la suc pentru meninerea intensitii gustului dulce n cazul sucurilor cu coninut parial de fruct, aa cum s-a observat pentru proba A11_50%. Devierea standard a valorilor prezis prin regresie PLS pentru cele mai multe probe a fost sub 10%. Turbiditatea sucurilor nu au perturbat analiza IR, obinndu-se rezultate acurate i pentru aceste probe. Rezultatele noastre demonstreaz c metoda FTIR combinat cu tehnici de analiz statistic multivariat ofer analize rapide, acurate, non-distructive i eficiente n ceea ce privete costurile, pentru monitorizarea de rutin a carbohidrailor din sucurile de mere, ca indicatori de calitate i autenticitate.

XXIII

II.2 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI I A ZAHAROZEI N SUCURILE DE FRUCTE UTILIZND SPECTROSCOPIA FTIR I ANALIZA STATISTIC MULTIVARIAT MATERIALE I METODE Probe. Un numr de 28 de sucuri din gama buturilor rcoritoare au fost achiziionate din supermarket-uri. Un numr de 5 sucuri de fructe autentice (mere, pere, portocale, ananas i pere) au fost obinute prin stoarcerea fructelor corespunztoare obinute de la supermarket-uri. Un total de 33 de probe de suc cu un coninut de suc pur (suc de fructe) ntre 4 i 100% sunt descrise n Tabelul II.2, n conformitate cu etichetarea. Tabel II.2. Notaie i scurt descriere a probelor de sucuri de fructe Table II.2. Fruit juice samples notation and short description
Nr. Prob Descriere Nr. Sample Description 1 Ap1_100% Suc de mere 100% 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ac_50% Ch_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Suc de mere 100% Suc de mere 100% Suc de mere 100% Suc de mere verzi 40% Suc de mere autentic (mr Jonagold presat) Suc de caise 50% Suc de ciree 15% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 4% Nr. Prob Nr. Sample 18 Or_G 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Descriere Description Suc de portocale (portocale presate) Suc de piersici 50% Suc de piersici 50% Suc de piersici 46% Suc de piersici 45% Suc de piersici 10%

autentic

Suc de piersici autentic (piersic presat) Pi1_100% Suc de ananas 100% Pi2_50% Suc de ananas 50% Pi_G Suc de ananas autentic (ananas presat) Pr1_50% Suc de pere 50% Pr2_50% Suc de pere 50% Pr3_50% Suc de pere 50% Pr4_30% Suc de pere 30% Pr_G Suc de pere autentic (par Packham presat) To_100% Suc de roii 100%

XXIV

Pentru calibrare au fost analizate un numr de 13 soluii standard, de diferite concentraii de glucoz (0.5 - 4.0 g/100ml), fructoz (0.5 - 14.0 g/100ml) i zaharoz (0.5 - 8.0 g/100ml), ce acoper concentraiile relevante pentru probele de sucuri naturale. Astfel, modelul elaborat prin regresia de tip PLS folosind spectrele FTIR ale soluiilor standard va folosit ulterior pentru predicia concentraiilor de carbohidrai din sucurile de fructe. Analiza FTIR. Spectre de absorbie mid-IR (MIR) au fost nregistrate folosind un spectrometru FTIR (IR-Prestige, Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Germania), echipat cu un detector DLATGS. Rezoluia spectral a fost de 4 cm-1 iar pentru fiecare spectru sau acumulat 128 nregistrri. Probele au fost analizate folosind un acesoriu ATR cu 10 reflexii consecutive (Pike Technology, Madison, SUA). ntre msurtori cristalul ATR a fost curat cu ap distilat. Analiza HPLC. Carbohidraii au fost separai i cuantificai cu ajutorul unui cromatograf Shimadzu, echipat cu un sistem binar de pompe, autosampler i detector PDA. Coloana de separare cromatografic utilizat a fost de tip C18 (250 x 4.6 mm), Amino-Altima modificat. Eluare a fost realizat la 300C, ntr-un sistem isocratic, acetonitril: ap (80:20, v / v) cu un debit constant de 1,3 ml / min. Carbohidraii determinai au fost identificai prin compararea lor n funcie de timpul de retenie a standardelor. Monitorizare s-a realizat la 260 nm cu un detector PDA. Determinarea activitii antioxidante. Metoda echivalentului Trolox al capacitii antioxidante (TEAC) se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de ctre antioxidani. ABTS este oxidat de ctre radicalii peroxil sau ali oxidani la radicalul su cationic ABTS +, intens colorat (max = 734 nm). Capacitatea antioxidant este exprimat ca i potenialul compuilor testai de a decolora radicalul ABTS+ prin reacie direct cu acesta. Capacitatea antioxidant a compuilor testai a fost exprimat ca i echivaleni Trolox, apoi transformat n activitate relativ prin raportarea la valoarea cea mai mare. Analiza tip Principal Components Analysis (PCA) i regresia tip Partial Least Squares (PLS). Analiza statistic a fost efectuat folosind programul Unscrambler 7.6

XXV

(CAMO ASA, Oslo, Norway). Cele mai bune rezultate au fost obinute folosind derivata de ordin una a spectrelor FTIR calculate pe baza procedurii Savitzky-Golay.

REZULTATE I DISCUII Analiza de tip Principal Component Analysis (PCA) Combinnd metodele FTIR i analiza tip PCA, s-a realizat clasificarea sucurilor n funcie de originea biologic. Figura II.3 prezint discriminarea sucurilor de mere, portocale i piersici n funcie de componentele principale PC1 i PC2 obinute n cadrul analizei PCA. Primele dou componente principale explica 94% din variaia spectrelor FTIR.

orange peach apple

Figura II.3. Distribuia scorurilor pentru primele dou componente principale, PC1 i PC2, obinute din analiza PCA a sucurilor de mere, portocale i piersici (autentice i comerciale). Figure II.3. Scores plot of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the apple, orange and peach juices (genuine and commercial).

XXVI

Majoritatea probelor de suc de mere, portocale i piersici apar n grupuri distincte, bine definite. n Figura II.3 se observ dou probe ce nu se ncadreaz n grupul caracteristic. Acestea sunt sucul de portocale cu 4% coninut de fruct, ce a fost poziionat n regiune suc de piersici. Autenticitatea acestuia este infirmat de analiza FTIR/PCA, ceea ce este n conformitate cu etichetarea. De asemenea sucul de piersici autentic apare departe de grupul caracteristic. Aceasta se explic prin faptul c sucurile de piersici analizate prezint un coninut de fruct sub 50%, comparativ cu cel autentic 100% .

Regresia de tip Partial Least Squares (PLS) Utiliznd modelele de regresie elaborate pe baza spectrelor soluiilor standard, au fost determinate concentraiile sucurilor de fructe comerciale i autentice. Tabelul II.3 prezint concentraiile prezise precum i deviaile pentru glucoz, fructoz i zaharoz. Erorile relative de predicie pentru glucoz, fructoz i zaharoz n sucurile de fructe au fost 2.88%, 8.05% i respectiv 2.86% (s-a calculat suma abaterilor i s-a mprit la numrul total de probe).

XXVII

Tabel II.3 Concentraii (g/100 ml) prezise pentru glucoz, fructoz i zaharoz precum i deviaiile ( ) pentru sucurile comerciale i cele autentice Table II.3 Predicted glucose, fructose and sucrose concentrations (g/100 ml) and deviations ( ) in the commercial and genuine fruit juices
Nr. Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Sample Prob
Ap1_100% Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ac_50% Ch_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Or_G Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Pi1_100% Pi2_50% Pi_G Pr1_50% Pr2_50% Pr3_50% Pr4_30% Pr_G To_100%

Glucose Glucoz
3.280.09 3.990.10 3.620.10 3.230.08 4.910.09 2.720.06 3.960.13 8.300.16 2.910.07 3.840.08 3.180.07 3.620.09 3.780.09 3.650.08 3.720.10 5.080.12 2.350.10 2.440.07 3.500.14 4.480.13 2.490.11 3.020.12 2.880.09 0.660.08 5.200.11 4.930.09 2.330.07 2.480.12 2.710.07 2.860.12 2.260.11 3.190.18 1.980.09

Fructose Fructoz
6.90.3 9.920.39 9.330.4 7.620.29 6.320.42 8.40.22 3.080.49 7.670.82 3.030.25 3.950.35 3.320.26 3.840.34 3.970.36 3.830.31 3.870.36 5.140.53 2.30.31 2.490.23 3.070.5 40.56 2.40.36 2.640.38 2.890.3 0.710.28 4.60.52 4.60.44 2.510.2 3.850.35 4.340.27 4.870.41 7.950.37 9.490.58 1.780.31

Sucrose Zaharoz
1.150.12 1.520.14 2.440.15 1.280.11 1.210.12 1.710.08 8.880.17 2.510.23 4.10.1 3.830.12 3.310.1 4.960.13 4.490.13 3.570.12 4.430.14 6.050.18 8.120.12 4.010.1 10.280.18 9.340.18 8.320.14 8.280.15 7.090.11 3.40.1 6.610.16 3.740.13 5.450.08 7.710.15 4.310.11 8.350.16 6.520.15 1.180.25 -0.150.13

XXVIII

Cele cinci sucuri autentice au fost analizate, de asemenea, prin HPLC pentru determinarea continutului de carbohidrati i validarea valorilor prezise, o cromatogram reprezentative fiind prezentat n Figura II.4.

Figura II.4. Separarea standardelor de carbohidrai i o cromatogram reprezentativ a probelor. Figure II.4. Separation of carbohydrate standards and a reprezentative syample chromatogram.

Tabelul II.4 prezint concentraiile carbohidrailor obinute prin HPLC, comparativ cu valorile corespunztoare prezise. Valorile HPLC obinute experimental au fost comparate cu valorile medii prezise i abaterile relative au fost de 10% pentru glucoz, de 7% pentru fructoz i 8% pentru zaharoz, validnd astfel modelele dezvoltate prin regresie PLS. Sucurile de mere etichetate suc fruc 100% prezint valori n coninut de glucoz, fructoz i zaharoz caracteristice acestora. Pentru un suc de mere autentic, raportul aproximativ dintre fructoz, glucoz i zaharoz este de 3:6:2, n timp ce carbohidraii variaz de la 1 la 4 (glucoz), 5-8 (fructoz) i 0-5 g/100 ml (zaharoz) (Irudayaraj, J., i Tewari, J. 2003).

XXIX

Tabel II.4 Valori prezise (pred) i determinate prin HPLC pentru glucoz (g), fructoz (f) i sucroz (s) n cinci sucuri de fructe autentice Table II.4 Predicted (pred) and HPLC determined concentrations of glucose (g), fructose (f) and sucrose (s) in five genuine fruit juices Sample Prob Ap_G Or_G Pc_G Pi_G Pr_G g/pred g/prezis 2.72 2.44 0.66 2.33 3.19 g/HPLC g/HPLC 3.01 2.19 0.75 2.4 2.63 f/pred f/prezis 8.4 2.49 0.71 2.51 9.49 f/HPLC f/HPLC 8.8 2.21 1 2.6 8.82 s/pred s/prezis 1.71 4.01 3.4 5.45 1.18 s/HPLC s/HPLC 2.1 4.47 3.6 5.33 1.44

Un suc autentic de caise ar trebui s conin mai puin de 1 g/100 ml de fructoz, n timp ce sucul de ciree s prezinte un coninut de zaharoz pur sub 1 g/100ml. Probele de suc de caise i suc de ciree analizate FTIR/PLS prezint un coninut mai mare de fructoz i zaharoz, ceea ce denot adugarea de ndulcitori. Portocale conin o medie de glucoz, fructoz i zaharoz de 2.2 - 2.4, 2.5 - 3 i respectiv 4 la 4.8 g/100ml. Se poate observa c valorile estimate (2.44, 2.49, 4.01 g/100ml) pentru sucul autentic de portocale sunt n concordan bun cu intervalele menionate mai sus. Probele Or8_100% i Or9_4% prezint abateri relativ mari de la valorile medii. Aceste abateri pot fi constatate i n analiza PCA, unde proba Or8_100% (poziionat n Figura II.3 la valori negative PC2) prezint deviere de la alte eantioane de suc de portocale. Sucul de portocale etichetat ca fruct 4% (Or9_4%) prezint o concentraie de zaharoz (7.90 g/100ml) de aproape dou ori mai mare comparativ cu alte sucuri de portocale, foarte probabil datorit adaosul de zaharoz suplimentar, necesare pentru meninerea intensitii gustului dulce. Sucul pur de piersici se caracterizeaz printr-un coninut ridicat de zaharoz, de aproximativ 5.5 g/100 ml i un coninut mai mic de glucoz i e fructoz, de 1.1 i 1.3 g/100ml, respectiv. Pentru sucul de piersici autentic au fost observate concentraii de glucoz i fructoz sub valorile menionate mai sus. Valorile mai mici sunt, probabil, din

XXX

cauza unei recoltri ntr-un stadiu mai incipient de coacere ca i recoltarea n cazul sucurilor de fructe prelucrate comerciale. Valorile crescute ale glucozei (2.49-3.50 g/100ml), fructozei (2.4-3.07 g/100ml) i zaharozei (7.09 - 10.28 g/100ml) prezise pentru sucurile de piersic comerciale denot adugarea de ndulcitori. Sucul din pulp matur de ananas conine zaharoz aproximativ 7 g/100ml i 3 g / 100ml din fiecare, glucoz i fructoz. Conform ateptrilor, pentru sucul de ananas autentic, precum i pentru proba Pi1_100%, s-a obinut un coninut ridicat de zaharoz, n timp ce sucul de fructe de ananas 50% fruct prezinta doar 3.74 zaharoz g/100ml. Sucul de pere autentic este caracterizat de un coninut mare de fructoz i coninut de zaharoz relativ mic. Din probele analizate, sucul de pere autentic prezinta concentraii de 9.49 i 1.18 g/100ml pentru fructoz i respectiv zaharoz. Prin urmare, datorit coninutului ridicat de zaharoz (4.31 - 8.35 g/100ml) prezis pentru probele comerciale de suc de pere, se poate presupune adugarea de ndulcitori. n final, de asemenea, a fost analizat o prob de suc de roii etichetat 100% autentic. Valorile prezise pentru glucoz i zaharoz sunt n concordan cu valorile din literatur (Briandet, R. i colab., 1996) lipsa de zaharoz n tomate este evideniat prin valoarea uor negativ prezis pentru zaharoz. De asemenea, un coninut total de carbohidrai de 3.76 g/100ml, conform valorilor prezise, este in acord cu valoarea de 3,5 g/100ml etichetat.

Evaluarea capacitii antioxidante a sucurilor prin FTIR i PLS Capacitatea antioxidant total (TAC) a sucurilor a fost determinat experimental, prin utilizarea metodei echivalentului Trolox al capacitii antioxidante (TEAC). Tabelul II.5 prezint valorile numerice ale valorilor TAC a sucurilor de fructe msurate cu metoda de referin TEAC comparativ cu valorile prezise FTIR/PLS i abaterile standard corespunztoare.

XXXI

Tabel II.5 Valori TAC msurate (TEAC) i prezise (PLS) Table II.5 Measured (TEAC) and predicted (PLS) TAC values
Sample Probe Ap1_100% Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ch1_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Or_G Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Pi1_100% Pi2_50% Pi_G Pr1_50% Pr2_50% Pr3_50% Pr4_50% Pr_G To1_100% Measured (%) Msurate 38.45 73.73 63.46 94.05 50.66 37.78 100 74.4 77.6 82.44 81.39 85.34 82.81 83.85 85.93 2.03 93.97 47.01 37.56 41.8 50.21 15.38 18.5 61.45 52.14 78.71 38.37 35.25 65.24 55.94 18.35 83.92 Predicted (%) Prezise 43.504 65.402 70.39 m 46.045 37.254 m m 79.442 71.981 79.632 77.994 76.613 87.563 94.887 7.81 m 40.511 45.045 38.742 m 11.878 23.06 65.012 54.848 m m 36.454 m 56.976 m 88.101 Pred. STDErr (%) Eroare standard prezis % 5.986 6.1 6.238 m 6.405 6.186 m m 5.734 5.68 5.757 5.696 5.65 5.768 6.414 6.143 m 6.01 6.026 6.04 m 6.07 6.437 5.871 6.125 m m 5.748 m 6.527 m 6.707

XXXII

Figura II.5 prezint grafic valorile TAC prezise, comparativ cu valorile msurate n cadrul testului TEAC

Figura II.5. Valori TAC msurate (axa Ox) n sucurile de fructe folosind metoda de referin (TEAC) i valori prezise (axa Oy) prin FTIR i PLS. Figure II.5. Measured TAC values (Ox axis) in fruit juices with the reference method (TEAC) and predicted values (Oy axis) with FTIR and PLS.

Comparnd valorile determinate TAC ale sucurilor (Tabelul II.5), cea mai mare capacitate antioxidant o prezint sucurile de portocale i sucul de roii cu valori n jur de 80%. Proba cu 4% suc pur de portocale apare ca excepie, cu o valoare sczut TAC (2.03% msurat i 7.81% prezis), cel mai probabil din cauza coninutului sczut de suc de fructe pur.

CONCLUZII Spectroscopia FTIR i statistica multivariat (PCA i PLS) au permis evaluarea calitii i autenticitii sucurilor de fructe. Prima derivat a spectrelor FTIR a prezentat cele mai bune capaciti de predicie, datorit valorilor sczute a erorilor RMSEP. Analiza PCA a soluiilor standard de carbohidrai a permis o mai bun nelegere a modului n care acestea se regsesc n spectrele FTIR, n timp ce analiza PCA a

XXXIII

spectrelor sucurilor de mere, portocale i piersici a permis discriminarea ntre aceste tipuri de sucuri, prin gruparea acestora n funcie de originea biologic. Folosind regresia de tip PLS, erorile relative de predicie pentru glucoza, fructoza i zaharoza din probele de suc de fructe au fost de 2.88%, 8.05% i respectiv 2.86%. A fost gsit o corelare satisfctoare (pn la 10% deviere) ntre media prezis FTIR/PLS a coninutului de carbohidrai i datele HPLC Adugarea de ndulcitori n sucurile de fructe poate fi dedus pe baza discrepanei fa de concentraiile medii de carbohidrai din probelor autentice, sau valorile raportate n literatura de specialitate. Spectroscopia FTIR i regresia PLS au fost folosite cu succes pentru determinarea capacitii antioxidante a sucurilor de fructe. Valorile prezise FTIR/PLS i valorile msurate prin metoda de referin TEAC sunt n bun concordan, factorul de corelaie ntre acestea fiind 0.958.

XXXIV

III. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR N GRU

Autenticitatea a patru varieti diferite de gru (Einkorn, Rosadur, Kamut and Toronit), recoltate ntre anii 2004-2007 a fost verificat prin realizarea amprentei carotenoidice, folosinu-se metoda HPLC

MATERIALE I METODE Probe. Patru varieti de gru galben recoltate n 2004, 2005, 2006 i 2007 au fost luate n studiu n vederea caracterizrii profilului lor carotenoidic. Speciile de gru Einkorn (EI-18), Toronit, Kamut i Rosadur au fost achiziionate de la Staia Experimental BOKU Vienna. Distribuia luteinei i zeaxantinei a fost cuantificat n diferite fraciui de mcinii (tre >900 m, shorts >500 m, middlings plus >275 m, middlings >180 m, i fin < 180 m) n probele Einkorn, Toronit i Topdur recoltate n anul 2007. Analiza HPLC. A fost utilizat cromatograful Agilent Technology model 1090 HP, echipat cu pomp binar, auto sampler i detector DAD. Separarea cromatografic a compuilor a dost realizat cu ajutorul coloanei C18 (250 x 4.6mm, 5m) GRACEVydac 201TP54. Eluarea s-a realizat la temperatura cameriei n sistem izocratic utiliznd metanol: acetonitril (9:1, v/v) ca faz mobil la un debit constant de 0.7 ml/min. Cromatogramele au fost nregistrate la 450 nm.

Purificarea SPE (extracie n faz solid) Purificarea extractului de carotenoide este necesar, deoarece cantiti nsemnate de lipide sunt extrase i concentrate iar prezena fraciunilor lipidice compromit coloana HPLC. Protocolul SPE pentru separarea carotenoidelor din extractul de gru este schematic prezentat n Figura III.1.

XXXV

Solid phase extraction

equilibrated with 10 ml 1% ethyl acetate/hexane

Silica SPE column

C. Xanthophylls: 15 ml 30% ethyl acetate / hexane + 5 ml ethyl acetate B. Lipids: 10 ml 10% ethyl acetate / hexane

A. Carotens: 2 ml 1% ethyl acetate / hexane

Figura III.1. Protocolul de separare pe coloana SPE a carotenoidelor, cu fraciile corespunztoare carotene, lipide i xantofili. Figure III.1. SPE protocol for separation of wheat extract, with the corresponding fractions carotenes, lipids and xantophylls.

REZULTATE I DISCUII Separarea cromatografic a carotenoidelor prin HPLC din probele de gru nesaponificate Spre deosebire de fructe i legume, n probele de gru nu sunt prezente epoxicarotenoidele de aceea saponificarea se efectueaz doar n vederea ndeprtrii lipidelor. Extractele probelor de gru pot fi analizate cu ajutorul HPLC n sistem izocratic. Separarea cromatografic a carotenoidelor utiliznd standarde de lutein i zeaxantin, - i -caroten este prezentat n Figura III.2 iar cea a carotenoidelor din proba de gru Einkorn, este prezentat n Figura III.3.

XXXVI

Figura III.2. Cromatograma HPLC a Figura lutein, zeaxantin, - i -carotene.

III.3.

Cromatogram

HPLC

amestecului de standarde de carotenoide extractul de gru Ei-18, recolta 2007.

Figure III.2. HPLC chromatogram of Figure III.3 HPLC chromatogram of Ei-18, lutein, zeaxanthin, - and -carotene crop 2007, wheat sample extract. standard mixture.

Analiza cantitativ a carotenoidelor din varietile de Einkorn, Rosadur, Kamut i Toronit nesaponificate n cadrul acestui studiu, au fost analizate varietile de gru Einkorn, Rosadur, Kamut i Toronit din recoltele 2004-2007. n acest rezumat vor fi prezentate doar rezultatele obinute n urma analizei probei Einkorn, ca fiind cea mai relevant. Probele Rosadur, Kamut i Toronit sunt analizate pe larg n capitolul VI al tezei. Analiza probelor Einkorn. Coninutul n lutein a variat ntre 4.55 mg/kg (EI-18, recoltat 2004) i 6.25 mg/kg substan uscat (s.u) (EI-18, recoltat 2005), cu media de 5.47 mg/kg s.u. Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul III.1 i n corelaie cu cele raportate de Abdel-Aal i colab. (Abdel-Aal, E. S. M. i colab., 2002). Din ntraga cantatitate de carotenoide, luneina este cea mai nsemnat cantitativ 84%, urmat de -caroten 8.87%. Zeaxantina a fost identificat n toate probele analizate. Aceste rezultate sunt n contradicie cu cele raportate de ctre Hidalgo i colab. (Hidalgo, A. i colab., 2006) care menioneaz absena zeaxantinei din varietatea Einkorn. Concentraia de zeaxantin identificat a fost de 0.31 (recoltate n 2004) i 0.44 mg/kg s.u

XXXVII

(recoltat n 2006). Concentraia de -caroten variaz ntre 41.31g/kg i 80.57 g/kg, n timp ce pentru -caroten raportm cantiti ntre 725.24 i 434.5 g/kg s.u. n concluzie varietatea EI-18 recoltat n 2007 a prezentat cantiti mai mari de carotenoide n comparaie cu EI-18 recoltate n ceilali ani. Tabelul III.1 reprezint concentraia de carotenoide din probele nesaponificate Ei-18, Rosadur, Kamut i Toronit. Tabel III. 1 Concentraia (mg/kg) carotenoidelor individuale din extractele probelor de gru nesaponificate Ei-18, Rosadur, Kamut i Toronit Table III.1 The concentration (mg/kg) of individual carotenoids from unsaponified extract of Ei-18, Rosadur, Kamut and Toronit varieties of wheat
Year An 2004 2005 2006 2007 Ei-18 (mg/kg) L 4.55 6.25 4.95 6.11 Z 0.31 0.35 0.44 0.43 Ei-18 (g/kg) 77.19 80.57 65.08 41.31 725.19 654.80 434.58 490.89 Rosadur (mg/kg) L 1.08 1.64 1.67 1.87 Z 0.17 0.21 0.29 0.20 Rosadur (g/kg) 25.02 29.78 59.68 46.46 44.25 47.95 47.95 47.01 Kamut (mg/kg) L 0.92 1.18 1.27 1.29 Z 0.17 0.20 0.22 0.23 Kamut (g/kg) 22.25 25.46 25.67 19.33 35.60 38.04 36.54 34.61 Toronit (mg/kg) L 2.32 2.67 2.35 Z 0.28 0.39 0.27 Toronit (g/kg) 67.24 21.17 20.41 31.31 35.16 43.39 -

L- lutein, Z- zeaxanthin, - -carotene and - -carotene

Separarea cromatografic a carotenoidelor din gru, folosind extracia n faz solid (SPE). n studiile noastre, analiza HPLC a fost utilizat pentru a compara cantitatea de carotenoide din probele saponificate i nesaponificate din gru. Pierderile de carotenoide n urma saponificrii n cazul extractelor de gru au fost de pna la 40%. Datorit pierderilor mari, am utilizat ca i metod alternativ pentru purificarea i ndeprtatrea lipidelor nedorite, metoda extraciei n faz solid (SPE). Tabelul III.3 prezint coninutul n lutein vs. zeaxantin i -caroten vs.-caroten dup separarea SPE. Dup cum se poate deduce comparnd Tabelul III.2 i Tabelul III.3, randamentul de recuperare a luteinei i zeaxantinei a fost de 82-99% pentru lutein i 8293% pentru zeaxantin. Recuperarea fraciunilor de - i- caroten au fost de 84-99 %.

XXXVIII

Randamentul de recuperare a pigmenilor carotenoidici pentru probele Rosadur, Kamut i Toronit au fost 74-98%, 81-95% i 75-98%. n acest studiu, am demonstrat c separarea SPE pentru ndeprtarea lipidelor este o metod mai rapid cu pierderi de 1-25 % n comparaie cu saponificarea unde pierderile de carotenoide nregistrate sunt mai mari de 40%. Table III.2 prezint concentraia de carotenoide n Ei-18, Rosadur, Kamut i Toronit dup separarea SPE. Tabel III.2 Concentraia (mg/kg) carotenoidelor individuale dup separarea SPE pe coloan deschis a probele de gru Ei-18, Rosadur, Kamut i Toronit Table III.2 The concentration (mg/kg) of individual carotenoids after SPE clean-up in Ei-18, Rosadur, Kamut and Toronit varieties of wheat
Year An 2004 2005 2006 2007 Ei-18 (mg/kg) L 4.51 6.19 4.89 5.63 Z 0.26 0.31 0.43 0.42 Ei-18 (g/kg) 70.67 72.43 59.28 40.08 706.25 554.28 409.63 464.08 Rosadur (mg/kg) L 1.06 1.49 1.52 1.73 Z 0.17 0.20 0.26 0.18 Rosadur (g/kg) 22.36 26.10 51.68 39.87 40.25 43.50 41.62 37.13 Kamut (mg/kg) L 0.79 1.13 1.16 1.23 Z 0.16 0.16 0.17 0.20 Kamut (g/kg) 19.30 20.91 22.43 17.35 29.38 28.83 33.00 32.88 Toronit (mg/kg) L 2.29 2.60 2.12 Z 0.26 0.33 0.23 Toronit (g/kg) 50.49 19.80 16.13 28.32 25.01 36.90 -

L- lutein, Z- zeaxanthin, - -carotene and - -carotene

Distribuia carotenoidelor n fraciunile de gru Condiiile de cretere, varietatea i factorii genetici ai grului nflueneaz coninutul de carotenoide i distribuia n semine. Randamentul fracionrii pentru fiecare varietate investigat a fost urmtorul: Ei-18 furnizeaz 16.5, 15.1, 12.2, 5.3 i 49.9%; Topdur furnizeaz 8.9, 10.9, 24.4, 23.1 i 31.9%; i Toronit furnizeaz 14.9, 9.3, 12.1, 12.9 i 49.8% tre, shorts, middlings plus, middlings, i fin. Fraciunea integral a fost utilizat n vederea evalurii extraciei i fracionrii. Figura III.4 prezint coninutul de lutein i zeaxantin n farciunile de mcini a urmtoarelor varieti de gru galben: Ei-18 (a, b), Topdur (c, d) i Toronit (e, f).

XXXIX

a)
8
***

< 180 mm > 180 mm

> 275 mm > 500 mm

> 900 mm whole EI-18

b)
0.4

< 180 mm > 180 mm

> 275 mm > 500 mm

**

> 900 mm whole EI-18

Lutein content (mg/kg)

Zeaxanthin content (mg/kg)

ns

6
ns

0.3
ns

ns

ns

4
*** ***

0.2

0.1

0.0

EI-18 wheat samples

EI-18 wheat samples

c)
5

< 180 mm > 180 mm > 275 mm

* **

> 500 mm > 900 mm whole Topdur

d)
0.4

< 180 mm > 180 mm > 275 mm

***

> 500 mm > 900 mm whole Topdur

Lutein content (mg/kg)

Zeaxanthin content (mg/kg)

0.3
***

ns

0.2
* ns

2
*** ***

0.1

ns

0.0

Topdur wheat samples

Topdur wheat samples

e)
4
**

< 180 mm > 180 mm > 275 mm

**

> 500 mm > 900 mm whole Toronit

f)
0.5

< 180 mm > 180 mm > 275 mm

***

> 500 mm > 900 mm whole Toronit

Zeaxanthin content (mg/kg)

0.4

Lutein content (mg/kg)

3
*

***

0.3

***

2
*** ***

0.2

0.1
*** ***

0.0

Toronit wheat samples

Toronit wheat samples

Figura III.4. Coninutul de lutein i zeaxantin a fraciunilor obtinute din cele trei varieti de gru: EI-18 (a, b), Topdur (c, d) i Toronit (e, f). Valorile sunt exprimate ca medie SD (* semnificativ, ** foarte semnificativ, *** extraem de semnificativ, P < 0.05, ns-nesemnificativ P> 0.05). Figure III.4. Lutein and zeaxanthin content in millstreams of yellow wheat varieties: EI18 (a, b), Topdur (c, d) and Toronit (e, f). Values are mean SD (* significant, ** very significant, ***extremely significant, P < 0.05, ns-non significant P> 0.05).

XL

Coninutul cel mai mare n carotenoide a fost identificat n fraciunile de fin Ei18 (6.92 pentru lutein i 0.24 mg/kg zeaxantin), urmat de fraciunile de fin Topdur (3.6 lutein i 0.09 mg/kg zeaxantin). n fraciunile de fin de Toronit a fost identificat cea mai mic cantitate de lutein 3.08 mg/kg.

CONCLUZII Pentru extracia luteinei, zeaxantinei, - i -carotenului, mixul eter de petrol: acetat de etil: metanol (1:1:1 v/v/v) a fost gsit ca fiind cel mai eficient solvent de extracie. Saponificarea standard produce pierederea carotenoidelor n procent de 40%. Astfel, metoda SPE a fost gsit ca fiind cea mai avantajoas. Recuperarea carotenoidelor dup procedura SPE a fost ntre 85-99%, 74-98%, 81-95% i 75-98% pentru varietile Einkorn, Rosadur, Kamut i Toronit. Metoda de extracie utiliznd SPE a fost identificat ca fiind o metod rapid cu pierderi mici de carotenoide. Diferene semnificative privind coninutul de carotenoide au fost nregistrate ntre varietile analizate. Prin alaliza HPLC, coninutul n lutein din gru a fost identificat ca fiind pigmentul carotenoidic majoritar. Cea mai mare cantitate de lutein a fost identificat n proba Einkorn cu o medie a anilor de recoltare( 2004-2007) de 5.47 mg/kg, urmat de proba Toronit 2.44 mg/kg, Rosadur 1.56 mg/kg i Kamut 1.16 mg/kg. Einkorn prezint o concentraie medie de - i -caroten de 66 g/kg i 576 g/kg, n timp ce n probele de Rosadur, Kamut i Toronit concentraia de -caroten a variat ntre 20-40 g/kg iar -caroten 36-46 g/kg, valorile exprimate ca medie a anilor 20042007. Concentraia de zeaxantin a fost deasemenea identificat n toate probele analizate cu variaii minore cuprinse ntre 0.21-0.38 mg/kg. Coninutul n carotenoide al cerealelor depinde de condiiile de cultivare din anul de recoltare. Pe aceeai varietate s-au observat variaii ale coninutului de carotenoide (cu mai mult de 25%) ntre probele recoltate ntre 2004 i 2007.

XLI

Probele din diferitele fraciuni ale mciniului de gru relev faptul c exist o distribuia diferit de carotenoide n cereale. Pentru varietile Einkorn, Topdur i Toronit, coninutul cel mai mare n lutein a fost identifiat n fraciunea de fin descrescnd odat cu mrimea particulelor fraciunii. Einkorn prezint cantiti de lutein ntre 6.92 mg/kg n fraciunea de fin, la 3.13 mk/kg n fraciunea de tre. Topdur prezint cantitatea de lutein de 3.6 mg/kg n fin i 0.92 mg/kg n tre, n timp ce Toronit prezint 3.08 mg/kg n fin i 1.18 mg/kg n fracia de tre. Concentraia de zeaxantin variaz ntre 0.091 i 0.37 mg/kg n fraciunea de mcini, excepie fcnd de fina din proba Toronit unde concentraia a fost sub limita de detecie.

XLII

IV. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR I ANTOCIANILOR DIN ORZ

MATERIALE I METODE Probe. Probele de orz colorat i decorticat au fost furnizate de Staiunea Experimental BOKU din Viena. Au fost utilizate urmtoarele 30 de linii de orz, recoltate n perioada 2007-2008: 8 linii de orz negru decorticat (Boku, BVAL358117, BVAL358163,C661, E360, E604, ICARDA, J307), 7 linii de orz purpuriu decorticat (BVAL350010, BVAL350017, Digersano, HB803, Lawina, Washonubet), 8 linii de orz albastru decorticat (C651, E515, E550, E632, GE-040,I 311, N308, N624) i 7 liniide orz galben decorticat (HOR 2199, HOR 2593, HOR 3727, HOR 4024, HOR 4940, HOR 11402, N 023). Pentru cuantificarea i determinarea carotenoidelor, au fost analizate toate cele petru genotipuri colorate de orz, cultivate n ani succesivi 2007 i 2008. Numai genotipurile de orz decorticat negru, albastru i purpuriu descrise au fost selectate pentru a studia diferentele ntre profilul lor antocianic. Analiza HPLC. Pentru determianrea carotenoidelor analiza HPLC s-a efectuat cu ajutorul unui cromatograf Agilent Technology model 1090 HP, echipat cu un sistem cu pompe binare, injector automat i detecie cu diod (DAD). Separarea cromatografic a compuilor a fost obinut cu ajutorul unei coloane C18 (250 x 4.6mm, 5 m) GRACEVydac 201TP54. Elutia a fost realizat la temperatura camerei isocratic, avnd ca i solvent amestecul de metanol:acetonitril, de puritate HPLC (9:1, v/v) la un debit constant de 0.7 ml/min. Carotenoidele au fost identificate cu ajutorul spectrului lor UV-Vis caracteristic i prin compararea timpilor de retenie cu cei ai soluiilor standard cunoscute. Cromatogramele au fost monitorizate la 450 nm cu un detector DAD. Antocianinii au fost separai i cuantificai utiliznd un cromatograf Agilent seria 1100, echipat cu pompe cuaternare, injector automat, thermostat pentru controlul temperaturii coloanei, degazor i detector cu fotodiod (PDA). Pentru separarea compuilor a fost utilizat o coloan Luna C-18 column (Phenomenex) (250 x 4.6mm, 5 m). Eluia a fost relizat la 350C pentru a mbuntti separarea. Coloana a fost eluat cu

XLIII

un faza mobil n gradient constnd n (A) 4.5% acid formic and (B) acetonitrile absolut cu un debit de 0.8 ml/min. Gradientul a fost programat dup cum urmeaz: 0-9 min, 1012% B; 9-16.5 min,12- 13% B; 16.5-30 min, 13-25% B; 30-45 min, 25-90% B; 45-50 min, 90% B; 50-55 min, 90-10% B; i 55-60 min, meninut cu 10% B. Antocianii separai au fost detectai i msurai la 520 nm, iar antocianii identificai au fost la fost n concordan cu timpii de retenie i spectrul UV-Vis al standardelor autentice pure.

REZULTATE I DISCUII Analiza cantitativ a carotenoidelor n genotipurile de orz Distribuia calitativ i cantitativ a luteinei i zeaxantinei n probele de orz a fost determinat prin HPLC cu faz inversat, utiliznd o coloan Luna C-18. Aceast coloan HPLC a fost cu succes ntrebuinat pentru separarea luteinei i zeaxantinei n condiii izocratice. Un profil HPLC specifical xantofilelor i al extractului de orz este prezentat n Figura IV. 1.
Zeaxanthin
14 16

Zeaxanthin

300000

(a)
Lutein

14000

(b)
12000 10000 8000

250000

200000

Area (mAU)

150000

Area (mAU)

6000 4000 2000

100000

50000

0
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

-2000 0 2 4 6 8 10 12 18 20 22 24 26 28 30

Time (min)

Figura IV. 1. Profilul HPLC al standardelor de carotenoide, lutein i zeaxantin (a) i cromatograma extractului din proba de orz de culoare purpuriu HOR (b). Figure IV. 1. Carotenoid HPLC profile of an standard mixture of lutein and zeaxanthin (a) and the chromatogram of HOR 4024 purple barley extract (b).

XLIV

Lutein

Time (min)

Analiza carotenoidelor din orz Determinarea autenticitii genotipurilor de orz s-a fcut prin realizarea amprentei carotenoidelor folosindu-se metoda HPLC. n acest rezumat am evaluat coninutul n carotenoide doar al genotipului de culoare neagr ca fiind cel mai relevant din punct de vedere al concentraiilor de lutein. Celelalte genotipuri au fost tratate pe larg in capitolul VII al tezei. Ca o privire general, Tabelul IV. 1 prezint coninutul de lutein i zeaxantin din patru genotipuri de orz negru, albastru, galben i purpuriu studiate, cultivate in anii 2007 i 2008. Tabel IV. 1 Compararea coninutului de carotenoide mg/kg (lutein i zeaxantin) n genotipuri de orz de culoare neagr, galben, albastr i purpuriu din probe recoltate n anul 2007 i 2008. Table IV. 1 Comparation of carotenoid content mg/kg (lutein and zeaxanthin) in black, yellow, blue and purple barley genotype samples harvested in 2007 and 2008.
Black barley [mg/kg] Orz negru [mg/kg] BOKU SNG 04 BVAL 358117 BVAL 358163 C 661 E 360 E 604 ICARDA J 307 Yellow barley [mg/kg] Orz galben [mg/kg] BVAL 350010 BVAL 350017 DIGERSANO HB 803 LAWINA WASHONUBET U 347

Lutein 2007 4.60 9.32 4.97 4.99 1.88 5.15 8.11 2.67

Zeaxanthin 2007 3.47 3.19 3.17 3.51 2.45 3.12 3.43 4.89

Lutein 2008 7.91 3.94 8.38 10.93 3.95 7.71 9.33 12.32

Zeaxanthin 2008 4.34 2.32 4.58 5.75 2.77 4.55 5.65 6.78

3.67 2.84 3.29 3.52 3.15 3.16 4.77

2.87 3.26 3.52 3.05 3.14 2.68 4.16

7.13 3.51 3.01 6.13 4.60 9.39 -

3.84 2.35 1.75 4.91 2.44 4.83 -

XLV

Blue barley [mg/kg] Orz albastru [mg/kg] C 651 E 515 E 550 E 632 GE 040 I 311 N 308 N 624 Purple barley [mg/kg] Orz purpuriu [mg/kg] HOR 2199 HOR 2593 HOR 3727 HOR 4024 HOR 4940 HOR 11402 N 023

Lutein 2007 3.01 1.86 2.64 2.54 1.34 2.57 1.42 3.88 Lutein 2007 1.81 2.66 2.16 2.24 2.87 4.09 3.42

Zeaxanthin 2007 3.28 2.00 2.66 2.99 2.96 2.82 2.78 3.56 Zeaxanthin 2007 2.24 2.39 2.74 2.21 2.62 3.38 3.35

Lutein 2008 4.60 5.92 8.65 4.04 4.57 5.09 3.13 5.23 Lutein 2008 4.61 3.37 4.11 4.93 4.95 5.26 5.64

Zeaxanthin 2008 4.03 2.76 4.00 1.76 3.02 2.66 2.33 3.07 Zeaxanthin 2008 3.15 2.39 3.32 3.45 2.88 3.70 3.86

Dac analizm anul de recoltare 2007, cel mai mare coninut de lutein a fost determinat n varietatea BVAL 358117 cu o concentraie de 9.3 mg/kg substan uscat (s.u), urmat de probele ICARDA cu un coninut de lutein de 8.1 mg/kg s.u. Probele BOKU SNG, BVAL 358163, C661 i E 604 au valori similare pentru coninutul de lutein: 4.6 mg/kg, 4.9 mg/kg, 4.9 mg/kg i 5.1 mg/kg. Coninutul de zeaxantin din probele de orz negru variaz ntre 2.4 mg/kg i 4.8 mg/kg cu o medie de 3.4 mg/kg. Comparnd concentraia de carotenoide distribuite n toate varietile de orz, se poate observa ca aproape toate probele prezint cantiti similare de zeaxantin, 3.3 mg/kg, cu dou excepii, E 360 i J 307 unde concentria este de 2.4 mg/kg respectiv 4.8mg/kg. n concluzie varietatea de orz negru BVAL 358117 are cea mai mare cantitate de carotenoide (lutein i zeaxantin) comparnd cu celelalte ase varieti studiate. Dac analizm anul de cultur 2008, cel mai ridicat coninut de lutein a fost gsit n proba J 307 cu 12.3 mg/kg s.u urmat de C 661 unde coninutul de lutein a fost de 10.9 mg/kg. Cel mai sczut coninut de lutein a fost determinat in probele de orz negru BVAL 358117, acestea avnd un coninut de 3.9 mg/kg.

XLVI

Concentriile de zeaxantin din probele de orz negru, cultivat n 2008 variaz ca medie ntre 2.3 mg/kg n proba BVAL 358117 i 6.8 mg/kg n proba J 307. Concluzionnd, au fost gsite diferene semnificative n coninutul de pigmeni carotenoidici, lutein i zeaxantin ntre genotipuri i ntre anii cultivrii. n general, analiza coninutului de carotenoide din genotipurile de orz negru, galben, albastru i purpuriu este influenat de condiiile climaterice, aadar extractele din anul 2008 conin cantinti mai mari de pigmeni carotenoidici comparativ cu anul 2007 de pna la 30%.

Separarea cromatografic a antocianilor din probele de orz prin metoda HPLC Figura IV.2 reprezint separarea unui amestec de nou standarde de antociani puri, cianidin-3-galactozid, cianidin-3-glucozid, delfinidin-3-ramnozid, pelargonidin-3glucozid, delfinidin, peonidin-3-glucozid, malvidin-3-glucozid, cianidin i respectiv malvidin, n 35 min la 520 nm. Cromatograma LC a extractului de orz purpuriu separat la 35C este prezentat n Figura IV.3. Cromatograma extractului de orz purpuriu prezint o bun separare a antocianilor: cianidin-3-glucozid, pelargonidin-3-glucozid, delfinidin, peonidin-3-glucozid i cianidin prezeni n prob, detectai la 520 nm..

XLVII

Malvidin

250000
Delphinidin rhamnoside Peonidin glucoside Delphinidin

300000

250000
Cyanidin

Cyanidin glucoside

Pelargonidin glucoside

Cyanidin galactoside

200000

Malvidin glucoside

200000

Area (mAU)

150000

Cyanidin glucoside

150000

Area (mAU)

100000

Delphinidin

100000

Pelargonidin glucoside

Peonidin glucoside

50000

50000

0 0 10 20 30

0 0 10 20 30

Time(min)

Time (min)

Figura IV.2. Separarea HPLC a noua standarde de antociani: cianidin-3galactosid, cianidin-3-glucosid, delphinidin-3-ramnosid, pelargonidin-3glucosid, delphinidin, peonidin-3-glucosid, malvidin-3-glucosid, cianidin i malvidin Figure IV.2. HPLC separation of pure standards of anthocyanins: cyanidin-3galactoside, cyanidin-3-glucoside, delphinidin-3-rhamnoside, pelargonidin-3glucoside, delphinidin, peonidin-3glucoside, malvidin-3-glucoside, cyanidin and malvidin.

Figura IV.3. Cromatogram relevant a unui extract de antociani din varietatea de orz de culoare purpuriu: cianidin-3glucosid, pelargonidin-3-glucosid, delfinidin, peonidin-3-glucosid i cianidin nregistrata la 520 nm. Figure IV.3. A relevant chromatogram of anthocyanins of a purple variety of barley extract: cyanidin-3-glucoside, pelargonidin-3-glucoside, delphinidin, peonidin-3-glucoside and cyanidine at 520 nm.

Analiza cantitativ a antocianilor din probele de orz negru, albastru i purpuriu Autenticitatea genotipurilor de orz negru, albastru i purpuriu s-a facut folosinduse ca i markeri coninutul n antociani. n studiul nostru, media coninutului total de antociani din genotipul negru a fost de 45.87 mg/kg (1.17 mg/kg cianidin glucozid, 3.38 mg/kg pelargonidin glucozid, 17.69 mg/kg delfinidin, 1.35 mg/kg peonidin glucozid i 22.27 mg/kg cianidin), comparativ cu cercetrile lui Mi-Jung Kim. Antocianii totali din probele de orz negru variaz de la 2.71 mg/kg n ICARDA la 91.87 mg/kg n varietatea C 661. Studiile de literatur raporteaz c,genotipul de orz purpuriu i albastru conin cantiti mai mari de antociani dect genotipul negru. Aceast caracteristic este confirmat i de studiul nostru.

XLVIII

Cyanidin

Antocianii totali cuantificai din varietatea de orz albastru din studiul nostru au fost 86.89 mg/kg (1.01 mg/kg cianidin glucozid, 2.43 mg/kg pelargonidin glucozid, 37.52 mg/kg delfinidin, 3.5 mg/kg peonidin glucozid i 42.42 mg/kg cianidin). Cel mai sczut coninut de antociani totali a fost gsit n proba N 624 (3.94 mg/kg), n timp ce cel mai mare coninut de a fost calculat pentru proba de orz C 651 cu o medie de 146.79 mg/kg antociani totali. Rezultatele concentraiilor de antociani din diferite genotipuri de orz purpuriu sunt reprezentate n Tabelul IV. 2. Tabel IV. 2 Concentraia de antociani (mg/kg) determinat prin metoda HPLC n pobe de orz din genotipul de culoare purpuriu Table IV. 2 Anthocyanins concentrations (mg/kg) detected by HPLC in purple barley genotypes
Probe de orz purpuriu mg/kg Purple barley samples mg/kg HOR 2199 HOR 2593 HOR 3727 HOR 4024 HOR 4940 HOR 11402 N 023 Cianidin glucozid mediaSD Cyanidin glucoside mean SD 8.130.01 9.980.96 16.11.2 52.91.04 13.710.66 11.690.42 0.690.01 Pelargonidin glucozid mediaSD Pelargonidin glucoside mean SD 2.680.03 2.170.06 4.270.28 11.550.27 4.920.21 4.30.12 0.930.05 Delfinidin mediaSD Delphinidin mean SD 61.971.67 162.115.52 50.432.6 77.652.65 190.817.7 155.643.12 50.082.73 Peonidin glucozid mediaSD Peonidin glucoside mean SD 39.230.01 27.411.04 113.637.35 198.885.54 45.180.74 42.151.79 Cianidin mediaSD Cyanidin mean SD 28.171.96 38.741.97 28.650.44 92.272.18 52.822.7 44.40.98 19.110.36

Media coninutului de antociani n probele de orz purpuriu studiate a fost de 237.49 mg/kg (16.17 mg/kg cianidin glucozid, 4.4 mg/kg pelargonidin glucozid, 106.8 mg/kg delfinidin, 66.6 mg/kg peonidin glucozid and 43.45 mg/kg cianidin).

XLIX

Antocianii toatali din probele de orz purpuriu variz de la 70.81 mg/kg n proba N 23 la 433.25 mg/kg n varietatea HOR 4024. Concluzionand, diferene semnificative n coninutul de antociani au fost identificate ntre genotipuri. Cel mai mare coninut de antociani a fost gsit n orzul purpuriu, urmat de genotipurile de orz albastru i negru, fiind n concordan cu literatura.

CONCLUZII Coninutul de carotenoide, lutein i zexantin, depinde de genotip, varietate i condiii climatice. Luteina i zeaxantina au fost analizate din patru genotipuri de orz negru, galben, albastru i purpuriu din doi ani de cultivare 2007 i 2008. Genotipul de orz cu cel mai mare coninut de carotenoide a fost identificat a fi orzl negru cu un coninut mediu de 8.06 mg/kg pentru lutein i 4.6 mg/kg pentru zeaxantin. Din varietile de orz negru, proba J 307 are o concentre de lutein de 12.3 mg/kg i 6.78 mg/kg pentru zeaxantin. Cea mai sczut cocnentraie de carotenoide a fost determinat n genotipurile albastru i purpuriu cu o medie de 2.5 mg/kg lutein i 2.7 mg/kg zeaxantin. Probele cultivate n 2008 au cel mai mare coninut de carotenoide mai mare de 30% dintre tate probele analizate din anul 2007. Continutul de antociani din orz, stabilit n acest studiu este in concordan cu alte studii pe alte varieti ale acelorai genotipuri. n contrast cu cantitile de carotenoide identificate, orzul negru conine cea mai mic cantitate de antociani. Cel mai mare coninut de antociani a fost identificat n orzl purpuriu (237.49 mg/kg), descrescnd n urmtoarea ordine: orz albastru (86.89 mk/kg) i orz negru (45.87 mg/kg).

Genotipul cu cea mai mare varietate de antociani (cianidin glucozid, pelargonidin glucozid, delfinidin, peonidin glucozid i cianidin), este orzul purpuriu, n timp ce varietatea cea mai srac n antociani este orzul negru.

LI

BIBLIOGRAFIE

1. Abdel-Aal, E. S. M., J. C. Young, P. J. Wood, I. Rabalski, P. Hucl, D. Falk and J. Fregeau-Reid (2002), Einkorn: A potential candidate for developing high lutein wheat, Cereal Chemistry 79:(3) 455-457.

2. Kim, M. J., J. N. Hyun, J. A. Kim, J. C. Park, M. Y. Kim, J. G. Kim, S. J. Lee, S. C. Chun and I. M. Chung (2007), Relationship between phenolic compounds, anthocyanins content and antioxidant activity in colored barley germplasm, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55:(12) 4802-4809.

3. Siebenhandl, S., H. Grausgruber, N. Pellegrini, D. Del Rio, V. Fogliano, R. Pernice and E. Berghofer (2007), Phytochemical profile of main antioxidants in different fractions of purple and blue wheat, and black barley, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55:(21) 8541-8547.

4. Irudayaraj, J. and J. Tewari (2003), Simultaneous monitoring of organic acids and sugars in fresh and processed apple juice by Fourier transform infrared-attenuated total reflection spectroscopy, Applied Spectroscopy 57:(12) 1599-1604.

5. Esbensen, K. H., D. Guyot, F. Westad and L. P. Houmller (2002). Multivariate Data Analysis - in practice, Camo Process AS.

LII