Cromatografie de lichide de inalta performanta

(HPLC)
Cursul II IPA

Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

HPLC utilizeaza o faza mobila lichida si faze stationare cu particule de mici
dimensiuni. Pentru a obtine debite satisfacatoare, lichidele trebuie introduse in
coloana sub presiune.
HPLC s-a pus la punct in anii 60, din punct de vedere al:
1. Fazelor stationare cu particule care si-au redus dimensiunile de la 150-200
micrometri la 5-10 micrometri.
2. Dimensiunile mici au condus la cresterea rezolutiei separarii si la reducerea
dimensiunilor coloanelor.

Clase de separari prin LC

Cromatografie de lichide in faza normala (NP-LC) faza stationara este polara,
faza mobila este formata dintr-un solvent nepolar
Cromatografie de lichide in faza inversa (RP-LC) faza stationara este nepolara
sihidrofoba, iar faza mobila este un solvent polar
Cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic faza stationara este un
schimbator de ioni, faza mobila este faza apoasa cu pH controlat
Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere faza stationara este un gel
cu porozitate controlata

Clasificarea separarilor in HPLC

In functie de natura fazei stationare si a procesului de separare avem:
In cromatografia de repartitie faza stationara este un adsorbent (silicagel sau alta
umplutura pe baza de silice) iar procesul de separare se bazeaza pe adsorbtii si desorbtii
repetate.
In cromatografia de schimb ionic faza stationara contine sarcini ionice de suprafata de
semn opus ionilor probei, tehnica aplicandu-se probelor ionice sau ionizabile, iar timpul
de elutie fiind functie de taria schimbului ionic. Faza mobila este o solutie tampon
apoasa, unde atat pH-ul cat si taria ionica sunt utilizate in controlul timpului de elutie.
In cromatografia de excludere sterica coloana este umpluta cu un material cu
dimensiuni de pori controlate, componentii probei find separati in functie de dimensiunile
moleculare.Aceasta tehnica se mai numeste filtrare in gel sau cromatografie de filtrare in
gel, desi astazi faza stationara nu mai este redusa numai la geluri.

Lichid-Solid opereaza pe principiul polaritatii. Compusii care poseda grupari

functionale capabile sa dea legaturi puternice de hidrogen vor adera mai puternic
la faza stationara in comparatie cu compusii mai putin polari. Astfel, compusii
mai putin polari vor fi eluati din coloana mai rapid decat cei puternic polari.
Lichid-Lichid opereaza pe acelasi principiu ca si in lichid-solid, aceasta tehnica
fiind mai mult utilizata pentru probe de polaritate medie solubile in solventi de
polaritate medie. Separarea ne-electrolitilor se realizeaza prin polaritati apropiate
ale probei si fazei stationare si utilizarea de faze mobile cu polaritati mult diferite.
Excluderea sterica opereaza pe principiul dimensiunilor moleculelor
componentilor probei. Faza stationara este poroasa. Coloana poate contine
umpluturi pe baza de silice sau alte tipuri de umpluturi.

In cromatografia de adsorbtie, in functie de polaritatea relativa a celor doua faze

avem: cromatografie normala si cromatografie cu faza inversa:
In cromatografia in faza normala, faza stationara este puternic polara (e.g.,
silica gel), iar faza mobila este nepolara (n-hexan sau tetrahidrofuran). Probele
polare sunt retinute pe suprafata polara a fazei mai mult decat cele nepolare sau
mai putin polare.
In cromatografia in faza inversa faza stationara este nepolara (hidrofobica) ,
in timp ce faza mobila este un lichid polar, e.g. amestecuri de apa si metanol sau
acetonitril. Cu cat materialul este mai nepolar cu atat va fi mai mult retinut pe
coloana.
Cele doua tipuri de cromatografii acopera 90% din aplicatiile cromatografice.
Polaritatea eluentului joaca un rol important in HPLC.
Sunt doua tipuri de elutie: izocratica si cu gradient. In primul tip eluentul de
compozitie constanta este pompat prin coloana in timpul analizei. In cel de-al
doilea tip, compozitia eluentului si taria ionica se modifica in timpul analizei.

Instrumentatie
Componentele HPLC
Probele lichide sunt injectate in coloana cu o siringa printr-o valva de injectie.
Proba este purtata de-a lugul coloanei cromatografice de faza mobila, iar
separarea cromatografica are loc pe masura ce amestecul traverseaza coloana.
Detectorii in HPLC detecteaza componentul eluat la capatul coloanei pe baza
unor proprietati fizice ca: absorbtia de lumina UV, fluorescenta, sau diferentele
de indice de refractie intre analit si faza mobila.
Schema unui sistem HPLC este prezentata mai jos:

Faza mobila
Rezervor

Pompa

Injector

Pre-Coloana

Coloana

Detector
Achizitie
Date

Faze mobile in HPLC.

Solvent

UV cut-off
(nm)

Refractive
Index

Boiling
Point
(C)

Viscosity
(cP, 25 C)

Solvent
Polarity
Parameter(P)

Selectivity
Group

Isooctane

197

1.389

99

0.47

0.1

N-Hexane

190

1.372

69

0.30

0.1

Methyl t-butyl
ether

210

1.369

56

0.27

2.5

Benzene

278

1.501

81

0.65

2.7

Methylene chloride

233

1.421

40

0.41

3.1

n-Propanol

240

1.385

97

1.9

4.0

Tetrahydrofuran

212

1.405

66

0.46

4.0

Ethyl acetate

256

1.370

77

0.43

4.4

Chloroform

245

1.443

61

0.53

4.1

Dioxane

215

1.420

101

1.2

4.8

Acetone

330

1.356

56

0.3

5.1

Ethanol

210

1.359

78

1.08

4.3

1.370

118

1.1

6.0

Acetic acid
Acetonitrile

190

1.341

82

0.34

5.8

Methanol

205

1.326

65

0.54

5.1

1.333

100

0.89

10.2

Water

Faze stationara
Faza stationara in HPLC se refera la suportul solid din coloana peste care
trece continuu faza mobila. Solutia probei se injecteaza in faza mobila prin
portul de injectie. Componentii amestecului vor migra in functie de
interactiunile ne-covalente ale acestora cu faza stationara. Interactiile chimice
ale fazei stationare si ale probei cu faza mobila determina gradul de migrare si
de separare al componentilor probei. Coloane continand diferite tipuri de faze
stationare comerciale sunt cele in care apar mecanismele de sorbtie : LichidLichid (Repartitie) in faza normala si in faza inversa, Lichid-Solid (Adsorbtie),
Excludere sterica, Schimb Ionic, si Afinitate.

Adsorbenti
Separarile prin HPLC au la baza interactiuni la suprafata si depind de natura
centrilor de adsorbtie (chimia suprafetei). Adsorbentii noi sunt particule mici,
rigide cu suprafete mari.
Parametrii adsorbentilor sunt:
Dimensiunea particulelor: 3-10 m
Distributia dimensiunii particulelor: cat mai ingusta posibil, < 10% din medie;
Dimensiunea porilor: 70-300 m
Aria suprafetei: 50-250 m2/g
Densitatea de legare (numarul de centri de adsorbtie/unitate de suprafata: 1-5/1
nm2
Depinzand de tipul de ligand atasat la suprafata, adsorbentul poate fi faza
normala (-OH, -NH2) sau faza inversa(C8, C18, Phenyl), sau schimbatori de ioni
(NH4+), (-COO-).

Faza normala opereaza pe baza hidrofilicitatii si lipofilicitatii prin utilizarea de

de faze stationare polare si faze mobile mai putin polare. Astfel compusii
hidrofobici sunt eluati mai rapid decat cei hidrofilici.
Faza inversa opereaza pe baza hidrofilicitatii si lipofilicitatii. Faza stationara
consta in umplutura pe baza de silice cu lanturi n-alchilice covalent legate. C-8
semnifica un lant octil si C-18 un ligand octadecil in matrice. Cu cat este mai
hidrofobica matricea, cu atat creste tendinta coloanei de a retine entitati
hidrofobice, iar compusii hidrofilici sunt mai rapid eluati in comparatie cu cei
hidrofobici.

Cromatografie in faza
normala

Cromatografie in faza
inversa

Faze stationare polare

Faze stationare nepolare

Solventii mai polari au

puteri mai mari de elutie

Solventii mai putin polari

au puteri mai mici de elutie

Clasificarea coloanelor in HPLC

Sunt si alte tipuri de coloane decat cele de separare propriu-zise care contin
faza stationara: de protectie, de derivatizare, capilare, rapide, si preparative.
Coloanele de protectie sunt plasate inaintea coloanei de separare fiind
utilizate la protejarea acesteia in scopul filtrarii sau separarii: 1) particulelor
care pot infunda coloana; 2) compusilor care conduc la variatii ale liniei de
baza "baseline drift", la rezolutii si sensibilitati scazute si la aparitia picurilor
false; 3) compusilor care pot provoca precipitarea la contactul cu faza
stationara sau faza mobila; 4) compusilor care pot fi co-eluati si produc picuri
suplimentare interferand in detectie si in analiza cantitativa. Aceste coloane
trebuie schimbate regulat pentru a-si pastra calitatile de protectie.

Coloane de derivatizare- Derivatizarea pre- sau post- coloana derivatization

reprezinta un aspect important al analizei cromatografice. Reducand sau
alterand compusul initial la molecule chimice inrudite la la fragmente
moleculare se pot obtine date complementare datelor analizei. In putine cazuri,
etapa de derivatizatizare poate conduce la date nesigure sau neconcludente,
acest aspect conferind avantaje HPLC in comparatie cu GC. Deoarece GC
necesita analiti volatili, termic stabili sau analiti nepolari, derivatizarea este
necesara si in acele probe care nu au aceste proprietati. Acetilarea, sililarea, sau
hidroliza acida reprezinta exemple de tehnici de derivatizare.
Coloane capilare- Progresele in HPLC au condus la coloane analitice de mici
dimensiuni, cunoscute ca microcoloane, coloanele capilare au diametre
submilimetrice si sunt de trei tipuri: tubulare deschise, cu umplere partiala si
umplute. Acestea permit lucrul cu probe de ordinul nanolitrilor, lucrul cu debite
mici si volume mici de solvent. In aceste conditii insa toata instrumentatia
trebuie miniaturizata debitele sunt dificil de reprodus, lucrul cu gradienti de
elutie nu este eficient si injectarea probelor trebuie facuta cu grija.

Microcoloanele cu umplutura sunt utilizate pentru volume mici, diametrul lor

fiind de 1-2 mm. Ca si coloanele capilare, instrumentele trebuie adaptate la
folosirea unor coloane de acest tip (de ex. debite mici in coloana). Pe langa
avantajele volumelor mici de proba si de faza mobila se remarca o crestere
sensibilitatii fara a se pierde din rezolutie. ---Electroforeza capilara
Coloane rapide- Argumentul in utilizarea acestor coloane este obtinerea unor
probe superioare (cantitate de component in unitate de timp). Pentru multe
coloane, cresterea debitului sau vitezei de migrare prin coloana afecteaza
negativ rezolutia si separarea in general. Din acest motiv, coloanele rapide sunt
utilizate in scopul reducerii timpului de analiza fara deviatii semnificative ale
rezultatelor. Aceste coloane au acelasi diametru intern, dar lungimi mult mai
mici fiind umplute cu particule cu diametrul de aprox. 3 m. Avantajele includ
sensibilitate marita, timpi de analiza redusi, utilizarea unor volume mai mici de
faza mobila si reproductibilitate marita.

Coloane preparative- Aceste coloane sunt utilizate pentru probe de ordinul

miligramelor in scopuri preparative. O coloana preparativa are diametre mari pentru
a facilita volume de injectie mari in sistemul HPLC.
Accesoriile importante sunt regulatorul de presiune si colectorul de fractii. Primul
este plasat imediat dupa detector, in scopul asigurarii unei presiuni constante la
iesirea din detector pentru a preveni introducerea bulelor de aer in sistem si a
imbunatati stabilitatea liniei de baza. Colectorul de fractii colecteaza uniform
fractiuni la iesirea din coloana, fiolele fiind plasate intr-un carusel programat in
ceea ce priveste intervalele de colectare. Fiecare fiola contine faza mobila si
fractiunea din proba la timpul de elutie corespunzator. Umplutura coloanelor are
diferite dimensiuni de particule, diametre, dimensiuni de pori sau suprafete
modificate(in cromatografia de afinitate). (Brown, 1990).