UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

CICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIE

Biochimie metabolica

Prof. Dr. Dana Iordachescu

CATENE TRANSPORTOARE DE ELECTRONI

Mitocondrii
Nucleu

Hidroxilanta
Desaturante

Cloroplaste
Membrana procariote
2

Citocromii P450 (P450, CYP)

familie de hem-proteine
prezenta n aproape toate tipurile de celule ale mamiferelor excepie in
eritrocitele mature i celulele muchilor scheletici- se gsesc, de asemenea,
la procariote
desemnarea unei proteine ca citocrom P450
s-a realizat iniial pe baza proprietilor ei spectrale, nainte ca funcia ei s fi
fost cunoscut
prezint un spectru unic, trasat dup adugarea unui agent reductor de tipul
ditionitului de sodiu la o suspensie de microzomi, urmat de barbotarea de
C0gaz n soluie
complexul format ntre C0 i proteina cu hemul redus are un spectru de
absorbie cu un maxim la 450 nm
denumirea provine de la majuscula P-pigment si 450 - lungimea de und a
maximului de absorbie.
3

Diferitele forme specifice de citocromi P450 prezint un maxim de

absorbie care se gsete ntre 446 nm i 452 nm
Reacia general catalizat de citocromul P450 este :
NADPH + H+ +O2 + AH

NADP+ + H2O + AOH

unde AH - substrat: un steroid, acid gras, medicament sau alt substanta

chimica care are un substituent - situs de oxigenare
Reacie de monooxigenare, citocromii P450 - monooxigenaze deoarece
numai unul din cei doi atomi de oxigen este incorporat n substrat.

In timp ce la procariote proteinele P450 sunt solubile, la om P450 sunt

asociate cu sistemele membranare ale RE si membrana interna a
mitocondriei

Situsul activ al P450 Fe hemic legat la proteina via un ligand tiolat un

rest Cys din secventa inalt conservata la toti citocromii P450 cunoscuti:
RXCXG
Desi citocromii P450 cunoscuti catalizeaza multe reactii extrem de diferite
exista o serie de caracteristici generale ale mecanismului lor de actiune:

1. Starea de repaus a proteinei are Fe3+

2. Legarea unui substrat AH initiaza transportul de electroni si legarea O2
3. Electronii care reduc CYP (Fe3+-hemic) provin de la alta proteina:
citocrom P450 reductaza, feredoxine sau citocromul b5
4. Oxigenul molecular este legat la Fe hemic redus si sufera o scindare
5. Un oxidant legat la Fe induce oxidarea/hidroxilarea substratului si
regenerarea starii de repaus a CYP
5

AOH
Catena transportoare de electroni hidroxilanta

H2O

2 H+

Cit P450.Fe2+.AH.O2
NADPH

E-FAD
e

Cit P450.Fe2+.AH.O2
O2

E-FADH2

NADPH:cit P450
reductaza (E-FAD)

Fe3+

Cit P450.Fe2+.AH

e
NADP+

Cit P450.

Cit P450.Fe3+.AH.O2

AH

endogene

Steroizi
Ac grasi
Prostaglandine
Leucotriene

Substrate AH
exogene

Medicamente
Aditivi alimentari
Subproduse industriale

Intra in organism prin hrana, injectii, inhalare, absorbtie piele

Inactivarea\activarea unor agenti terapeutici

Catene TE hidroxilante

Transformarea unui compus chimic intr-o

structura reactiva leziuni celulare nedorite
- mutatii
- moartea celulara
Etape din biosinteza compusilor hidroxilici
Metabolismul acizilor grasi & derivati

Metabolizarea medicamentelor: 2 faze

P450 este implicat in faza I a detoxifierii care consta din reactii de oxidare,
reducere, hidroliza, ciclizare, deciclizare. Reactiile de oxidare care au loc de
regula in ficat implica P450, NADPH si O2.
Daca produsii sunt suficient de polari ei sunt excretati rapid. Daca acesti
produsi nu pot fi excretati sufera faza II.
Faza II consta din reactii de conjugare (cu acid glucuronic, sulfonati,
glutation sau amino acizi) care cresc caracterul polar al produsilor in
vederea excretiei

Forme multiple ale citocromului P 450

- au aprut acum 5-50 milioane de ani,

- gene primordiale au codificat citocromi P450 implicai n metabolizarea
substratelor endogene
-cei mai vechi citocromi P450 au fost implicai n metabolizarea colesterolului i
acizilor grasi - au jucat un rol primordial n meninerea integritii membranelor
primelor eucariote
-genomul uman codifica
57 proteine P450 (Cyp) implicate in hidroxilarea sterolilor, acizilor biliari,
acizilor grasi, eicosanoidelor si vitaminelor liposolubile +
~50 proteine P450 implicate in metabolismul medicamentelor si altor
molecule xenobiotice
Genele ce codifica citocromii P450 si proteinele codificate sunt desemnate
prin abreviatia CYP urmata de un numar arab ce indica familia genica, o litera
majuscula care indica subfamilia si un numeral ce indica gena individuale.
De exemplu CYP2E1 este gena care codifica proteina CYP2E1 este implicat in
metabolismul acetaminofenului (paracetamol).
Sunt si abateri: CYP 5 sau TXAS (tromboxan A2 sintaza); CYP51 sau LDM
(lanosterol 14--demetilaza)

18 familii si 43 subfamilii

10

-arbori filogenetici, compararea secvenelor de aminoacizi, proces din

duplicare genetic care rezultat al presiunii selective a influenei mediului
-citocromii P450 din acelai organ sau din acelai organit celular au mase
moleculare i alte proprieti fizico-chimice similare, ceea ce face extrem de
dificil, dac nu imposibil separarea i purificarea lor
-o posibilitate de caracterizare i de difereniere a lor o ofer studiul
specificitii de substrat - realizabil numai pe proteine obinute prin
tehnicile biologiei moleculare (exprimarea cDNA)
-prin acest tip de studii s-a constatat c un anumit citocrom P450 poate
metaboliza diferite substrate nenrudite structural.
membrii unei familii CYP prezinta >40% aminoacizi identici, membrii unor
subfamilii >55% aminoacizi identici

11

Inducia citocromului P450

12

de ctre compui endogeni i exogeni.

diferite mecanisme de inducie - la nivel transcripional sau post transcripional, nicio corelaie ntre modul de inducie i o anumit clas de
ageni inductori
Ex 1 : etanolul i acetona pot induce membrii a dou subfamilii genetice
diferite de citocromi P450 prin mecanisme diferite : n primul caz inducie la
nivel transcripional, n al 2-lea caz - post-transcripional, stabilizarea mRNA
Ex2 : inducerea P450 IIE1 la obolan, prin tratamentul cu etanol, aceton
sau pirazol, prin nfometare sau la instalarea diabetului
la majoritatea productie crescuta de P450 IIE1 fara afectarea mRNA;
pirazolul stabilizeaza P450 fa de degradarea proteolitic
la obolanii diabetici crete de 10 ori nivelul mRNA - inducie de 6 ori a
nivelului P450 IIE1 - stabilizarea mRNA
dificil de prezis mecanismul de inducie n diferite condiii, chiar n cazul
unui singur citocrom P450

Studiul procesului de inductie

13

Ex p450 IA1
are o gen n care secventa promotor
(-1642)(+57)
excizat cu enzim de restricie HIND III
Fragmentul cu secv promotor poate fi
inserat n plasmida pSVOcat care are:
are
gena cat (cloramfenicol acetil transfer)
secvena Ampr care confer rezistena
la ampicilin
segmentul Ori
produsul rezultat este transfectat n celule hepatoma de oarece
se adaug n mediu TCDD (2,3,7,8-tetra clor dibenzo-p-dioxina) un inductor
cunoscut care interacioneaz cu un receptor citosolic aril hidrocarbur (Ah)
dac n acest sistem de exprimare genic se evideniaz activitatea enzimei
procariotice CAT, nseamn c n secvena promotor exist elemente XRE
(xenobiotic regulatory elements) implicate n reglarea acestei gene

14
Secventializarea regiunii promotor i repetarea experimentului permite
stabilirea cu precizie a situsului secvenei XRE
In general, arenele policiclice se leag la receptor ce formeaza un complex
implicat in legarea la elemente XRE din regiunea promotor a diferitelor gene
ale citocromilor P450

15
Inductori ai unor izoforme P450

Substrate exogene ale unor izoforme P450

16

Substrate endogene ale cit P450

17

Inhibitorii citocromilor P450

18

utilizati pentru a demonstra rolul unui anumit P450 intr-o cale metabolica
CO puternic inhibitor se leaga in locul O2 la Fe hemic inh nespecifica
Anticorpii monoclonali si policlonali la un anumit P450 inhibitor mai
specific, dar apar reactivitati incrucisate datorita similitudinii structurale
cu alti P450
inhibitori suicide contin grupari functionale care se leaga covalent,
ireversibil la un anumit citocrom

19

Sisteme transportor de electroni P450 dependente

Sistemul din RE: NADPH doneaz electronii
unei FAD-enzime de 78 kDa (NADPH-cit.
P450 reductaza), ce conine ca grupri
prostetice att FAD ct i FMN inglobata in
RE prin captul N-terminal al enzimei

In RE exista un al doilea sistem

transportor care contine NADH, alta
FAD-enzima NADH-cit. b reductaza si
un citocrom b5 care catalizeaza
desaturarea acizilor grasi

R-CH2 - CH2 - (CH2 )7 -COOH + NADH +H+ + O2

R-CH = CH - (CH2 )7 -COOH + NAD+ + H2O + H2O

Sisteme transportor de electroni P450 dependente mitocondriale

In mitocondrii, exista o FAD-reductaza, de 51 kDa,
acceptor de electroni de la NADPH - numit
NADPH: adrenodoxin reductaza (izolata pentru
prima dat izolat din gl suprarenale) asociat
slab la mediul membanar spre deosebire de
componentul corespunztor din membranele RE
O protein mic, adrenodoxina (12,5 kDa) slab
asociat cu membr mitocondrial intern;
intern contine
dou clustere Fe-S care servesc ca centre redox ntre adrenodoxin reductaz i
citocromii P450 mitocondriali.

unde side chain cleavage cytochrome P 450 (P450SCC)

20

21

22

23

24

Generarea de carcinogeni de catre izoformele P450

25

Aflatoxina B1 - micotoxina produsa de multe specii din genul Aspergillus

dupa intrarea in organism este metabolizata de ficat la epoxid - carcinogen

Benzo[a]pirenul xenobiotic, contaminant frecvent din

mediu, rezultat din arderea
crbunilor, a tutunului sau a
subproduselor industriale
-se leag la un receptor aril
hidrocarbur i induce sinteza de P450, activnd propria
metabolizare
-metabolizat la un produs
cancerigen pentru animale i mutagen pentru bacterii: bezo [a] piren-7,8dihidrodiol-9,10-epoxid
Benzo [a] pirenul este un carcinogen slab ce asemenea majoritii
carcinogenilor necesit o activare metabolic pentru a forma compui
carcinogeni puternici

26