Spectrometria de absorbtie

moleculara in UV-VIS

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Radiatia electromagnetica (luminoasa)

= =

Unde: l = lungimea de unda, n = frecventa, T = perioada

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Spectre
Spectru toate valorile pe care le poate lua o marime
fizica

Continuu poate lua orice valoare

Discret poate lua

numai anumite valori

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Spectrul electromagnetic

E hn h

h = 6,62 * 10-34 J*s (const. lui Planck)

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Spectrometrie/Spectroscopie
Spectru de absorbtie moleculara in UV-VIS

SPECTROMETRIE pentru
determinarea unei cantitati
(analiza cantitativa)

Spectru de absorbtie moleculara in IR

SPECTROSCOPIE pentru
determinarea naturii
substantei (analiza calitativa)

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Clasificarea tehnicilior spectroscopice/spectrometrice

Spectroscopie atomica

Spectroscopie moleculara

Spectrometrie de absorbtie atomica

Spectroscopie de absorbtie moleculara in IR

Spectrometrie de emisie atomica

Spectrometrie de absorbtie moleculara in

UV-VIS
Spectrometrie de fluorescenta moleculara

Spectrometrie de fluorescenta atomica

Spectrometrie de fluorescenta de raze X

Spectrometrie de masa
Spectroscopie Raman
Spectroscopie RMN
Spectroscopie de rezonanta electronica
de spin (RES)

Necesita atomizarea probei

Spectre de linii (discrete)
UMFCD - Biofizica

In general spectrele contin benzi

spectrale
Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Interactia unei molecule cu energia EM

absorbtie/emisie

o O molecula va absorbi radiatia electromagnetica, trecand intr-o

stare excitata :
M + hn M**

o Molecula nu va ramane in starea excitata M* sau M**, ea va

reveni la starea fundamentala M fie prin procese neradiative, fie
prin procese radiative (emisie). In cazul din urma, n n
M** M* (fara emisie de lumina)
M* + hn

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Nivelurile energetice ale unei molecule

Energia totala a unei molecule suma energiilor: electronica, de vibratie, de rotatie

DE = DEel + DEvib + DEr

DEel > DEvib >DEr

UMFCD - Biofizica

Domeniu EM

Tranzitii

Microunde

Rotationale

Infrarosu

Vibrationale +
Rotationale

Ultraviolet si vizibil

Electronice +
Vibrationale +
Rotationale

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Absorbtia energiei de catre molecule

Diferitele grupari functionale din molecule
(cromofori) absorb energie la anumite lungimi de
unda. Cand in molecula e un sistem de legaturi
duble conjugate absorbtie la energii mai mici
(lungimi de unda mai mari).

In functie de lungimea de unda la care o

substanta absoarbe, ea va aparea ochiului ca
fiind colorata in culoarea sa complementara
(radiatia neabsorbita fiind reflectata).

Substanta va fi colorata in culoarea opusa pe

roata fata de culoarea absorbita. Substanta alba
absorbtie nesemnificativa in VIS; substanta
neagra absorbtie puternica in tot domeniul VIS.
Ex : absorbtie la 420 nm (in albastru) culoare
galbena
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Legea Lambert-Beer
Exprima legatura intre intensitatea luminii absorbite si concentratia solutiei.

I I o10

cl

I0 intensitatea luminii incidente

I intensitatea luminii transmise
coeficient de absorbtie molara
(caracteristica a substantei)
c concentratia substantei din cuva
l lungimea cuvei

O substanta absoarbe diferit in functie de lungimea de unda :

= f (l)
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Marimi folosite in spectrofotometrie

Transmitanta

I
T 10 cl
I0

I
T % 100 10cl 100
I0

Dependenta neliniara fata de concentratie mai greu de lucrat. Se prefera

obtinerea unei dependente liniare.

Absorbanta

I0
A log( T ) log( ) cl
I
A l cl
O alta forma a legii
Lambert-Beer
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Aplicatie analiza fluidelor biologice

Fluidele biologice contin un numar mare de substante dizolvate
Spectrofotometria nu poate fi utilizata pentru a da informatii
calitative despre substantele dizolvate in absenta unei separari
prealabile
Separarea substantelor chimice obtinuta prin cromatografie

Detectia e asigurata prin spectrofotometrie (de obicei prin

masurarea la o lungime de unda fixa) rezulta o cromatograma
(absorbanta in functie de timpul pe care substanta il petrece in
coloana cromatografica)
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Spectrofotometrul de absorbtie

1.
2.
3.
4.
5.

SURSA DE RADIATII
MONOCROMATOR selecteaza radiatia de o singura lungime de unda
COMPARTIMENT PENTRU PROBA
DETECTOR
COMPUTER

o Detectorul masoara intensitatea radiatiei transmise. Pentru a putea

masura absorbanta e nevoie de si de intensitatea radiatiei incidente.
o Trebuie masurata intensitatea luminii ce trece printr-o solutie cat mai
asemanatoare cu cea pe care o analizam, dar care nu contine
substanta de interes solutie blank.
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Spectrofotometrul monofascicul/dublu fascicul

Monofascicul

Dublu fascicul

Schema dublu fascicul permite o analiza mult mai rapida, fara a mai fi
nevoie sa schimbam proba cu blank de fiecare data cand schimbam
lungimea de unda. Dezavantaj pret mai mare.
UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Parte experimentala
1. Trasarea spectrului de absorbtie pentru o solutie de colorant
alimentar Sunset Yellow (E110) in intervalul 400 700 nm prin
citirea absorbantei din 20 in 20 nm
2. Alegerea lungimii de unda la care absorbanta este maxima (lmax)
3. Masurarea absorbantei la aceasta lungime de unda pentru solutii
de Sunset Yellow de concentratie cunoscuta (3, 5, 10, 20, 30, 40
mM)
4. Trasarea dreptei de calibrare/etalonare A = f (c) si gasirea
parametrilor dreptei
5. Masurarea absorbantei unei solutii de Sunset Yellow de
concentratie necunoscuta la lmax
6. Aflarea concentratiei necunoscute prin interpolare pe dreapta de
calibrare

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Mod de lucru
1. Se porneste spectrofotometrul si se asteapta pana cand pe
ecran e afisata absorbanta.
2. Se selecteaza lungimea de unda la care se doreste citirea
absorbantei.
3. Deoarece spectrofotometrul din laborator este monofascicul, este
necesara aducerea absorbantei la 0 de fiecare data cand se
schimba lungimea de unda. Pentru aceasta se introduce o
cuva cu solventul probei (apa) si se apasa pe butonul ZERO.

4. Se introduce in spectrofotometru cuva cu solutia de interes si se

citeste absorbanta.

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Trasarea spectrului Sunset Yellow (E110)

Spectrul de absorbtie al Sunset Yellow se obtine prin reprezentarea A = f (l)

Gasirea maximului de absorbtie in

intervalul ales

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Trasarea dreptei de calibrare

A ( nm)

c (mM)

3
5

Ax

Almax

Parametrii dreptei y = a + bx se obtin cu

Excel / Origin sau cu ecuatiile :

N xy x y
N x x
2

c (mM)

X=?

y b x

a
N

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu

Observatii
1. Folosim pentru determinari cantitative numai absorbanta masurata
la o lungime de unda unde avem un maxim.
2. Legea Lambert-Beer e valabila cand se folosesc concentratii
molare sau normale.
3. Absorbanta este aditiva. Daca in solutie ar mai exista o alta specie
care sa absoarba la aceeasi lungime de unda ca si colorantul
nostru, absorbanta ar fi suma absorbantelor individuale date de
cele doua componente.
4. Metoda spectrofotometrica e sensibila pana la concentratii de ~ 1
ppm (1 mg/mL)

UMFCD - Biofizica

Spectrometrie - Dr. Octavian Clinescu