ENZIMOLOGIE APLICAT

Introducere
Considerat astzi de muli specialiti ca tiin de sine stttoare, enzimologia are
numeroase implicaii practice n cele mai diverse domenii ale activitii umane: medicin, industrie
(alimentar, textil i de medicamente), chimie analitic etc. n acelai timp, studiul enzimelor sub
toate aspectele prezint o importan deosebit din punct de vedere fundamental, contribuind la
nelegerea mecanismelor moleculare ce stau la baza transformrilor metabolice din celula vie i la
dezvoltarea altor tiine moderne i domenii interdisciplinare cum ar fi biologia molecular,
genetica i ingineria genetic, microbiologia, fiziologia animalelor, plantelor i microorganismelor,
biotehnologia i altele.

I. SCURT ISTORIC AL DEZVOLTRII ENZIMOLOGIEI

nc din antichitate se cunoteau diferite procese de transformare realizate de ctre
organismele vii, n special microorganisme (obinerea vinului, oetului, pinii etc.). Mult timp ns,
mecanismele moleculare ce stau la baza acestor procese, locul i rolul enzimelor n desfurarea lor
au rmas total necunoscute. Chiar i astzi, multe mecanisme de aciune ale enzimelor precum i
unele procese biochimice rmn nc neelucidate.
Primele noiuni tiinifice de enzimologie apar la nceputul secolului XIX ns dezvoltarea
rapid a acestei ramuri a biochimiei s-a realizat abia n ultimele decenii. innd cont de
multitudinea proceselor biochimice neelucidate nc, precum i de importana practic imens a
enzimelor (acestea constituind obiectul de studiu al unuia din domeniile prioritare ale
biotehnologiei) se poate afirma cu certitudine c i n secolul XXI enzimologia va cunoate o
dezvoltare spectaculoas.
Primele date tiinifice ce au condus mai trziu la definirea noiunii de enzim au aprut n
1833 cnd Persoz i Payen obin un principiu activ din extractele apoase de germeni de orz,
capabil s hidrolizeze amidonul. Prin precipitri repetate cu etanol, autorii reuesc s l purifice sub
forma unei pulberi, numind preparatul obinut diastaz (gr. = separare).
Dup formularea conceptului de cataliz de ctre Berzelius n 1834-1837, acesta sugereaz
c diferite fenomene biologice cum ar fi digestia i fermentaia pot fi realizate de unii catalizatori
specifici lumii vii. n perioada imediat urmtoare, aceast teorie a fost confirmat prin descoperirea
pepsinei gastrice, a emulsinei din migdale, lipazei i tripsinei pancreatice, invertazei din drojdii i a
altor enzime. Pentru toate aceste substane, Khun propune n 1877, denumirea de enzim care, n
limba greac nseamn n drojdii. n perioada respectiv se mai utiliza i termenul de ferment

2
(de la latinescul ferveo = fierbere), ns primul termen a fost treptat acceptat de marea majoritate a
cercettorilor.
n 1860 ncepe o disput tiinific ntre Pasteur i Liebig, nerezolvat timp de 37 de ani. n
aceast disput, Pasteur susinea noiunea de fermeni organizai, atribuit celulelor microbiene
integre capabile s realizeze procese fermentative, n timp ce Liebig utilizeaz noiunea de ferment
solubil pe care o atribuie principiului activ sintetizat de celulele vii i nu celulelor intacte. Teoria lui
Liebig a avut ctig de cauz, fiind confirmat n 1897 de ctre fraii Bchner care au demonstrat c
extractul acelular obinut din celule de Saccharomyces cerevisiae pstreaz ntreaga activitate
catalitic a celulelor din care a fost obinut.
La sfritul secolului XIX apare i prima teorie asupra mecanismului de aciune a enzimelor
i anume teoria lactului i a cheii elaborat de Fischer, conform creia, n procesul catalitic,
enzima recunoate substratul datorit unei similitudini structurale ntre molecula substratului i
centrul activ al enzimei, aceast asemnare fiind comparat cu cea existent ntre un lact i cheia
lui.
Chiar i dup elaborarea acestei teorii, structura chimic a enzimelor a rmas foarte mult
timp neelucidat. Astfel, ediia din 1929 a Enciclopediei Britanice arat c enzimele par a fi
proteine, dar aceasta nu este sigur.
n primii ani ai secolului XX se pun bazele cineticii enzimatice prin cercetrile lui Henri i
Brown, iar n 1913 se realizeaz prima exprimare matematic a cineticii reaciilor enzimatice cu un
singur substrat de ctre Michaelis i Menten. Studiile de cinetic enzimatic au fost ulterior
dezvoltate prin cercetrile unor biochimiti de frunte ai lumii: Haldane, Lineweaver, Burk, Chance,
Theorel, Dixon, Webb i alii.
Studiul structurii chimice a enzimelor a fost posibil abia dup elaborarea metodelor de
izolare i purificare a proteinelor n general i a enzimelor n special, din sursele biologice.
Din acest punct de vedere, o importan deosebit o prezint separarea, purificarea i
cristalizarea ureazei de ctre Sumner n 1926 i demonstrarea structurii ei proteice. A urmat o
perioad de intense cercetri cnd au fost cristalizate pepsina, tripsina, chimotripsina etc. Dup
1940, n paralel cu cercetrile de cinetic enzimatic, n aproape toate laboratoarele din lume s-au
efectuat experimente privind separarea i purificarea enzimelor din cele mai diferite surse biologice,
att de natur microbian ct i vegetal i animal.
Sfritul secolului XX este marcat de apariia i dezvoltarea unei noi direcii de cercetare n
enzimologie cu largi implicaii n biotehnologie imobilizarea enzimelor, organitelor celulare i a
celulelor ntregi pe suporturi solide. Biocatalizatorii heterogeni astfel obinui i-au gsit deja largi

3
aplicaii n medicin, industria alimentar i de medicamente, chimia analitic, epurarea apelor
reziduale i alte domenii ale activitii umane.

II. NOIUNI GENERALE

II.1 PROPRIETILE GENERALE ALE ENZIMELOR
Toate enzimele cunoscute pn n prezent sunt substane de natur proteic i ndeplinesc rol
de catalizatori ai transformrilor biochimice din celula vie. Fiind biocatalizatori, enzimele prezint
toate proprietile generale ale catalizatorilor chimici:
- mresc viteza reaciilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic prin scderea
energiei de activare i instalarea mai rapid a strii de echilibru;
- activitatea catalitic se manifest la concentraii mici, mediul de reacie coninnd
concentraii relativ mari de substrat;
- la sfritul transformrii se regsesc n mediu nemodificai din punct de vedere cantitativ i
calitativ.
Fiind

proteine,

enzimele

macromolecule. Din aceast cauz,

prezint

toate

proprietile

fizico-chimice

ale

acestor

metodele i tehnicile folosite n biochimia proteinelor n

general (separare, purificare, dozare etc.) se aplic i n enzimologie. Datorit faptului c acioneaz
n celula vie, enzimele mai prezint o serie de proprieti ce difereniaz net cataliza enzimatic de
cea chimic. n primul rnd, eficiena catalitic a enzimelor este cu mult mai mare comparativ cu
cea a catalizatorilor chimici. Enzimele acioneaz n condiii blnde de temperatur, pH, presiune
osmotic etc., spre deosebire de catalizatorii chimici care acioneaz n general, n condiii dure de
reacie.
Cea mai important proprietate a enzimelor, total nentlnit n cataliza chimic, o constituie
nalta specificitate de aciune a acestora, ceea ce nseamn c o enzim catalizeaz transformarea
unui singur substrat i doar n cazuri rare a unui grup restrns de substane nrudite structural. n
funcie de modul de manifestare, specificitatea de aciune a enzimelor poate fi de mai multe tipuri:
specificitate de reacie, de substrat, absolut de grup, relativ de grup, stereospecificitate etc.

SPECIFICITATEA DE REACIE
Specificitatea de reacie este tipul de specificitate cel mai des ntlnit i const n capacitatea
enzimelor de a cataliza un anumit tip de reacie biochimic. Aceast proprietate st la baza
clasificrii enzimelor n ase clase n funcie de tipul de reacie la care particip (vezi cap. II.2).

4
Astfel, o oxidoreductaz va cataliza un proces redox, o hidrolaz va scinda hidrolitic substratul, iar
o sintetaz va participa la o reacie n care se formeaz o nou legtur covalent carbon carbon
sau carbon heteroatom. O situaie aparte se ntlnete n cazul proteazelor care prezint
concomitent activitate peptidazic, amidazic i esterazic. Aceste enzime catalizeaz ns reacii de
scindare hidrolitic a peptidelor, a polipeptidelor, amidelor i esterilor, aceste reacii diferite avnd
loc n acelai centru activ, dup acelai mecanism de aciune.

SPECIFICITATEA DE SUBSTRAT
O alt proprietate a enzimelor care le difereniaz net de catalizatorii chimici o constituie
specificitatea de substrat care const n capacitatea de a cataliza transformarea unui singur substrat,
fiind total indiferente fa de alte substane, chiar dac sunt nrudite structural cu substratul. n
procesul catalitic, la formarea complexului enzim-substrat, enzima recunoate conformaia
structural a ntregii molecule de substrat, a unei grupri funcionale din aceasta sau o anumit
legtur chimic ce urmeaz a fi scindat. Acest tip de specificitate este condiionat de
complementaritatea structural (spaial i/sau electronic) dintre molecula substratului i a
centrului activ al enzimei.
n funcie de mecanismul de formare a complexului enzim-substrat, acest tip de
specificitate poate fi de mai multe feluri: specificitate absolut de substrat, specificitate relativ de
substrat, stereospecificitate etc.
a) Specificitatea absolut de substrat este ntlnit la acele enzime ce sunt capabile s
recunoasc structura chimic a unei singure specii moleculare, aceasta reprezentnd unicul substrat.
De exemplu, ureaza prezint o specificitate absolut de substrat, cataliznd reacia de scindare a
ureei:

H2N C NH2

H2O

ureaza

CO2

2 NH3

O
Ureaza este ns total inactiv fa de alte substane asemntoare structural cu ureea, sau
chiar fa de derivaii ureei. Cercetri recente atest faptul c ureaza ar putea totui cataliza i alte
transformri, aceste aspecte nefiind ns complet elucidate.
Exist un numr relativ mare de enzime implicate n reacii bimoleculare care prezint
specificitate absolut fa de un singur substrat sau fa de ambele substrate. Exist, de asemenea,
enzime care prezint grade diferite de specificitate n funcie de sursa biologic din care au fost
izolate.

5
b) Specificitatea relativ de substrat se ntlnete atunci cnd enzima manifest specificitate
fa de o anumit grup funcional din molecula substratului, sau fa de anumite legturi chimice
din structura acestuia, fiind indiferent fa de restul moleculei.
Un exemplu elocvent n acest sens l reprezint fosfomonoesterazele. Aceste enzime
recunosc legtura fosfoesteric, cataliznd hidroliza esterilor acidului ortofosforic cu alcoolii
primari, secundari i ciclici, precum i unii fosfoesteri ai glucidelor, mononucleotidelor . a.
c) Stereospecificitatea enzimelor se refer la capacitatea acestora de a recunoate un anumit
izomer geometric sau optic. Acest tip de specificitate este foarte des ntlnit, dat fiind faptul c
majoritatea compuilor bioorganici conin atomi de carbon asimetrici, putnd deci exista sub forma
celor doi antipozi optici.
Cu mici excepii, enzimele recunosc doar unul din cei doi enantiomeri. Aa se explic faptul
c n organismele vii se ntlnesc cu precdere monozaharidele aparinnd seriei D i respectiv Laminoacizii.
Exist situaii cnd o anumit enzim izolat dintr-o surs biologic este activ fa de un
anumit izomer optic, iar aceeai enzim izolat din alt surs recunoate antipodul optic al acestuia.
De exemplu lactat-dehidrogenaza din muchi este activ fa de izomerul levogir al acidului lactic:

NAD+
COOH
HO C H
CH3

NADH+H+
COOH
C O
CH3

L.D.H.

L(+)lactat

piruvat

Aceeai enzim izolat din Lactobacillus plantarum catalizeaz oxidarea acidului D(+)-lactic:
+

NAD

NADH+H

COOH
H C OH
CH3
D(+)lactat

COOH
C O
L.D.H

CH3
piruvat

Stereospecificitatea se manifest i n reaciile n care substratul are o molecul simetric, iar

produsul transformrii conine atomi de carbon chirali. n asemenea cazuri se realizeaz aa numita
sintez asimetric, adic se formeaz ntotdeauna un singur izomer optic i nu amestecul racemic

6
cum se ntmpl n sinteza chimic organic. De exemplu, prin carboxilarea propionil-CoA, care
este o substan optic inactiv, se formeaz ntotdeauna metil-malonil-CoA optic activ:
CO2

ATP

ADP + Pi

CH3

CH3

CH2
C S CoA

propionil-CoA-carboxilaza

H C COOH
C S CoA

propionil-CoA

metil-malonil-CoA

O clas special de enzime o constituie racemazele care acioneaz asupra ambilor

enantiomeri cu formare de amestecuri racemice. De exemplu alanin-racemaza poate aciona att
asupra L(+)-alaninei ct i D(-)-alaninei formnd amestecul racemic D,L-alanin:

COOH
H2N C H
CH3
L (+) alanin

COOH
H C NH2
CH3
L () alanin

II.2 NOMENCLATURA I CLASIFICAREA ENZIMELOR

II.2.1 NOMENCLATURA ENZIMELOR
Din punct de vedere chimic, enzimele pot cataliza reacii cu un singur substrat, respectiv cu
dou sau chiar mai multe substrate. Nomenclatura general a reaciilor enzimatice a fost conceput
pentru a descrie un numr de substrate i produi implicai n reaciile enzimatice, utiliznd
prefixele latine uni, bi, tri .a.m.d. cu referire la una, dou, trei sau mai multe specii moleculare. De
exemplu, o reacie care utilizeaz dou substrate pentru a produce doi produi este o reacie de tip
bi bi, o reacie la care particip trei substrate pentru a forma doi produi este o reacie de tip tri bi,
.a.m.d. (tabelul I).
Tabelul I
Tipuri de reacii enzimatice n funcie de numrul de substrate i produi de reacie

Schema reaciei
S P
S1 + S2 P
S1 + S2 P1 + P2
S1 + S2 + S3 P1 + P2

Tipul reaciei
Uni uni
Bi uni
Bi bi
Tri bi

7
Primele enzime descoperite au fost denumite dup criterii ntmpltoare, fiind utilizat, cel
mai adesea, adugarea sufixului aza la numele substratului a crei transformare o catalizeaz
(ureaza, amilaza, proteaza etc.). Dup descoperirea unui numr relativ mare de enzime, s-a
observat c exist mai multe proteaze, amilaze etc. Pe de alt parte, denumirile respective nu ddeau
nici o informaie asupra tipului de reacie, iar n unele cazuri (tripsina, pepsina, ficina, catalaza
etc.) nici asupra naturii chimice a substratului.
Din aceste motive s-a impus ca o necesitate obiectiv introducerea unui nou tip de
nomenclatur a enzimelor. Acest lucru a fost realizat prima dat n 1964 cnd Comisia de
Enzimologie a Uniunii Internaionale de Biochimie (IUB) elaboreaz normele ce stau la baza
nomenclaturii i clasificrii enzimelor. Conform acestor norme denumirea enzimelor trebuie s
reflecte numele substratului supus transformrii sau numele produsului de reacie i tipul de reacie
catalizat de fiecare enzim n parte, urmate de sufixul aza. De exemplu catalaza are denumirea
sistemic H2O2:H2O2-oxidoreductaza ceea ce nseamn c substratul reaciei este apa oxigenat
care sufer o reacie de oxidoreducere, o molecul de substrat reprezentnd donorul, iar cealalt
acceptorul de electroni. n mod similar celulaza are denumirea sistemic -1,4-glucanglucanohidrolaza, iar invertaza sau zaharaza se numete -fructofuranozid-fructohidrolaza.
Pentru unele enzime se pot utiliza i denumirile triviale atunci cnd acestea au intrat deja n
uz, iar modificarea lor ar genera confuzii (tripsina, pepsina, renina etc.).
Denumirile uzuale se mai folosesc i atunci cnd denumirile sistemice sunt prea lungi, iar
utilizarea repetat a acestora ar fi deranjant din punct de vedere stilistic. n asemenea cazuri ns
trebuie menionat cel puin odat denumirea tiinific nsoit de codul numeric al enzimei dup
care se poate folosi denumirea trivial.
II.2.2 NOMENCLATURA PRECURSORILOR ENZIMATICI
Multe enzime sunt sintetizate n organismele vii sub forma unor precursori inactivi pentru
care IUB a propus denumirea de preenzime, fiind ns des utilizate i denumirile de proenzime,
respectiv zimogene. n funcie de locul de aciune, acestea pot fi transportate prin diferite
mecanisme la esutul sau organul unde vor aciona, aici fiind transformate n enzime active din
punct de vedere catalitic. De regul, aceast activare are loc prin clivarea unui fragment din
molecula zimogenului, fragment ce blocheaz activitatea proenzimei.
Sensul biologic al biosintezei unor enzime sub forma zimogenelor lor poate fi diferit. Pe de
o parte, este posibil ca aceste forme inactive s reprezinte una din modalitile de stopare a unor
transformri biochimice atunci cnd necesitile metabolice o cer, iar pe de alt parte este

8
mpiedicat aciunea enzimelor asupra constituenilor celulari ai esutului sau organului care le-a
sintetizat, aa cum se ntmpl n cazul proteinazelor digestive.
n funcie de denumirea enzimei active, nomenclatura zimogenelor se face prin adugarea
prefixelor pre- sau pro-, respectiv a sufixului -ogen la numele enzimei ce ia natere prin activarea
zimogenului respectiv: pepsinogen, tripsinogen, procarboxipeptidaza, prorenin etc.
II.2.3 CLASIFICAREA ENZIMELOR
Odat cu creterea numrului de enzime descoperite i studiate sub aspectele structurii lor
chimice i mecanismului reaciei catalizate, a aprut necesitatea unei clasificri tiinifice a acestora.
Astzi este valabil clasificarea propus n 1964 de ctre Comisia de Enzimologie a Uniunii
Internaionale de Biochimie care are la baz tipul i mecanismul reaciei catalizate (fig. 2).
Conform acestui criteriu, enzimele cunoscute pn n prezent se clasific n ase clase
principale, enzimele cuprinse ntr-o clas cataliznd acelai tip de reacie:
1) oxidoreductazele - enzime ce catalizeaz reaciile de oxidoreducere ce au loc n
organismele vii;
2) transferazele - enzime ce catalizeaz reacii de transfer ale unor grupe de atomi ce pot fi
i grupe funcionale de la un substrat la altul, fr ca aceste grupri s existe libere n timpul
procesului;
3) hidrolazele - enzime ce catalizeaz scindarea diferitelor legturi covalente din molecula
substratului cu participarea moleculelor de ap;
4) liazele - enzime ce catalizeaz reacii de adiie a unor grupe de atomi la molecula
substratului sau clivarea acestor grupri cu rearanjarea ulterioar a valenelor;
5) izomerazele - enzime care catalizeaz diferite reacii de izomerizare a substratelor;
6) ligazele sau sintetazele - enzime ce catalizeaz formarea unor noi legturi chimice carbon
carbon sau carbon heteroatom, n majoritatea cazurilor utilizndu-se energia stocat n legturile
macroergice ale moleculelor de ATP.
La rndul lor enzimele din fiecare clas se mpart n subclase i subsubclase, n funcie de
mecanismul de reacie, natura cofactorului, tipul de legtur chimic din substrat asupra creia
acioneaz etc. n cadrul fiecrei subsubclase, enzimele sunt aranjate ntr-o anumit ordine, n
special cronologic (cartea cu nomenclatura enzimelor).
Conform acestei clasificri, fiecare enzim este caracterizat nu numai de o denumire ci i
de un cod specific format din patru cifre: prima cifr reprezint clasa, a doua subclasa, a treia cifr
arat subsubclasa, iar ultima cifr a codului indic numrul de ordine din subsubclasa respectiv.

9
Acest cod este precedat de prescurtarea E.C. (Enzyme Commission). De exemplu,
denumirea corect i complet a catalazei este H2O2: H2O2-oxidoreductaza (EC 1.11.1.6), iar cea a
enzimei cu denumirea trivial dihidroorotaza este L-5,6-dihidroorotat-amidohidrolaza (EC
3.5.2.3).
II.2.3.1 Caracterizarea clasei oxidoreductazelor
Din numrul total de enzime cunoscute pn n prezent, aproximativ 25 % sunt enzime ce
catalizeaz diferite reacii de oxidare i reducere biologic, aparinnd clasei oxidoreductazelor.
Acestea sunt implicate, n principal, n procesele de oxidare biologic i catalizeaz reacii
bimoleculare:

Aox + Bred

Ared + Box

Denumirea sistemic a oxidoreductazelor se alctuiete prin includerea denumirii donorului

i acceptorului de hidrogen urmate de termenul oxidoreductaza (donor:acceptor-oxidoreductaza).
Atunci cnd acceptorul de hidrogen este oxigenul, se folosete termenul de oxidaz. De exemplu,
denumirea sistemic a alcooldehidrogenazei este alcool:NAD+ - oxidoreductaza (EC 1.1.1.1),
catalaza are denumirea sistemic H2O2:H2O2-oxidoreduc-taza (EC 1.11.1.6). n acelai timp,
Uniunea Internaional de Biochimie permite i utilizarea aa-numitelor denumiri de lucru
prescurtate: alcooldehidrogenaza, malat - dehidrogenaza etc.
O enzim important din aceast clas este lactat - dehidrogenaza (L-lactat:NAD+oxidoreductaza EC 1.1.1.27) ce catalizeaz reacia de conversie a acidului lactic n acid piruvic:
+

NAD
COOH
H C OH
CH3

NADH+H

COOH
C O
L.D.H

D(+)lactat

CH3
piruvat

Aceast reacie este implicat n fermentaiile lactice precum i n procesul anaerob de

degradare a glucidelor prin glicoliz. Determinarea activitii acestei enzime n snge este utilizat
n practica medical pentru diagnosticul infarctului de miocard, a hepatitei virale, a anemiei
pernicioase etc.
+
Reaciile enzimatice
catalizate de oxidoreductaze
coenzim NAD +
NADcare posed n calitate de
GliceraldehidAcetaldehid

-3-fosfat

sau NADP+ sunt de obicei reacii reversibile i sunt cuplate cu alte reacii de regenerare a
Alcool-dehidrogenaza

Gliceraldehidfosfatdehidrogenaza

Acid 1-3-difosfogliceric

NADH+H

Etanol

10
coenzimei. n prima reacie coenzima, care are i rol de cosubstrat, se reduce, iar n reacia cuplat
(conjugat) se regenereaz forma oxidat a coenzimei:

Aceste reacii conjugate prezint o deosebit importan pentru procesele redox ce au loc n
celulele vii deoarece permit refacerea continu a acceptorilor de hidrogen.
II.2.3.2 Caracterizarea clasei transferazelor
n transformrile biochimice catalizate de enzimele aparinnd acestei clase, are loc clivarea
unei grupe de atomi R (ce poate fi i grupare funcional) din structura substratului A-R i fixarea
acesteia pe cel de-al doilea substrat:

A R + B

transferaz

A +

B R

Reaciile catalizate de transferaze sunt prin urmare reacii bimoleculare, n care un substrat
joac rol de donor, iar cellalt rol de acceptor al gruprii transferate. Din aceast cauz, denumirea
sistemic a acestor enzime este de tipul donor:acceptor-transferaza.
Dintre enzimele cunoscute pn n prezent, aproximativ 30% sunt transferaze. Din aceast
clas de enzime fac parte, de exemplu aminotransferazele, enzime ce catalizeaz reacia unui aminoacid cu un -cetoacid, conducnd la formarea unui nou aminoacid i a unui nou cetoacid. Din
punctul de vedere al mecanismului de reacie, aceast transformare poate fi considerat ca fiind o
dezaminare oxidativ a donorului (aminoacidul) cuplat cu aminarea reductiv a acceptorului
(cetoacidul) iar aminotransferazele ar putea fi considerate i ca oxidoreductaze:
COOH
H C NH 2
R1

-Aminoacid I

COOH

COOH

C=O

H C NH 2

COOH

C=O

Aminotransferaz
R2

R2

-Cetoacid I

-Aminoacid II

R1

-Cetoacid II

II.2.3.3 Caracterizarea clasei hidrolazelor

Aceast clas conine aproximativ 24 % din enzimele cunoscute pn n prezent, enzime ce
catalizeaz reacia de scindare a substratului cu participarea apei:
S R + H2O

S OH + R H

11
Dei reaciile sunt reversibile, in vivo echilibrele sunt deplasate n sensul hidrolizei, n timp
ce procesele inverse au loc, de regul, pe alte ci metabolice. Reacii hidrolitice se ntlnesc n
aproape toate cile metabolice, hidrolazele participnd att la metabolismul glucidelor, lipidelor i
proteinelor, ct i n metabolismul produilor secundari.
Clasificarea hidrolazelor n subclase i subsubclase se face n funcie de natura legturii
chimice ce urmeaz a fi scindat. Pentru hidrolazele implicate n scindarea hidrolitic a diferitelor
tipuri de esteri este intrat n uz denumirea generic de esteraze. O esteraz foarte cunoscut este
lipaza a crei denumire sistemic este triacilglicerol-acil-hidrolaza (EC 3.1.1.3) i care este
implicat n scindarea hidrolitic a triacilglicerolilor:

CH 2 O CO R1
lipaza
CH O CO R2 + 3 H 2O
CH 2 O CO R3
triacilglicerol

CH2 OH
CH OH
CH2 OH

R1 COOH
R2 COOH
R3 COOH

acizi grasi
,

glicerol

Spre deosebire de celelalte enzime, lipaza prezint o particularitate legat de natura

substratului asupra cruia acioneaz, mai exact a lipidelor care sunt insolubile n ap. In vivo are
loc mai nti o emulsionare a grsimilor (care n cazul animalelor se realizeaz cu ajutorul bilei
secretat de ficat) i n felul acesta crete suprafaa de contact dintre faza liposolubil a substratului
i cea hidrosolubil a enzimei. Din aceast cauz, viteza iniial de reacie este dependent de
numrul de molecule enzimatice adsorbite la interfaz, fiind, n general, mic. Ulterior, dup
formarea primelor molecule de acizi grai, viteza de reacie crete datorit emulsionrii mai rapide a
substratului, moleculele de acizi grai avnd zone cu proprieti hidrofobe i hidrofile (R-COO).
Din aceeai clas fac parte cele dou fosfomonoesteraze (fosfataze), alcalin i acid cu
denumirile sistemice ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim alcalin) (EC 3.1.3.1) i
respectiv ortofosfat-monoester-fosfohidrolaza (pH optim acid) (EC 3.1.3.2). Fosfataza alcalin
catalizeaz scindarea hidrolitic a esterilor acidului ortofosforic ai alcoolilor primari, secundari i
ciclici, fenolilor etc., dar nu i fosfodiesterii. Fosfataza acid hidrolizeaz un mare numr de
fosfomonoesteri, fosfoproteine i altele:

CH 2 OH
CH O PO 3H2
CH 2 OH
- Glicerofosfat

H2O

CH 2 OH
CH OH

fosfataz
CH 2 OH
Glicerol

H3PO4

12
Aceste dou enzime prezint o importan deosebit i din punct de vedere medical,
activitatea lor fiind determinat n snge n scopul diagnosticrii litiazelor biliare i a diferitelor
afeciuni hepatice, respectiv a unor boli ale prostatei.
Un rol extrem de important n procesul complex de rennoire a proteinelor structurale l
joac o serie de proteinaze tisulare reunite sub numele de catepsine. n prezent se cunosc mai multe
catepsine notate cu majuscule ale alfabetului latin (A, B, C, D, E etc.) ce se deosebesc ntre ele dup
specificitatea de substrat, pH-ul optim de aciune i alte criterii.
O grup de enzime proteolitice extrem de intens studiat n ultima vreme o reprezint
caspazele (cysteinil aspartate cleaving proteases), cistein-proteinase responsabile de
distrugerea progresiv a celulei prin apoptoz.
Moartea celular programat este parte integrat a fiziologiei normale a unui organism.
Astfel, n cursul numeroaselor mitoze i diferenieri celulare care permit crearea unui organism
pornind de la stadiul de ou, este necesar eliminarea celulelor inutile sau potenial periculoase.
Acest fenomen de eliminare selectiv a celulelor este mediat printr-un proces denumit apoptoz
(termenul provine de la grecescul , ce nseamn cderea frunzelor).
Noiunea de apoptoz a fost introdus n 1972 de ctre Kerr i et al.. pentru a indica o form
de moarte celular total diferit de necroz att din punct de vedere morfologic ct i biochimic.
Apoptoza se ntlnete la toate tipurile de celule vegetale sau animale, uni- sau pluricelulare, pn la
nivelul mamiferelor superioare.
O dereglare de la moartea celular programat poate sta la originea numeroaselor stri
patologice; unele sunt legate de o inhibiie a apoptozei (cancer, sindrom limfoproliferativ etc), n
timp ce altele sunt asociate cu o stimulare a acestui fenomen (SIDA, maladiile neurodegenerative,
maladiile auto-imune etc.).
n cursul apoptozei, celulele pun n eviden un mecanism de sinucidere care se traduce
prin numeroase schimbri morfologice: membranele plasmatice se dezorganizeaz i exprim
semnale pro-fagocitare alctuind corpii apoptotici, cromatina se condenseaz nainte de a fi
degradat ntr-un profil caracteristic numit treptele scrii. Corpii apoptotici formai sunt apoi
rapid eliminai de ctre celulele adiacente. Aceast eliminare este primordial deoarece ea nu
permite lsarea nici unei urme n esutul unde survine apoptoza, n particular, previnenind toate
necrozele secundare care vor avea drept consecin eliberarea aleatorie a coninutului celular i va
permite astfel limitarea stabilirii unei reacii inflamatorii.
Necroza i apoptoza. Necroza este considerat ca o moarte celular dezordonat. n fapt n
cursul necrozei celulele acumuleaz ap astfel nct antreneaz liza membranei plasmatice. Aceast
veritabil explozie celular conduce la redetaarea n mediul nconjurtor a coninutului

13
citoplasmatic. Organitele vor avea, de asemenea, tendina de a se gonfla, iar ADN-ul nuclear va fi
degradat n manier aleatorie de endoglucanaze activate (mai ales serin-proteinaze). n opoziie
cu necroza, apoptoza este considerat ca o moarte celular ordonat, acionnd n diferite faze.
Mai nti celulele n apoptoz vor fi izolate de alte celule (dispare contactul ntre celule).
Unul din punctele morfologice caracteristice al apoptozei este importana condensrii
simultane a nucleului i a citoplasmei ce induce o diminuare semnificativ a volumului celular.
Mitocondriile celulelor apoptotice vor suferi mai multe modificri majore, dintre acestea amintim
detaarea citocromului c n citoplasm, diminuarea potenialului membranar i modificarea
permeabilitii mitocondriale care permite deschiderea porilor specializai.
Nucleul se condenseaz, apoi cromatina este clivat n fragmente regulate de aproximativ
180 pb. Membrana plasmatic va nmuguri i va conduce la formarea corpilor apoptotici
renchiznd o parte din citoplasm n celul. n scopul de a facilita recunoaterea corpilor apoptotici
prin fagocitoz, celulele vor semnala starea lor apoptotic graie schimbrilor de localizare a
moleculelor de fosfatidilserin care trec de la o orientare citoplasmatic la una extracelular.
Moartea celular programat este un proces rapid cteva ore. Unul din punctele majore ale
apoptozei este integritatea membranei plasmatice care nu este niciodat alterat n cursul
procesului, ceea ce permite evitarea deversrii coninutului celular i astfel, prevenirea tuturor
deteriorrilor esuturilor din jur. Totui, inflamarea nu este total absent n timpul apoptozei (avnd
n vedere externalizarea IL-1 i IL -18 n mediul nconjurtor) ns este vorba de o inflamare
regulat.
II.2.3.4 Caracterizarea clasei liazelor
Din aceast clas fac parte enzimele ce catalizeaz reacii de rupere a unor legturi carboncarbon sau carbon-heteroatom din molecula substratului, fr participarea apei, cu rearanjarea
ulterioar a valenelor. Pentru majoritatea enzimelor din aceast clas, denumirea sistemic se face
prin adugarea termenului liaza la numele substratului asupra cruia acioneaz enzima respectiv.
Atunci cnd reacia invers este mai important din punct de vedere metabolic, sau atunci cnd s-a
demonstrat doar existena acesteia, se poate utiliza i denumirea de sintaz (dar nu sintetaz).
Pentru liazele ce catalizeaz unele reacii particulare, sunt utilizate denumirile triviale:
decarboxilaz, aldolaz, dehidrataz etc.
Dintre enzimele cunoscute pn n prezent, liazele reprezint aproximativ 13 %. mprirea
liazelor n subclase se face n funcie de natura legturii chimice pe care acestea o scindeaz. Astfel,
subclasa 4.1. cuprinde enzimele ce catalizeaz ruperea legturilor carbon-carbon: decarboxilazele

14
(4.1.1), aldehid-liazele (4.1.2), hidroxiacid-liazele (4.1.3) etc. n mod similar, subclasa 4.2. conine
carbon-oxigen-liazele, subclasa 4.3. - carbon-azot-liazele .a.m.d.
O categorie important de enzime din aceast clas o reprezint aldolazele, enzime ce
catalizeaz diferite reacii de condensare aldolic. Astfel, fructozo-difosfat-aldolaza, a crei
denumire sistemic este D-fructozo 1 , 6 difosfat D gliceraldehid 3 fosfat - liaza (EC
4.1.2.13) catalizeaz o reacie important a cii glicolitice i a fotosintezei:

O CH2 O

CH2 O

D-frutozo1,6-difosfat

CH2 O P
C O
CH2 OH
dihidroxiacetonfosfat

H C O
H C OH
CH2 O

D-gliceraldehidfosfat

II.2.3.5 Caracterizarea clasei izomerazelor

Aceast clas reunete aproximativ 3% din enzimele cunoscute pn n prezent, enzime ce
catalizeaz diferite reacii de izomerizare. Procesul catalitic propriu-zis const n inducerea unor
rearanjri interne ale atomilor din molecula substratului n urma crora au loc modificri geometrice
sau structurale. n funcie de tipul reaciei de izomerizare catalizat, izomerazele pot fi mprite n
racemaze, epimeraze, cis-trans-izomeraze, tautomeraze etc.
Este cunoscut faptul c marea majoritate a organismelor vii conin monozaharidele
aparinnd seriei D, respectiv L-aminoacizii. Deoarece unele microorganisme conin i antipozii
optici ai acestor compui, pentru acestea racemazele joac un rol deosebit. Astfel, au fost
descoperite i studiate alanin-racemaza (EC 5.1.1.1), metionin-racemaza (EC 5.1.1.2), glutamatracemaza (EC 5.1.1.3) etc.
Dou izomeraze extrem de importante pentru participarea vitaminei A n procesul vederii
sunt retinal-izomeraza cu denumirea sistemic all-trans-retinal-11-cis-trans-izomeraza (EC
5.2.1.3) i respectiv retinol-izomeraza, sau all-trans-retinol-11-cis-trans-izomeraza (EC 5.2.1.7) ce
catalizeaz conversia formei trans a retinalului n izomerul 11-cis i respectiv izomerul trans al
retinolului n forma 11-cis.

15
O etap important a secvenei metabolice Embden-Meyerhof-Parnas o constituie
izomerizarea reversibil a celor dou trioze fosforilate rezultate prin scindarea fructozo-1,6difosfatului sub aciunea aldolazei. Sub aciunea triozo-fosfat-izomerazei are loc conversia
permanent a dihidroxiaceton-fosfatului n aldehida 3-fosfogliceric. Denumirea sistemic a
enzimei este D-gliceraldehid-3-fosfat-cetol-izomeraza (EC 5.3.1.1).
CH2 O
P
C O
CH2 OH

H
H

dihidroxiacetonfosfat

C O
C OH
CH2 O

D-gliceraldehidfosfat

II.2.3.6 Caracterizarea clasei ligazelor (sintetazelor)

Aceast clas cuprinde aproximativ 5% din enzimele cunoscute pn n prezent, liazele
cataliznd reacii de formare a unor noi legturi carbon-carbon sau carbon-heteroatom. De regul,
aceste reacii au loc cu consum de energie, ele fiind cuplate cu reacii de hidroliz ale ATP-ului sau
ale altor nucleozidtrifosfai. Denumirea sistemic se face prin adugarea termenului ligaza la
numele substratului, sau a termenului sintetaza la numele produsului de reacie.
O grup important de enzime ce fac parte din aceast clas o constituie aminoacil-ARNtsintetazele, enzime ce catalizeaz reaciile de activare ale aminoacizilor din procesul de biosintez a
proteinelor. Aceste enzime prezint o nalt specificitate de substrat, existnd cte o sintetaz pentru
fiecare aminoacid proteinogen: tirozil-ARNt-sintetaza sau L-tirozin-ARNttyr-ligaza (EC 6.1.11),
triptofan-ARNt-sintetaza cu denumirea sistemic L-triptofanil-ARNttrp-ligaza (EC 6.1.1.2),
treonin-ARNt-sintetaza sau L-treonil-ARNtthr- ligaza (EC 6.1.1.3) .a.m.d.
Formarea complexului aminoacil-ARNt este un proces complex ce se realizeaz n dou
etape catalizate de aceeai enzim. Procesul debuteaz prin activarea aminoacidului cu ajutorul
energiei din ATP:

ATP

PPi

H2NCHCOOH
R
aminoacid

O
E [H2NCHC ~ OAMP]

aminoacil-ARNt -sintetaza

R
aminoacil-AMP
(complex ES)

16
Se formeaz deci complexul hiperreactiv dintre enzim i dou din cele trei substraturi,
adic aminoacidul ce urmeaz a se activa i molecula de ATP. Acest complex interacioneaz n
etapa urmtoare cu cel de-al treilea substrat care este ARNt ul specific aminoacidului activat:

ARN t

Enzim

E [H2NCHC ~ OAMP]
R

AMP

H2NCHC ~ ARN t
aminoacil-ARNt -sintetaza

aminoacil-AMP
(complex ES)

R
aminoacil-ARN t

II.3 STRUCTURA CHIMIC A ENZIMELOR

Toate enzimele cunoscute pn n prezent, fr excepie, sunt de natur proteic. Din punct
de vedere structural, enzimele pot fi clasificate n dou mari grupe: enzime monocomponente i
enzime bicomponente.
Enzimele monocomponente sunt holoproteine, ceea ce nseamn c moleculele acestora
sunt formate din una sau mai multe catene polipeptidice.
Enzimele bicomponente sunt heteroproteine (proteine complexe sau proteine conjugate) i
conin, n afar de componenta polipeptidic i o component de alt natura, neproteic, numit
cofactor enzimatic. Componenta proteic a enzimelor bicomponente poart numele de apoenzim.
Legarea cofactorului de apoenzim se face n mod diferit. Atunci cnd ntre cele dou
componente iau natere legturi relativ slabe, necovalente, cofactorul poart numele de coenzim,
iar dac legarea se face puternic, prin legturi covalente, componenta neproteic se numete
grupare prostetic. Nu se poate face o delimitare net ntre cele dou noiuni, deoarece se ntmpl
uneori ca acelai cofactor enzimatic s fie coenzim pentru unele enzime i grupare prostetic
pentru altele.
Pentru enzimele bicomponente, cofactorul enzimatic este implicat direct n realizarea actului
catalitic, n timp ce apoenzima este rspunztoare n primul rnd de specificitatea de aciune. Acest
aspect este ilustrat foarte sugestiv de Hugo Theorell, care arat: este fascinant s gndeti c
natura folosete coenzimele aa cum un dulgher utilizeaz uneltele sale. Dulgherul poate folosi
acelai fel de cuie i ciocane pentru a produce tot felul de lucruri. Dulgherul ar corespunde
proteinelor care pot face uz de una i aceeai coenzim pentru o larg varietate de scopuri. De
ceea, natura a fost n stare s se limiteze ea nsi la folosirea unui numr mic de compui chimici
pentru funciile de coenzime.

17

II.3.1 Aminoacizii - uniti structurale de baz ale enzimelor

II.3.2 Structura enzimelor

n procesul biosintezei proteice la nivelul ribosomilor are loc formarea de legturi peptidice
ntre resturile de aminoacizi a cror succesiune n catena polipeptidic este determinat genetic.
Acestea sunt legturi amidice secundare, cu caracter parial de dubl legtur:

H
C

O
I

II

Datorit fenomenului de conjugare,

H atomii implicai n legtura peptidic sunt coplanari, n

forma trans:
C.... N

..

Aceasta nseamn c legtura peptidic C N nu este simpl ci parial dubl, fiind astfel
mpiedicat rotaia liber a substituenilor. Acest caracter de legtur parial dubl are o
importan deosebit pentru structurile de ordin superior ale proteinelor.
La nivelul legturilor peptidice se ntlnete izomeria de tip trans, iar rotaia liber este
permis numai la nivelul celorlalte legturi covalente. Orientarea spaial a catenelor
polipeptidice este datorat, n principal, acestor rotaii libere n jurul legturilor menionate.
Fiind proteine, enzimele prezint aceeai organizare structural specific tuturor proteinelor
caracterizat prin structur primar, secundar, teriar i cuaternar.
Structura primar este dat de numrul, natura i succesiunea resturilor de aminoacizi din
catena polipeptidic. Acest nivel de organizare structural nu ine cont deci de aranjamentele
spaiale ale catenei polipeptidice:

H2N CH C N CH C
R1
H R2
capt N-terminal

N CH COOH
H Rn
capt C-terminal

18

n structura primar, resturile de aminoacizi sunt unite prin legturi peptidice identice cu
cele ntlnite n structura peptidelor:

legtur peptidic

...... NH CH CO NH CH CO ......
R1

R2

Studiul peptidelor sintetice cu ajutorul metodei difraciei de raze X prin cristale pure a
permis determinarea distanelor interatomice ntr-o caten polipeptidic, precum i a unghiurilor
dintre atomii componeni. Aceste determinri au demonstrat existena unei perioade de identitate
de 7,2 pentru fiecare dou resturi de aminoacizi. Totodat s-a observat c distana interatomic
C N este mai mic, iar distana C = O este mai mare dect cele normal ntlnite n ali compui..
innd cont de unghiurile optime de valen i de punile de hidrogen ce se stabilesc ntre
componentele legturilor peptidice, se poate concluziona c moleculele polipeptidice nu sunt
filiforme ci ocup un aranjament spaial care determin structura secundar. Acest nivel de
organizare structural se poate materializa n dou moduri: structura helicoidal ( -helix) generat
de formarea punilor de hidrogen ntre oxigenul carbonilic al unui rest de aminoacid i hidrogenul
iminic al altui rest de aminoacid din aceeai caten polipeptidic i respectiv structura -pliat
cnd legturile de hidrogen se formeaz ntre aceeai atomi, dar sunt intercatenare.
n acest din urm caz, straturile -pliate pot avea structur paralel (cnd o extremitate a
moleculei conine capetele N-terminale, iar cealalt capetele C-terminale ale catenelor
polipeptidice), sau antiparalel (fiecare extremitate conine att capete N-terminale ct i Cterminale).
Structura -helicoidal. Studiul proteinelor fibrilare din clasa scleroproteinelor prin
metoda difraciei razelor X a evideniat faptul c acestea se caracterizeaz prin prezena unor
regulariti structurale ale moleculei, prin uniti care se repet i care sunt dispuse de-a lungul
unui ax imaginar al moleculei.
Aceste regulariti n structura moleculei au fost numite perioade de identitate i ele difer
de la o protein la alta.
n funcie de mrimea perioadelor de identitate, proteinele se mpart n trei grupe:
grupa keratinei, miozinei i fibrinogenului cu perioada de identitate 5,1 5,4 ;

19
grupa keratinei i fibroinei cu perioada de identitate de 6,5 7,0 ;
grupa colagenului cuprinde proteine a cror perioad de identitate este cuprins ntre
2,8 2,9 .
Efectund experimente pe cristale peptidice, Pauling i Corey au stabilit cu rigurozitate
condiiile formrii catenelor polipeptidice i au constituit modele experimentale care s ilustreze
modul n care catenele polipeptidice sunt orientate n spaiu n funcie de natura i numrul
legturilor peptidice, precum i de dimensiunile lor. Autorii au stabilit de asemenea, urmtoarele
criterii care stau la baza formrii catenelor polipeptidice:
aminoacizii constitueni trebuie s prezinte configuraie L i au n structura proteinelor
aceeai valoare, deoarece catenele lor laterale nu influeneaz structura secundar;
distanele interatomice i unghiurile de valen trebuie s prezinte aceleai valori,
indiferent de mrimea catenei polipeptidice;
atomii participani la legtura peptidic trebuie s fie coplanari, aceast aezare fiind
favorizat energetic;
modelul experimental elaborat pe baza datelor de laborator trebuie s permit formarea
unui numr maxim posibil de legturi de hidrogen.
Pe baza acestor postulate, Pauling i Corey gsesc c cel mai simplu aranjament
corespunztor acestor cerine este modelul helicoidal sau spiralat, denumit -helix. Acesta
rezult prin spiralizarea catenei polipeptidice n jurul unui cilindru imaginar. (?).
n funcie de direcia de spiralizare, -helixul poate s apar teoretic sub dou forme:
-helixul de dreapta are sensul unui urub cu pasul spre dreapta;

-helixul de stnga are sensul unui urub cu pasul spre stnga.

Catenele laterale ale resturilor de aminoacizi ies n afara corpului propriu-zis al -helixului
i pot interaciona ntre ele sau cu solventul n care este dizolvat proteina.
Dintre toi aminoacizii proteinogeni, prolina, hidroxiprolina i chiar glicocolul nu se
ncadreaz perfect n -helix, determinnd o deranjare a structurii regulate a acestuia. Aceast
structur helicoidal a macromoleculelor proteice a fost postulat cu 16 ani naintea lui Pauling i
Corey de ctre biochimistul romn Haralamb Vasiliu.
Aezarea spaial, care confer moleculei o arhitectur structural special, este meninut
datorit formrii unui mare numr de puni de hidrogen intracatenare la care particip oxigenul

20
carbonilic din vecintatea unei legturi peptidice i hidrogenul iminic din vecintatea alteia,
situat la o distan de 4 resturi de aminoacizi. Aceste puni de hidrogen sunt aproape paralele cu
axul moleculei deoarece ntr-o spir intr 3,6 resturi de aminoacizi.
Distana dintre dou spire succesive este de 5,41 , iar diametrul lor este de 0,101 . Dup
un interval al -helixului care cuprinde 18 resturi de aminoacizi, adic 27 , -helixul este
superpozabil, adic se repet identic dup fiecare 5 spire. Acest interval reprezint aa-numita
perioad mare de identitate (perioada mic de identitate fiind reprezentat de secvena NH
*

CH CO ).
Modelul helicoidal a fost apoi confirmat experimental i reprezint una din variantele

structurii secundare a proteinelor. Multe date experimentale demonstreaz ns faptul c proteinele

native nu prezint o structur secundar total sau perfect spiralat. Cele mai multe proteine
prezint o organizare structural parial helicoidal, n sensul c regiuni cu structur de -helix
pot alterna cu regiuni ce prezint alt tip de structur secundar. Procentul de -helix n structura
proteinelor oscileaz ntre: 0 10% n cazein, actin i -globulin, 10 20% n ribonucleaz, 20
30% la pepsin i histone, 30 45% la ovalbumin, muramidaz i fibrinogen, 60 80% la
mioglobin i hemoglobin i respectiv 80 100% n tropomiozin.
Structura -pliat. Datorit structurii lor chimice, prolina i hidroxiprolina nu se nscriu n
structura -helicoidal. Aceti doi aminoacizi heterociclici, dar i glicocolul, tind s confere
catenelor polipeptidice un alt tip de structur secundar, denumit -conformaie, care
corespunde modelului straturilor pliate.
Conform acestui model, dou sau mai multe catene polipeptidice, sau fragmente ale
aceleiai catene se orienteaz spaial sub form pliat, n zig-zag (fig. 20).
Modelul straturilor pliate se poate prezenta n dou variante:
modelul straturilor pliate paralele (caracteristic de exemplu pentru -keratin) se
ntlnete atunci cnd la o extremitate a moleculei sunt orientate capetele C-terminale, iar la
cealalt, capetele N-terminale ale catenelor polipeptidice;
modelul straturilor pliate antiparalele (ntlnit de exemplu la fibroin) se caracterizeaz
prin faptul c la ambele extremiti ale moleculei capetele C-terminale ale catenelor polipeptidice
alterneaz cu cele N-terminale. n mod automat, atunci cnd structura -pliat este format de
diferite fragmente ale aceleiai catene polipeptidice, aceasta va fi de tip antiparalel.
Structura -pliat este stabilizat de puni de hidrogen care se formeaz n mod similar ca
n cazul structurii helicoidale, dar care sunt intercatenare i perpendiculare pe axul moleculei.
Dac la -helix radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi sunt orientai spre exterior, n

21
structura -pliat ei se orienteaz de o parte i de alta a planului legturii peptidice, perpendicular
pe acesta.
Exist foarte puine proteine (enzime) a cror structur s fie exclusiv -helicoidal sau
exclusiv -pliat. Marea majoritate a proteinelor prezint structuri secundare n care unul sau mai
multe fragmente -helicoidale alterneaz cu unul sau mai multe fragmente -pliate. De regul,
punctele de trecere de la fragmentele helicoidale la cele pliate i invers sunt reprezentate de
resturile de prolin i hidroxiprolin i uneori de cele de glicin, aminoacizi care, din cauza
structurii lor chimice, nu se nscriu n nici una din aceste dou forme structurale.
n funcie de numrul de fragmente helicoidale i pliate, structurile secundare ale
proteinelor (enzimelor) pot fi de mai multe tipuri: etc.
Structura teriar a macromoleculelor de protein-enzime este dat de superspiralizarea
catenei (catenelor) polipeptidice ntr-o structur spaial complex sub form de ghem (globul).
Superspiralizarea este generat de formarea punilor disulfidice ntre resturi de cistein aflate n
locuri total diferite ale catenei polipeptidice. Majoritatea proteinelor native au o structur spaial
compact determinat de dimensiunile i polaritatea resturilor de aminoacizi precum i de
succesiunea acestora n catenele polipeptidice componente.
Acest nivel de organizare structural reprezint deci rezultatul interaciunilor dintre
resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice. Structura teriar este definit ca fiind forma
structural ce rezult prin superspiralizarea a dou sau mai multe catene polipeptidice ce conin
fragmente -helicoidale i -pliate ntr-o arhitectur spaial complex sub form de ghem sau
globul, fiind deci direct dependent de nivelul primar i secundar de organizare structural.
Formarea unei structuri globulare native, caracteristic pentru o protein dat este un
proces complex ce are la baz formarea unei multitudini de legturi slabe, necovalente.
Principalele proteine ale cror structuri teriare au fost bine studiate sunt hemoglobina,
mioglobina, muramidaza, ribonucleaza, papaina, chimotripsinogenul, carboxipeptidaza A,
subtilizina i altele.
Meninerea i stabilizarea structurii teriare se realizeaz prin forele de atracie ce apar
ntre radicalii aminoacizilor componeni care se pot orienta n aa fel nct s ajung n poziii
favorabile formrii diferitelor tipuri de legturi. Dintre acestea, cele mai importante sunt
urmtoarele:
legturile de hidrogen se formeaz ntre gruprile fenolice ale resturilor de tirozin i
respectiv grupele COOH aparinnd resturilor de acid aspartic i glutamic, sau ntre nucleul
imidazolic al histidinei i grupa OH a serinei;

22
legturile ionice se formeaz ntre grupele COOH ale acizilor aspartic i glutamic i
grupele NH2 ale lizinei i argininei. Numrul legturilor ionice este relativ mic, deoarece
majoritatea grupelor funcionale ionizate interacioneaz cu dipolii apei. Conformaia proteinelor
n soluie este de aa natur nct un numr ct mai mare de grupri polare s fie expuse la
suprafaa arhitecturii moleculare, cu gruprile hidrofobe orientate, de regul, spre interiorul
moleculei;
legturile van der Waals se formeaz ntre resturile hidrocarbonate ale aminoacizilor.
Aceste interaciuni sunt date, n principal, de resturile de alanin, fenilalanin, leucin, valin,
izoleucin etc. Majoritatea radicalilor nepolari, hidrofobi ai acestor aminoacizi se orienteaz spre
interiorul moleculei asigurnd stabilitatea structurii acestora. Radicalii polari, ionizai, ai unor
aminoacizi (n primul rnd cei de arginin, lizin, acid aspartic i acid glutamic) sunt orientai spre
exteriorul moleculei proteice unde interacioneaz cu dipolii apei din mediu.
Datorit apariiei interaciunilor enumerate mai sus este asigurat pe de o parte stabilitatea
structurii tridimensionale i, pe de cealalt parte, conformaia optim din punct de vedere
termodinamic. Pe de alt parte, diversitatea tipurilor de legturi ntlnite n structura teriar a
proteinelor, precum i valorile energiilor de legtur, explic marea labilitate a proteinelor sub
aciunea diverilor factori fizico-chimici cum ar fi pH-ul mediului, temperatura, presiunea
osmotic, prezena sau absena unor substane chimice etc.
Observaie! Dezorganizarea structurii teriare, care este foarte complex i variat,
determin pierderea proprietilor biologice ale proteinelor!
Deseori se pot produce modificri foarte mici n conformaia determinat de structura
teriar prin legarea ntr-un mod oarecare (de exemplu adsorbie) a unui compus chimic cu mas
molecular mic. Aceste modificri conformaionale poart numele de efect alosteric i joac un
rol extrem de important n reglarea activitii enzimelor. n ceea ce privete forma moleculelor
proteice care este dat de structura secundar i teriar a acestora, se cunosc dou tipuri extreme
(proteine fibrilare i respectiv proteine globulare), majoritatea proteinelor avnd ns structuri
intermediare. Forma moleculelor proteice nu depinde numai de factorii ce in de nsi structura
proteinelor ci i de factorii de mediu.
Replierea i superspiralizarea catenelor polipeptidice depind de pH-ul mediului, de
salinitatea acestuia, de prezena sau absena anumitor compui chimici, de presiunea osmotic, de
temperatur etc., ceea ce explic marea variabilitate funcional a proteinelor n raport cu mediul de
reacie, precum i faptul c unele proteine fibrilare pot trece n form globular i invers, odat cu
modificarea caracteristicilor mediului.

23
Structura cuaternar este cel mai nalt nivel de organizare structural, ntlnit doar la
unele proteine (enzime). Prin structura cuaternar se nelege asocierea a dou sau mai multe catene
polipeptidice (monomeri, protomeri), fiecare cu structura ei primar, secundar i teriar, ntr-o
arhitectur spaial complex (oligomeri). Subunitile componente ale unei macromolecule
proteice cu structur cuaternar pot fi separate prin metode specifice, relativ blnde, fr ruperea
vreunei legturi covalente.
Stabilizarea structurii cuaternare se realizeaz prin formarea de interaciuni ntre subuniti,
pe seama grupelor funcionale libere ionizate, gruprilor hidrofobe, grupelor sulfhidrilice etc.
Molecula tinde s formeze, att n interiorul ei ct i cu moleculele solventului, un numr de
legturi ct mai mare posibil, deci tinde spre un nivel minim al energiei libere i o stabilitate
maxim. Pentru majoritatea enzimelor, acest nivel minim de energie este atins spontan i
corespunde conformaiei lor biologic active (fig. 23).
Unele enzime cu structur cuaternar prezint activitate catalitic doar n forma oligomer,
n timp ce la altele, activitatea catalitic este decelat att la forma nativ ct i la subunitile
separate. ntr-o enzim oligomer, subunitile pot fi identice sau diferite. n general, enzimele sunt
compui macromoleculari, cu mas molecular extrem de variat care oscileaz ntre 10.000 i
cteva milioane de daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomic a 12C, adic 1,66.10-24 g).
Fiind proteine, enzimele prezint toate proprietile fizico-chimice ale acestor compui
printre care i capacitatea de a precipita sub aciunea unor factori specifici. n funcie de
comportarea moleculelor dup ndeprtarea agentului precipitant, aceasta poate fi de dou tipuri:
precipitare reversibil i ireversibil sau denaturare.
Precipitarea reversibil are loc atunci cnd, dup ndeprtarea agentului precipitant (de
exemplu prin dializ), enzima redevine solubil. Aceast proprietate este utilizat frecvent n
tehnicile de separare i purificare a enzimelor din cele mai diferite surse biologice. n aceste tehnici,
aproape ntotdeauna se realizeaz n prima faz o precipitare fracionat a enzimelor prin utilizarea
unor concentraii succesive ale agentului precipitant (sulfat de amoniu, etanol, aceton, alcool
izopropilic etc.). Enzimele astfel precipitate se separ apoi prin centrifugare sau filtrare dup care se
nltur agentul precipitant prin diferite metode (dializ, diluie etc.) pentru a le redizolva.
Precipitarea ireversibil sau denaturarea are loc atunci cnd enzima rmne n stare solid
chiar i dup ndeprtarea agentului precipitant (uree, guanidin, dodecilsulfat de sodiu, valori
extreme de pH, temperaturi ridicate etc.). De regul, precipitarea este nsoit de pierderea complet
a activitii catalitice, motiv pentru care, denaturarea reprezint principala modalitate de stopare a
activitii enzimatice in vitro n enzimologia practic.

III.3.3 Centrul activ al enzimelor

24
Cu unele excepii, masa molecular a enzimelor este mult superioar maselor moleculare ale
substratelor lor. Astfel, pentru marea majoritate a cazurilor, masele moleculare ale substratelor
reprezint cel mult 1 % din masele moleculare ale enzimelor ce catalizeaz transformarea lor. Pe de
alt parte, multe enzime sunt heteroproteine, iar cofactorul enzimatic este implicat n actul catalitic
(fig. 24). inndu-se cont de aceste considerente, a fost enunat urmtorul postulat asupra realizrii
procesului catalitic: activitatea catalitic este realizat de o regiune mic din enzim, geometric
discret, numit centrul activ sau situs catalitic (activ).
Structura centrului activ este diferit de la o enzim la alta i depinde n mare msur de
structura macromoleculei enzimatice n ansamblu. Astfel la enzimele monocomponente, a cror
molecul este format exclusiv din catene polipeptidice, centrul activ este alctuit din resturi de
aminoacizi localizate n zone extrem de diferite ale catenei (catenelor) polipeptidice dar care, n
urma spiralizrii i plierii acestora pentru formarea structurilor de nivel superior, devin vecine, fiind
grupate pe o arie cu diametrul de cel mult 30 .

Astfel, muramidaza este o enzim a crei

molecul este reprezentat de o singur caten polipeptidic ce conine 129 resturi de aminoacizi.
Centrul activ al acesteia este format din resturile Glu35 i Asp52. n cazul chimotripsinei, a crei
molecul conine trei catene polipeptidice formate din 242 resturi de aminoacizi, centrul activ este
alctuit din resturile His57 i Ser195 dintr-o caten i Asp102 din alt caten polipeptidic.
n cazul enzimelor bicomponente, cofactorul enzimatic face parte integrant din structura
centrului activ fie singur, fie, de cele mai multe ori, mpreun cu unele resturi de aminoacizi din
structura apoenzimei. De exemplu, n cazul carboxipeptidazei A, care este o metaloenzim, situsul
catalitic conine ionul Zn2+ i resturile de aminoacizi Arg145, Tyr248 i Glu270, apoenzima fiind
alctuit din 300 resturi de aminoacizi.
Dei centrul activ reprezint zona din structura enzimei implicat direct n realizarea actului
catalitic, toate segmentele din structura macromoleculei enzimatice particip, direct sau indirect, n
realizarea transformrii biochimice pe care aceasta o catalizeaz.
n funcie de rolul jucat n procesul catalitic, resturile de aminoacizi ce alctuiesc catenele
polipeptidice ale enzimelor monocomponente, precum i cele ale apoenzimelor enzimelor
bicomponente pot fi clasificate n mai multe grupe astfel:
- grupri de contact reprezentate de acele resturi de aminoacizi implicate direct att n
fixarea substratului n vederea formrii complexului enzim-substrat (ES) ct i n realizarea actului
catalitic. Aceste resturi sunt localizate n catenele polipeptidice n zone diferite dar, prin formarea
structurilor de ordin superior, devin vecine;

25
- grupri conformaionale, adic acele resturi de aminoacizi care nu fac parte din centrul
activ, nefiind deci implicate direct n procesul catalitic, dar care asigur o conformaie spaial
caracteristic fiecrei enzime, absolut necesar realizrii procesului catalitic;
- grupri auxiliare sunt reprezentate de resturile de aminoacizi cu anumite proprieti
fizico-chimice (de exemplu hidrofile sau hidrofobe), proprieti ce joac un anumit rol n cataliz
dei nu particip direct n legarea substratului;
- grupri indiferente reprezentate de ceilali aminoacizi care nu particip n nici un fel la
realizarea procesului catalitic, ele putnd fi clivate sau nlocuite fr pierderea activitii enzimatice.
Dei se numesc indiferente, aceste grupri confer totui enzimelor anumite proprieti (solubilitate,
stabilitate etc.) care faciliteaz aciunea enzimei asupra substratului, att in vivo ct i in vitro.
Studiind cinetica reaciilor enzimatice, Michaelis i Menten propun urmtoarea formulare a
reaciilor enzimatice cu un singur substrat:
S + E ES P + E
Autorii postuleaz c reaciile enzimatice decurg n dou etape. n prima faz are loc o
interaciune reversibil ntre enzim (E) i substratul su (S) cu formarea unui complex binar
enzim-substrat (ES) care ulterior a fost denumit complex Michaelis. Acesta este instabil i se
transform fie pe cale invers cu regenerarea substratului i a enzimei, fie cu formarea produsului
de reacie i regenerarea catalizatorului.
n vederea formrii complexului Michaelis, ntre enzim i substratul su pot lua natere
urmtoarele tipuri de legturi:
- legturi coordinative care apar n complecii metaloenzimelor. Ele se realizeaz prin
punerea n comun a electronilor neparticipani ai atomilor de oxigen i azot din apoenzim i
reprezent cele mai puternice legturi ce se pot forma ntre enzim i substrat;
- legturi de hidrogen care se formeaz ntre atomii de hidrogen i atomii cu caracter
electronegativ, n special cei de oxigen i azot. n general, n timpul formrii complexului Michaelis
ia natere un numr relativ mare de puni de hidrogen;
- atracii electrostatice care iau natere datorit existenei unei grupe funcionale libere ce
ionizeaz la pH fiziologic. Un rol important n realizarea acestor interaciuni l joac, n primul
rnd, gruprile aminice libere ale resturilor de lizin i arginin i gruprile carboxilice ale resturilor
acizilor aspartic i glutamic;
- interaciunile hidrofobe au loc cu precdere n cazul substratelor cu caracter hidrofob, iar
apoenzimele particip n formarea acestor interaciuni prin resturile aminoacizilor aromatici sau
alifatici cu caten lung;

26
- transferul de sarcin se realizeaz atunci cnd substratul i enzima posed structuri bogate
i respectiv srace n electroni.

II.3.4 Centrul alosteric. Enzime alosterice

Iniial, termenul de alosterie era atribuit fenomenului de modificare a conformaiei unei
enzime ca urmare a interaciunii sale cu o anumit substan, legarea acesteia avnd loc ntr-o zon
diferit de situsul activ. n acest sens al noiunii, alosteria a fost observat, de exemplu, n cazul
aciunii 2,3-difosfogliceratului asupra hemoglobinei, ntr-o zon diferit de centrii de transport
pentru oxigen. Mai exact, aceast substan interacioneaz prin sarcinile sale negative cu atomii de
azot de la capetele N-terminale ale catenelor.
n urma aprofundrii cercetrilor de cinetic enzimatic, noiunea de alosterie a cptat noi
nelesuri. Clarificarea deplin a acestei noiuni a fost posibil datorit cercetrilor privind reglarea
activitii enzimelor in vivo, una din principalele particulariti ale transformrilor biochimice.
Aceste transformri nu sunt de obicei formate dintr-o singur reacie enzimatic ci reprezint
succesiuni de reacii care alctuiesc o aa-numit cale sau secven metabolic:

E1

P1

E2

P2

E3

En

n aceste secvene, produsul reaciei ce are loc sub aciunea enzimei E1 reprezint substratul
enzimei E2 .a.m.d., iar produsul final P este considerat produsul cii metabolice date. n
desfurarea acestor transformri, dac produsul final P se acumuleaz ntr-o cantitate mai mare
dect cea fiziologic normal, el inhib activitatea enzimei E 1 care declaneaz secvena metabolic
respectiv, n aa fel nct ntreaga cale este stopat.
Acest tip de inhibiie difer total de celelalte forme de inhibiie (vezi cap. IV) i poart
numele de retroinhibiie sau inhibiie de tip feed back. Ea are loc n urma interaciunii produsului
final P cu o anumit zon din geometria enzimei E 1 distinct de centrul activ, zon numit centru
alosteric. n urma acestor interaciuni este modificat conformaia moleculei de protein-enzim,
deci i a centrului su activ, cu repercusiuni asupra capacitii catalitice.
n momentul n care concentraia produsului final P scade ca urmare a transformrii lui pe
alte ci metabolice, enzima E1 este dezinhibat, iar secvena se reia. Aceast proprietate de a fi
inhibate prin feed back o au enzimele implicate n primele reacii ale unei secvene metabolice, cel
mai adesea enzima ce catalizeaz prima reacie. Acestea se numesc enzime alosterice i ndeplinesc
un rol extrem de important n capacitatea de reglare a activitilor celulare.

27
Studiul enzimelor alosterice a demonstrat c ele prezint unele proprieti comune:
- prezint structur cuaternar;
- nu respect, de regul, cinetica Michaelis-Menten (sunt enzime nemichaeliene);
- pot suferi modificri conformaionale fr pierderea activitii catalitice, aceste modificri
fiind detectabile prin msurtori fizice sau cinetice;
- joac, n general, un rol de reglare a metabolismului, n special n cile de biosintez.

II.3.6. Enzime membranare

Din punctul de vedere al localizrii lor intracelulare, enzimele se mpart n dou mari
categorii:
a) enzime solubile (enzimele solubilizate n citoplasm, nucleoplasm, matricea
mitocondrial etc.);
b) enzime membranare, ale cror molecule sunt nglobate n diferite membrane biologice,
fcnd parte integrant din structura acestora. Din totalitatea enzimelor cunoscute n prezent, cele
mai multe enzime sunt membranare, insolubile.
Constituenii principali ai membranelor biologice sunt proteinele i lipidele ce se afl n
proporii variabile, n funcie de rolul biologic al fiecrei membrane n parte. Interaciunea specific
cu lipidele membranare confer proteinelor o serie de caracteristici speciale. n funcie de localizare
i de modul de interaciune cu lipidele membranare, proteinele membranare sunt, la rndul lor, de
dou tipuri:
a) proteinele intrinseci sunt asociate cu lipidele i intr n constituia propriu-zis a
membranei, fcnd parte integrant din structura acesteia. Proteinele intrinseci sunt de fapt
proteinele membranare propriu-zise. Ele nu pot fi extrase prin simpla dizolvare n ap sau n diferite
soluii tampon, fiind absolut necesar dezintegrarea membranelor cu detergeni specifici sau prin
alte metode;
b) proteinele extrinseci, sau periferice sunt localizate la nivelul uneia din suprafeele
membranelor biologice, putnd fi uor extrase la pH acid sau bazic, sau prin tratare cu o soluie
tampon de trie ionic superioar. De cele mai multe ori, proteinele extrinseci se ataeaz de
membran prin interaciuni ionice (fig. 30).
n afara acestor dou categorii de proteine membranare mai exist proteine care pot fi
considerate ca fiind membranare dar care se leag de componentele membranei prin intermediul
unei molecule lipidice ce joac rol de ligand. Acestea prezint toate caracteristicile proteinelor
solubile cu excepia faptului c se leag covalent de un rest de acid gras sau de un rest fosfolipidic
prin intermediul crora au posibilitatea de a se ataa de faza lipidic a membranei.

28

Reprezentarea schematic a localizrii proteinelor membranare (Pelmont, J. 1995)

Cu excepia membranelor mielinice, n care ponderea lipidelor depete 80%, n toate

celelalte membrane biologice proteinele depesc ponderea lipidelor (reprezentnd peste 50%), n
unele cazuri ajungnd chiar la 75% cum ar fi de exemplu membrana intern mitocondrial sau
membranele lisosomale. n aceste membrane lipidele se gsesc ntr-o cantitate strict necesar
asamblrii macromoleculelor proteice. Cu toate acestea ele sunt absolut indispensabile funcionrii
normale a membranelor respective.

III. COENZIME
Dup cum s-a artat n capitolul II, din punct de vedere structural, enzimele cunoscute n
prezent pot fi grupate n doua clase distincte: enzime monocomponente i enzime bicomponente.
Cele mai multe enzime sunt heteroproteine; aceasta nseamn c moleculele lor, pe lng
componenta proteic, numit apoenzim, mai conine i o component de alt natur numit

29
cofactor enzimatic. Cele dou componente pot interaciona diferit n funcie de structura lor
chimic, iar n funcie de natura legturilor chimice ce se stabilesc ntre ele, cofactorii enzimatici
pot fi clasificai astfel (fig. 34):
- grupri prostetice reprezentate de compuii organici cu structur neproteic ce se fixeaz
puternic pe apoenzime, prin legturi covalente. mpreun cu unele resturi de aminoacizi din diferite
regiuni ale catenelor polipeptidice, gruprile prostetice formeaz centrul activ al enzimei;
- coenzimele sunt reprezentate de anumii compui organici ce interacioneaz slab cu
apoenzimele. n acest caz, ntre cele dou componente se formeaz legturi slabe de tipul punilor
de hidrogen, interaciunilor hidrofobe etc., iar coenzimele pot fi separate relativ uor de apoenzime,
de exemplu prin dializ. Cele mai multe coenzime sunt cofactori ai transferazelor, iar reaciile
catalizate decurg, n general, n doua etape: n prima faz gruparea funcional sau radicalul ce
urmeaz a fi transferat se leag de coenzim, iar n etapa urmtoare aceasta o cedeaz celuilalt
substrat.
Dei aceast clasificare se face n funcie de tria legturilor dintre cele dou componente,
acelai cofactor se poate lega n mod diferit de diverse apoenzime. Din aceast cauz nu se poate
face o delimitare net ntre coenzime i grupri prostetice, adic acelai cofactor poate fi coenzim
pentru o enzim i grupare prostetic pentru alta. De exemplu, FAD-ul este grupare prostetic
pentru lipoamid-dehidrogenaz i respectiv coenzim pentru D-aminoacid-oxidaze.
Exist situaii cnd cofactorul enzimatic poate juca rol de cosubstrat n anumite etape ale
unei secvene metabolice, urmnd ca el s se regenereze n etapele urmtoare sau n reacii din alte
secvene. Din aceste motive, n cele ce urmeaz vom folosi termenul de coenzim chiar dac n
unele situaii substanele respective sunt grupri prostetice.
Coenzimele alctuiesc o grup de substane extrem de heterogen structural. Din acest punct
de vedere, coenzimele se mpart n patru clase principale: coenzime de natur alifatic, coenzime de
natur aromatic, coenzime heterociclice i coenzime cu structur nucleozidic i nucleotidic.
a) COENZIME DE NATUR ALIFATIC. Principalele coenzime din aceast grup sunt
glutationul, acidul lipoic i acidul ascorbic (vitamina C).
b) COENZIME DE NATUR AROMATIC. Din aceast clas fac parte ubichinonele sau
coenzimele Q, substane ce conin n molecula lor un numr variabil de uniti izoprenice i un
nucleu derivat de la hidrochinon.
Datorit capacitii lor de a da reacii redox reversibile, coenzimele Q particip la procesele
de oxido-reducere celular, unde ndeplinesc un rol asemntor cu cel al coenzimelor flavinice i
piridinice. Pe de alt parte, proprietile oxido-reductoare ale ubichinonelor, fac posibil

30
participarea lor n catena respiratorie, unde transport hidrogenul de la flavoenzime la sistemul
citocromic.
n celulele animale, ubichinonele sunt prezente predominant n mitocondrii, n special sub
forma compusului cu 10 uniti izoprenoide (ubichinona 10), ns numrul acestora poate oscila
ntre 4 si 12. Din aceast cauz, reprezentanii respectivi ai coenzimei Q sunt denumii ubichinona
6, ubichinona 8 etc. n celulele vegetale se ntlnete n plastide o ubichinon special numit
coenzima Q245 (absorbie maxim la 245 nm) sau plastochinona care conine 9 uniti
izoprenoidice, iar gruprile metoxi din poziiile 4 i 5 ale nucleului naftochinonic sunt nlocuite cu
grupe metil.
Cea mai important funcie biochimic a coenzimei Q o constituie implicarea sa n catena
respiratorie, proces n care se realizeaz transferul de electroni de la metabolii cu potenial negativ
mare la oxigen.
c) COENZIME DE NATUR HETEROCICLIC. n aceast grup intr un numr mare
de coenzime diferite din punct de vedere structural i al mecanismului de aciune. Singurul criteriu
care st la baza gruprii lor ntr-o singur clas l constituie faptul c aceste coenzime conin n
molecula lor unul sau mai muli heterocicli. La rndul lor, ele se clasific n urmtoarele subgrupe:
- coenzime derivate de la tiamin;
- coenzime derivate de la biotin;
- coenzime derivate de la piridoxin;
- coenzime derivate de la acid folic;
d) COENZIME DERIVATE DE LA NUCLEOZIDE. Att din punct de vedere structural
ct i al mecanismului de aciune i tipului reaciilor n care sunt implicate, coenzimele nucleotidice
formeaz o clas de compui extrem de heterogen. Ea include:
- Acidul adenozintrifosforic
- Coenzima A
- Coenzime piridin-nucleotidice NAD+ i NADP+
- Coenzime flavinice - FMN) i respectiv FAD
- Coenzimele cobamidice
- Cofactori feroporfirinici - citocromii,
- Feredoxinele. Aceast clas de compui cuprinde cofactorii ce conin fier sub form
neheminic, cu un potenial redox foarte sczut. Feredoxinele sunt larg rspndite la bacterii
anaerobe, la bacteriile fotosintetizante, precum i n cloroplastele unor plante superioare.

IV. CINETICA REACIILOR ENZIMATICE

31
Acionnd n celula vie i fiind proteine, enzimele prezint unele proprieti fizico-chimice i
funcionale

care

le

delimiteaz

net

de

catalizatorii

chimici.

Complexitatea

structurii

biocatalizatorilor precum i complexitatea mecanismului intim de reacie fac ca studiul cineticii

reaciilor enzimatice s fie mult mai dificil comparativ cu cinetica reaciilor chimice n general.
Studiul cineticii enzimatice, ca i n cinetica chimic, se bazeaz pe msurarea vitezei de
reacie n condiii standard (care se asigur n aa fel nct s fie ct mai apropiate posibil de
condiiile existente in vivo) i n diferite condiii particulare create ntr-un anumit scop. Cum ns
numrul variabilelor ce corespund tuturor parametrilor transformrii biochimice date este extrem de
mare, prelucrarea matematic a datelor obinute este att de complex nct este absolut necesar s
se fac unele aproximaii n vederea reducerii la maximum a numrului acestor variabile.

IV.1 NOIUNI GENERALE DE TERMODINAMIC ENZIMATIC

Dup cum se tie din chimia fizic, principiile termodinamice pot fi exprimate prin trei
parametri termodinamici principali: entalpia, entropia i energia liber. Dintre acetia, energia
liber reprezint parametrul cel mai des utilizat n enzimologie. Reaciile enzimatice ce au loc in
vivo respect toate legile termodinamicii dei noiunea de echilibru este oarecum diferit de
noiunea similar aplicat reaciilor chimice, iar pe de alt parte, sistemele biologice se
caracterizeaz prin existena reaciilor cuplate n care produsul unei reacii este substrat pentru
reacia urmtoare:

S1

E1

S2

E2

G1

G2

S3

E3
3

S4

G3

Conjuncia ntre dou reacii ale unui astfel de sistem este asigurat de prezena unui proton,
electron sau a unui compus cu structur complex. Un exemplu concludent n acest sens l
reprezint reaciile catalizate de dehidrogenazele NAD(P)+-dependente. n asemenea situaii,
coenzima dehidrogenazei trece n form redus ca urmare a dehidrogenrii substratului i se
regenereaz n forma sa oxidat ntr-o reacie cuplat cu prima cnd cedeaz protonii i electronii
unei molecule de FAD oxidat:

32

S
red

NAD(P)+

FADH2

S
ox

NAD(P)H+H+

FAD

n reaciile metabolice cheie exist mecanisme enzimatice speciale numite reacii

antiparalele unidirecionale sau bucle ireversibile ce pot fi explicate din punct de vedere
termodinamic. De exemplu, la conversia fructozo-6-fosfatului n fructozo-1,6-difosfat sub aciunea
fosfo-fructokinazei n prezena ATP-ului, valoarea entalpiei libere este negativ, iar reacia este
practic ireversibil. Reacia invers are totui loc dar n absena ATP-ului i este catalizat de o alt
enzim fructozo-1,6-difosfataza. Dac cele dou enzime ar aciona concomitent, ar avea loc o
hidroliz necontrolat a ATP-ului. Aceast pierdere inutil de energie este mpiedicat de celula vie
prin mecanisme proprii de reglare. Astfel, fosfofructokinaza este activat n prezena AMP-ului n
timp

ce

ATP-ul

este

inhibitor, iar fructozo-1,6-

difosfataza este inhibat de

AMP. De aceea n cazul

creterii

stare de
tranzitie

ATP/AMP

raportului
echilibrul

este

deplasat n sensul hidrolizei

stare
initial

fiind

stimulat

gluconeogeneza, iar n cazul

stare
final
timp

diminurii acestui raport este

favorizat

reacia

de

fosforilare, fiind stimulat

glicoliza.

Dac presupunem posibilitatea realizrii unei reacii n trei moduri posibile (fr
catalizator, n prezena unui catalizator chimic i respectiv sub aciunea unei enzime specifice)
diagrama variaiei energiei libere este diferit, enzima diminund la maximum energia liber, acea
barier energetic ce trebuie depit de reactani pentru a reaciona (se face figura - Variaia

33
energiei libere n timpul unei reacii necatalizate (1), n prezena unui catalizator chimic (2) i n
prezena unei enzime specifice (3).

IV.2 INFLUENA UNOR FACTORI FIZICO-CHIMICI ASUPRA VITEZEI

REACIILOR ENZIMATICE
Acionnd n organismele vii, enzimele se comport total diferit fa de catalizatorii chimici
la aciunea unor factori de mediu. Astfel, enzimele i manifest activitatea catalitic maxim n
condiii fiziologic normale de pH, temperatur, presiune osmotic etc. Pe de alt parte, dinamica
activitii enzimatice la concentraii diferite ale substratului, enzimei, modulatorilor etc. este de
asemenea diferit.
IV.2.1 Influena concentraiei enzimei asupra vitezei de reacie
n reaciile chimice ce au loc sub aciunea unor catalizatori exist o dependen liniar (de
tipul yaxb) ntre viteza de reacie i concentraia catalizatorului. n cazul reaciilor enzimatice,
aceast linearitate este respectat doar pentru un domeniu al concentraiei enzimei, mai exact n
domeniul concentraiilor mici. La concentraii ale enzimei mai mari de o valoare dat viteza de
reacie se modific neliniar (fig. 82).

v
1

concentratia catalizatorului

Fig. 82. Influena concentraiei catalizatorului asupra vitezei reaciilor chimice (1) i enzimatice (2)

Aceast abatere de la linearitate nu reflect ntotdeauna comportamentul real al enzimelor,

poriunea curb ce corespunde abaterii de la proporionalitatea liniar, putnd fi datorat i altor
fenomene ce au loc n mediul de incubare n prezena unor concentraii mari ale enzimei. Din aceste
motive, n determinarea experimental a activitii catalitice pentru fiecare enzim exist un

34
domeniu de valabilitate (intervalul de concentraii 0A din figura 82) n care rezultatele sunt reale i
reproductibile. Cu ct concentraia enzimei depete mai mult valoarea A, cu att eroarea
determinrii este mai mare.
n multe situaii, graficul dependenei vitezei de reacie de concentraia enzimei poate s nu
treac prin originea axelor rectangulare ci s intersecteze abscisa sau ordonata intr-un anumit punct.
Acest lucru poate fi datorat existenei unor impuriti n preparatul enzimatic sau altor fenomene ce
au loc n mediul de incubare. O situaie aparte o prezint enzimele proteolitice la care dependena
vitezei de reacie de concentraia enzimei este neliniar (fig.83).

[E]

Fig.83. Dependena vitezei de reacie de concentraia enzimelor proteolitice

Mai muli autori au ncercat s gseasc ecuaii empirice care s defineasc aceste
dependene. Cea mai acceptat a fost ecuaia elaborat de Schtz conform creia viteza reaciilor de
proteoliz este proporional cu rdcina ptrat a concentraiei enzimei:

v=K[E]1/2
Utilizarea acestei ecuaii este ns limitat, ea fiind valabil doar n anumite condiii
experimentale. Din aceste motive, de cele mai multe ori se procedeaz mai nti la trasarea unei
curbe de etalonare prin folosirea diluiilor succesive ale unei soluii de enzim pur. Aceste curbe de
etalonare convertesc unitile de densitate optic n uniti de activitate catalitic.
IV.2.2 Influena concentraiei substratului asupra vitezei reaciilor enzimatice
Acest aspect al cineticii reaciilor enzimatice a fost studiat de ctre L.Michaelis, M.L.Menten
i J.B.S.Haldane. Autorii au plecat de la premiza existenei complexului intermediar enzimsubstrat (ES) i au studiat acest aspect cinetic pentru reaciile enzimatice cu un singur substrat:

35

E + S

K+1
K-1

ES

K+2

E + P

unde:
E enzima;
S substratul reaciei;
ES complexul enzim-substrat;
P produsul de reacie.
Reaciile enzimatice decurg deci cel puin n dou faze, uneori separabile, alteori nu. n
prima etap are loc interaciunea substratului cu enzima la nivelul situsului catalitic al acesteia (vezi
cap. II.3.3) ca urmare a complementaritii stereochimice a acestora. n aceast faz se formeaz
complexul intermediar enzim-substrat (ES) care se mai numete complex Michaelis. n

etapa

urmtoare, acest complex bogat n energie se poate scinda pe calea invers (regenernd substratul i
enzima) sau poate realiza transformarea propriu-zis a substratului cnd se formeaz produsul de
reacie i se regenereaz catalizatorul.
n marea majoritate a cazurilor ns, reaciile enzimatice sunt cu dou sau mai multe substrate.
Pentru aceste transformri, enzima formeaz mai muli compleci, adevratul complex Michaelis
fiind considerat cel care determin viteza reaciei totale n cel mai nalt grad. De exemplu, pentru
reaciile enzimatice cu dou substrate se formeaz trei astfel de compleci (ES 1, ES2 i respectiv
complexul ternar ES1S2).
Cinetica reaciilor enzimatice cu un singur substrat se bazeaz pe teoria strii staionare
elaborat de ctre Haldane i Briggs. Conform acestei teorii, n cursul reaciilor enzimatice se
instaleaz o stare staionar, un echilibru, cnd concentraia complexului ES este practic constant
deoarece viteza cu care acest complex se formeaz devine egal cu viteza de degradare a acestuia.
Revenind la ecuaia general a unei reacii enzimatice cu un singur substrat putem scrie
expresia vitezei de formare (vf) a complexului ES i respectiv a vitezei cu care acesta se
descompune vd, pentru etapa iniial:

vf = K+1[E][S]
i respectiv:

vd = K-1[ES] + K+2[ES] = [ES](K-1+K+2)

36
Dup instalarea strii de echilibru, concentraia complexului ES rmne constant ca
urmare a faptului c viteza de formare devine egal cu viteza de descompunere a acestui complex.
De aceea:

vf vd
ceea ce nseamn c:
K+1[E][S] = [ES](K-1+K+2)
Aceast relaie mai poate fi scris i sub forma:

E S

ES

K 1 K 2
K 1

Cea de a doua fracie reprezint un raport de constante, ceea ce nseamn c valoarea ei este o
constant, care a fost notat cu KM:

K 1 K 2
constant K M
K 1

Deci:
KM

E S

ES

n momentul instalrii strii de echilibru, enzima exist n mediu att sub form liber ct i
sub forma complexului ES. Deci concentraia total a enzimei Et va fi dat de relaia:

[Et] = [E] + [ES]

Introducnd valoarea concentraiei enzimei libere ( E Et -ES ) n formula constantei KM
obinem:
KM =

([Et] [ES] ) [S]

[ES]

Rearanjnd termenii i explicitnd n funcie de ES obinem:

KM[ES] = ([Et]-[ES])[S]
sau:

KM[ES] = [Et][S]-[ES][S]

37
sau:

KM[ES]+[S][ES] = [Et][S]
de unde:

[ES](KM+[S]) = [Et][S]
sau:

E S
ES K S
t

Dar viteza reaciei enzimatice propriu-zise este reprezentat de fapt de viteza cu care complexul
ES se descompune n sensul formrii produsului P:

v = k [ES]
Dac ntreaga cantitate de enzim ar fi legat sub forma complexului ES, enzima ar cataliza
reacia respectiv cu viteza maxim (Vmax) teoretic posibil:

Vmax = k [Et] = k [ES]

Din ultimele dou relaii se poate deduce:
k

Vmax

deci :

Vmax ES

E
t

n ultima relaie, nlocuim valoarea concentraiei complexului ES prin valoarea sa:

Vmax E t S
Vmax ES
Vmax E t S
K M S
v

Et
Et
Et K M S

deci:
v

Vmax S
K M S

Aceast ecuaie reflect dependena vitezei reaciilor enzimatice de concentraia substratului

i poart numele de ecuaia Michaelis-Menten. Reprezentarea grafic a acestei ecuaii n sistemul

38
de axe rectangulare, n care concentraia substratului se trece pe abscis, iar viteza de reacie pe axa
ordonatelor, se prezint sub o form de arc de hiperbol (fig. 84).

V max

[S]

Fig. 84. Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten

n aceast reprezentare, curba tinde asimptotic ctre paralela la abscis dus din punctul V max.
Din punct de vedere practic, aceast reprezentare grafic determin erori relativ mari pe de o parte
din cauza stabilirii cu dificultate a punctului Vmax pe axa ordonatelor, iar pe de alt parte din cauza
faptului c la concentraii relativ mari de substrat intervin fenomene secundare printre care i
inhibiia prin substrat a activitii enzimatice.
Pentru micorarea erorilor de determinare, se utilizeaz reprezentarea grafic a valorilor
inverse, ecuaie obinut de ctre Lineweaver i Burk prin prelucrarea matematic a ecuaiei
Michaelis-Menten:

1 KM 1
1

v Vmax S Vmax

Reprezentarea grafic a acestei ecuaii ( 1/v n funcie de 1/s ) d o dreapt ce intersecteaz

axa absciselor n punctul - 1/KM i axa ordonatelor n punctul 1/Vmax (fig. 85).
Pentru a putea defini i caracteriza constanta KM, ecuaia Michaelis-Menten poate fi prelucrat
n continuare, fcnd unele artificii de calcul. Deoarece viteza maxim Vmax nu poate fi obinut n
mod practic la realizarea nici unei transformri enzimatice in vitro, se presupune c reacia
enzimatic luat n studiu ar decurge cu o vitez ce reprezint jumtate din viteza maxim teoretic
posibil:

v = 1/2Vmax

39

1
v

1
V max

_ 1
KM

1/[s]

Fig. 85. Reprezentarea grafic a ecuaiei Lineweaver-Burk

n aceast situaie, ecuaia Michaelis-Menten devine:

nlocuind v cu valoarea sa obinem:

Vmax S
K M S

Vmax
vKVMmax
vK
S M Vmax
S S V S
max
2
2

Eliminnd numitorii n aceast proporie rezult:

VmaxKM+Vmax[S] = 2 Vmax[S]
sau:

VmaxKM = Vmax[S]
Din ultima relaie rezult:

KM = [S]
n funcie de aceast relaie i innd cont de modul cum a fost ea dedus, constanta Michaelis
KM se definete ca fiind concentraia substratului corespunztor creia viteza de reacie
reprezint jumtate din viteza maxim. Constanta KM este o msur a afinitii dintre substrat i
centrul activ al enzimei i este ntotdeauna aceeai pentru fiecare pereche enzim-substrat, n
condiii standard de reacie. Pe de alt parte, aceeai enzim izolat din surse biologice diferite,
prezint valori diferite ale constantei Michaelis. Unitile de msur pentru constanta Michaelis sunt
uniti de concentraie, utilizndu-se n special molaritatea. n cazul n care substratul are o mas

40
molecular variabil (de exemplu amidonul pentru amilaze, diferite proteine pentru proteinaze etc.)
se poate exprima valoarea constantei KM i prin uniti de concentraie procentual.
Cu ct valoarea constantei KM este mai mic cu att afinitatea dintre enzim i substrat este
mai mare. i invers. Caracterizarea oricrei enzime din punct de vedere structural i funcional este
incomplet fr determinarea constantei KM fa de substratul su natural, n condiii standard de
reacie.
Dac se ia n considerare acelai tip de reacie, cu un singur substrat, un singur complex
enzim-substrat i un singur produs de tipul:

E + S

k+1
k-1

ES

k+2

P + E

se poate urmri dinamica concentraiilor substratului, produsului, complexului ES i a enzimei

libere. Reprezentnd grafic aceast dinamic (lund pe abscis timpul, iar pe ordonat concentraiile
parametrilor respectivi), se observ iniial o aa-numit faz prestaionar (intervalul de timp 0-t1)
cnd se formeaz complexul ES care, prin scindare, formeaz primele molecule de produs (fig. 86).
c

S
E
ES
O

t1

t2

timp

Fig. 86. Cinetica unei reacii enzimatice cu un singur substrat, cu delimitarea fazelor prestaionar,
staionar i poststaionar

41
Intervalul de timp imediat urmtor (t1-t2) corespunde fazei staionare cnd concentraia
complexului ES este constant i, de asemenea, cantitatea de produs format n unitatea de timp este
constant. n acest interval de timp concentraiile enzimei i complexului ES sunt constante, iar
concentraia substratului este mult n exces, reacia fiind de ordinul 0. Intervalul de timp urmtor
(>t2) corespunde fazei poststaionare cnd concentraia substratului diminueaz treptat el
nemaifiind n exces, iar reacia este de ordinul I.

Abateri de la cinetica michaelian

Nu toate enzimele cunoscute n prezent respect cinetica Michaelis-Menten. De exemplu
enzimele alosterice, enzime ce ndeplinesc n organismele vii un important rol de reglare a
metabolismului, prezint unele abateri de la cinetica michaelian. Exist de asemenea enzime a
cror activitate catalitic scade progresiv odat cu creterea concentraiei substratului, dependena
Michaelis-Menten fiind respectat doar n domeniul concentraiilor mici. Acest fenomen poart
numele de inhibiie prin substrat (fig. 89) i poate fi explicat prin mai multe mecanisme.
v

1
v

V max

1
V max

K S K'S
a

[S]

1 _
KM

K S K'S

1
[S]

Fig. 89. Reprezentarea Michaelis-Menten (a) i Lineweaver-Burk (b) pentru enzimele supuse inhibiiei prin
substrat

IV.2.3 Influena temperaturii mediului asupra vitezei reaciilor enzimatice

Spre deosebire de catalizatorii chimici, enzimele catalizeaz procesele biochimice n care sunt
implicate n condiii fiziologic normale de temperatur. Modificarea temperaturii mediului de
incubare modific puternic viteza reaciilor enzimatice prin modificarea stabilitii enzimei, a
afinitii acesteia pentru substrat, a afinitii enzimei fa de diferii modulatori etc.

42
Primele cercetri privind influena temperaturii mediului asupra vitezei reaciilor chimice au
fost efectuate de ctre Harcourt, Vantt Hoff i Arrhenius. Aceti autori au postulat c pentru
majoritatea reaciilor chimice, creterea temperaturii mediului cu 10 oC determin o dublare a vitezei
de reacie. Vant Hoff stabilete o formul empiric ce reflect dependena dintre viteza de reacie
(v), temperatur (T), variaia entalpiei standard (Ho) i constanta universal a gazelor.
Din considerente practice, efectul temperaturii asupra reaciilor enzimatice se exprim sub
forma coeficientului de temperatur Q10 care indic creterea vitezei de reacie cauzat de mrirea
cu 10oC a temperaturii mediului de incubare:

RT 2 logQ10
Ea
T2 T1
Spre deosebire de catalizatorii chimici, modificarea temperaturii mediului determin o
modificare puternic a activitii catalitice a enzimelor. Pentru marea majoritate a acestora,
reprezentarea grafic a vitezei de reacie n funcie de temperatur are aspectul unui clopot,
activitatea maxim nregistrndu-se la o temperatur dat, numit temperatur optim de aciune
(fig. 96).
v

V max

t1

toptim

t2

oC

Fig. 96. Dependena vitezei reaciilor enzimatice de temperatura mediului de incubare

La temperaturi sczute, viteza reaciilor enzimatice este nul, activitatea catalitic ncepnd
s se manifeste la o temperatur dat (t1). Odat cu creterea temperaturii se nregistreaz o cretere
a vitezei de reacie care este maxim la temperatura optim de aciune. Creterea n continuare a
temperaturii determin scderea vitezei de reacie pn la anularea complet.
Att temperatura optim de aciune ct i intervalul termic t 1-t2 sunt extrem de diferite i
depind, n primul rnd de sursa enzimei. Astfel, pentru enzimele din esuturile animale cu snge
cald, temperatura optim se situeaz n jurul valorii de 37oC, iar intervalul termic t1-t2 este, n

43
general, foarte restrns. Pentru enzimele de origine vegetal i microbian, temperatura optim de
aciune este reprezentat, de fapt, de un interval termic (20-30oC) iar intervalul t1-t2 este mult mai
larg.
Exist i multe excepii de la aceast regul. De exemplu enzimele organismelor vii din
apele termale sau ale microorganismelor din gheari au temperaturi optime de aciune mult mai
crescute (50-70oC i chiar peste 100oC) i respectiv foarte sczute (0-10oC i chiar temperaturi
negative).
Efectul diferit al temperaturii asupra reaciilor enzimatice comparativ cu cele chimice se
explic printr-o multitudine de fenomene ce apar n cataliza enzimatic. Astfel, modificarea
temperaturii mediului de incubare poate determina o modificare mai mult sau mai puin profund a
structurii enzimei, a stabilitii complexului enzim substrat, a gradului de ionizare al grupelor
funcionale din structura enzimei etc.
Alte efecte se refer la micromediul ce nconjoar macromolecula de protein-enzim cum ar
fi capacitatea de a traversa faza lipidic a membranelor. n fine, efectul temperaturii se poate
manifesta uneori i asupra concentraiei substratului. Astfel, n cazul oxigenazelor, enzime ce
utilizeaz oxigenul molecular n calitate de agent oxidant, solubilitatea acestuia n mediul apos este
invers proporional cu temperatura.
Gradul de stabilitate termic al unei enzime date se refer la intervalul de timp n care enzima
respectiv poate fi stocat la o temperatur apropiat de cea de denaturare, fr a avea loc o
diminuare apreciabil a capacitii sale catalitice. Evaluarea stabilitii (sau invers, a labilitii)
termice a unei enzime se poate realiza experimental prin stocarea enzimei respective la o
temperatur apropiat de temperatura de denaturare.
Problema stabilitii termice a enzimelor, dei cunoscut de mult timp, a redevenit actual n
urma descoperirii unor microorganisme capabile s se dezvolte n condiii extreme de temperatur.
Cercetrile au fost orientate spre studiul echipamentelor enzimatice ale bacteriilor termofile extreme
(sau hipertermofile). Datorit implicaiilor practice deosebite, studiul enzimelor termostabile
produse de diferite tulpini microbiene termofile sau termotolerante se bucur de un interes major
din partea cercettorilor. O enzim cu stabilitate termic mare este gliceraldehid-3-fosfat
dehidrogenaza produs de Thermotoga maritima, un termofil extrem izolat din surse submarine
tropicale (Wrba, A. et al. 1995). Enzima este un tetramer care i-a conservat pe parcursul
procesului evolutiv secvena n aminoacizi i organizarea structural spaial. Aceast enzim are
stabilitatea termic cea mai pronunat dintre toate enzimele cunoscute n prezent. Astfel, la pH =
6,0 ea se inactiveaz la 100oC abia dup dou ore, iar denaturarea nu se produce dect la
temperaturi mai mari de 109oC (Jaenicke, H. et al. 1995).

44
n vederea lrgirii ariei de aplicabilitate, au fost testate mai multe metode de cretere a
termostabilitii enzimelor. Se pare c metoda cea mai convenabil o constituie fixarea acestora pe
diferite suporturi insolubile cu obinerea de biocatalizatori heterogeni cunoscui sub numele de
enzime imobilizate. Creterea stabilitii termice n acest caz se explic prin modificarea
caracteristicilor fizico-chimice ale mediului n care enzimele respective funcioneaz. n afar de
creterea termostabilitii, enzimele imobilizate mai prezint i numeroase alte avantaje practice
comparativ cu enzimele native.
IV.2.4 Influena pH-ului mediului asupra vitezei reaciilor enzimatice
Ca i n cazul temperaturii, reacia mediului manifest o aciune extrem de puternic asupra
activitii catalitice a enzimelor. Astfel, pH-ul mediului de reacie poate afecta activitatea enzimelor
fie ireversibil (cnd are loc denaturarea lor la valori extreme ale acestui parametru fizico-chimic, fie
reversibil cnd este influenat gradul de ionizare a enzimei, substratului, complexului ES sau al
tuturor acestor specii moleculare. Dac se consider c aceste specii moleculare pot exista sub trei
forme protonate, n funcie de pH-ul mediului i c doar o form a enzimei este activ, reacia
enzimatic cu un singur substrat poate fi reprezentat schematic astfel:
S

ke1

ke2

EH

E H2

k+1 k-1

ES

ks 1

ES H

ks 2

E S H2

k+2

EH + P

Calculul constantelor cinetice (efectuate n mod similar ca n cazul studiului influenei

concentraiei substratului, adic prin descrierea constantelor i nlocuirea acestora cu valorile lor n
ecuaia de vitez) conduc la o formul ce determin pH-ul optim de aciune:

pH optim

pK eS1 pK eS2
2

45
Reprezentarea grafic a vitezei reaciilor enzimatice de pH-ul mediului este, ca i n cazul
efectului termic, o curb gaussian, n care viteza maxim de reacie se obine la pH-ul optim de
aciune (fig. 99).

V max

pHoptim

pH

Fig. 99. Influena pH-ului mediului de incubare asupra vitezei reaciilor enzimatice

Ca i n cazul temperaturii, att valoarea pH-ului optim de aciune ct i intervalul de pH n

care enzima este activ, sunt foarte variate de la o enzim la alta. n general, enzimele de origine
animal dezvolt activitatea catalitic maxim la un pH situat n jurul valorii de 7,4. Exist ns i
unele excepii cnd pH-ul optim de aciune se situeaz n zona acid sau chiar puternic acid sau n
zona alcalin. De exemplu pepsina gastric este activ n intervalul de pH 1,5-4,0 cu un maxim de
activitate n jurul valorii pH=1,8. n acest interval de pH, majoritatea enzimelor nu numai c sunt
inactive dar pot fi chiar denaturate. Multe enzime sunt active n zona alcalin. De exemplu, pH-ul
optim de aciune pentru arginaza tisular este situat n jurul valorii de 10,0, temperatur extrem la
care alte enzime se inactiveaz.
Pentru transformrile enzimatice reversibile, efectul pH-ului poate fi uneori diferit pentru
reacia direct i reacia invers, iar pH-ul optim de aciune poate fi n astfel de situaii, de asemenea
diferit. Studiul dinamicii parametrilor cinetici ai unei enzime n funcie de pH-ul mediului este
foarte des utilizat la studiul enzimelor ce conin n structura situsului lor catalitic grupe funcionale
ionizabile. Aceste grupri polare pot fi identificate i prin studiul dependenei vitezei de reacie de
pH-ul mediului de incubare.
Aceast dependen strict a capacitii catalitice a enzimelor de pH-ul mediului de incubare
are numeroase implicaii practice. Cea mai des ntlnit este stoparea activitii enzimatice prin
modificarea brusc a reaciei mediului. Astfel, denaturarea enzimelor n mediu acid (creat prin

46
adugare de HCl, acid tricloracetic, acid percloric etc.) se utilizeaz n mod curent n enzimologie.
Acest efect demonstreaz faptul c prezena n structura enzimelor (i a proteinelor n general) a
grupelor funcionale ionizabile contribuie la meninerea stabilitii moleculei.
Prin modificarea pH-ului mediului are loc o modificare a gradului de ionizare ce are drept
rezultat alterarea efectului stabilizator al acestor grupri. Mult timp s-a considerat c efectul
valorilor extreme de pH este acela de a mri sarcina electric global a moleculei proteice cu
repercusiuni asupra creterii forelor de repulsie electrostatic care ar putea determina disocierea
moleculei. Problemele sunt ns mult mai complexe deoarece situsurile ionizabile nu posed n mod
obligatoriu aceeai valoare a constantei pKa n molecula enzimei native, a celei denaturate i,
respectiv, a celei parial denaturate. Astfel, la o valoare constant de pH, sarcina electric global a
unei proteine date nu este aceeai la forma nativ i la formele corespunztoare diferitelor stadii de
denaturare. n cazul enzimelor native, unele resturi de aminoacizi sunt localizate n micromedii
speciale care modific puternic valorile pKa ale acestora comparativ cu valorile obinuite. De
exemplu, o grup COOH al crei pKa se situeaz ntre 3 i 4 ntr-o protein denaturat, poate avea
valori ale acestei constante cuprinse ntre 5 i 6, sau chiar mai mari n cazul aceleiai proteine aflat
n forma sa nativ. Se consider c tocmai acest fenomen este responsabil, n cea mai mare parte, de
efectele pe care le manifest valorile extreme de pH asupra proteinelor deoarece alterarea, chiar i
parial, a structurilor superioare poate determina o modificare brusc a gradului de ionizare (Yang,
A.S. et al. 1992).
In vitro, realizarea condiiilor optime de pH pentru efectuarea unei transformri enzimatice
se face cu ajutorul soluiilor tampon. Alegerea tamponului adecvat este esenial nu numai pentru
crearea pH-ului optim ci i datorit faptului c ionii existeni n soluiile tampon pot da diferite
interaciuni secundare cu moleculele protein-enzimelor.
Interpretarea aciunii pH-ului mediului asupra activitii enzimelor este, de foarte multe ori,
extrem de dificil.
IV.2.5 Influena efectorilor asupra vitezei reaciilor enzimatice
Se numesc efectori sau modulatori, compuii chimici care, adugai n mediul de incubare,
modific viteza reaciilor enzimatice. Efectorii care accelereaz reaciile enzimatice se numesc
modulatori pozitivi sau activatori, iar cei care diminueaz viteza reaciei n mediul creia sunt
adugai se numesc modulatori negativi sau inhibitori.
Rolul de activatori poate fi ndeplinit de diferii ioni metalici (molibden, mangan, magneziu,
fier, zinc etc.), unii anioni anorganici (Cl) sau unii compui organici. n privina rolului activator al
unor ioni metalici, trebuie fcut o distincie net ntre enzime activate de metale i metaloenzime.
Din prima categorie fac parte acele enzime (ce pot fi mono sau bicomponente) care catalizeaz
anumite reacii biochimice cu o vitez mai mare, n prezena unor ioni metalici dect n absena lor.

47
De exemplu, activitatea ATP-azei este mult mai mare atunci cnd mediul de reacie conine
ioni de magneziu ntr-un raport Mg2:ATP1:1. S-a constatat n acest caz c ionii metalici formeaz
cu substratul compleci Mg2+-ATP a cror afinitate fa de situsul catalitic al enzimei este mult mai
mare dect a moleculelor de ATP libere. n a doua categorie (metaloenzime) intr acele enzime ce
conin n molecula lor unul sau mai muli ioni metalici, acetia intrnd de regul n structura
centrului activ, fcnd deci parte din structura macromoleculei de protein-enzim.
Din punct de vedere cinetic mai importani sunt inhibitorii, acetia avnd un rol bine determinat
n reglarea procesului metabolic. i din punct de vedere fundamental studiul inhibitorilor
enzimatici este extrem de important, n primul rnd pentru elucidarea structurii centrului activ al
enzimei respective. n funcie de modul lor de aciune, inhibitorii enzimatici se clasific n dou
grupe principale:
a) inhibitori ireversibili cunoscui i sub denumirea de otrvuri catalitice, au o importan
mai mic pentru cinetica enzimatic. Acetia se leag preponderent prin legturi puternice,
covalente, de anumite resturi de aminoacizi eseniale pentru activitatea catalitic. n urma
interaciunii acestor inhibitori cu enzimele se formeaz compleci stabili, inactivi din punct de
vedere catalitic, inhibitorul neputnd fi ndeprtat prin metode fizico-chimice obinuite de tipul
dializei sau gel-filtrrii.
Rolul de inhibitori ireversibili poate fi jucat i de ionii unor metale grele astfel c, studiile
cinetice ale acestora se fac n prezena EDTA sau a altor ageni de chelatizare pentru ndeprtarea
lor;
b) inhibitorii reversibili sau inhibitorii propriu-zii diminueaz viteza reaciilor enzimatice,
dar aceasta revine la valoarea ei normal dup nlturarea inhibitorului. Adugarea n mediul de
incubare a unui inhibitor reversibil are repercusiuni asupra valorilor constantelor cinetice KM i
Vmax. n funcie de modificarea acestor parametri, inhibiia reversibil este de mai multe tipuri:
- inhibiia competitiv cnd inhibitorul determin o cretere a valorii constantei K M (deci o
diminuare a afinitii dintre enzim i substrat), parametrul Vmzx rmnnd constant;
- inhibiia necompetitiv cnd are loc o diminuare a valorii lui Vmzx (KM rmne constant);
- inhibiia incompetitiv sau anticompetitiv n care ambii parametri cinetici i micoreaz
valoarea ntr-un raport constant;
- inhibiia mixt care este o combinare a dou sau a tuturor celor trei efecte
anterioare.Schema general a unei reacii enzimatice n prezena inhibitorilor reversibili poate fi
redat astfel (Botts i Morales, 1953):

48
S

ES

I
P
S

EI S

EI

Prin omiterea unor ci din aceast schem se obine fiecare din cele patru tipuri de inhibiie
reversibil.
a) Inhibiia competitiv
Atunci cnd n mediul de reacie exist substane nrudite structural cu substratul natural al
enzimei respective, acestea se pot lega la centrul activ al enzimei. n acest caz, inhibitorul i
substratul se afl n competiie pentru situsul catalitic enzimatic. Dac mediul de reacie conine
concentraii crescute de substrat inhibiia dispare (competiia este ctigat de substrat a crui
concentraie este net superioar celei a inhibitorului). Deoarece att substratul ct i inhibitorul
interacioneaz cu centrul activ al enzimei, n inhibiia competitiv au loc urmtoarele reacii:
E + S

k+1
k -1

E + I

k+3
k -3

ES

k+2
k -2

E + P

EI

Complexul EI nu se scindeaz cu formarea vreunui produs de reacie, fiind un complex

neproductiv. Pentru ecuaiile de mai sus, relaia de echilibru se poate scrie ca fiind:
k+1[E][S] = (k-1 + k+2)[E]

de unde:

E S

ES

k 1 k 2
KM
k 1

49
i respectiv:
k+3 [E][I] = k-3 [E I]
de unde:

E I

EI

k 3
Ki
k 3

Constanta Ki se numete constant de inhibiie i descrie echilibrul dintre enzim, inhibitor i

complexul EI.
Prelucrarea matematic a acestor relaii (vezi IV.2.2) d ecuaia de vitez a reaciei enzimatice
n prezena unui inhibitor competitiv:

Vmax S

I
S K M 1
Ki

Comparnd aceast relaie cu ecuaia Michaelis-Menten (IV.2.2) se observ c valoarea

constantei KM este multiplicat cu termenul 1+([I]/K i). Acest produs reprezint constanta Michaelis
n prezena inhibitorului competitiv:

I
K' M K M 1

Ki

deci inhibiia competitiv determin creterea valorii constantei Michaelis (fig. 101).
1/v

1/Vmax

- 1/KM

- 1/K'M

1/[S]

Fig. 101. Reprezentarea grafic a funciei Lineweaver-Burk pentru o enzim inhibat competitiv

Exist multe exemple de inhibiie pur competitiv. Astfel succinat-dehidrogenaza, al crei

substrat natural este acidul succinic, prezint fa de acesta o valoare a constantei Michaelis
KM=1,3x10-3M. Dac n mediul de reacie se adaug acid malonic, acesta este un inhibitor

50
competitiv ce determin creterea valorii constantei Michaelis n funcie de concentraia sa,
constanta de inhibiie fiind Ki=4,1x10-5M. n mod similar L-alanin-dehidrogenaza (KM=1,7x10-3M
n raport cu L-alanina) este inhibat competitiv de ctre D-alanin (Ki=2x10-2M).
Exist numeroi compui ce manifest inhibiie competitiv pentru multe enzime datorit
similitudinii structurale cu substratele naturale ale acestora. Sunt ns i situaii cnd multe
substane pot juca rol de inhibitori competitivi, fr a fi omologi structurali ai substratelor. n aceste
situaii este posibil ca centrul activ al enzimelor, datorit caracterului hidrofob i flexibilitii sale,
s poat lega diferite molecule, chiar dac acestea sunt diferite structural de substratele naturale,
complecii rezultai fiind neproductivi. n cazul enzimelor oligomere, aceti compui se pot fixa la
nivelul diferitelor situsuri, altele dect centrul activ, determinnd o deformare a moleculelor
enzimatice. n toate aceste cazuri are loc o inhibiie de tip competitiv deoarece are loc o modificare
a valorii lui KM. Pentru a evita confuziile, Monod atribuie denumirea de efector de tip K pentru toi
inhibitorii ce determin o modificare a valorii constantei KM i respectiv efector de tip V pentru cei
ce modific parametrul Vmax.
Mecanismele prin care inhibitorii competitivi influeneaz viteza reaciilor enzimatice sunt
strns legate de specificitatea de aciune a enzimelor. Studiul inhibiiei competitive prezint un
interes enorm pentru toxicologie, pentru conceperea de noi medicamente, pentru industria de
pesticide i multe alte domenii. Pentru a putea aciona ca inhibitor competitiv, un compus chimic
dat trebuie s ndeplineasc mai multe condiii:
s prezinte analogie cu substratul natural al enzimei din punctul de vedere al formei i
dimensiunilor moleculei precum i din punctul de vedere al naturii i orientrii spaiale a grupelor
funcionale polare (ionizabile);
s ndeplineasc anumite criterii structurale care s-i permit legarea la nivelul centrului
activ al enzimei (puni de hidrogen, legturi ionice, interaciuni hidrofobe etc.).
Att n cazul lactozei ct i al substratului sintetic, -galactozidaza cliveaz restul de
galactoz, aflat sub forma anomerului la nivelul carbonului su semiacetalic. Orice modificare a
configuraiei la nivelul oricrui atom de carbon asimetric face ca enzima s fie total indiferent.
nlocuirea atomului de oxigen cu un atom de sulf, aa cum se ntmpl n IPTG, face ca legtura glicozidic s nu mai poat fi hidrolizat enzimatic. Acelai lucru se ntmpl i n cazul nlocuirii
gruprii alcoolice primare (de la C6 al restului de galactoz) cu o grupare metil.
Dac condiiile structurale sunt deosebit de riguroase n ceea ce privete restul de galactoz,
enzima este mult mai puin specific n raport cu restul de glucoz, ceea ce face ca n metodele de
determinare a activitii -galactozidazei s se foloseasc n calitate de substrat nu numai lactoza ci
i o serie ntreag de derivai O-glicozidici ai -D-galactozei.

51
n prezent se cunosc foarte muli compui capabili s exercite inhibiie competitiv asupra
diferitelor sisteme enzimatice i muli inhibitori de acest tip prezint importante utilizri practice.
De cele mai multe ori inhibitorii competitivi prezint similitudini structurale cu substratele naturale
ale enzimelor pe care le inhib. Printre acetia se numr i numeroase pesticide, erbicide i ageni
antivirali al cror mecanism de aciune const n stoparea biosintezei acidului nucleic al agentului
patogen.
Un inhibitor competitiv propriu-zis nu este transformat de ctre enzima asupra creia
acioneaz. Dac un anumit compus ce prezint o structur chimic asemntoare cu cea a
substratului natural este transformat de ctre enzima respectiv, el nu poate fi catalogat ca fiind
inhibitor competitiv ci este un analog de substrat. Uneori, aciunea enzimelor asupra analogilor de
substrat amintete de cinetica reaciilor enzimatice inhibate competitiv, fapt ce ar putea avea
urmtoarele explicaii:
aciunea enzimelor asupra analogilor de substrat este foarte lent;
aciunea enzimelor este deturnat, transformrile ce au loc decurgnd ntr-o alt direcie
ce nu este detectat de metodele respective.
Cea de a doua situaie se pare c este foarte frecvent, ntlnindu-se, de exemplu, n cazul
agenilor antivirali. n cele mai simple cazuri, agentul antiviral concur cu substratul natural al unei
enzime implicat ntr-o reacie important, absolut necesar replicrii virusului. n alte cazuri,
agentul antiviral este transformat, substituind substratul natural i conduce la apariia unui compus
care este inhibitorul competitiv al enzimei implicat n etapa urmtoare a ciclului viral (Mazunder,
A. et al. 1994).
Printre cei mai cunoscui ageni antivirali se numr trei compui ce au o structur chimic
similar cu cea a timidinei: ribavirina, acicloguanozina (aciclovir) i respectiv azatimidina (AZT):
Ribavirina este un analog structural al guanozinei foarte activ fa de unele virusuri deoarece
guanozina intr n structura fragmentului 5-terminal al ARN m prezent n virus. Din pcate,
ribavirina prezint o anumit toxicitate i asupra celulelor normale, putnd genera anumite forme de
anemie n urma aciunii asupra celulelor sanguine.
Aciclovirul (acicloguanozina) este un inhibitor competitiv care, sub aciunea timidin-kinazei
specifice din virusul herpesului, este transformat n derivatul su monofosforilat ce intr, la rndul
su, n competiie cu acidul deoxitimidilic (dTMP). Acesta din urm este fosforilat n mod normal
de kinazele celulare specifice cu formare de dTDP i dTTP. De aceea, celulele infectate sunt primele
n care ADN-polimeraza se inactiveaz datorit absenei dTTP-ului.
Azatimidina (AZT, numit i Zidovudin sau Retrovir) este un medicament utilizat n tratarea
SIDA chiar dac are i unele efecte toxice asupra mduvei osoase. Ea este transformat n derivatul

52
su trifosforilat (AZTTP) de ctre kinazele celulare, acesta din urm jucnd rol de inhibitor
competitiv al revers-transcriptazei. De fapt, AZT manifest dou aciuni asupra reverstranscriptazei: pe de o parte concur cu substratul natural (dTTP) pentru centrul activ al enzimei, iar
pe de alt parte ntrerupe etapa de elongare a ADN-ului deoarece gruparea azidic (N 3) mpiedic
legarea nucleotidului urmtor. S-a demonstrat c revers-transcriptaza este de peste 100 de ori mai
sensibil la aciunea AZTTP dect ADN-polimeraza celular. De asemenea, AZT este inhibitor
competitiv i pentru integraz, enzim implicat n ciclul viral la nivelul integrrii ADN-ului viral
rezultat n urma transcripiei inverse (Mazunder, A. et al. 1994).
b) Inhibiia necompetitiv
Acest tip de inhibiie are loc atunci cnd ntre inhibitor i substrat nu exist nici o analogie
structural, inhibitorul legndu-se la situsuri specifice, altele dect situsul catalitic. n asemenea
situaii, nu exist nici o concuren ntre substrat i inhibitor. Legarea inhibitorului de enzim
determin diferite modificri conformaionale ale moleculelor enzimatice cu repercusiuni asupra
valorilor parametrilor cinetici. Inhibiia necompetitiv pur caracterizat prin modificarea lui Vmax,
fr ca valoarea constantei KM s fie afectat, apare n foarte puine cazuri. Cei mai cunoscui
inhibitori necompetitivi sunt compuii cu molecule mici de tipul protonilor, ionilor metalici etc.
Deoarece inhibitorul reacioneaz cu enzima la nivelul unor situsuri diferite de cel catalitic, n
inhibiia necompetitiv se pot forma dou tipuri de compleci binari (ES i EI) i un complex ternar
(ESI) n care enzima fixeaz att substratul ct i inhibitorul:
E + S

E + I

EI + S

ES + I

k+1

k+2

ES

k -1

k+3
k -3

k+4
k -4
k+5

k -2

E + P

EI

ESI

ESI

k -5

Prin calcule similare celor anterioare, se scriu relaiile de echilibru pentru fiecare ecuaie, iar
prin prelucrare matematic se determin ecuaia ce descrie viteza de reacie n prezena unui
inhibitor necompetitiv ca fiind:

53

V max S

K M S

1
1

Ki

sau:

'
Vmax
S
K M S

n care:
'
Vmax

Vmax
I
1
Ki

Deci, n inhibiia necompetitiv, are loc o scdere a valorii parametrului Vmax, constanta KM
rmnnd nemodificat.
Deoarece inhibitorul nu concur cu substratul pentru centrul activ al enzimei, KM rmne
nemodificat, ceea ce nseamn c afinitatea enzimei pentru substratul su nu se schimb.
Inhibiia necompetitiv pur apare n foarte puine cazuri deoarece interaciunea inhibitorului
cu enzima determin, de regul, o deformare a moleculei enzimatice, ceea ce nseamn c i
conformaia centrului activ poate s sufere modificri mai mult sau mai puin pronunate. Acestea la
rndul lor determin i o modificare a afinitii enzimei pentru substrat i deci a constantei K M.
Pentru a putea fi delimitat de inhibiia competitiv, acest tip de inhibiie se mai numete i
inhibiie competitiv aparent, iar reprezentarea grafic a ecuaiei Lineweaver-Burk nu este o
dreapt ci are aspect hiperbolic.
c) Inhibiia incompetitiv (anticompetitiv)
Complexul ternar ESI ce se formeaz n inhibiia necompetitiv ia natere prin interaciunea
enzimei libere cu inhibitorul, complexul EI format astfel interacionnd apoi cu substratul. n
inhibiia incompetitiv, inhibitorul nu se fixeaz pe enzima liber ci interacioneaz cu complexul
Michaelis, din care cauz are efecte similare att asupra lui V max ct i a lui KM. n acest caz au loc
reaciile:

54
k+1
k -1

E + S

k+3
k -3

ES + I

ES

k+2
k -2

E + P

ES I

k+4
k -4

E + I + P

Plecnd de la reaciile de echilibru i prelucrnd matematic ca n celelalte tipuri de inhibiie,

se obine relaia vitezei sub forma:
'
Vmax
S
v '
K M S

n care:
'
Vmax

Vmax
I
1
Ki

I
; K 'M K M 1
Ki

Factorul 1+([I]/Ki) modific att Vmax i KM, ceea ce nseamn c inhibitorii incompetitivi
afecteaz ambii parametri cinetici dar nu modific raportul Vmax/KM.

d) Inhibiia mixt
Cele trei tipuri de inhibiie descrise se manifest rareori n form pur. Cele mai multe enzime
pot suferi inhibiie mixt n care efectele inhibitorului sunt comune pentru dou sau pentru toate
cele trei tipuri de inhibiie simpl.
Pentru a nelege mai bine mecanismul inhibiiei mixte, s lum n considerare o enzim dat
ce catalizeaz o reacie bimolecular printr-un mecanism de tip ping-pong. Enzima poate oscila
ntre dou forme conformaionale E1 E2 i acioneaz asupra substratelor S1 i S2 pentru a forma
produii P1 i P2:

S1

E1

E1S1

S2

P1

E2P1

E2

E2S2

P2

E1P2

E1

55

Se constat c substratul S1 i produsul P2 se leag numai de una din formele conformaionale

al enzimei (E1), n timp ce S2 i P1 se leag de forma conformaional E2. Aceasta nseamn c
produsul P2 se comport ca un inhibitor competitiv n raport cu substratul S1 i ca un inhibitor
necompetitiv n raport cu substratul S2, n timp ce produsul P1 este inhibitor competitiv n raport cu
substratul S2 i respectiv necompetitiv n raport cu substratul S1.

V. METODE I TEHNICI UTILIZATE N ENZIMOLOGIE

Datorit structurii lor chimice i rolului pe care-l ndeplinesc n organismele vii, enzimele
prezint unele caracteristici comune cu ale altor biomolecule dar i proprieti specifice. Fiind
proteine, enzimele prezint toate proprietile fizico-chimice i structurale ale acestora. Fiind
biocatalizatori, respect toate legile catalizei chimice, iar faptul c acioneaz n organismele vii
determin o serie de caracteristici specifice (vezi cap.IV.1).
Un studiu complet i corect al enzimelor sub aspectul structurii lor chimice, cineticii reaciilor
enzimatice, specificitii lor de aciune etc. presupune, n primul rnd, izolarea lor din surse
biologice i purificarea pn la un grad de puritate ct mai nalt. Metodele utilizate la izolarea i
purificarea enzimelor sunt comune cu cele utilizate n studiul proteinelor n general. Spre deosebire
ns de proteinele necatalitice, n cazul enzimelor trebuie evitat nu numai denaturarea ci i
inactivarea lor. Este cunoscut faptul c stabilitatea maxim a enzimelor se ntlnete in vivo, adic
n mediul lor natural. Cu ct gradul lor de puritate crete, cu att stabilitatea enzimelor scade, fapt ce
impune unele precauiuni suplimentare pe parcursul procedurilor de separare i purificare.
Principalii factori ce inactiveaz enzimele n timpul acestor proceduri sunt temperatura i pH-ul
mediului. n afara temperaturilor ridicate i a valorilor extreme de pH, enzimele sunt puternic
afectate i de modificrile brute ale acestor factori. De aceea, toate operaiunile se execut la rece
(0 +4oC), iar separarea fazei insolubile se face utiliznd centrifuga cu rcire. Sunt i operaiuni care
se execut la temperaturi foarte joase. De exemplu, precipitarea enzimelor cu diferii solveni
(aceton, alcool izopropilic etc.) se face la 15oC sau chiar 20oC.
Modificarea pH-ului ntr-un interval mic al valorilor acestui parametru determin o modificare
mai mult sau mai puin accentuat a activitii enzimelor, iar valorile extreme (de regul n afara
intervalului de pH 5-9) produc chiar denaturarea acestora. De aceea ajustarea pH-ului se face la pHmetru i nu cu ajutorul hrtiei indicatoare. Acest lucru se face sub agitare continu, utiliznd soluii

56
acide sau alcaline diluate care se adaug cu pictura pentru a evita o modificare prea puternic a
pH-ului n zona de contact din jurul picturii.
i modificarea triei ionice a mediului are influen asupra capacitii catalitice a enzimelor
prin afectarea structurii chimice a biocatalizatorului. Acest lucru se explic prin faptul c enzimele
au, n general, o structur compact n care resturile polare sunt orientate spre exterior n marea lor
majoritate interacionnd cu dipolii apei. Fora ionic a mediului poate perturba stratul apos din
imediata vecintate a moleculei enzimatice. n mod similar pot aciona i unii ageni tensioactivi
utilizai n scopul solubilizrii enzimelor fixate n membranele biologice ale diferitelor structuri
subcelulare. i prezena n mediu, chiar n concentraii mici, a inhibitorilor i activatorilor
influeneaz capacitatea catalitic a enzimelor. Un factor extern ce poate influena puternic
activitatea enzimelor l reprezint contaminarea microbian, motiv pentru care operaiunile de
separare i purificare trebuie efectuate ct mai repede posibil.
n cercetrile de enzimologie se utilizeaz soluii preparate n ap distilat sau bidistilat (n
funcie de enzim), iar reactivii folosii trebuie s aib un grad de purificare ct mai nalt posibil. De
regul se folosesc reactivi din categoria chimic pur (c.p.) i reactiv pentru analiz (p.a.).

V.1 Surse de enzime

Din punctul de vedere al localizrii lor, enzimele se clasific n dou grupe principale:
a) enzime solubilizate n diferite lichide biologice (snge, urin, lichid cerebrospinal, lichid
interstiial, sperm, saliv, citoplasm, mediu de cultur pentru microorganisme, sev etc.);
b) enzime fixate pe diferite structuri tisulare i subcelulare. n acest din urm caz, multe
enzime sunt puternic legate de diferite componente ale membranelor biologice, fcnd parte din
structura lor. Alegerea sursei optime pentru izolarea i purificarea unei enzime date se face n
funcie de mai multe criterii. n primul rnd se alege materialul biologic cel mai bogat n enzima
respectiv. Cum ntr-un esut localizarea unor enzime este diferit, iar n fiecare celul enzimele
sunt localizate preponderent sau exclusiv n anumite organite celulare, prima operaiune a tehnicilor
de izolare o constituie omogenizarea esutului i separarea formaiunilor subcelulare respective prin
centrifugare difereniat. Dei majoritatea enzimelor se ntlnesc n mai multe organite subcelulare,
esuturi, organe i respectiv lichide biologice, exist enzime localizate exclusiv ntr-o formaiune
subcelular fiind enzime indicator pentru fraciunea subcelular respectiv. Principalele enzime
indicator sunt urmtoarele:
a) nuclee:
- ARN-polimeraza ADN-dependent;
- ATP : NMN-adenoziltransferaza.

57
b) mitocondrii:
- monoamin-oxidaza;
- adenilat-kinaza;
- componentele catenei respiratorii.
c) peroxisomi:
- catalazele;
- D-aminoacid-oxidazele;
- peroxidazele.
d) lisosomi:
- fosfomonoesteraza acid;
- catepsinele.
e) microsomi:
- oxidaze NADPH-dependente;
- citocrom b3-reductaza.
f) citosol:
- aminoacil-ARNt-sintetazele;
- acil-CoA-sintetazele;
- transcetolaza;
- fosfofructokinaza.
Localizarea enzimelor n organe, esuturi i celule este primul criteriu de care se ine cont n
alegerea sursei optime. De exemplu, cea mai bun surs de pepsin o reprezint sucul gastric n
timp ce -amilaza, tripsina i lipaza se vor izola din esutul pancreatic, iar fosforilaza din esutul
muscular.
Studiul metodelor de extracie i purificare a enzimelor din cele mai diferite surse biologice
ocup un loc central n biotehnologia enzimatic. Pentru a argumenta acest lucru este suficient s
menionm faptul c producia mondial de enzime prezenta n 1990 o cifr de afaceri de cca. 600
milioane de dolari (Scriban, R. 1993). Aproximativ 60% din cantitatea total de enzime se
utilizeaz n industria agro-alimentar. Dintre acestea, 16 enzime sunt considerate enzime
industriale i ocup aproximativ 90% din piaa mondial de desfacere. Datorit importanei lor
practice, enzimele utilizate n industria agro-alimentar i cea farmaceutic fac obiectul unor
reglementri internaionale foarte exigente n ceea ce privete producia, precum i puritatea lor
chimic, biochimic i microbiologic. Enzimele ce se utilizeaz n calitate de biocatalizatori n
industria alimentar, farmaceutic, textil, de pielrie etc. pot fi obinute practic din toate sursele
biologice, existnd din acest punct de vedere trei categorii de enzime:

58

enzime de origine vegetal;

enzime de origine animal;

enzime de origine microbian.

a) Enzimele de origine vegetal

Din sursele vegetale se obine o gam larg de enzime, mai importante din punct de vedere
practic fiind enzimele proteolitice: papaina sintetizat de o plant din zonele tropicale (Carica
papaya), bromelina sintetizat de ananas (Ananas comosus Merr), ficina din Ficus glabrata i
altele. Toate aceste enzime sunt proteinaze tiolice deoarece conin n centrul lor activ o grupare
tiolic liber (un rest de cistein) indispensabil activitii lor catalitice. Arborele de papaya este o
plant foarte rspndit n zonele tropicale, iar papaina brut sau purificat se obine industrial n
cantiti foarte mari datorit numeroaselor sale aplicaii practice n domeniul industrial i terapeutic.
Cantitile cele mai mari de papain (aproximativ 12% din substana uscat) se gsesc n
fructele de papaia, nainte de coacere. Pentru obinerea industrial a papainei pure se recolteaz
latex-ul care se depoziteaz la rece (+4oC). Pentru nlturarea impuritilor se dilueaz cu ap
distilat, se agit i se centrifugheaz sau se filtreaz pe kiesselguhr, dup care se liofilizeaz sub
vid la 50oC. Se obine o pudr de culoare alb care ns se oxideaz relativ uor, devenind brun,
datorit prezenei grupelor SH libere. Din aceast cauz, ambalarea se face n condiii care
mpiedic att oxidarea ct i contaminarea microbian.
Activitatea proteolitic a papainei industriale astfel obinute oscileaz ntre 40.000 i 84.000
U.P. (uniti proteazice). Prin electroforez pe acetat de celuloz s-a demonstrat faptul c
preparatele industriale de papain conin trei componente majore: papaina (? E.C. 3.4.22.2),
chimopapaina (?E.C. 3.4.22.6) i lizozimul (?E.C. ).
Papaina nalt purificat a fost cristalizat prima dat n 1937 de ctre Balls, T. et al. Ea este o
enzim tiolic ce conine 211 resturi de aminoacizi i are o mas molecular de 23 kD. Temperatura
optim de aciune se situeaz ntre 55 60oC, enzima avnd o termostabilitate crescut (denaturarea
termic se observ abia la 65 70C), iar pH-ul optim se nscrie n domeniul de pH 5,0 7,0 ceea
ce faciliteaz utilizarea sa n diferite procese biotehnologice.
Papaina se utilizeaz n multe domenii industriale. Din cele aproximativ 300 de tone ct este
consumul anual, aproximativ 75% reprezint consumul n industria berii, 10% n industria crnii,
5% n fabricarea hidrolizatelor de pete i capuri de pasre pentru nutriia animalelor, 2% n
industria chimico-farmaceutic etc. Preparatele de papain imobilizat se folosesc la hidroliza latexului de arahide, hidrolizatele obinute utilizndu-se la stabilizarea fizico-chimic a sucurilor de
struguri i mere.

59
Chimopapaina este o alt proteinaz tiolic sintetizat de Carrica papaya. Ea se deosebete
de papain printr-o solubilitate mai mare i printr-o mai bun stabilitate la valori acide de pH. n
latex-ul arborelui de papaya, coninutul n chimopapain este cu mult mai mare dect cel de
papain, iar masa sa molecular este cuprins ntre 27 33 kD. n afar de proteine, chimopapaina
mai hidrolizeaz i alte substrate cum ar fi peptidele, poliamidele i esterii aminoacizilor. Prin
electroforez pe acetat de celuloz, fraciunea proteic reprezentat de chimopapain se separ n
dou subfraciuni care au fost catalogate ca fiind chimopapaina A i respectiv chimopapaina B.
Ficina (E.C. 3.4.4.12) este o proteinaz tiolic din latex-ul plantelor aparinnd genului
Ficus. Molecula sa conine o singur caten polipeptidic i are masa molecular de aproximativ 26
kD. Specificitatea de substrat a ficinei este relativ larg, iar activitatea catalitic maxim se
manifest ntr-un interval larg de pH.
b) Enzimele de origine animal
n prezent, dintre enzimele de origine animal, cea mai mare importan pentru industrie o
prezint pepsina porcin i bovin. Pepsina bovin este un constituent normal al cheagului, secreia
sa fiind abundent dup nrcare. Utilizarea practic a pepsinei porcine a nceput n perioada anilor
30 din secolul XX dar a cunoscut o amploare deosebit dup 1960. pentru obinerea sa la scar
industrial, se utilizeaz mucoasa gastric de porc unde pepsina se gsete sub forma precursorului
su inactiv numit pepsinogen. Pentru obinerea pepsinei se pot utiliza mai multe metode, cea mai
des folosit fiind extracia, din mucoasa raclat, cu ap distilat acidulat cu acid clorhidric n
prezen de cloroform. Dup filtrare se concentreaz prin liofilizare, obinndu-se o pulbere alb,
solubil n ap (Scriban, R. 1993).
Activarea pepsinogenului se realizeaz la pH < 6,0 i const ntr-o proteoliz limitat prin
care se cliveaz mai multe peptide. Aceast conversie a pepsinogenului n pepsin activ se
realizeaz practic prin meninerea zimogenului timp de patru minute la pH = 2,0 2,5 sau timp de
12 ore la pH = 3,0 (Scott, R. 1979). Pepsina obinut este de fapt un amestec de trei enzime:
pepsina A (E.C. 3.4.23.1 ?), pepsina B (E.C. 3.4.23.2 ?) i pepsina C (E.C. 3.4.23.3 ?)
activitatea catalitic este considerabil n intervalul de pH 1,0 4,0 cu un pH optim de aciune de
1,8 dar care poate ns oscila n funcie de natura substratului. La temperaturi mai mari de 55C
pepsina aflat n soluie apoas este termolabil, fapt ce i limiteaz utilizarea n diferite procese
biotehnologice, ns anumite tratamente de corecie i conserv capacitatea de coagulare a cazeinei,
proprietate ce st la baza fabricrii brnzeturilor. Astfel, modificarea grupei COOH libere din
poziia 11 (de exemplu prin esterificare) n molecula pepsinei porcine conduce la o modificare
profund a specificitii de aciune i a proprietilor catalitice i fizico-chimice. Sub aceast form

60
modificat pepsina i conserv ns capacitatea de a coagula proteinele putnd fi folosit n
industria laptelui (Mo, C. Y. et al. 1980).
Actualmente, pepsina se folosete n industria buturilor rcoritoare, n industria berii la
stabilizarea coloidal n timpul pasteurizrii etc. Toate aceste utilizri se bazeaz pe proprietatea
pepsinei de a precipita proteinele i polipeptidele (efectul clotting) n sucuri, bere, lapte .a.
Mai menionm faptul c pepsina poate realiza scindarea hidrolitic a unor enzime cum ar fi
amilazele, tripsina, papaina etc., fapt de care trebuie s se in cont la utilizarea sa practic.
Au mai fost obinute preparate de pepsin i din stomacul altor animale, cea mai intens
studiat fiind pepsina din morunul din Oceanul Atlantic. La 15C aceast pepsin prezint o
capacitate de coagulare a laptelui mult mai mare dect cheagul de viel, fiind astzi utilizat n
procesul tehnologic de obinere a cacavalului Cheddar (Brewer, P. et al. 1984). Aceleai
brnzeturi se pot fabrica i prin utilizarea pepsinei de gin cu condiia ca maturarea s nu
depeasc trei luni. Aproximativ 50% din cacavalul fabricat n Israel se obine cu ajutorul
pepsinei de gin, iar n Canada s-au obinut rezultate foarte bune n fabricarea cacavalului
Cheddar prin utilizarea pepsinei de foc (Shamsuzzaman, K. et al. 1985).
c) Enzimele de origine microbian
Obinerea enzimelor de origine microbian a luat o amploare deosebit dup clarificarea
mecanismelor de biosintez a enzimelor de ctre microorganisme. Spre deosebire de sursele de
origine vegetal i animal, folosirea surselor microbiene de enzime prezint unele avantaje majore:
producia de enzime de natur microbian nu depinde de condiiile climaterice i geografice;
se utilizeaz materii prime regenerabile ce pot fi reprezentate deseori de deeuri din alte industrii;
randamentele pot fi mrite prin optimizarea condiiilor de cultivare i prin alegerea de tulpini
microbiene performante.
Toate aceste avantaje au fcut ca producia mondial de enzime de origine microbian s cunoasc
o dezvoltare important n ultimele decenii, pentru obinerea lor fiind necesar parcurgerea mai
multor etape obligatorii.
Stabilirea enzimei ce urmeaz a fi obinut
n obinerea unei enzime de uz industrial se ine cont, n primul rnd, de procesele de
biotransformare n care va fi utilizat enzima respectiv. Este absolut obligatorie determinarea
principalelor caracteristici ale enzimei n cauz, cele mai importante fiind urmtoarele:

61
Specificitatea de aciune. Din acest punct de vedere o problem extrem de important o
constituie activitatea global

a preparatelor enzimatice comerciale dat fiind probabilitatea

existenei i altor capaciti catalitice pe lng cea principal, activiti ce pot realiza transformri
indezirabile. n cazul pectinazei de exemplu (enzim utilizat pe scar larg n industria de
cofetrie), preparatele enzimatice pot conine de fapt trei enzime cu activiti catalitice diferite. n
funcie de procesele ce urmeaz a se realiza, se aleg preparatele enzimatice convenabile a cror
specificitate de aciune se manifest fa de substratele de care dispunem.
pH-ul optim de aciune. Acest factor poate manifesta o influen hotrtoare asupra bunei
desfurri a proceselor biotehnologice realizate de enzime. n general, se aleg enzime ce i menin
activitatea catalitic ntr-un interval ct mai larg posibil de pH.
Temperatura optim de aciune. n general, n industrie sunt preferate enzimele a cror
temperatur optim de aciune este ct mai mare posibil deoarece la temperaturi relativ crescute este
facilitat meninerea sterilitii mediului.
Alegerea tulpinii microbiene
Microorganismele capabile s sintetizeze n cantiti crescute anumite enzime se ntlnesc, n
condiii naturale, n acele habitaturi care conin substratele enzimelor respective, acesta fiind un
factor extrem de important de care se ine cont n alegerea tulpinii productoare. De exemplu, dac
se intenioneaz s se obin enzime celulozolitice, tulpinile microbiene productoare se vor izola
din medii naturale bogate n celuloz. Iniial cel3e mai multe microorganisme se izolau din sol.
Actualmente ns aria cercetrilor a fost mult extins, fiind studiat posibilitatea izolrii
productorilor industriali de enzime i din alte surse: ape reziduale, reziduuri din industria celulozei,
a pielriei, cea alimentar etc., reziduuri din zootehnie i altele.
Pentru izolarea tulpinilor microbiene productoare de enzime se folosesc metodele clasice,
cea mai important fiind metoda cultivrii pe medii mbogite urmat de realizarea de subculturi pe
medii selective. ntr-un mediu selectiv ideal, substratul enzimei n cauz reprezint unica surs a
unuia din elementele vitale (de exemplu unica surs de carbon). Astfel, pentru obinerea de amilaze,
mediul selectiv trebuie s conin amidonul ca unic surs de carbon i energie.
Pentru obinerea de enzime la scar industrial, tulpinile microbiene productoare trebuie s
ndeplineasc o serie de condiii (Aunstrup, K. 1979):
s se dezvolte pe medii ct mai simple cu putin i ieftine;
s produc ct mai puini metabolii secundari;
enzima ce urmeaz a fi obinut s fie exportat n mediul de incubare n aa fel nct s fie
uor de izolat i purificat;
s nu fie poluante;

62
s nu fie patogene i s nu produc metabolii toxici.
Dac enzimele n cauz urmeaz s fie utilizate n industria alimentar, tulpinile microbiene
productoare trebuie s ndeplineasc toate condiiile G.R.A.S. (Generaly Recognized As Safe)
adic toate condiiile impuse produselor alimentare. De aceea, orice nou tulpin studiat, nainte de
a fi utilizat n producerea de enzime, este supus unui minuios examen toxicologic, ceea ce
necesit mult timp. Acesta este motivul datorit cruia majoritatea cercettorilor prefer tulpinile
microbiene deja incluse n cataloagele GRAS.
Dup alegerea tulpinii productoare se pot face numeroase studii de optimizare a proceselor
fermentative, iar ingineria genetic ofer posibiliti teoretic infinite de ameliorare. Se apeleaz
foarte des la realizarea de mutante n vederea obinerii unor tulpini productoare de enzime cu
randamente superioare. n acelai timp, prin mutaii pot fi suprimate acele caractere ale tulpinii
slbatice care influeneaz negativ producia industrial a enzimelor, dat fiind faptul c, deseori,
tulpinile slbatice produc unii metabolii secundari, alte enzime dect cea care ne intereseaz,
antibiotice etc., compui ce se elimin relativ greu. De exemplu, n cazul obinerii glucoamilazei,
preparatele rezultate conin de multe ori cantiti relativ mari de transglucozidaz, iar proteaza
produs de Bacillus licheniformis este impurificat cu bacitracin. Cea mai eficient metod const
n obinerea unor mutante care s nu produc metaboliii secundari respectivi (Aunstrup, K. 1979).
n ultimul timp, ingineria genetic ofer noi posibiliti de obinere a enzimelor de interes
industrial. Cel mai adesea se recurge la clonarea genei responsabile de biosinteza unei enzime dintrun microorganism incompatibil cu industria alimentar ntr-un al microorganism agreat de G.R.A.S.
Cultivarea tulpinii productoare
Iniial, enzimele de origine microbian se obineau prin realizarea culturilor de suprafa pe
medii solide sau semisolide. Aceast metod se mai utilizeaz nc la obinerea unor enzime de
origine fungic cum ar fi amilazele (Aspergillus), proteazele (Aspergillus i Mucor), pectinazele
(Penicillium) i altele. Actualmente sunt ns preferate culturile submerse deoarece n cazul
culturilor pe mediu solid apar dificulti n ceea ce privete controlul temperaturii, umiditii i
aerrii. Culturile n mediu lichid reduc riscul contaminrii i permit controlul periodic al
parametrilor biochimici i microbiologici.
Extracia i purificarea enzimelor
La sfritul perioadei de cultivare, enzimele trebuie extrase din celule i/sau lichidul de
cultur dup care sunt supuse unui ir de operaiuni pentru obinerea preparatelor comerciale. Cel
mai adesea se folosete centrifugarea, filtrarea, evaporarea, precipitarea reversibil, liofilizarea .a.,
iar preparatele enzimatice obinute se pot comercializa sub form de pudre, soluii, cristale, sub
form imobilizat etc.

63
n cazul enzimelor intracelulare extracia lor este mai dificil i presupune realizarea unei
etape suplimentare de liz a celulelor microbiene, dup care procedurile sunt similare cu cele
aplicate enzimelor extracelulare.

V.2 Extracia enzimelor

n cazul enzimelor solubilizate n lichide biologice, extracia enzimelor se face direct din
acestea. Pentru enzimele fixate pe structuri celulare, se efectueaz mai nti omogenizarea esutului,
izolarea structurilor subcelulare i solubilizarea enzimelor.
a) Omogenizarea esuturilor se face fie prin mojarare pe nisip de cuar sau sticl pisat, fie cu
ajutorul omogenizatoarelor speciale (de exemplu de tip Potter). Pentru aceasta, se sacrific animalul
fr a-l stresa. Se recolteaz imediat organul sau esutul interesat i se introduce ntr-o capsul rece,
aflat pe ghea. Dac omogenizarea i operaiunile ulterioare nu se execut imediat, se recomand
congelarea esutului pentru a mpiedica inactivarea enzimelor.
Se mrunete apoi esutul cu un bisturiu sau cu un foarfece rece. Fragmentele astfel obinute
se introduc n tubul de omogenizare care este o eprubet cu pereii interiori rodai. Aceasta se
introduce apoi ntr-un pahar ce conine ap cu ghea, iar n tub se introduce pistilul
omogenizatorului. Se apas pe pedala acestuia pentru a conferi pistilului o micare de rotaie i se
omogenizeaz esutul executnd o micare de du-tevino de-a lungul axului pistilului.
Omogenizarea se realizeaz un anumit interval de timp i cu o anumit vitez de rotaie, n funcie
de tipul esutului. n lipsa omogenizatorului special, dezintegrarea esutului se poate face i prin
mojarare pe nisip de cuar, sticl pisat, oxid de aluminiu, pmnt de diatomee etc. Se recomand ca
aceast operaiune s se execute la rece i n camere frigorifice speciale.
Att omogenizarea ct i mojararea se face n prezena unui lichid de extracie (soluie salin
izotonic, soluie izotonic de zaharoz, diferite soluii tampon, ap bidistilat etc.). O alt
modalitate de obinere a extractelor acelulare o constituie congelarea-decongelarea repetat, metod
des folosit n special pentru levuri. Dezintegrarea peretelui celular se mai poate efectua prin tratare
cu ultrasunete, tratament enzimatic (lizozim, proteaze, lipaz etc.), tratament chimic (deoxicolat de
sodiu, triton X-100, uree, guanidin etc.) i alte metode.
b) Izolarea structurilor subcelulare. Dup omogenizarea esutului, omogenatele obinute sunt
supuse centrifugrii difereniate n vederea separrii structurilor subcelulare. Centrifugarea se face
la rece, dup ce instalaia frigorific a centrifugei cu rcire a fost cuplat n prealabil pentru rcirea
rotorului i eprubetelor. n funcie de scopul urmrit, se folosesc diferite viteze de rotaie i intervale
de timp diferite

64
Dei viteza de rotaie este marcat la toate tipurile de centrifug n rotaii pe minut, n toate
metodele i tehnicile de centrifugare difereniat aceasta este redat ca multiplii ai acceleraiei
gravitaionale (g) deoarece una i aceeai centrifug poate avea rotoare cu raze diferite, ceea ce
nseamn c fora centrifug este diferit pentru rotoare de diametru diferit la acelai numr de
rotaii pe minut. Folosind viteze de rotaie i timpi intermediari pot fi obinute fraciuni mai fine. De
exemplu mitocondriile formeaz reziduuri n condiii apropiate cu cele specifice reticulului
endoplasmatic, cele dou fraciuni putnd fi obinute printr-o nou centrifugare. n mod similar,
dup dezintegrarea membranelor mitocondriale, cele dou membrane pot fi obinute n fraciuni
separate.
c) Solubilizarea enzimelor. Enzimele fixate pe structurile subcelulare nu pot fi extrase dect
dup ndeprtarea lor din aceste structuri. n acest scop, fraciunea subcelular ce ne intereseaz este
supus dezintegrrii prin diferite metode. Poate fi utilizat tratamentul sonic, tratamentul enzimatic,
chimic etc. Printr-o modalitate sau alta, membrana biologic respectiv este dezintegrat, iar
enzimele se solubilizeaz n mediul de extracie. ndeprtnd prin centrifugare la rece resturile
membranare se obin, n final, supernatante ce conin enzimele n form solubil.
Pentru separarea i purificarea enzimelor din diferite lichide biologice, acestea se utilizeaz
direct, operaiunile ce se execut fiind asemntoare cu cele aplicate supernatantelor obinute n
ultima faz pentru enzimele membranare. n cazul enzimelor microbiene, cele extracelulare se
extrag direct din lichidele de cultivare dup ndeprtarea biomasei, iar enzimele intracelulare pot fi
extrase ca i enzimele membranare de origine vegetal sau animal.
Schema general de extracie i purificare a enzimelor microbiene extracelulare i intracelulare
cuprinde o serie de etape obligatorii ce se respect pentru toate enzimele.

Metode de extracie a enzimelor. Condiii optime de extracie

Lichidele biologice, precum i supernatantele obinute dup solubilizarea enzimelor
membranare, se trateaz n continuare n mod asemntor. Deoarece mediile respective conin un
numr foarte mare de proteine, enzimele fiind deseori n cantiti mai mici dect proteinele
structurale, se trece la extracia acestora n vederea obinerii aa-numitelor preparate enzimatice
brute care conin cea mai mare parte a enzimei studiate i un numr relativ restrns de proteine
balast. Aceast operaiune are la baz proprietatea proteinelor de a precipita reversibil i difereniat

65
n funcie de cantitatea, respectiv intensitatea factorului precipitant. Enzimele pot fi precipitate
selectiv prin mai multe metode, alegerea metodei optime fiind n funcie de enzima ce urmeaz a fi
izolat.
a) Termoprecipitarea este o metod aplicat relativ rar, putnd fi aplicat doar pentru
enzimele termostabile. Marea majoritate a proteinelor sunt stabile ntr-un interval termic relativ
restrns (0 +40oC), temperaturile situate n afara acestui interval putndu-le denatura. Dac
enzima ce urmeaz a fi separat este termostabil, se nclzete mediul la o temperatur ct mai
ridicat posibil dar care s nu afecteze enzima respectiv. La aceast temperatur proteinele balast
sunt denaturate, putnd fi ndeprtate prin centrifugare.
b) Precipitarea la pH izoelectric. Fiind proteine, moleculele enzimelor conin grupe
funcionale acide i bazice care sunt orientate, de regul, spre exterior unde interacioneaz cu
dipolii apei. Fiecare protein, n general, este caracterizat de o structur primar specific, avnd
deci un numr dat de grupe funcionale ionizabile. De aceea, fiecare din ele se caracterizeaz printro valoare specific a punctului izoelectric, adic a acelei valori de pH la care molecula este neutr
din punct de vedere al ncrcrii electrice. Ajustarea mediului la un pH egal cu punctul izoelectric al
unei enzime date face ca interaciunea moleculelor acesteia cu dipolii apei s nceteze, stratul apos
din micromediul imediat vecin moleculei enzimatice dispare, iar enzima precipit.
Grupele funcionale polare, valoarea punctului izoelectric i comportarea acido-bazic a unei
enzime pot fi determinate prin trasarea curbei de titrare poteniometic. n general, enzimele au
valori diferite ale pH-ului lor izoelectric. De exemplu, pentru catalaz pI=5,4; pepsina are pI=1,0;
elastaza are pI=8,5; iar punctul izoelectric al lizozimului (muramidaza) din ou este la pH=11,0.
c) Precipitarea cu solveni organici se bazeaz pe proprietatea acestora de a diminua valoarea
constantei dielectrice a mediului cu repercusiuni asupra forelor de atracie coulombian dintre
radicalii polari ai enzimei. n mediu apos, forele de atracie dintre moleculele de protein-enzim
datorate grupelor ionizate cu sarcini electrice de semn contrar sunt anulate prin interaciunea
acestora cu moleculele de ap care se comport ca un dipol datorit electronilor neparticipani ai
atomului de oxigen i caracterului electropozitiv al atomilor de hidrogen. Prin adugarea solvenilor
organici, are loc o diminuare treptat a numrului moleculelor de ap din stratul imediat
nconjurtor moleculelor enzimatice i scderea constantei dielectrice a mediului. Grupele polare
sunt astfel eliberate putndu-i exercita fora de atracie electrostatic, iar proteinele precipit.
d) Precipitarea cu sruri neutre se bazeaz pe solubilitatea diferit a proteinelor n general i
a enzimelor n special n soluii saline. Reprezentarea grafic a solubilitii unei proteine n funcie
de concentraia srii are aspectul unui clopot. Aceasta nseamn c la concentraii mici ale srii
solubilitatea proteinelor crete pn la o anumit valoare cu creterea concentraiei n sare dup care

66
diminueaz treptat. Deci, la concentraii saline mari, proteinele precipit din soluii putnd fi
separate prin centrifugare. Deoarece fiecare protein precipit la o anumit concentraie a srii, este
posibil realizarea unei precipitri fracionate a proteinelor dintr-un lichid biologic. Nu orice sare
poate fi ns utilizat n precipitarea fracionat a proteinelor. Pentru a fi un bun agent precipitant, o
sare trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
a) s posede o solubilitate mare n aa fel nct s se poat realiza o gam larg de
concentraii;
b) dizolvarea srii respective n ap nu trebuie s modifice pH-ul i temperatura soluiei (s nu
fie un proces exoterm);
c) s nu reacioneze cu proteinele i s poat fi ndeprtat prin metode obinuite (de exemplu
prin dializ).
Cel mai adesea se utilizeaz n acest scop sulfatul de amoniu, amestecul sulfat monopotasic
i bipotasic, sulfatul de magneziu .a. De regul, concentraia srii n cazul precipitrii fracionate a
proteinelor nu se exprim procentual (g substan la 100 g soluie) ci n procente de saturaie. De
regul se prepar mai nti o soluie saturat dup care, n funcie de metod, se adaug aceast
soluie la lichidul biologic i nu sarea cristalin, pn la un procent de saturaie dat. n literatura de
specialitate ce abordeaz metode practice de enzimologie, se gsesc nomograme cu ajutorul crora
se poate calcula cantitatea de sare ce trebuie adugat la 1000 ml soluie pentru a obine un anumit
procent de saturaie.

V.3 Purificarea enzimelor

Preparatele enzimatice obinute prin una din metodele descrise mai sus prezint un grad mic
de purificare, necesitnd operaii ulterioare prin care s se mreasc puritatea acestora. n cazul
obinerii preparatului enzimatic brut prin precipitare fracionat cu sruri neutre, acesta se afl sub
form de precipitat, operaia urmtoare constnd, n mod obligatoriu n ndeprtarea ionilor srii.
Aceasta se poate realiza prin mai multe metode, cel mai adesea utilizndu-se dializa.

V.3.1 Dializa
Dializa este o metod des utilizat n biochimie n general i enzimologie n special. Prin
aceast metod se pot separa biomoleculele cu mase moleculare mari de compuii chimici obinuii
cum ar fi srurile. Preparatele enzimatice obinute prin precipitare cu sruri se introduc n tuburi de
dializ care sunt reprezentate de tuburi confecionate din celofan sau dintr-o alt membran
semipermeabil. Se leag tubul la capete i se introduce ntr-un vas ce conine un volum mare dintr-

67
un lichid fa de care se realizeaz dializa. Mrirea porilor membranei semipermeabile nu permite
trecerea macromoleculelor, n schimb ionii srii sunt eliminai treptat n lichidul exterior. Dat fiind
concentraia relativ crescut a srii cu care s-a realizat precipitarea, dializa nu se realizeaz direct
fa de ap distilat. n acest caz, datorit efectului Donnan, ar avea loc o distribuie inegal a
ionilor care ar determina o acidifiere a mediului intern, n paralel cu alcalinizarea mediului extern.
Aceast acidifiere a mediului intern poate determina denaturarea enzimei. Pentru a nltura
acest efect, dializa se execut mai nti fa de o soluie tampon adecvat (24 de ore), apoi fa de
ap de robinet n flux continuu (24-48 de ore) i n final fa de ap distilat (24 de ore prin
schimbarea periodic a acesteia).

V.3.2 Purificarea enzimelor prin gel-cromatografie

n gel-cromatografie, componentele amestecului ce urmeaz a fi separate, migreaz cu viteze
diferite printr-un strat cromatografic, viteza de migrare depinznd de efectul repartiiei lor ntre faza
lichid i cea staionar. Stratul cromatografic este reprezentat de un gel cu o structur
tridimensional caracteristic, insolubil.
Coeficientul de partiie al unui solvent ntre faza solid i cea lichid este dependent exclusiv
de efectele sterice, acest lucru stnd la baza mecanismului gel-cromatografiei. Moleculele mici
ptrund n porii gelului, n timp ce substanele cu mas molecular mare neputnd penetra n
ochiurile reelei tridimensionale, au viteze mari de eluie, prsind reticulul gelului mai repede.
Caracterizarea suportului se face prin doi parametri:
a) geometria stratului cromatografic care se refer la nlimea i diametrul acestuia.
Volumul total al suportului se calculeaz ca fiind egal cu volumul coloanei cromatografice (care are
form cilindric):

Vt = R2h
Volumul spaiului gol (Vo) care este volumul dintre granulele gelului, se determin cu ajutorul
unor substane ce nu sunt reinute de gel, prin evaluarea volumului lor de eluie. Prin diferen, se
determin volumul stratului cromatografic:

Vx = Vt - Vo
Volumul lichidului din interiorul particulelor de gel (volumul interior V i) se determin ca fiind
diferena dintre volumul gelului umflat (hidratat) i volumul parial al suportului:

Vi = Vx - mgVg

68
unde:
mg - masa gelului din strat;
Vg - volumul specific al acestuia.
Acest volum mai poate fi determinat i prin relaia Vi = mgWr, unde Wr este capacitatea de
reinere a apei de ctre gelul uscat;
b) viteza de eluie este parametrul ce caracterizeaz eluia stratului cromatografic i se
exprim prin ml/min sau ml/or. Volumul de eluie, Ve, se definete ca fiind volumul eluatului
necesar pentru a transporta moleculele unei substane date prin coloana cromatografic. ntre
volumul de eluie i coeficientul de partiie K ntre cele dou faze se poate scrie relaia:

Ve = Vo + Kvs
n care Vs este volumul fazei staionare. Atunci cnd ntregul gel este considerat faz staionar,
coeficientul de partiie este:

Ve Vo
Vx

iar dac faza staionar este considerat a fi doar lichidul care mbib gelul, coeficientul de partiie
este:

Ve Vo
Vi

Pentru a putea fi utilizat n gel-cromatografie, un gel trebuie s prezinte urmtoarele

proprieti:
- s fie inert chimic;
- s fie stabil din punct de vedere fizico-chimic;
- s conin un numr ct mai mic posibil de grupri polare pentru a evita efectele de schimb
ionic;
- s permit obinerea unei game largi de porozitate pentru a acoperi un domeniu ct mai
larg de fracionare;
- porozitatea s poat fi riguros controlat;
- s fie rigid i s opun rezisten la eluie.
n acest tip de cromatografie, cel mai adesea se utilizeaz gelurile pe baz de dextran, cum ar
fi de exemplu Sephadex-urile produse de firma Pharmacia Fine Chemicals, gelurile pe baz de

69
poliacrilamid (de exemplu gelurile de tip Bio-Gel produse de firma Bio-Rad), cele pe baz de agar
i agaroz (Sagavac, Sepharose, Gelarose etc.) i altele.

V.3.3 Fracionarea enzimelor cu ajutorul schimbtorilor de ioni

Datorit prezenei n structura apoenzimelor a resturilor de aminoacizi diaminomonocarboxilici, monoamino-dicarboxilici, hidroxi-aminoacizilor etc., moleculele enzimatice
prezint la suprafaa lor o serie de grupe polare ale cror natur i numr difer de la o enzim la
alta. Datorit acestei caracteristici, enzimele mai pot fi purificate i prin fracionare cromatografic
pe schimbtori de ioni. Acetia sunt reprezentai de unele substane insolubile care conin grupe
ncrcate electric ce fac parte din structura lor i ioni de schimb mobili. Cromatografia pe
schimbtori de ioni se bazeaz pe capacitatea ionilor mobili de a fi schimbai reversibil cu ali ioni
ncrcai cu sarcini electrice de acelai semn, fr ca matricea suportului s sufere modificri fizicochimice. n funcie de natura acestor sarcini, schimbtorii de ioni pot exista sub dou forme:
- schimbtori de anioni (anionii) care au grefate grupri polare pozitive pe o matrice
insolubil, ionii de schimb fiind negativi;
- schimbtori de cationi (cationii) n care ionii de schimb sunt ncrcai cu sarcini pozitive,
gruprile polare ale suportului fiind ncrcate negativ.
n calitate de suport pot fi utilizate rini sintetice schimbtoare de ioni, silicai, polizaharide
modificate etc. Capacitatea unui schimbtor de ioni de a-i schimba ionii si mobili cu ionii din
mediu poart numele de capacitate de schimb i depinde de numrul de grupe polare raportat la 1
gram substan uscat, de accesibilitatea acestora, de natura ionilor de schimb, de natura chimic,
fora ionic i pH-ul eluantului etc. n procesul de separare cromatografic a unui amestec de
proteine pe o coloan cu schimbtori de ioni are loc un fenomen de adsorbie reversibil a
fraciunilor proteice. Fracionarea se realizeaz n funcie de ncrcarea electric a fiecrei proteine
n parte, iar ndeprtarea lor treptat se face cu un eluant adecvat. Metoda eluiei n gradient este
una din metodele cel mai des utilizate.
Printre suporturile frecvent utilizate n cromatografia prin schimb ionic se numr
aluminosilicaii i hidroxizii de fier i aluminiu n calitate de suporturi anorganice, iar schimbtorii
de ioni organici cei mai adecvai sunt unii derivai ai celulozei (AE-celuloza, DEAE-celuloza,
TEAE-celuloza, PAB-celuloza, ECTEOLA-celuloza, CM-celuloza, P-celuloza, SE-celuloza etc.),
diferite tipuri de Sephadex (DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, SP-Sephadex etc.), unii copolimeri
ai stirenului cu divinilbenzenul, ai acidului metacrilic cu divinilbenzenul i altele.

70

V.3.4 Fracionarea enzimelor cu ajutorul adsorbanilor

Acest tip de fracionare reprezint o alt variant a cromatografiei solid-lichid, separarea
depinznd de echilibrul ce se stabilete la interfaz i de solubilitatea relativ a fraciunii enzimatice
respective. La baza acestei metode st adsorbia enzimei ce urmeaz a fi purificat pe un suport
datorit grupelor polare, forelor van der Waals, interaciunilor dipol-dipol, punilor de hidrogen etc.
n procesul adsorbiei se instaleaz un echilibru ntre moleculele proteice adsorbite i cele libere,
masa de solut adsorbit de unitatea de mas a suportului fiind descris de ecuaia Langmuir:

K1 K 2 c
1 K2 c

n care:
K1 - numrul centrilor de adsorbie din unitatea de mas a adsorbantului;
K2 - constant ce descrie gradul de afinitate a solutului fa de adsorbant;
c - concentraia solutului.
Materialele adsorbante cel mai des utilizate sunt alumina, gelul de fosfat de calciu,
hidroxiapatit i altele.

V.3.5 Separarea enzimelor prin cromatografia de afinitate

O alt metod des utilizat n purificarea enzimelor este cromatografia de afinitate care are la
baz interaciunea biospecific a acestor compui fa de anumii liganzi. Suportul se formeaz prin
imobilizarea prin legare covalent a unui anumit ligand pe un suport insolubil cu formarea unui
adsorbant de afinitate. Prin trecerea amestecului proteic printr-o coloan umplut cu un astfel de
adsorbant, enzima ce urmeaz a se purifica este adsorbit datorit interaciunilor specifice cu
ligandul, celelalte fraciuni trecnd libere prin coloan. Dup fracionare, enzima poate fi eluat fie
specific, de exemplu cu o soluie a substratului ei natural, fie nespecific cum ar fi n cazul
modificrii pH-ului sau concentraiei eluantului.
Suportul insolubil inert utilizat n cromatografia de afinitate, poate fi reprezentat de agaroz,
celuloz, sticl poroas, granule de poliacrilamid, dextrani reticulai etc.
n etapele finale ale purificrii enzimelor se pot folosi: electroforeza preparativ n gel de
poliacrilamid, izoelectrofocusarea prin electroforez n gradient de pH i alte metode.

71

V.4 Cristalizarea enzimelor

Odat cu creterea gradului de puritate al unei enzime crete puternic i labilitatea acestora,
att fa de temperatur ct i fa de pH-ul mediului de stocare sau ali factori. De aceea, dup
obinerea unui grad de puritate convenabil, preparatele enzimatice nu se stocheaz sub form de
soluii, cu cteva excepii cnd exist stabilizatori specifici hidrosolubili ai anumitor enzime. De
cele mai multe ori enzimele se cristalizeaz n vederea stocrii, prin aceast operaiune realiznduse i o etap suplimentar de purificare. Exist mai multe metode de cristalizare a enzimelor, cea
mai frecvent utilizat fiind cristalizarea cu ajutorul sulfatului de amoniu sau a solvenilor polari cum
ar fi alcoolii. Cristalizarea cu sulfat de amoniu se face la rece (0-4 oC) prin adugarea treptat a srii
sau a unei soluii saturate, sub agitare continu, pn la apariia unei turbiditi. Suspensia se las
apoi cteva ore (n unele cazuri cteva zile sau chiar sptmni) la rece pentru maturarea cristalelor.
n cazul cristalizrii enzimelor cu ajutorul solvenilor organici polari (de exemplu etanol)
operaiunile se execut, de asemenea, la rece dup ce solventul a fost rcit n prealabil la -10 oC sau
chiar mai mult. Formele cristalelor difer de la o enzim la alta sau depind de sursa biologic,
procedeul de purificare utilizat, agentul de cristalizare, pH-ul mediului de cristalizare etc.
Dei enzimele pure sunt mult mai instabile dect cele aflate n mediul lor natural, ele sunt
totui mai stabile dect preparatele enzimatice brute. Enzimele cristaline se pot pstra la rece (04oC) un timp relativ ndelungat fr pierderea activitii catalitice. Dac deshidratarea se face prin
liofilizare, stocarea se face, de asemenea la rece, dar n absena total a umiditii. Enzimele aflate
n soluii se pstreaz foarte bine la congelator dar nghearea-dezghearea repetat determin o
inactivare destul de rapid. Din aceast cauz, acestea se stocheaz n frigider (0-4 oC) dup ce s-a
adugat un stabilizator adecvat.

V.5 Determinarea activitii enzimatice

Determinarea activitii catalitice a unei enzime poate fi evideniat fie prin evaluarea
consumului de substrat fie prin evaluarea produsului de reacie format. Pentru marea majoritate a
enzimelor, viteza de reacie este o funcie liniar de timp doar pentru primele minute de reacie. Din
aceast cauz, determinarea activitii enzimelor se face prin efectuarea transformrii respective n
condiii optime de reacie ntr-un interval de timp n care aceast dependen este liniar. Dup
scurgerea acestui interval de timp se stopeaz reacia enzimatic printr-o modalitate sau alta dup
care se determin fie concentraia substratului (substratelor) fie a produsului (produilor) de reacie
prin metode fizico-chimice specifice. Crearea condiiilor optime de reacie nseamn crearea unor
condiii de pH, temperatur, presiune osmotic, raport masic enzim/substrat etc., care s fie ct mai

72
apropiate posibil de condiiile naturale, adic de condiiile pe care enzima le ntlnete in vivo. n
funcie de proprietile fizico-chimice ale substratelor sau produilor de reacie, metodele de
determinare a activitii enzimelor se mpart n mai multe grupe: metode spectrofotometrice,
fluorimetrice, titrimetrice, calorimetrice, polarimetrice, radiometrice etc.

V.5.1 Metode spectrofotometrice de determinare a activitii enzimelor

Aceste metode se bazeaz pe proporionalitatea care exist ntre extincia E (sau densitatea
optic D.O.) a unei soluii i produsul dintre concentraia soluiei respective (c) i drumul optic (d)
adic grosimea stratului de soluie pe care lumina o strbate:
E (sau D.O.) = cd
unde este coeficientul de extincie molar, adic extincia substanei respective aflat n soluie
ntr-o concentraie de 1 molar atunci cnd drumul optic este de 1 cm. Pe de alt parte, valoarea
extinciei este dat de relaia:

E log

Io
log T
I

unde:
Io - intensitatea luminii incidente;
I - intensitatea luminii transmise;
T - transmisia.
innd cont de aceste relaii, unitatea de msur a coeficientului de extincie molar este:

Io
1
cm
I

mol
c d
mol
2 cm
cm
log

Cea mai mare sensibilitate n determinarea unui compus prin metode spectrofotometrice se
situeaz la lungimea de und corespunztoare absorbiei maxime. De aceea, determinrile se fac la
lungimi de und bine stabilite n funcie de spectrul de absorbie, aceste metode fiind pe deplin
realizabile deoarece este practic imposibil ca att substratul ct i produsul de reacie s posede
acelai spectru de absorbie. n multe situaii se determin direct extincia substratului sau a
produsului de reacie la o lungime de und bine determinat, situat n ultraviolet, domeniul vizibil
sau chiar domeniul infrarou. De foarte multe ori, se folosesc metode n care substratul sau produsul
de reacie formeaz compleci colorai cu reactivi specifici, iar intensitatea culorii este direct

73
proporional cu concentraia substanei respective. n asemenea situaii se determin densitatea
optic a acestui compus colorat la o lungime de und din domeniul vizibil. Calculul rezultatelor n
toate metodele spectrofotometrice, se face, fie prin utilizarea unei soluii etalon (standard), fie prin
trasarea unei curbe de etalonare.

V.5.2 Metode fluorimetrice de determinare a activitii enzimelor

Aceste metode de analiz sunt extrem de sensibile deoarece pot fi nregistrate modificri ale
emisiei spectrale chiar la concentraii foarte mici ale substanelor analizate. Metodele fluorimetrice
de dozare se pot utiliza atunci cnd fie substratul, fie produsul de reacie, fie cofactorul enzimatic
prezint proprieti fluorescente. De exemplu, activitatea dehidrogenazelor FAD-dependente poate
fi determinat cu mare exactitate prin metode fluorimetrice deoarece coenzimele flavinice sunt
fluorescente n stare oxidat. Proprietile fluorescente dispar prin reducerea lor n procesele redox
pe care le catalizeaz flavoenzimele.

V.5.3 Metode titrimetrice de determinare a activitii enzimelor

Exist reacii enzimatice cnd substratul sau produsul de reacie prezint caracter acid sau
bazic putnd fi dozat prin titrare. De exemplu lipaza, acionnd asupra triacilglicerolilor,
hidrolizeaz acest substrat cu formare de glicerin i acizi grai liberi. Concentraia acestora poate fi
apoi determinat prin titrare cu o soluie alcalin de titru cunoscut. Aria de aplicabilitate a acestor
metode este totui destul de restrns deoarece formarea unor produi de reacie cu caracter acid sau
alcalin determin modificarea pH-ului mediului de incubare cu repercusiuni asupra capacitii
catalitice a enzimei respective.

V.5.4 Metode calorimetrice

Aceste metode de determinare a activitii enzimelor se bazeaz pe msurarea cldurii de
reacie ca o msur a vitezei cu care substratul este modificat enzimatic, atunci cnd reacia este
exoterm. i aceste metode sunt puin utilizate deoarece eliberarea unei anumite cantiti de cldur
modific condiiile de temperatur ale incubaiei, reacia enzimatic decurgnd n continuare n
condiii termice diferite de cele optime.

V.5.5 Metode polarimetrice

Datorit faptului c foarte multe biomolecule prezint activitate optic determinat de
prezena unuia sau mai multor atomi de carbon chirali, aceste metode de determinare a activitii

74
unor enzime se bazeaz pe msurarea unghiului sub care soluia substratului sau a produsului de
reacie rotete planul luminii polarizate. Metodele polarimetrice de analiz se pot aplica n
enzimologie n trei situaii:
a) substratul reaciei este optic activ, iar produsul este optic inactiv;
b) produsul de reacie este optic activ, iar substratul nu prezint activitate optic;
c) att substratul ct i produsul transformrii enzimatice prezint activitate optic, dar
rotaiile lor specifice sunt diferite.
Pentru determinarea activitii unor enzime se mai folosesc metode radiometrice, metode cu
enzime imobilizate, metode cu kit-uri de reactivi i altele.

VI ENZIME IMOBILIZATE
VI.1 NOIUNEA DE ENZIM IMOBILIZAT
Unul din domeniile principale ale biotehnologiei l reprezint obinerea, studiul i utilizarea
biocatalizatorilor heterogeni sub form de enzime imobilizate. Noiunea de enzim imobilizat
desemneaz catalizatorul heterogen obinut prin fixarea uneia sau mai multor enzime, sau a
organitelor subcelulare i a celulelor ntregi pe suporturi insolubile, cu pstrarea capacitii
catalitice.
Dezvoltarea cercetrilor privind obinerea enzimelor imobilizate este dictat att de
considerente fundamentale, ct mai ales aplicative. n ultimele 2-3 decenii s-a acordat o atenie tot
mai mare tehnologiilor enzimatice plecnd de la dezvoltarea extensiv i intensiv a metodelor de
imobilizare i stabilizare a enzimelor. Cercetrile efectuate pe plan mondial sunt numeroase i au
scopul ambiios de a substitui treptat sintezele chimice sau transformrile i tratamentele chimice
aplicate industrial. n general, procedeele biocatalitice industriale se pot clasifica n funcie de tipul
i starea biocatalizatorului astfel:
a) biocatalize enzimatice:
- cu enzime n sistem liber;
- cu enzime imobilizate;
b) biocatalize realizate de celule :
- cu celule n sistem liber;
- cu celule imobilizate.
Cercetrile n acest domeniu ntreprinse pe plan mondial au condus la rezultate promitoare,
att din punct de vedere fundamental ct i aplicativ. Problema obinerii enzimelor imobilizate cere
mbinarea unor cercetri multidisciplinare cum ar fi:

75
- cercetri de enzimologie i biologie molecular privind studiul structurii i stabilitii
enzimelor libere i imobilizate;
- cercetri n domeniul compuilor macromoleculari i a materialelor anorganice poroase n
vederea obinerii de suporturi solide pentru imobilizare;
- cercetri n domeniul chimiei fizice i coloidale de alegere a metodelor optime de
imobilizare pentru fiecare enzim i suport n parte;
- cercetri de cinetica catalizei heterogene.

VI.2 METODE DE IMOBILIZARE

Metodele de imobilizare a enzimelor se pot clasifica n funcie de natura interaciunilor ce au
loc ntre enzim i suport n procesul de imobilizare. O prim clasificare a fost fcut de Durand G.
et al. care consider c exist dou categorii de metode de imobilizare:
- prin includere (entrapare - ENT i microencapsulare - MEC);
- prin legare (adsorbie- ADS i covalent - CVB).
Mai trziu s-a fcut o alt clasificare, raional, a metodelor de imobilizare. Conform acestei
clasificri metodele de imobilizare se mpart n dou mari grupe, fiecare coninnd alte subgrupe de
metode :
- grupa A: metode fizice de imobilizare (metode de imobilizare prin adsorbie, metode de
includere mecanic a moleculelor enzimatice n suport prin reticulare, microncapsulare, includere
n membrane de ultrafiltrare etc.);
- grupa B: metode chimice de imobilizare (imobilizarea prin legare covalent i
imobilizarea cu ajutorul liganzilor).

VI.2.1 Metode fizice de imobilizare a enzimelor

Metodele de imobilizare prin care enzima se leag de suport fr formare de legturi
covalente reprezint metodele fizice de imobilizare. Acestea la rndul lor se mpart n dou
subgrupe : imobilizarea prin adsorbie i respectiv includerea mecanic a moleculelor enzimatice n
suport (includere n geluri, microncapsulare etc.).
n cazul adsorbiei, enzimele sunt meninute la suprafaa suportului datorit interaciunilor
electrostatice, a legturilor hidrofobe, punilor de hidrogen .a. Includerea mecanic n suport
presupune utilizarea unor geluri reticulate, microcapsule, fibre, membrane de ultrafiltrare etc. Dei
metodele fizice de imobilizare a enzimelor sunt, n general, simple, rapide i eficiente, aria de
aplicabilitate este relativ restrns, datorit faptului c meninerea moleculelor de protein-enzim la
suprafaa suportului este asigurat de legturi relativ slabe, ceea ce face ca s existe pericolul unei

76
eluii pariale sau chiar totale a enzimelor n cazul utilizrii de substrate n soluii de for ionic
superioar.

VI.2.1.1 Imobilizarea enzimelor prin adsorbie

Dintre metodele fizice, imobilizarea prin adsorbie este cel mai des utilizat, reprezentnd
cel mai economic procedeu de insolubilizare. a enzimelor. Enzimele sunt fixate la suprafaa
suportului datorit urmtoarelor tipuri de legturi ce intervin n adsorbie:
- interaciuni van der Waals - interaciuni electrostatice ntre atomi sau molecule cu moment
de dipol;
- puni de hidrogen ce se formeaz n cazul gruprilor -OH, -COOH, -NH2;
- transfer de sarcin - adic toate interaciunile ntre substane electrofile i nucleofile;
- schimb de ioni.
Cantitatea de enzim legat de suport n cazul adsorbiei depinde de urmtorii parametri :
a) concentraia proteic a soluiei enzimatice influent; masa de enzim fixat crete
proporional cu concentraia pn la o valoare limit cnd adsorbantul se satureaz. Valoarea
acesteia este dat de urmtoarele relaii:

m k1C k2

izoterma Freundlich

n care:
m - masa legat
C - concentraia la echilibru
k1, k2 - constantele de echilibru
sau:

k1 k 2 C
1 k 2 C

izoterma Langmuir

Reprezentarea grafic C/m n funcie de C permite obinerea valorilor k1 i k2 pentru fiecare

imobilizat;
b) timpul de contact: viteza de adsorbie este determinat de caracteristicile fizico-chimice
ale adsorbantului i ale proteinei adsorbite (dimensiunile moleculelor i ale particulelor suportului,
prezena i natura sarcinilor electrice etc.). n condiii obinuite, timpul necesar pentru obinerea
unui preparat enzimatic imobilizat este, n general, scurt, nedepind cteva ore;
c) temperatura de reacie: viteza de adsorbie, depinznd de caracteristicile difuzionale ale
moleculelor, va crete cu temperatura pn la o valoare optim a acesteia;

77
d) influena pH-ului: s-a constatat experimental c adsorbia maxim este, de regul, n
vecintatea punctului izoelectric al enzimei adsorbite.
VI.2.1.2 Imobilizarea enzimelor prin includere n geluri
Simplitatea obinerii, lipsa modificrilor chimice n structura enzimelor ntr-un interval larg
al compoziiei i structurii gelului, stabilitatea ridicat a preparatelor enzimatice obinute sunt
factori ce determin utilizarea larg a metodei de imobilizare a enzimelor prin includere n geluri. n
ultimul timp s-au propus noi tehnici de includere n geluri i noi tipuri de geluri. De exemplu,
polimerizarea n emulsie constnd dintr-o faz apoas (solvent pentru monomer, iniiator i enzim)
i o faz hidrofob (amestec de toluen i cloroform) permite obinerea unui hidrogel sub form de
particule sferice a cror dimensiune poate fi controlat prin schimbarea condiiilor de polimerizare.
n cazul n care emulsia este ngheat naintea polimerizrii se obin particule poroase cu o
suprafa specific mare.
O rspndire larg, n prezent, o are metoda polimerizrii iniiat de radiaiile , nefiind
nevoie de aciunea iniiatorilor chimici care pot inactiva enzimele.
n prezent, pentru imobilizarea enzimelor cel mai adesea se folosesc gelurile de
poliacrilamid. Calitile acestor geluri pot fi mbuntite utiliznd metoda radiopolimerizrii.
Gelurile astfel obinute au o structur poroas, cu suprafa activ mare, iar elasticitatea
crete considerabil dac polimerizarea are loc n prezena amidonului 5 %, crescnd totodat i
termostabilitatea enzimei imobilizate.

VI.2.1.3 Imobilizarea enzimelor prin microncapsulare

Microncapsularea este o metod fizic de imobilizare ce se realizeaz prin includerea
enzimelor ntr-o microcapsul format dintr-o membran semipermeabil. Aceasta este
impermeabil pentru protein-enzima din interior i compuii macromoleculari externi, ns permite
difuzia liber a compuilor cu mas molecular mic cum ar fi unele substrate i produii lor de
reacie.
Drept suport de imobilizare se folosesc att polimerii naturali ct i cei sintetici. Obinerea
microcapsulelor sintetice se realizeaz prin policondensare i coacervare interfazic sau prin
emulsionare dubl. n cazul policondensrii interfazice, formarea membranei semipermeabile se
face prin reacii chimice ce au loc la suprafaa de separare dintre cele dou faze (ap-solvent
organic), iar n cazul coacervrii, aceasta se formeaz datorit scderii solubilitii polimerului la
limita dintre faze. Dezavantajul acestor dou metode de microncapsulare const n faptul c sunt
necesare substane de umplutur inerte pentru meninerea presiunii interne n microcapsule i
stabilizarea enzimelor la valori crescute ale pH-ului amestecului.

78

Metoda emulsionrii duble reprezint o modificare a primelor dou metode de

microncapsulare. Soluia apoas de enzim se emulsioneaz mpreun cu soluia monomerului ntrun solvent organic, apoi suspensia obinut se emulsioneaz n faza apoas cu formare de sfere
solide coninnd micropicturi din soluia enzimatic. Prin aceste metode se obin microcapsule cu
diametrul de zecimi pn la sutimi de micron. n ceea ce privete rolul substanelor inerte de
umplutur, acestea particip la reacia de polimerizare reticulnd macromoleculele polimerului, fapt
ce confer membranei o structur rigid.
Utilizarea microcapsulelor naturale permite obinerea unor preparate de enzime imobilizate
de uz medical. Folosirea enzimelor n scop terapeutic este legat de o serie de afeciuni, n special
congenitale, cauzate de lipsa unor enzime sau activitatea diminuat a acestora. Aceste boli nu pot fi
tratate cu mijloace terapeutice clasice i, n principiu, cedeaz numai la introducerea enzimei
deficitare.
Printre suporturile naturale folosite des la microncapsularea enzimelor se numr liposomii
i fantomele eritrocitare. Avantajul acestora const n faptul c odat introduse n organism nu
prezint fenomenul de respingere i sunt vehiculate de fluxul sanguin la toate organele i esuturile.
Imobilizarea enzimelor n microcapsule naturale se face relativ uor i n condiii fiziologice
normale care nu duc la inactivare. n ultimul timp se fac ncercri de utilizare a altor suporturi
naturale cum ar fi hepatocitele sau leucocitele. n liposomi i fantome eritrocitare au fost
microncapsulate cele mai diverse enzime folosite n scop terapeutic.

VI.2.1.4 Alte metode fizice de imobilizare a enzimelor

n afar de metodele fizice enunate mai sus, n literatura de specialitate ntlnim numeroase
lucrri privind imobilizarea prin alte metode cum ar fi: includerea enzimelor n membrane organice
artificiale sau naturale, imobilizarea prin diferite metode a unui preparat enzimatic preimobilizat
etc.

VI.2.2 Metode chimice de imobilizare a enzimelor

Dup cum am artat mai sus, n cazul metodelor fizice de imobilizare, ntre suport i enzim
iau natere o serie de interaciuni i se formeaz legturi relativ slabe din care cauz, n procesul de
exploatare poate avea loc eluia parial sau total a enzimei, n funcie de concentraia substratului
i de fora ionic a soluiei acestuia. Pentru o mai bun fixare a enzimelor pe suport, muli
cercettori au recurs la metode chimice de imobilizare care constau n formarea de legturi
covalente fie direct ntre enzim i suport fie prin intermediul liganzilor. n cazul legrii directe,

79
legturile covalente iau natere ntre gruprile funcionale ale suportului i cele ale protein-enzimei,
grupri aflate, de regul, n afara situsului activ enzimatic.
Randamentele reaciilor enzimatice catalizate de acest tip de catalizatori heterogeni,
comparativ cu enzimele libere, sunt ceva mai mici, n general, dect n cazul imobilizrii prin
metode fizice, probabil din cauza unor uoare modificri la nivelul structurii cuaternare sau chiar
teriare a protein-enzimei ce se pot produce prin formarea legturilor covalente. Cu toate acestea,
prin legare covalent se obin preparate cu o stabilitate operaional mai mare, fapt ce anuleaz
dezavantajul mai sus menionat.
Imobilizarea chimic a enzimelor pe suporturi solide poate fi executat i prin intermediul
liganzilor care sunt, n general, compui chimici bifuncionali sau nesaturai. i n acest caz se
asigur o fixare puternic a enzimei pe suport.

VI.2.2.1 Imobilizarea enzimelor prin legare covalent

n principiu, prin imobilizarea enzimelor prin legare covalent se poate utiliza orice tip de
suport anorganic sau organic, natural, semisintetic sau sintetic care prezint grupe funcionale
adecvate formrii de legturi covalente. n acest caz suportul se alege n funcie de natura gruprilor
funcionale ale protein-enzimei ce urmeaz a se imobiliza. Formarea legturilor covalente poate
induce, probabil, uoare modificri n structura teriar i cuaternar a enzimei, manifestnd n felul
acesta o oarecare influen asupra centrului activ enzimatic ce se repercuteaz asupra activitii
catalitice a preparatului obinut.
Legturile covalente, fiind legturi chimice puternice, este nlturat practic posibilitatea
eluiei pariale a enzimei de pe suport n timpul exploatrii. Din aceast cauz numeroi cercettori
utilizeaz aceast metod pentru imobilizarea enzimelor de importan practic.

VI.2.2.2 Imobilizarea enzimelor cu ajutorul liganzilor

O alt metod de imobilizare covalent a enzimelor o reprezint fixarea acestora cu ajutorul
liganzilor. Acetia sunt substane bi- sau multifuncionale sau substane nesaturate. n procesul de
imobilizare se formeaz cte dou legturi covalente pentru fiecare molecul proteic: ligandul se
fixeaz de suport prin intermediul uneia din gruprile sale funcionale, cealalt rmnnd
disponibil pentru fixarea enzimei. n cazul folosirii n calitate de ligand a unor compui nesaturai,
acetia dau reacii de polimerizare sau policondensare (n spe trimerizare respectiv tricondensare
suport ligand - enzim), cu formarea de legturi covalente ntre cei trei componeni ai sistemului.
Avantajul acestei metode const n faptul c se poate realiza o imobilizare optim alegnd
ligandul specific n funcie de natura gruprilor funcionale ale suportului i respectiv enzimei ce

80
urmeaz a se imobiliza. Metoda de imobilizare a enzimelor pe suporturi solide cu ajutorul liganzilor
este din ce n ce mai des folosit n ultimii ani.
Analiznd literatura de specialitate se poate concluziona c aldehida glutaric este ligandul
consacrat, tot mai muli cercettori folosind acest reactiv n vederea activrii celor mai diferite
suporturi. Noi am testat posibilitatea imobilizrii unor enzime (catalaza, ureaza etc.) pe fibre de
celuloz prin reticulare cu aldehid glutaric. Pentru obinerea unor caracteristici optime, n mediul
de cuplare s-a introdus o protein inert (serumalbumina) care particip la procesul de reticulare.
Reaciile s-au realizat la 4oC timp de 20-24 de ore dup care preparatele au fost splate cu soluii
tampon adecvate pentru nlturarea excesului de enzim

VI.2.3 Metode de imobilizare a celulelor ntregi

n general, pentru imobilizarea celulelor se folosesc aceleai tipuri de suport i aceleai
metode ca n cazul enzimelor. Rezultate superioare se obin, de regul, la celulele imobilizate prin
includere n geluri (entrapare) sau reticulare n (co-)polimeri, deoarece prin aceste metode se evit
blocarea gruprilor funcionale ale constituenilor peretelui celular, imobilizarea efectundu-se prin
simpla reinere mecanic a celulelor n structura suportului.
Cu toate acestea, n cazuri speciale, se obin rezultate bune i prin folosirea altor metode de
imobilizare. n literatura de specialitate predomin ns metodele de includere a celulelor
microbiene n diferite geluri cum ar fi gelul de poliacrilamid, alginat, carrageenan, alcool
polivinilic etc.

VI.3 TEHNICI DE IMOBILIZARE A ENZIMELOR I CELULELOR

Tehnicile de imobilizare a enzimelor i celulelor ntregi se mpart n urmtoarele dou grupe:
a) tehnici de imobilizare n sistemul coloan care constau n trecerea soluiei enzimatice
sau a suspensiei celulare printr-o coloan umplut cu suportul de imobilizare ce a fost n prealabil
activat i echilibrat;
b) tehnici de imobilizare n sistemul baie, n care caz imobilizarea se face sub agitare
continu n vase speciale, apoi, dup splare, preparatul obinut se trece n coloana de reacie n
vederea exploatrii.
Alegerea tehnicilor de imobilizare se face n funcie de metoda de insolubilizare utilizat.
Astfel, imobilizarea prin adsorbie sau prin alte metode fizice se face cu precdere n sistemul
coloan, n timp ce imobilizarea prin includere n geluri, reticulare sau legare covalent se face, n
general, n sistemul baie, tehnic ce asigur crearea condiiilor optime pentru reaciile chimice ce
au loc.

81
n ceea ce privete tehnica de imobilizare n sistemul coloan, singurele probleme mai
dificile care se pun sunt cele legate de crearea condiiilor optime de fixare (pH, temperatur etc.)
condiii care s nu duc la inactivarea enzimelor. Aceast tehnic este similar cromatografiei pe
coloan executndu-se n condiii identice.
Tehnicile de imobilizare n sistemul baie sunt ceva mai complexe din cauza condiiilor
aspre n care au loc reaciile chimice. n general, aceste tehnici se aseamn cu cele din sinteza
chimic organic cu deosebirea c se fac anumite modificri n scopul obinerii unor condiii mai
blnde de reacie care s nu denatureze proteinele. De obicei, n cazul imobilizrii prin legare
covalent direct, prin reticulare sau includere, formarea suportului are loc concomitent cu
imobilizarea (n cazul suporturilor sintetice), reaciile chimice respective executndu-se n mod
obligatoriu n condiii fiziologice normale de pH i temperatur.
Exist suporturi ce conin un numr mare i variat de grupri funcionale i care, din acest
punct de vedere prezint caliti optime de imobilizare. Totui, formarea de legturi chimice ntre
enzim i suport necesit condiii aspre de reacie, motiv pentru care se recurge la folosirea
liganzilor. Scopul utilizrii acestora este de a nlocui gruprile funcionale ale suportului cu altele, la
fel de reactive sau mai reactive, dar n condiii mai blnde. Astfel, reactivul Woodward (N-etil-fenil5-izoxozalin-3'-sulfonat) asigur transformarea gruprii carboxil n grupare ester reactiv n condiii
relativ blnde. Un alt exemplu l constituie activarea cu azotit de sodiu a suporturilor coninnd
grupri aminice.
Utilizarea n calitate de ligand a clorurilor acide conduce la transformarea gruprilor
carboxilice (COOH) ale suportului n cloruri acide dup care imobilizarea are loc prin legare
covalent nsoit de eliminarea unei molecule de HCl dintre clorura acid i gruparea NH 2 din
molecula enzimatic. Pentru a evita denaturarea enzimei este necesar s se neutralizeze continuu
acidul clorhidric eliberat n proces.