Sunteți pe pagina 1din 21

Tehnici de histopatologie

Fragmentele de esut recoltate de la pacient n vederea diagnosticului


trebuie procesate n laboratorul de histopatologie pentru a obine preparate
permanente care vor fi examinate microscopic de ctre morfopatolog.
Fragmentele de esut pot fi recoltate prin biopsie, prin exerez chirurgical i prin
autopsie. Procesarea esuturilor n vederea diagnosticului histopatologic
presupune o suit de operaiuni i tehnici care vor permite vizualizarea
elementelor fungice intratisulare i / sau a leziunilor specifice determinate de
acestea.
Obinerea probelor
Probele de esut primite n laboratorul de histopatologie trebuie s fie nsoite de
un formular de cerere a examenului de laborator n care vor fi specificate datele
pacientului i istoricul bolii, precum i descrierea zonei de origine a fragmentului
de esut. Probelor primite li se va atribui un numr care va identifica fiecare prob
pentru fiecare pacient. Acest numr va corespunde cu numrul de ordine din
registrul laboratorului.
Examenul macroscopic
Examinarea macroscopic const n descrierea probelor, alegerea zonelor
relevante pentru diagnostic i introducerea lor (total sau parial) n mici casete
din plastic, unde vor sta pe toat durata procesrii iniiale, pn n momentul
includerii n parafin. Iniial, casetele sunt plasate ntr-un fixator.
Fixarea
Fixarea are scopul de a conserva morfologia esuturilor aa cum se prezint ea
n momentul recoltrii. Fixarea trebuie realizat ct mai curnd posibil dup
prelevarea probelor de esut pentru a preveni autoliza. Nu exist un fixator
perfect, dei formaldehida este considerat aproape un gold standard. Exist o
varietate de fixatori, care se vor folosi n funcie de tipul de esut.
Factorii care influeneaz procesul fixrii: -soluia-tampon; -penetrarea; -volumul
piesei vs. volumul fixatorului; -temperatura; -concentraia fixatorului; -intervalul de
timp. Fixarea trebuie realizat la un pH aproape de neutralitate, adic ntre 6 i 8.
Datorit hipoxiei esuturilor, fixatorul trebuie s aib capacitatea de a tampona

aciditatea acestora prevenind dehiscena lizozomal i autoliza tisular


consecutiv acesteia. Aciditatea favorizeaz formarea de pigment hem - formol
care apare colorat n negru, prin depuneri polarizate n esuturi. Soluiile-tampon
includ fosfatul de sodiu, bicarbonatul de sodiu, cocodilatul de sodiu i veronalul.
Formolul comercial este o soluie de formaldehid n tampon fosfat cu pH 7.
Penetrarea esuturilor depinde de difuzibilitatea fiecrui fixator.Formolul i
alcoolul penetreaz foarte bine, iar glutaraldehida foarte prost. Ceilali fixatori au
un grad intermediar de penetrabilitate tisular. O posibilitate de a rezolva acest
inconvenient este secionarea ct mai fin a esuturilor (2-3 mm grosime),
deoarece penetrarea unei seciuni subiri va fi mult mai rapid dect cea a unei
seciuni mai groase. Volumul de fixator este de asemenea extrem de important.
Acesta trebuie s fie n raport de 10:1 (fixator-esut). Se recomand schimbarea
fixatorului la diferite intervale de timp pentru a evita o eventual scdere a
volumului acestuia. Agitarea probelor n fixator va intensifica fixarea. Creterea
temperaturii, ca n cazul tuturor reaciilor chimice, va crete viteza de fixare, dar
se va avea totui n vedere s nu degradeze esuturile. Formolul fierbinte va fixa
esuturile mai repede i acesta este adesea primul pas n procesarea
automatizat a esuturilor. Concentraia fixatorului va fi cea mai redus
concentraie activ, acest fapt reprezentnd i un avantaj economic. Formolul
este cel mai activ la 10%; glutaraldehida este n general activ la concentraii de
0,25-4%. Concentraiile prea ridicate pot avea efect advers asupra esuturilor
producnd artefacte asemntoare cu cele ale creterii temperaturii fixatorului.
De asemenea, foarte important este intervalul de timp recomandat pentru
meninerea probelor n afara fixatorului. Dup fixare, probele vor fi prelucrate
rapid deoarece prin deshidratare se vor produce artefacte.esuturile meninute
temporar n afara vasului cu fixator, se vor umezi cu ser fiziologic. Tipul fixatorului
indicat este dat de tipul de esut i de detaliile histologice care urmeaz a fi
vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate esuturile recoltate chirurgical i
necropsic, cnd se dorete obinerea unor preparate colorate H-E. Formolul este
cel mai puin pretenios dintre toi fixatorii atunci cnd condiiile de fixare nu sunt
cele ideale, el dunnd aproape neglijabil esutului respectiv. Pentru fixarea
esuturilor n vederea procesrii lor pentru diagnosticul histopatologic al . Formol
soluie 10% tamponat pH 6,8 se folosesc frecvent urmtorii fixatori: soluia de
formol 10% tamponat pH 6,8, acest fapt reprezentnd i un avantaj economic.
Formolul este cel mai activ la 10%; glutaraldehida este n general activ la
concentraii de 0,25-4%. Concentraiile prea ridicate pot avea efect advers
asupra esuturilor producnd artefacte asemntoare cu cele ale creterii

temperaturii fixatorului. De asemenea, foarte important este intervalul de timp


recomandat pentru meninerea probelor n afara fixatorului. Dup fixare, probele
vor fi prelucrate rapid deoarece prin deshidratare se vor produce
artefacte.esuturile meninute temporar n afara vasului cu fixator, se vor umezi
cu ser fiziologic. Tipul fixatorului indicat este dat de tipul de esut i de detaliile
histologice care urmeaz a fi vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate
esuturile recoltate chirurgical i necropsic, cnd se dorete obinerea unor
preparate colorate H-E. Formolul este cel mai puin pretenios dintre toi fixatorii
atunci cnd condiiile de fixare nu sunt cele ideale, el dunnd aproape neglijabil
esutului respectiv. Pentru fixarea esuturilor n vederea procesrii lor pentru
diagnosticul histopatologic al . Formol soluie 10% tamponat pH 6,8 se folosesc
frecvent urmtorii fixatori: soluia de formol 10% tamponat.

Scop
Este un fixator larg utilizat, cu pH 6,8
Reactivi
Fosfat de sodiu monobazic ........................... 4,0 mg
Fosfat de sodiu dibazic ................................. 6,5 mg
Formaldehid 37% ..................................... 100,0 ml
Ap distilat ............................................... 900,0 ml
Se omogenizeaz, apoi se eticheteaz i se dateaz.
Atenie! Carcinogen.
Timpul de fixare
Fragmentele biopsice ar trebui fixate timp de minim 1-4 ore. Un timp mai
ndelungat se recomand pentru piesele mai mari.
Tehnica fixrii
1. Piesele recoltate de chirurgi sunt pstrate n acest tip de fixator;

2. Primele dou staii ale tuturor procesatoarelor de esuturi conin formol


10%;
3. Probele pot fi pstrate n formol 10% indefinit sau sunt transferate n
etanol
70%.
Note:
1. Se lucreaz ntr-un spaiu ventilat. Se vor purta ochelari de protecie,
mnui i halat.
2. Formaldehida este puternic iritant pentru ochi i piele. Este
sensibilizant (prin contact) pentru piele i aparatul respirator.Este toxic
prin ingestie i inhalare.Are aciune coroziv i carcinogen. Se eticheteaz
cu inscripia: ATENIE FORMALDEHID!

Timpul de fixare
Probele de dimensiuni mici 2-4 ore, iar cele mai mari pn la 3 zile.
6.4. Procesarea esuturilor
Odat ce esuturile au fost fixate, ele trebuie nglobate ntr-o form care s
permit manipularea i efectuarea unor seciuni seriate foarte subiri. Cel
mai folosit material n acest scop este parafina. esuturile incluse n
parafin pot fi secionate n fragmente cu grosimi de la 3 la 10 m, uzual 4-6
m. Tehnica de includere n parafin a esuturilor fixate se numete
Procesarea esuturilor. Paii principali ai acestui proces sunt
deshidratarea i clarificarea.
- esuturile fixate umed (n soluii apoase) nu pot fi direct impregnate cu
parafin deoarece aceasta nu este miscibil cu apa. De aceea, esuturile
trebuie
deshidratate. Aceasta se realizeaz de obicei cu ajutorul unor soluii de
etanol,

de concentraii crescnde - 70%, 95% i 100%. Uneori, primul pas este


tratarea
cu un amestec format din formol i etanol. Pot fi utilizai i ali
deshidratani,
dar unii prezint dezavantaje majore: acetona dei este foarte rapid, este
inflamabil, de aceea se poate utiliza doar pentru mici seturi de esuturi
Tehnici de histopatologie procesate manual
6.4.1. Deshidratarea
1. Dac piesa de esut a fost imersat n ap dup scoaterea din fixator, ea
trebuie s fie transferat n etanol 30%, 1-2 ore;
2. Etanol 50%, 1-2 ore;
3. Etanol 70%, 1-2 ore;
4. Etanol 95%, 1-2 ore;
5. Etanol 100%, 1-2 ore;
6. Etanol 100%, 1-2 ore;
7. esuturile deshidratate vor fi pregtite pentru clarificare, adic se scot
piesele
histologice din etanol i se trec n toluen.
Not: Etanolul absolut produce o deshidratare foarte rapid a esuturilor:
pentru a avea aceast siguran, flacoanele cu etanol se vor pstra nchise
etan.
6.4.2. Clarificarea
1. Se transfer piesele histologice din etanol 100% ntr-un amestec
constituit din o
parte toluen i 3 pri etanol 100%, 1 or;
2. Se trec apoi n amestecul de 1:1 toluen-etanol 100%, 1 or;

3. Apoi n amestecul de 3:1 toluen-etanol 100%, 1 or;


4. Toluen 100%, 3-4 ore;
5. Toluen 100%, 3-4 ore;
6. Dup clarificare, esuturile sunt gata pentru impregnare cu parafin.
Not:
Agenii de clarificare, cum ar fi etanolul, trebuie introdui lent pentru a
preveni
degradarea esuturilor. Aceste amestecuri de toluen i etanol permit n plus
i ndeprtarea
oricror urme de ap. Flacoanele se nchid etan. Apariia unei turbiditi a
soluiilor sau a
unor pete opace pe esuturi sunt indicatori siguri ai deshidratrii
incomplete. n ambele cazuri,
lamele cu seciuni se reintroduc n etanol 100% pentru o deshidratare
suplimentar, apoi se
continu cu bile de toluen - etanol. Insuficienta ndeprtare a alcoolului va
determina
imposibilitatea impregnrii cu parafin n zonele respective ale esutului,
ceea ce va produce
dificulti de secionare. Actualmente, exist numeroi ageni de clarificare
disponibili
comercial (Histosolve, Americlear etc.) care sunt mai puin toxici i au un
miros mai plcut
dect toluenul sau xilenul.
6.4.3. Impregnarea cu parafin
1. Se transfer esuturile din agentul de clarificare ntr-un nou flacon cu un
amestec
prenclzit de parafin - toluen 1:2. Se acoper etan flaconul i se las la

etuv, la 45C, timp de 1 or;


2. Se transfer esuturile ntr-un al doilea flacon care conine un amestec
nclzit de
parafin - toluen 1:2. Se acoper flaconul i se meine la 45C timp de 1 or;
3. Se transfer piesele apoi n prima baie de parafin pur. Aceasta este un
flacon
cu parafin lichid care se menine n etuv setnd o temperatur
superioar
punctului de topire al parafinei. Piesele se menin n aceast baie timp de 24
ore;
4. Se transfer piesele n a doua baie de parafin, unde se menin nc 2-4
ore;
5. Se includ (pasul urmtor).
Not:
O alternativ a metodei de impregnare:
1. Se introduce piesa histologic n agentul clarificator proaspt i apoi se
adaug parafin pn la saturarea clarificatorului. Se las n repaus 1 or la
30C 60C, apoi se mai adaug parafin i se las peste noapte. n
dimineaa urmtoare, se adaug parafin pn cnd amestecul conine
aproximativ 75 % parafin, apoi se menine 1 or la 45C.
2. Se trece piesa apoi direct prin 2 bi de parafin pur.
6.4.4. Includerea

1. Se lubrifiaz interiorul casetelor sau al diferitelor tvie metalice cu


un amestec de etanol 60% - glicerin 9:1.
2. Acesta va preveniaderarea parafinei la recipientul ce constituie forma
de turnare a blocurilor.

Acest lucru nu este necesar dac se utilizeaz matrie de hrtie.


2. Se rcete matria prin meninerea prii sale inferioare pe ghea cteva
minute.
3. Se scoate recipientul cu parafin topit din etuv i se vars n matri.
4. Se introduce esutul n matri cu ajutorul unei pense hemostatice
nclzite i se verific dac piesa a fost orientat corect. n funcie de
dimensiunea matriei,
se pot include simultan mai multe piese (1-10) obinndu-se un numr
echivalent de blocuri. Etichetele din hrtie sunt ataate n parafin, la
marginea
matriei, n dreptul piesei histologice.
6.4.5. Secionarea
Dup includere, esuturile trebuie secionate pentru a putea fi etalate pe
lam.
Secionarea se realizeaz cu un microtom, la grosimi de 4-6 m. Pentru
realizarea unor seciuni corespunztoare este necesar ca lama cuitului s
fie perfect ascuit; se prefer utilizarea cuitelor single use. Odat obinute
seciunile, acestea se depun pe suprafaa apei dintr-o baie de ap
prenclzit, fapt care ajut la deplierea panglicii secionate.
Fragmentele de panglic sunt recuperate cu ajutorul unei lame de
microscopie. Lama
cu seciunea etalat este apoi plasat ntr-o etuv timp de aproximativ 15
minute pentru ca, prin topirea parial a parafinei, seciunile s adere mai
bine la lam.

1. Blocurile de parafin cu piesele incluse, se secioneaz rectangular pe


lng
esut, lsndu-se civa milimetri de parafin pe fiecare fa a blocului;

2. Urmeaz o nou fasonare a blocului cu ajutorul unei lame de ras. Se va


ndeprta mai nti parafina de pe faa de secionare la microtom, ct mai
aproape de esutul din bloc. Urmtoarele secionri se vor face pe celelalte
fee ale blocului, n aa fel ca acestea s devin paralele una cu alta. Se va
lsa
suficient parafin la baza blocului astfel nct acesta s poat fi ataat la
obiectiv. Tierea bazei blocului se va face n aa fel nct ea s fie paralel
cu
faa de secionare;
3. Se ataeaz blocul de parafin la discul obiectiv. Se depune un mic
fragment de parafin pe discul obiectiv i se modeleaz cu o spatul
nclzit prin flambare la un bec de gaz. Se las ca stratul de parafin s se
rceasc, apoi se pregtesc cele dou suprafee (baza blocului i suprafaa
obiectului) n vederea aderrii prin topirea stratului superficial de parafin
(se ating cele dou suprafee timp de cteva secunde cu spatula bine
nclzit). Se preseaz apoi blocul de parafin pe discul obiectiv i se las
n repaus pentru solidificare;
4. Se fixeaz discul obiectiv cu blocul ataat n mandrina microtomului, se
ajusteaz poziia n aa fel ca blocul s fie paralel cu tiul cuitului de
microtom;
5. Ajustarea unghiului cuitului se face prin ncercri succesive. Unghiul
diedru
format de faa cuitului i faa blocului trebuie s fie de aproximativ 5 grade.
6. Se alege grosimea de secionare (4-6 m pentru majoritatea esuturilor)
i se
ncepe secionarea cu vitez moderat. Se manevreaz panglica rezultat
prin
nlnuirea seciunilor cu ajutorul unui penson, preferabil din pr de cmil.
Se
secioneaz aproximativ 25 de seciuni, apoi se ndeprteaz panglica de la

cuit i se depune pe o coal de hrtie colorat n negru.


7. Dac se vor practica seciuni mai subiri (de 2-4 m) sau dac esutul
este dur, se pot obine rezultate superioare prin rcirea blocului de parafin
i a cuitului. n acest scop, se ia un cub de ghea i se las s se
topeasc n aa fel ca gheaa
topit s se preling peste partea frontal a blocului. Alt cub de ghea se
pune
pe faa anterioar a cuitului. Se va folosi un material absorbant (lavete,
prosoape de hrtie) pentru colectarea apei rezultate n urma topirii gheii i
rcirii piesei / cuitului. Cuburile de ghea se vor menine cca. 1-2 minute,
apoi se ndeprteaz orice pictur de ap de pe cuit i bloc cu ajutorul
unui
prosop de hrtie i se ncepe secionarea. Rcirea blocului de parafin se
poate
face i prin meninerea sa timp de cteva minute n congelator.
8. Microtomul i cuitul de secionare se toaleteaz dup fiecare utilizare.
Niciodat nu se las fixat cuitul n microtom cnd nu este folosit.
6.4.6. Etalarea seciunilor
Albumina Baker
Albu de ou .................................................. 50,0 ml
Ap distilat ................................................. 50,0 ml
NaCl ................................................................. 0,5 g
p-hidroxibenzoat de sodiu1
............................... 0,1g
n apa distilat nclzit la 90C, se dizolv clorura de sodiu i conservantul
(phidroxibenzoatul de sodiu). Dup rcire se adaug albuul, se
centrifugheaz pn cnd supernatantul devine clar, se filtreaz prin vat
ori se las n repaus pn cnd stratul superior devine clar. Ca adeziv, se

utilizeaz numai supernatantul clar.Pentru o bunconservare, acesta se


pstreaz la frigider.

Bibliografie selectiv
1. Bancroft J, Stevens A (1982) - Theory and Practice of Histological
Techniques, 2nd ed., Churchill Livingstone, N.Y.
2. Bancroft, J D, Stevens A (1982) - Theory and practice of histological
techniques 2nd ed., Churchill Livingstone, Edinburgh & London, UK.
3. Carson F (1990) - Histotechnology: A Self-Instructional Text, 1st ed.,
ASCP,
III.
4. Crookham J, Dapson R (1991) - Hazardous Chemicals in the
Histopathology
Laboratory, 2nd ed., Anatech.
5. Culling C F A (1974) - Handbook of histopathological and histochemical
techniques; 3nd ed., Butterworth, London, UK.

6. Gray P (1954) - The Microtomist's Formulary and Guide. The Blakiston


Co. Robert E. Krieger Publishing.
7. Humason G L (1967) - Animal tissue techniques, 2nd ed., W H Freeman &
Company, San Francisco, Ca, USA.
8. Lillie R D (1954) - Histopathologic technique and practical histochemistry
2nd
ed., Blakiston, New York, USA.
9. Lillie R D, Glenner G G (1957) - Journal of Histochemistry and
cytochemistry; 5:311.
10. Luna L (1968) - Manual of Histologic Staining Methods of the AFIP, 3nd
ed.,
McGraw-Hill, NY.
11. McManus J F A, Mowry R W (1960) - Staining Methods Histologic and
Histochemical; Harper & Row, New York, NY, USA.
12. Sheehan D, Hrapchak B (1980) - Theory and practice of
Histotechnology; 2nd
ed., Battelle Press, Ohio.

Mod de lucru
Procedura 1
1. Se degreseaz lamele i lamelele prin imersia lor n alcool acidifiat 95%
(1 ml
HCl concentrat la 100 ml etanol) i se terg energic cu o pnz curat din
bumbac. Seciunile nu vor adera la lam dac acestea nu sunt complet
degresate. Se evit contactul degetelor cu suprafaa lamelor;
2. Se plaseaz seciunile pe lam cu ajutorul unor ace de disociere. Acestea
vor
pluti la adugarea ctorva picturi de albumin diluat la marginea
panglicii.
Ne vom asigura c seciunile au fost montate pe faa lamei cu captul mat
i nu
pe faa cu captul lucios;

3. Seciunile se plaseaz pe lama nclzit cu ajutorul unei platine


nclzitoare
reglat la o temperatur cu aproximativ 5-10C sub punctul de topire al
parafinei;
4. Seciunile se vor ntinde i netezi rapid. Excesul de fluid se va ndeprta
prin
nclinarea lamei, meninnd panglica cu seciuni cu ajutorul unor ace de
disociere;
5. Se transfer lamele cu seciuni n etuv, la 30-40C i se las peste
noapte pentrua se asigura deshidratarea complet a acestora.

Procedura 2
1. Se utilizeaz lame degresate ca mai sus; se adaug o pictur de adeziv
nediluat pe lam i se etaleaz cu pulpa degetului mic prin micri
circulare. Excesul se terge cu pulpa degetului inelar. Degetele vor fi
degresate n prealabil cu alcool acidifiat 95 %;
2. Se plaseaz una sau dou seciuni pe suprafaa apei ntr-o baie reglat la
o
temperatur cu 5-10C sub punctul de topire a parafinei. Se las cteva
minute
pentru ntinderea seciunilor;
3. Se introduce lama n baie, sub seciune i folosind un ac de disociere se
prinde i se fixeaz fragmentul de panglic pe lam, dup care aceasta se
scoate din
baie; fragmentul de panglic va adera la lam;

4. Se las lamele cu seciuni n etuv peste noapte pentru uscare.


Dezlipirea
seciunilor de pe lam n timpul colorrii este o problem frecvent ntlnit
la
histotehnicienii debutani. Dac lamele sunt curate i seciunile sunt
ntotdeauna uscate complet dup etalare, aceste incidente vor fi rare.
Colorarea
Procesul de includere n parafin, necesar secionrii pieselor, trebuie
urmat de
deparafinarea seciunilor etalate pe lam astfel nct s fie permis
penetrarea
coloranilor hidrosolubili. Lamele cu seciuni se deparafineaz prin trecerea
succesivn bi de xilen (sau nlocuitori), alcool etilic i ap. Tehnicile de
colorare sunt diverse i se selecteaz n funcie de abilitatea lor de a colora
diferite componente celulare i esuturi. Coloraia de rutin este
Hematoxilin-Eosin (HE), celelalte metode de colorare sunt coloraii
speciale, pentru c se utilizeaz n situaii specifice conform nevoilor de
diagnostic.

Coloraia Hemalaun Eozin


Scop
Aceasta este cea mai comun coloraie histologic i histopatologic
utilizat
pentru studierea de ansamblu a citoarhitectonicii tisulare.
Hemalaun-Eozin este o metod de colorare de rutin, dar care necesit o
execuie atent pentru a asigura obinerea unor rezultate corecte i
uniforme.
Fixator
Se obin rezultate excelente, comparabile, folosind diveri fixatori

Tehnica de secionare
Seciuni cu grosimea de 4-5 m, din fragmente de esut incluse n parafin
Echipament
Sticlrie de laborator, timer de laborator
Reactivi
Hematoxilina Ehrlich (1886)
Hematoxilin ...................................................... 2 g
Etanol 95% ................................................... 100 ml
Ap distilat .................................................. 100 ml
Glicerin ....................................................... 100 ml
Alaun de potasiu, n exces ..................... aprox. 20 g
Acid acetic ...................................................... 10 ml
Hematoxilina Harris
Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Etanol 95% .................................................. 50,0 ml
Alaun de potasiu .......................................... 100,0 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml
Oxid de mercur ................................................ 2,5 g
Se dizolv hematoxilina n etanol i alaunul n ap cu ajutorul cldurii. Se
amestec cele dou soluii. Amestecul se aduce la fierbere ct mai repede
posibil i apoi se adaug oxidul de mercur. Se continu fierberea pn
cnd apare o culoare purpurie intens (rou-nchis, violet), apoi se
introduce recipientul ntr-o baie de appn la rcirea complet. Dup
rcire, se adaug 40 ml de acid acetic glacial.Cnd se observ o strlucire
aurie a soluiei, aceasta se filtreaz. Dac aceast strlucire nu apare,
coloraia va fi de calitate inferioar.

Hematoxilina Mayer
Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Ap distilat ............................................... 700,0 ml
Alaun de potasiu ............................................ 50,0 g
Glicerin .................................................... 300,0 ml
Iodat de sodiu .................................................. 0,4 g
Acid acetic glacial ....................................... 20,0 ml
Se dizolv hematoxilina ntr-o cantitate redus de ap, apoi alaunul n
aproximativ 650 ml de ap distilat. Se amestec cele dou soluii i se
completeaz pn la 700 ml. Se adaug iodatul de sodiu n soluie, dup
care aceasta se nclzete blnd pentru a grbi oxidarea
hematoxilinei.Soluia se las la rcit pentru o jumtatede or, se filtreaz,
apoi se adaug acidul acetic glacial i glicerina. Soluia poate fiutilizat
imediat i este stabil 2-3 luni.
Tehnica de colorare
1. Deparafinarea i hidratarea cu ap distilat a seciunilor;
2. Se imerseaz preparatele ntr-una din soluiile de hematoxilin, un timp
variabil, conform variantei de hematoxilin ntrebuinate: 5-10 minute
pentru
hematoxilina Mayer, 5 minute pentru hematoxilina Harris i 15 minute
pentru
hematoxilina Ehrlich;
3. Se spal lamele cu ap distilat, apoi se introduc n soluia de albstrire
Scott
pentru 1-2 minute. Se cltesc n ap distilat i se examineaz la
microscop.
Seciunea trebuie s fie supracolorat;

4. Se difereniaz cu alcool - acid 0,5% pentru a ndeprta excesul de


colorant din fond, lsnd colorai numai nucleii;
5. Cltire cu ap distilat i apoi reimersare n soluia de albstrire Scott
pentru
nc 1-2 minute;
6. Se reexamineaz la microscop i dac seciunile sunt suficient
decolorate se
continu cu pasul urmtor. Dac seciunea este insuficient difereniat
atunci se
repet paii 4 i 5;
7. Splare n ap de robinet 5-10 minute;
8. Colorare cu eozin alcoolic (se las lamele cu seciuni n soluia de
colorare
pn cnd acestea sunt uor supracolorate);
9. Cltire n 2 bi de etanol 95%;
10. Difereniere n alcool absolut pn cnd se obine o coloraie optim;
11. Deshidratare ntr-o baie de alcool absolut;
12. Clarificare n cteva bi de xilol;
13. Montarea lamelelor cu balsam de Canada, Xam sau alte medii neutre de
montare care sunt miscibile cu xilolul.
Rezultatul colorrii
Nucleii albastru purpuriu
Hematiile rou
Celulele musculare roz intens
Fibrele de colagen roz
Not:

Pentru realizarea coloraiei Hematoxilin-Eozin, se poate folosi oricare din


soluiile de hematoxilin prezentate la reactivi.
6.5. Montarea
Montarea presupune n prealabil deshidratarea i clarificarea seciunilor.
nainte de introducerea lamelor cu seciuni n prima baie de etanol, acestea
se
usuc prin compresare uoar cu hrtie de filtru pe ambele fee. De
asemenea, lamele se terg pe verso cu un tifon curat pentru a ndeprta
resturile de colorant.
Urmeaz deshidratarea:
1. Etanol 95 %, 5 minute;
2. Etanol 95 %, 5 minute;
3. Etanol 100 %, 5 minute;
4. Etanol 100%, 5 minute;
5. Toluen, 10 minute.
Dac seciunile nu sunt complet deshidratate, la introducerea lor n toluen
va
apare o turbiditate albicioas. Aceasta va limita conservabilitatea
preparatelor.
Medii de montare
Balsamul de Canada
Este o rin a coniferului Abies balsamea, dizolvat n proporie de 55 %
n
xilol. Prin nvechire capt o coloraie glbuie, iar unele coloraii nu se
conserv
corespunztor (ex. coloraiile cu fucsin acid, verde luminos).
Pe lama umectat cu toluen se pune o pictur de mediu de montare, iar

deasupra se aeaz o lamel:


1. Lamela se aeaz pe lam, sub o inciden de 45, atingnd cu marginea
pictura de mediu de montare; dup ce pictura s-a extins pe toat
lungimea marginii ce formeaz unghiul diedru cu lama, aceasta se
preseaz uor2. Se depune o pictur de mediu de montare pe lam i una
pe lamel, apoi
acestea se aduc paralel pn cnd cele dou picturi conflueaz, apoi
lamela se
preseaz uor.
Se ndeprteaz eventualele bule de aer de sub lamel cu ajutorul unui ac
de
disociere. Excesul de mediu de montare se ndeprteaz cu ajutorul unui
tifon mbibat n benzen.Preparatele histologice astfel obinute se menin n
poziie orizontal la temperatura camerei, timp de 2-3 zile.
6.6. Etichetarea i arhivarea
Dup ce excesul de mediu de montare este ndeprtat, preparatele se pot
eticheta. Preparatele histologice se eticheteaz prin plasarea unor mici
etichete
dreptunghiulare adezive la captul mat al lamei. Aceast etichet se
completeaz cuajutorul unei tu rezistent la ap i va cuprinde instituia,
numrul din registrul laboratorului, anul, natura probei, coloraia etc.
Arhivarea preparatelor histologice trebuie s asigure n primul rnd
protejarea
acestora de ocuri mecanice, de lumin, umiditate i praf. Dup
interpretarea
microscopic i fotografierea aspectelor morfologice de interes,
preparatele histologice permanente se arhiveaz n cutii speciale n ordinea
seriei, n fante numerotate, iar cutiile se introduc n sertarele histotecii.
Blocurile de parafin se vor pstra n plicuri care vor avea aceleai
nsemnri ca i preparatele i vor fi depozitate n rafturile unor dulapuri

special destinate acestui scop. n registrul de laborator, n dreptul fiecrei


probe de esut, se vor nota datele de identificare i locul de depozitare al
preparatelor i blocurilor (Histoteca nr., sertarul nr, cutia nr..,
rndul nr...). Ele se menin minim 10 ani i sunt refcute cnd este
necesar.