Diagnosticul,de,laborator,

,
Etapele,diagnosticului,virusologic:,
1,orientarea,diagnosticului,
2,recoltarea,produsului,patologic,
3,transportul,produselor,patologice,
4,directiile,diagnosticului,virusologic,
1.,Orientarea,diagnosticului:,
;,se,iau,date,de,la,pacient,,in,cursul,anamnezei,
;,ne,intereseaza:,data,debutului,simptomatologiei,,date,epidemiologice,(contact,
cu,boli,infectioase,,transmisibile),,calatorii,in,zone,endemice,,vaccinari,
2.,Recoltarea,produsului,patologic,
;,se,face,cu,tampon,steril,dupa,decontaminarea,zonei,de,alti,germeni,
bacteriologici,
Produse,patologice,
,;,sange:,punctie,venoasa,aseptica,pe,anticoagulant:,virusuri,care,disemineaza,
viremic,si,agentii,etiologici,ai,febrelor,hemoragice.,
,;,materiile,fecale:,4;8,g,in,solutie,de,MgSO4.,Se,izoleaza,enterovirusuri,,
rotavirusuri,,calicivirusuri,
,;,secretii,nazo,faringiene,
,,;,spalatura,nazofaringiana:,tampoane,sterile,
,,;,aspirat,nazofaringian:,speculum,nazal,
,,;,lavaj,traheobronsic:,bronhoscopie,
,,Se,izoleaza:,virusuri,gripale,A,si,B,,paragripale,,adenovirusuri,,rhinovirusuri,,
coronavirusuri,,VRS,,rujeolos,,rubeolos,,urlian,
;,LCR:,virus,rabic,,arbovirusuri,
;,saliva:,cu,tampon,steril;,pentru,virus,rabic.,
;,lichid,vezicular:,colectare,din,vezicule,,bule,,pustule,se,face,dupa,dezinfectarea,
prealabila,a,regiunii,cutanate,sau,mucoase.,Virusuri,izolate:,HSV1,,HSV2,,VZV,
;,urina:,CMV,,virus,rujeolos,
;,tampoane,vaginale,,lavaj,cervico;vaginal,,tampon,uretral:,de,la,nivelul,colului,
uterin,si,uretrei.,Virusuri,izolate:,herpetic,,HPV;,diagnostic,uretrite,,leziuni,
veziculare,
;,biopsia,tisulara:,fragmente,de,organ,
3.,Transportul,probelor,recoltate,
;,rapid,,la,rece,si,sigur,
;,ambalare,riguros,corecta,,etichetare,cu,semn,biorisc,,documentatie,in,legatura,
cu,agentul,etiologic,transportat,
4.,Directiile,diagnosticului,virusologic,
,a.,izolare,virala,
,b.,demonstrarea,prezentei,virusului/componentelor,sale,
,c.,diagnostic,serologic,
a.,Izolarea,virusurilor:,
,Exista,3,sisteme,de,izolare:,culturi,celulare,,OGE,,animal,de,laborator,
Izolarea,pe,culturi,de,celule,determina,efecte,citopatice,
Ex:,Rabia,da,incluzii,Negri,in,neuron.,,
Izolarea,prin,inoculare,la,animal,de,laborator:,
Ex:,Rabia,produce,modificari,patognomonice,in,SNC.,,
,

b.,Demonstrarea,prezentei,virusului/componentelor,sale,
;,prin,microscopie,electronica,
;,prin,detectie,directa:,a,acidului,nucleic,sau,antigenelor,virale,
,,;,PCR,
,,;,ELISA:,test,imuno,enzimatic,
,,;,reactia,de,imunofluorescenta,
,,;,neutralizarea,efectului,citopatogen:,reactia,de,seroneutralizare,
(enterovirusuri),
,,;,inhibarea,efectului,viral:,hemaglutinoinhibare,;,virusuri,gripale,
C.,Diagnostic,serologic,
;,pe,proba,unica,de,ser:,anticorpi,antivirali,de,tip,IgM,;,ELISA,de,captura,
;,pe,probe,pereche,de,ser:,proba,1,la,debut,si,proba,2,la,2;3,saptamani,;,ELISA,
tehnica,indirecta,(de,competitie):,
,,,;,seroconversia,
,,,;,cresterea,semnificativa,a,titrului,de,anticorpi,intre,cele,2,probe,
,

Izolarea(virusurilor(in(culturi(celulare.(Efecte(citopatice(
(
Directiile(diagnosticului(virusologic(
1.(Izolare(virala(in:(culturi(celulare,(OGE,(animal(de(laborator(
2.(Detectia(directa(a:(particulelor(virale,(antigenelor(virale,(genomului(viral(
3.(Teste(serologice:(Ac(virus(specific(de(tip(IgM;(seroconversia(in(anticorp(specific(de(tip(IgG.(
Culturi(celulare:(metodologia(propagarii(in(vitro(a(unui(fragment(de(tesut(sau(a(unor(celule(
dispersate(obtinute(din(tesuturi(cu(ajutorul(unor(enzime(proteolitice(si(introduse(intrFun(mediu(
nutritiv(capabil(sa(le(asigura(homeostazia(si(proliferarea.(
Clasificare(culturi:(
F(culturi(de(organ:(mentinerea(in(vitro(a(unor(fragmente(de(organ(in(vederea(pastrarii(arhitecturii(
si(functiei(intacte(a(celulelor.(Corona,(rhinovirusurile(nu(se(cultiva(decat(pe(culturi(de(trahee.(
F(culturi(de(celule(dispersate:(provin(din(disocierea(tesuturilor(intrFo(suspensie(de(celule(prin(
tratare(enzimatica(asociata(cu(agitare(mecanica.(Se(clasifica(dupa(timpul(de(supravietuire(in:(
culturi(primare,(tulpini(celulare(si(linii(celulare.(
((
Culturile(primare:(
((Se(formeaza(direct(din(dispersia(enzimatica(a(unui(tesut(proaspat(recoltat.(Formeaza(monostrat.(
Celulele(tind(sa(mentina(caracteristicile(organului(din(care(deriva.(Pot(aparea(proprietati(de(
suprafata(noi.(Se(mentine(in(vitro(timp(limitat,(adica(3F5(pasaje((reinoculari).(
(Tulpini(celulare(
((Sunt(omogene(si(au(o(durata(de(viata(de(50F60(de(pasaje.(Virusurile(respiratorii(cresc(foarte(bine(
pe(tulpini(derivate(din(piele,(intestin(si(amigdale.(Cariotipul(cromozomial(este(cel(de(origine(
diploida.(Pot(fi(utilizate(in(producerea(de(vaccinuri(virale(si(pentru(diagnosticul(virusologic(
(Liniile(celulare(
((Sunt(populatii(de(celule(derivate(din(tesut(normal(sau(mailgn(ce(pot(fi(subcultivate(un(timp(
nelimitat.(Au(caracter(heteroploid.(Nu(pot(fi(folosite(in(producerea(de(vaccinuri(din(cauza(
instabilitatii(genomului.(
(
Componente(culturi(de(celule(dispersate:(
(F(celule(vii:(Reflecta(tesutul(de(provenienta:(tesut(embrionar,(adult(sau(tumoral(
(F(mediu(nutritiv:(saruri(tamponate(izotone,(aminoacizi(esentiali,(ser(de(vitel,(vitamine,(antibiotice(
si(antifungice(
(
Conditii(necesare(pentru(pastrarea(in(viata(a(celulelor(din(cultura(celulara:(pH(adecvat,(
temperatura(constanta,(atmosfera(cu(10%(CO2,(conditii(aseptice.(
(
Obtinerea(unei(culturi(celulare:(
F(se(preleva(tesutul(sursa(in(conditii(aseptice(
F(se(fragmenteaza(tesutul(in(bucati,(se(spala(cu(solutie(salina(tamponata(
F(disocierea(enzimatica(a(celulelor:(tripsinizare(
F(suspendarea(celulelor(in(mediu(nutritiv(
F(controlul(viabilitatii(celulelor(cu(coloratie(vitala(albastru(de(tripan(
F(repartizarea(celulelor(in(volume(egale(in(flacoane(de(culturi(
F(incubare(in(pozitie(culcata(
F(urmarirea(formarii(culturii(cu(microscopul(invers(
(
Subcultivarea(culturilor(celulare:(
(Dupa(5F7(zile(de(la(realizarea(culturii(se(epuizeaza(substantele(nutritive,(sursele(de(energie(si(se(
acidifica(mediul.(Pentru(mentinerea(celulelor(in(viata,(acestea(trebuie(pasate(si(subcultivate.(
Celuele(se(detaseaza(de(pe(peretele(flaconului(cu(solutie(de(tripsina(si(EDTA,(se(centrifugheaza,(se(
spala(cu(solutie(salina(tamponata(si(se(seuspendeaza(in(mediu(nutritiv.(Se(verifica(viabilitatea(

celulelor,(se(numara(celulele(si(se(ajusteaza(la(concentratia(optima.(Se(repartizeaza(volume(egale(
in(flacoane(de(cultura(celulara:(
((F(culturile(primare(se(subcultiva(de(3F5(ori(
((F(tulpinile(celulare(se(subcultiva(de(50F60(de(ori(
((F(liniile(celulare(se(subcultiva(la(infinit(
(
Culturi(provenite(din(celule:(
(F(normale:(celulele(se(ataseaza(de(peretele(flaconului,(se(multiplica(pana(acopera(peretele(si(
realizeaza(o(cultura(monostrat(
(F(tumorale:(se(multiplica(si(dupa(acoperirea(suprafetei(disponibile,(cresc(in(mai(multe(straturi(si(
in(suspensie.(
(
Celulele(transformate:(
(Sunt(linii(celulare(care(au(suferit(o(modificare(stabila,(spontana(sau(prin(expunere(la(diferiti(
agenti;(modificare(care(este(mentinuta(indefinit(prin(cultivare(in(vitro(sau(transplant(in(vivo.((
(Sunt(morfologic(distincte(si(se(dispun(dezordonat.(Daca(se(inoculeaza(la(animale(produc(tumori.(
Se(multiplica(haotic,(nu(au(inhibitie(de(contact,(nu(adera(la(substratul(de(izolare.(Au(cerinte(
nutritive(mici,(se(divid(la(concentratii(mici(de(ser(de(vitel.(Prezinta(antigene(de(suprafata(diferite(
de(celulele(normale.(Prezinta(modificari(cromozomiale,(cariotip(aneuploid.((
(
Inocularea(virusurilor(in(culturi(celulare(
(Se(arunca(mediul(nutritiv(si(se(introduce(suspensia(virala.(Incubare(1(ora((pentru(adsorbtie).(Se(
adauga(mediu(de(intretinere,(se(incubeaza.(In(3F5(zile(apar(modificarile(survenite(in(cultura(
celulara.(
Izolarea(urmareste(efectele(citopatice.(
Efectele(citopatice:(
(F(sincitial:(HIV,(rujeolos,(VRS(
(F(picnotic(litic:(enterovirusuri(
(F(incluzionar:((
((F(intranuclear(acidofil:(papovavirusuri(
((F(intranuclear(bazofil:(adenovirusuri:(se(multiplica(in(nucleu(unde(proteinele(capsidare,(produse(
in(exces,(formeaza(incluziile(intranucleare(
((F(intracitoplasmatic(acidofil:(virus(rabic,(vaccinia(
((F(mixt:(virusuri(herpetice,(rujeolos(
(

Diagnostic*in*viroze*respiratorii*
*
Orientare*clinica:*febra*(375*zile),*mialgie,*cefalee,*astenie,*tuse*neproductiva,*
faringita,*rinoree.*
Gripa*nu*se*diagnosticheaza*clinic.*
Are*simptomatologie*asemanatoare*cu:*mycoplasma*pneumoniae,*adenovirusuri,*
VRS,*rhinovirusuri,*Legionella*
Sunt*Orhtomixovirusuri.*Sunt*tipuri*A,*B,*C*i*au*subtipuri*n*funcie*de*
hemaglutinina*sau*neuraminidaza*pe*care*o*contin.**
Sunt*formate*din:*HA,*NA,*nucleocapsida*helicoidala*ARNss,*anvelopa,*
transcriptaza*si*matrice.*
*
Produse*patologice:*
7*spalatura*nazofaringiana:*se*obtine*cu*tampoane*sterile*in*cornetul*nazal*
inferior*
7*aspirat*nazofaringian:*cu*speculum*nazal*
7*lavaj*traheobronsci:*prin*bronhoscopie*
7*exsudat*nazo7faringian:*
*Se*recolteaza*cu*tampon*steril*secretii*de*pe*peretele*posterior*si*lateral*al*
orofaringelui*si*din*orice*zone*cu*inflamatie,*exsudat*sau*ulceratie.*Recoltarea*se*
face*folosind*un*tampon*steril.*
Stocare*si*transport:*se*inoculeaza*imediat*dupa*recoltare*sau*se*ingheata*la*7
70C*in*gheata*carbonica.*
Prelucrare:*tamponul*este*dispus*intr7un*tub*steril*cu*circa*15ml*de*mediu*de*
transport*pentru*elutia*virusului.*Tubul*se*centrifugheaza*la*2500*rot/15*minute*
la*4C.*Se*spala*celulele*si*se*formeaza*un*depozit*de*celule*pentru*izolare*virala*
sau*efectuare*de*seruri*antivirale*disponibile.*
Directii*de*diagnostic:*
*7*izolare*virala*+*identificare*
*7*detectie*directa:*RIF,*PCR*
*7*diagnostic*serologic*
Izolarea*virala*7*diagnostic*de*electie:*
*1.*Culturi*primare*de*rinichi*de*maimuta*rhesus;*linie*continua*epiteliala*de*
rinichi*de*caine*
*2.*Pe*OGE*de*9711*zile,*inoculat*intraamniotic*sau*intaalantoidian.*Izolarea*se*
demonstreaza*prin*proprietatea*virusurilor*gripale*de*a*aglutina*hematii.*
Hemadsorbtia:*
*Demonstreaza*izolarea*virusurilor*gripale*pe*culturi*de*celule.*
*Virusurile*nu*sunt*citopatogene.*La*48*de*ore*dupa*inocularea*virusului*gripal*se*
incearca*detectia*virusului*prin*hemadsorbtie*obisnuit*cu*eritrocite*de*cobai*la*
4C.*Hemadsorbtia*rezulta*din*incorporarea*in*membrana*plasmatica*celulara*a*
HA*virale.*Hematiile*adsorbite*specific*rozeteaza*la*periferia*celulelor*infectate.*
*
Reactia*de*hemaglutinare:*
*Este*capacitatea*unor*virusuri*de*a*aglutina*hematiile*unor*specii*de*animale.*
Virusurile*care*poseda*capacitatea*de*a*aglutina*hematii*se*numesc*virusuri*
hemaglutinante*(rubeola,*rujeola,*urlian,*adenovirusuri,*enterovirusuri,*gripale*si*
paragripale).*Se*pun*in*contact*dilutii*succesive*binare*de*antigen*hemaglutinant*
cu*hematiile*corespunzatoare*virusului*incriminat.*

*
Demonstrarea*prezentei*virusului*prin*RHA:*
*Etape:**
**7*dilutii*binare*de*antigen*viral*
**7*suspensie*de*hematii*
**7*se*incubeaza*la*temperatura*camerei*7*60*de*minute*
Se*produce*titrarea*antigenului*hemaglutinant*inaintea*reactiei*de*hemaglutino7
inhibare.*
Clasificare*virusuri*hemaglutinante:*
1.*HA*structurala*care*distruge*R:*gripale,*paragripale*
2.*HA*structurala*care*nu*distruge*R:*arbovirusuri,*rubeola*
3.*HA*non*structurala:*poxvirusuri*
*
Reactia*de*hemaglutino7inhibare:*
Se*produc*dilutii*binare*din*ser*imun*de*referinta*cu*antigen*viral*hemaglutinant*
(60*min*la*37C).*Se*foloseste*sistem*indicator7suspensia*de*hematii.*Se*
incubeaza*60*minute*la*temperatura*camerei.*
Ultima*unitate*hemaglutinanta:*ultimul*godeu*in*care*s7a*produs*hemaglutinarea.*
*
Detectie*directa:*
a.*Reactia*de*imunoflorescenta:*
7*test*rapid,*ieftin,*reproductibil*
7*pentru*gripa,*herpes,*rabie*
7*incubare*cu*anticorp*fluorescent,*spalare*si*citire*la*MO*in*lumina*UV.**
RIF+:*minim*2*celule*fluorescente*
RIF7:*minim*20*de*celule*negative**
b.*PCR:*acid*nucleic*
*
Diagnosticul*serologic:*
*Necesita*recoltarea*de*probe*de*ser*pereche*de*la*acelasi*pacient.*Nu*se*practica*
in*mod*curent*decat*in*caz*de*epidemii*pentru*diagnostic*retrospectiv.*
Diagnosticul*necesita*demonstrarea*unei*cresteri*semnificative*a*titrului*de*Ac*
specifici*antivirali*intre*proba*de*faza*acuta*si*cea*din*convalescenta.**
Metoda*preferata*de*evidentiere*a*anticorpilor*anti7virali*specific*e*
hemaglutinoinhinarea.*
*

Diagnostic*in*infectia*cu*virusuri*herpetice*

!
Herpesviridae:!
,!Alfaherpesvirinae:!HSV1,!HSV2,!VZV!
,!Betaherpesvirinae:!CMV,!HHV6,!HHV7!
,!Gamaherpesvirinae:!Epstein!barr,!HHV8,kapsoi!associated!
!
Diagnostic*in*infectia*cu*alfaherpesvirusuri*
Produse!patologice:!lichid!vezicular,!tampon!conjunctival,!tampoane!vaginale,!lavaj!cervico,
vagina;,!tampon!uretral!
Recoltarea!este!recomandata!in!cazul!leziunilor!active.!
Directii!de!diagnostic:!
a.!izolare!virala:!diagnostic!de!electie!
b.!diagnostic!direct:!PCR,!RIF!
c.!diagnostic!indirect:!valoarea!testelor!serologice!
!
a.!Izolarea!virala:!
Are!efect!citopatic!mixt:!
,!sincitial:!formeaza!celule!balonizate,!multinucleate!
,!incluzionar!acidofil:!corpii!Cowdry!A!
b.!Diagnostic!direct:!
Reactia!de!imunofluorescenta!directa:!
,!este!test!specific!reproductibil!si!ieftin.!
,!se!face!amprenta!direct!pe!lama!si!impersie!in!acetona!la!2,8C!timp!de!10!minute,!apoi!uscare!
,!se!face!incubare!cu!anticorp!fluorescent!apoi!spalare!si!citire!la!MO!in!lumina!UV.!
,!Anticorpii!monoclonali!marcati!cu!ITC!fluoresceina!sau!rhodamina!sunt!anti!epitopi!specifici!de!
la!nivelul!anvelopei:!
!!,!glicoproteina!C!si!ICP35:!HSV1!
!!,!polipeptide:!HSV2!
PCR:!metoda!mai!sensibila!de!confirmare!a!diagnosticului!de!infectie!
!,!util!in!detectia!infectiei!in!excretia!asimptomatica,!evaluarea!riscului!transmiterii!HSV!in!cupluri!
discordante,!eficienta!supresiei!replicarii!virale!in!terapia!antivirala.!
!
Diagnostic*in*infectia*cu*betaherpesvirusuri*4*CMV*
4*prenatal:!malformatii!congenitale!severe!
,!perinatal:!boala!cu!incluzii!citomegalice!a!nou,nascutului!
,!postnatal:!infectie!asimptomatica!sau!asemanatoare!mononucleozei!
Produse!patologice:!lavaj!bronhoalveolar,!LCR,!biopsii!tisulare,!sange,!urina!
Directii!de!diagnostic:!
1.!Izolare!virala:!pe!culturi!de!fibroblaste!diploide!umane.!Are!loc!replicare!lenta.!Efectul!citopatic!
apare!dupa!2,3!saptamani.!Acesta!este!reprezentat!de!citomegalie!si!incluzii!intranucleare!tipice!in!
ochi!de!bufnita!
Directii!de!diagnostic:!
2.!IF!directa:!pentru!detectia!antigenelor!pp65!din!fractia!limfocitara.!
3.!PCR!pentru!ADN!CMV!din!sange!sau!lichid!amniotic.!
4.!ELISA!pe!captura:!pentru!anticorpi!anti!CMV!IgM.!Se!poate!face!si!ELISA!cantitativa!pentru!
evidentierea!seroconversiei!in!anticorpi!antiCMV!IgG!pe!probe!pereche!de!ser.!!
*
Diagnostic*in*infectia*cu*gamaherpesvirusuri*4*EBV*
Se!efectueaza!EIA!si!IF,!din!ser,!cu:!
!,!anticorpi!anticapsidari!IgM!(antiVCA)!
!,!anticorpi!antinucleari!(anti!EBNA)!
Se!face!PCR,!din!biopsie!tisulara!sau!sange,!pentru!ADN!EBV!

Diagnostic*de*laborator*in*hepatite*virale*
Orientarea(diagnosticului(
1.(Tablou(clinic:(durere(in(hipocondru(drept,(greata,(voma,(pierderea(apetitului,(icter,(oboseala,(
mancarimi,(eritroza(palmara(
2.(Teste(Biochimice:(markerii(necrozei(hepatocitare((transaminaze,(LDH),(markeri(colestaza((FAL,(
GGT,(bilirubina),(markeri(ai(incapacitatii(de(sinteza(la(nivel(hepatic((proteine(serice,(colesterol,(TG)(
3.(Date(epidemiologice:(cale(de(transmitere,(contact(infectant,(perioada(incubatie,(vaccinuri(
(H(transmitere(enterica:(A,(E(
(H(transmitere(parenterala:(B,(C,(D(
alte(virusuri(care(dau(hepatite:(VHF,(VHG,(Coxackie,(EBV,(CMV,(arbovirusuri(
4.(Diagnostic(etiologicH>(detectia(markerilor(virali:(antigene(virale,(anticorpi,(acid(nucleic(
(
Diagnostic(VHB(
(Antigenele(VHB:(
((H(Ag(HBs(H>(Ac(antiHBs:(markeri(de(vindecare.(Daca(e(pozitiv(inseamna(ca(pacientul(este(infectat.(Daca(
este(negativ(sunt(mai(multe(optiuni:(nu(este(infectat,(are(hepatita(acuta(B,(are(hepatita(oculta(cronica(
B,(este(vindecat,(este(vaccinat.(
((H(Ag(HBc(H>(IgM(si(IgG(anti(HBc.(E(prezent(in(hepatocite.(Daca(e(pozitiv,(e(fals(pozitiv.(Este(clivat(in(Ag(
HBe.(((
((H(Ag(HBe(H>(Ac(anti(HBe;(marker(de(replicare(virala(
Pacientii(vindecati(pot(pastra(ADN(viral(in(hepatocit(si(se(poate(reactiva(ducand(la(hepatita(B(
fulminanta(in(caz(de(imunosupresie(
ADN$VHB$este$marker$de$replicare$virala$si$de$diagnostic.$
$
(
(
(
IgM(anti(HBc(+(
IgM(anti(HBc(H(
Ag(HBs(+(

hepatita(acuta(B(

hepatita(cronica(

Ah(HBs(H(

hepatita(acuta(B(

nu(e(hepatita(acuta(

(
(

Hep(cronica(
agresiva(activa(
+(
H(
+(
+(
H(
H(

Hep(cronica(
persistenta(
+(
H(
+(
H(
+(
H(

Vaccinat(

Vindecat(

Hep(cronica(
oculta(
H(
H(
+(
(
(
(

Ag(HBs((
H(
H(
IgM(anti(HBc(
H(
H(
IgG(anti(HBC(
H(
+(
Ag(HBe(
H(
H(
Ac(anti(HBe(
H(
+(
Ac(anti(HBs(
+(
+(
(
Hepatita(B(poate(fi:(
(H(acuta(
(H(cronica(persistenta(
(H(cronica(agresiva:(ciroza,(carcinom(hepatoHcelular(
Pentru(detectia(antigenelor(virale(se(face(ELISA.(
(H(Tehnica:(Incubare(ser(pacient;(spalare;(Incubare(conjugat(Ac(anti(HBs(cuplat(cu(o(enzima);(spalare;(
Incubare(substrat;(solutie(de(stopare;(citire(la(spectrofotometru(
(
(
(

Diagnostic(molecular:(
1.(Monitorizarea(evolutiei(naturale(sau(sub(tratament(a(hepatitei(virale(B:(riscul(de(ciroza/cancer(
creste(cu(nivelul(viremiei,(atat(pentru(persoanele(Ag(HBe(negative(cat(si(pentru(cele(pozitive.(
(Mortalitatea(datorata(bolilor(hepatice(prin(infectie,(este(de(vreo(20x(mai(mare(in(cazul(coinfectiei(HIV.(
2.(Initierea(tratamentului(pentru(hepatita(cronica(B.(Tratamentul(este(initiat(pe(baza:(
H(testelor(serologice,(teste(moleculare,(transaminazelor(serice(
La(persoanele(AgHBe(negative,(incarcatura(virala(mai(mare(de(10000(de(copii(indica(infectie(activa.(
3.(Criterii(de(evaluare(a(raspunsului(la(terapie(in(hepatita(cronica(B(
a.(Virusologice:(
(H(mentinerea(nedetectabila(a(ADNHVHB(plasmatic(
(H(seroconversie(sustinuta(la(antiHBe(la(pacientii(AgHBe(pozitivi(
(H(eliminarea(AgHBs(seroconversie(antiHBs(
b.(Biochimice:(
(H(normalizarea(sustinuta(a(nivelului(transaminazelor(
c.(Histologice:(
(H(reducerea(stadiului(de(fibroza(sau(absenta(a(progresiei(
(H(reducerea(activitatii(necroHinflamatorii(
(
Diagnostic(VHD(
H(are(transmitere(parenterala(
H(infectia(cu(VHD(apare(doar(la(cei(care(sunt(infectati((au(avut(infectia)(VHB(
H(hepatita(D(se(trateaza(doar(cu(PegInterferon(
H(in(caz(de(cronicizare(poate(duce(la(cancer;(nu(se(vindeca(si(nici(nu(are(tratament(
(
Hepatita(acuta( Suprainfectie(H( Hepatita(
concomitent(
cronicizare(
cronica(D(
Ag(HBs(

+(

+(

+(

IgM(anti(HBc(

+(

H(

H(

IgM(anti(VHD(

+(

+(

H(

Ag(VHD(

+(

+(

H(

IgG(anti(VHD(

H(

H(

+(

(
Diagnostic(VHC(
1.(Teste(serologice:((H>(nu(pot(diferentia(intre(o(infectie(acuta,(cronica(sau(vindecata(
(H(ELISA:(detectie(Ac(anti(VHC.(Are(sensibilitate(mare.(In(populatii(cu(risc(scazut(de(infectie(are(valoare(
predictiva(mica.(
H(RIBA/(Western(Blot(
2.(Teste(moleculare:(
H(teste(calitative:(RTHPCR:(pentru(diagnosticul(infectiei(active.(Ajuta(la(detectia(timpurie(a(infectiei.(Dar(
o(singura(determinare(negativa(este(neconcludenta(
H(teste(cantitative:(RTHPCR,(BHDNA:(aprecierea(rezultatelor(terapiei((pentru(raspuns(virusologic(
sustinut).(Nu(exclude(diagnosticul(infectiei(
3.(Teste(de(genotipare:(
H(secventierea(nucleotidica,(RFLP,(LiPA.(Se(pot(identifica(genotipuri,(subtipuri(si(qvasispecii.(Apreciaza(
durata(tratamentului(si(prognosticul(raspunsului(virusologic(sustinut(
(
(
(

Patternul(serologic(al(infectiei(VHC(acute(cu(vindecare:((
H(simptome(;(ARN(VHC(este(detectabil(doar(in(primele(cateva(luni.(Transaminazele(au(un(maxim(la(
inceput(apoi(incep(sa(scada(pana(la(normal.(Anticorpii(anti(VHC(cresc(si(se(mentin(la(un(nivel(crescut(
Patternul(serologic(al(infectiei(VHC(care(se(cronicizeaza:(
H(simptome(;(ARN(VHC(este(persistent(avand(cateva(momente(in(care(poate(fi(nedetectabil.(
Transaminazele(variaza(tot(timpul,(iar(anticorpii(anti(VHC(cresc(si(se(mentin(la(un(nivel(crescut.(
(
( Anticorpi( ARN( Explicatii(
1( H(

H(

absenta(infectiei(VHC(

2( +(

+(

infectie(acuta/cronica((activa)(

3( H(

+(

4( +(

H(

infectie(acuta(recenta(in(fereastra(serologica(/(infectie(cronica(la(
un(pacient(imunosupresat(
infectie(vindecata(/(viremie(redusa(sau(fluctuanta;(intermitent(
negativa(

(
Succesul(terapeutic(in(hepatita(cronica(C:(
(H(Raspunsul(virusologic(sustinut:(duce(la(vindecare;(inseamna(mentinerea(ARN(VHC(nedetectabil(la(
mai(mult(de(6(luni(de(la(oprirea(tratamentului.(
(H(Nonresponderi:(pacienti(care(nu(raspund(la(tratament(
(H(la(unii(pacienti(poate(aparea(o(recadere(dupa(oprirea(tratamentului(
(
Genotipul(1(este(cel(mai(rezistent(la(tratament(
Efecte(adverse(interferon:(leucopenie,(trombocitopenie,(psihologice(
(
Teste(de(genotipare:(
LiPA:(
(H(hibirdizare(cu(sonde(moleculare(cu(specificitate(pentru(regiuni(conservate(din(cadrul(genotipurilor(
si(subtipurilor(
(H(evidentierea(profilului(specific(unui(genotip(prezent(in(ampliconii(din(5NTR(si(miez.(
(
Diagnostic(VHA(
(H(hepatita(A(nu(cronicizeaza(
(H(hepatita(A(se(face(o(singura(data(
(H(simptomatologia(poate(fi(sau(nu(prezenta(
(Pentru(diagnostic(se(realizeaza(detectie(de(Ac(anti(VHA(IgM,(prin(ELISA(de(caputra.(Prezenta(Ac(anti(
VHA(IgG(semnifica(vindecarea(sau(vaccinarea.(
(ELISA(de(captura(pentru(Ac(IgM:(
((H(tehnica:(incubare(ser(pacient;(spalare;(incubare(conjugat((antigen(marcat(enzimatic);(spalare;(
incubare(substrat;(citire(la(spectrofotometru(
( IgM(
IgG(
Tipul(de(infectie(
antiVHA( antiVHA(
1( +(
H(
hepatita(acuta(
2( H(
+(
vindecat/vaccinat(
3( H(
H(
nu(e(infectat(
4( +(
+(
spre(sfarsitul(infectiei(acute(
(
(
(
(

Utilizarea(metodelor(moleculare(in(infectiile(virale:(
(H(infectia(HIV(
(H(infectia(VHB:(monitorizarea(evolutiei(naturale(/(sub(tratament(a(hepatitei(virale(B;(initierea(
tratamentului(pentru(hepatita(B(
(H(infectia(VHC:(diagnosticul(infectiei(active;(aprecierea(rezultatelor(terapiei;(aprecierea(duratei(
tratamentului(si(prognosticul((genotipare)(
(H(infectia(HPV:(detectia(ADN(HPV((PCR);(identificare(genotipuri(high(risk(si(low(risk((genotipare)(

Diagnostic*in*infectia*HIV/SIDA*
!
Beneficii:!tratament,!monitorizare,!cresterea!calitatii!vietii!
Temeri:!agravarea!bolii,!scaderea!calitatii!vietii,!contagiozitatea!
!
Incarcarea!virala:!In!faza!acuta!creste!incarcarea!virala!mult,!apoi!scade!si!se!mentine!la!un!nivel!
sesizabil!dar!mai!scazut,!pana!in!perioada!SIDA,!cand!iar!creste!mult!(10^7).!!
Numarul!de!celule!CD4+:!In!faza!acuta!scade!pana!la!un!punct!in!care!incarcarea!virala!este!cea!mai!
mare,!apoi!creste!iar,!dar!doar!pana!la!vreo!600,!dupa!care!incepe!sa!scada!progresiv!pana!la!moarte,!
cand!vor!fi!doar!cateva.!
Complicatii!infectie!HIV:!encefalopatie!
!
I.!Diagnostic!serologic:!
K!teste!de!triaj!(sensibilitate):!ELISA,!teste!rapide!
K!teste!de!confirmare!(specificitate):!western!blot,!radioimunoprecipitare,!imunofluorescenta!
indirecta!
II.!Detectia!directa!a!virusului!sau!a!produselor!virale:!izolare!virala,!detecia!antigenemiei!p24,!
detectia!acidului!nucleic!viral!(ARN!plasmatic!sau!ADN!limfocitar)!
!
I.!Diagnostic!serologic!
ELISA:!
1.!Incubare!ser!pacient!1h!la!37C!
2.!Spalare!
3.!Incubare!conjugat!(Ac!anti!IgG!x!enzima)!1h!la!37C!
4.!Spalare!
5.!Incubare!substrat!20K30!min!la!temperatura!camerei!
6.!Citire!la!sectrofotometru:!probe,!martori!si!cut!off.!
Substratul!adaugat!este!colorat!de!catre!enzima!in!functie!de!cantitatea!de!anticorpi!prezenti!in!cuva.!
!ELISA!de!competitie:!!
!1.!Incubare!ser!pacient!1h!la!37C!
!2.!Spalare!
!3.!Incubare!substrat!20K30!min!la!temp!camerei!
!4.!Citire!la!spectrofotometru!
!
Western!Blot:!
!K!test!imunoblot!folosit!pentru!confirmarea!prezentei!anticorpilor!in!diferite!infectii.!Se!bazeaza!pe!
detectia!anticorpilor!defalcati!pe!grupe!antigenice!
K!Se!foloseste!pentru:!detectia!proteinelor!virale,!caracterizarea!preparatelor!de!anticorpi!mono!si!
policlonali,!determinarea!specificitatii!raspunsului!imun!imptriva!antigenelor!virale.!!
K!Principiu:!proteinele!dintrKun!lizat!viral!sunt!separate!electroforetic!dupa!greutatea!moleculara!
prind!SDSKPAGE;!apoi!sunt!transferate!pe!o!membrana!de!nitroceluloza.!Apoi!se!realizeaza!detectie!
prin!anticorpi!marcati!radioactiv!saun!enzimatic!(colorimetric)!
!!K>!electroforeza:!se!realizeaza!pe!gel!de!poliacrilamida,!apoi!proteinele!sunt!transferate!pe!o!
membrana!de!nitroceluloza!prin!difuzie,!electroforeza!sau!prin!afinitate.!Fixarea!se!face!prin!simpla!
absorbtie!pasiva,!prin!legaturi!covalente,!pe!membrana!diazotata!sau!prin!legare!specifica!pe!
membrana!acoperita!de!anticorpi.!!
K!Tehnica:!SDSKPAGE;!transfer;!detectia!anticorpilor!
K!criteriu!de!pozitivitate:!2!env!+!1!gag!
!!K!gag:!gp120,!gp41,!gp160!
!!K!env:!p24,!p17,!p7/p9!
!
!
!

!
Diagnostic:!
!Daca!ELISA!e!negativ,!se!face!duplicat.!Daca!si!acesta!este!negativ!inseamna!ca!ori!nu!este!infectat!ori!
se!afla!in!fereastra!serologica!K>!in!care!se!determina!Ag!p24,!ADN!proviral!sau!ARN!HIV.!
!Daca!ELISA!este!pozitiv!se!face!western!blot.!Daca!acesta!este!negativ,!pacientul!se!poate!afla!in!
fereastra!serologica!si!se!detecteaza!Ag!p24,!ADN!proviral!sau!ARN!HIV.!Dar!poate!fi!necesara!si!
repetarea!sau!executarea!unui!alt!test!de!confirmare.!Daca!WB!e!pozitiv!inseamna!ca!are!infectie!HIV.!
!
II.!Diagnostic!molecular!
!K!Amplificarea!tintei:!PCR,!NASBA!
!K!Amplificarea!semnalului:!BKDNA!
!
PCR:!polymerase!chain!reaction.!Este!metoda!utilizata!pentru!detectia!ADNKului!de!orice!tip.!Se!
bazeaza!pe!obtinerea!unui!numar!mare!de!catene!tinta!prin!repetarea!unui!nr!de!N!cicluri!ce!contin!
in!principal!3!etape:!
!K!denaturarea:!incalzire!pentru!separarea!catenelor!
!K!aditia!primerilor!la!captele!secventei!tinta:!prin!racire!
!K!extensia!primerilor!(sub!actiunea!ADN!polimeraza!Taq):!se!extinde!capatul!3'!al!fiecarui!primer;!
prin!incalzire!
RT5PCR:*reverstranscriere!+!PCR.!!
!Etape:!
!K!aditie!primer!la!secventa!tinta!de!ARN!
!K!reverstranscriptazele!catalizeaza!extensia!primerului!prin!incorporarea!nucleotidelor!
complementare!
!K!rezulta!sinteza!ADN!complementar!pe!secventa!tinta!ARN!
!Apoi!se!face!PCR.!
!
Detectia!ampliconului:!
!K!electroforeza!in!gel!de!agar,!colorare!cu!bromura!de!ethidiu!si!comparare!cu!markeri!de!greutate!
moleculare!cunoscuta!
!K!hibridizare!cu!sonde!moleculare!marcate!complementar!si!apoi!detectie!(spectrofotometrica)!
!
Utilizarea!metodelor!moleculare!in!infectia!HIV!
!!Pacienti!aflati!in!fereastra!serologica,!nouKnascuti!din!mame!seopozitive!HIV,!initierea!si!
monitorizarea!terapiei!antiretrovirale:!!
!!!K!incarcatura!virala!>5.000K10.000!corelat!cu!nr!CD4!si!status!clinic!
!!!K!incarcatura!virala!>!30.000K50.000!indiferent!de!nr!CD4!si!status!clinic!
!!!K!monitorizarea:!reducerea!incarcaturii!sub!50!de!copii!ARN!HIV/ml!la!24!de!saptamani!
!
!

Papilomavirusuri,
!Determina!tumori!benigne!ale!pielii!care!pot!regresa!spontan.!Papiloamele!
mucoasei!genitale!determinate!de!genotipuri!specifice,!mai!ales!tipurile!
16,18,6,11,!45!si!31!se!pot!maligniza!daca!persista!mai!multi!ani.!!
Papovavirusurile!pot!interactiona!cu!celulele!gazda!in!2!moduri:!
!A!infectie!litica!in!celule!permisive!cu!productia!de!virioni!infectanti!
!A!infectie!persistenta!in!celule!nepermisive!care!duce!la!transformare!maligna!
!
Diagnostic,HPV,
!Scopul!diagnosticului:!
!A!detectia!prezentei!virusului!
!A!demonstrarea!infectiei!active!
!A!decelarea!tipului!de!virus!implicat!in!infectie!
Diagnosticul!direct!vizeaza!detectia!ADNAului!viral!din!leziune!prin!diverse!
tehnici.!Se!vizeaza!detectia!secventei!ADN!L1,!E6,!E7.!!
!A!hibridizare!cu!sonde!ARN!sintetice!care!captureaza!ADN!viral!prin!real!time!
PCR!
!A!tehnica!microarray!
Diagnosticul!indirect,!serologic,!monitorizeaza!prezenta!anticorpilor!anti!L1!si!
poate!decela!infectia!in!curs!de!desfasurare!sau!infectia!vindecata!pentru!a!fi!
utilizate!cu!beneficiu!in!clinica.!
Genotipare,HPV:!
!A!Inno!lipa:!
Unul!din!testele!comerciale!folosite!in!Romania!este!destinat!identificarii!a!26!de!
genotipuri!diferite!de!HPV!prin!detectia!unro!secvente!specifice!din!regiunea!L1!
a!genomului!HPV.!Testul!se!bazeaza!pe!hibridizare!inversa.!O!parte!din!regiunea!
L1!a!HPV!este!amplificata!prin!PCR!si!ampliconii!rezultati!sunt!denaturati!si!
hibridizati!cu!sonde!oligonucleotidice!specifice.!!
Sondele!sunt!imobilizate!ca!liniii!paralele!pe!stripuri!de!celuloza.!Dupa!
hibridizare!si!spalare!se!adauga!un!conjuvat!cu!steptavidina!ce!se!cupleaza!cu!
orice!hibrid!format!anterior.!Pentru!vizualizarea!si!interpretarea!rezultatelor!se!
incubeaza!un!substrat!cromogen.!Rezultatul!acestui!test!poate!fi!pozitiv,!negativ!
sau!pozitiv!pentru!alt!genotip!HPV!fara!a!se!cunoaste!genotipul!HPV!responsabil!
de!leziune.!
!A!Linear!Array!HPV:!bazat!pe!PCR!urmat!de!hibridizarea!acizilor!nucleici!
Prevenirea!cancerului!de!col!uterin:!
!A!Gardasil:!anti!HPV!6,11,16,18!
!A!Cervarix:!anti!HPV!16!si!18!
!