Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cursuri Analiza Medicamentului
Cursuri Analiza Medicamentului
CURS 1 07.10.2013
Calitatea medicamentului
2/3 din aceasta cantitate reprezinta proba si 1/3 contraproba care se pastreaza pe toata
durata de valabilitate a produsului respectiv.
Prelevarea de probe din farmacii/depozite
Se preleveaza o cantitate de substanta de analizat proces verbal de scadere din
gestiune;
Reactiile de identificare la masa de analizat reactii calitative;
Masa de analiza este totata cu reactivi necesari analizelor calitative conform prevederilor
FRX.
Prelevari de probe din laborator
Se preleveaza o cantitate de 3 ori mai mare decat cantitatea necesara efectuarii tuturor
analizelor;
2/3 sunt destinate analizei si 1/3 reprezinta contraproba care se pastreaza pe toata durata
de valabilitate a produsului repspectiv.
Medicamentul
Orice substanta sau combinatie de substanta prezentata ca avand proprietati pentru
tratarea bolilor la om;
Orice substanta sau combinatie de substante folosita sau administrate la om pentru
corectarea, restabilirea sau modificarea functiilor fiziologice sau pentru stabilirea unui
diagnostic medical.
Substanta orice materie indiferent de origine (umana, animala, vegetala, chimica) si care
este utilizata in vederea obtinerii de medicamente.
Substante de uz farmaceutic (de origine organica sau anorganica)
- Definite in suplimentele FRX sa sau excipienti folosite in scopul obtinerii de
medicamente de uz uman sau veterinar;
- Se obtin prin sinteza, extractie, fermentatie sau natural.
-
Preparatele chmice;
Modul in care se efectueaza testele clinice sau nonclinice etc
In Romania autoritatea e ANM
1. Principii care stau la baza bunei practici de lab;
2. Organizarea si personalul instalatiei de testare;
3. Programul de asigurare a calitatii;
4. Instalatiile de laborator;
5. Aparatele. Materialele. Reactivii;
6. Sisteme de testare (chimice, biologice);
7. Substante chimice testate (SCT)/referinta (SCR);
8. Metode standard de studii in laborator;
9. Planul de studiu in laborator;
10.Cum se introduce raportul in laborator;
11.Stocarea si pastrarea materiei si arhivei.
CURS 2 14.10.2013
Stabilitatea medicamentului
Principii generale
- Niciodata nu a existat ceva facut de mana omului, care sa fie atat de bine elaborat sau
atat de bine stabilit incat sa fie nedegradabil odata cu trecerea timpului... Thomas
Cranmer
- Tot ce este facut de mainile omului de la sublimul Parthenon la uzualul milkshake este
supus degradarii. Produsele farmaceutice nu fac exceptie de la aceasta afirmatie generala.
Daca exista un atribut relevant al calitatii unui produs medicamentos care sufera
modificari odata cu timpul, evaluarea acestei modificari face obiectul oamenilor de stiinta
si a celor ce impun normele in industria medicamentului, cuantificand stabilitatea.
- Timpul in care produsele medicamentoase se degradeaza variaza puternic. Unele produse
farmaceutice radioactive trebuie folosite in interval de 1-2 zile. Alte produse farmaceutice,
pe de alta parte, daca sunt depozitate si conditionate corespunzator isi mentin stabilitatea
pentru un deceniu sau chiar mai mult, desi, in multe state, durata maxima de viata pe
care o va aproba o agentie de reglementare a normelor este de 5 ani. (Aceasta restrictie
nu cauzeaza in general probleme, avand in vedere ca si pentru produsele cu durata de
viata de 5 ani este probabil ca peste 95% din produs sa fie vandut si folost in treizeci de
luni de la fabricatie, cu conditia ca toti cei implicati sa asculte prima regula a depozitarii:
primul intrat, primul iesit).
- De vreme ce evaluarea stabilitatii unui produs medicamentos este foarte elaborata, nu se
pune accentul pe testarea organoleptica a produsului de catre pacient. Astfel, guvernele
din mai multe parti ale lumii in special din Vestul Europei, America de Nord si Japonia
au decis ca este necesara instituirea obligatorie a testarii stabilitatii datorita grijilor
ridicate de siguranta, eficacitatea si calitatea produsului medicamentos. Totusi, trebuie sa
luam in considerare ca diverse companii reputabile acordau atentie stabilitatii
medicamentelor si luau masurile care se cuveneau inainte de implicarea activa a
guvernului.
-
lucru doar cand se gandesc la efectele adverse ale stabilitatii produsului medicamentos.
Acest lucru este in mod evident neadevarat, iar pentru unele produse inactivarea nu este
factorul determinant al perioadei de valabilitate. Totusi, este adevarat ca pentru multe
produse, pierderea potentei este de o importanta majora. In general, privim orice produs
care contine mai putin de 90% din cantitatea de s.m. mentionata pe prospect ca fiind de
calitate inacceptabila.
-
Tipuri de degradare
Degradarea chimica (reducere, oxidare, hidroliza etc.) este des intalnita. Cunostintele de
cinetica ne pot fi de folos cand avem de-a face cu degradarea chimica.
Degradarea fizica poate fi cauzata de o varietate de factori (de exemplu: impact, vibratie,
abraziune, fluctuatii de temperatura precum inghetarea sau topirea si fragmentarea).
Degradarea biologica (si, mai ales, microbiologica) In America de Nord, Japonia si Europa
de Vest, cei mai intalniti factori biologici care sunt implicati in problemele de stabilitate
sunt cei microbiologici. Totusi, in unele parti ale lumii, sobolanii, viermii, mustele si alte
organisme non-microbiologice pot fi responsabile pentru problemele de stabilitate.
Cunostinte stiintifice solide
Nu mai este nevoie sa precizam ca testarea stabilitatii produselor medicamentoase
necesita o cunoastere corespunzatoare a formularii farmaceutice, evaluarii, analizei si
statisticii. Din pacate, inca mai sunt companii unde personalul cu o astfel de educatie
corespunzatoare lipseste.
Cunostinte la zi cu toate normele relevante ale institutiilor care reglementeaza piata
farmaceutica si cu standardele aplicate ale Farmacopeei:
Reglementarile oficiale si metodele standard de testare continua sa evolueze. Astfel, este
important ca cel putin o persoana din fiecare companie sa fie insarcinata cu
responsabilitatea de a pastra documente la zi asupra datelor de la FDA si Conventia
Farmacopeei USA sau de la alte astfel de entitati, pentru ca ar putea avea un efect
semnficativ asupra designului, executiei, sau interpretarii testelor de stabilitate. Folosirea
forumului farmacopeei, jurnalul in care conventia Farmacopeei SUA publica informatii
esentiale despre metode sau monografii noi de testare, ar trebui sa fie obligatorie in toate
companiile in care standardele sunt importante.
Comunicarea eficienta intra statia pilor, productie, controlul calitatii/evaluarea calitatii,
reclamatii si diferite reglementari:
Pentru a avea un program de succes de testare a stabilitatii, este important sa existe o
comunicare clara, eficare si rapida intre toate entitatile organizatorice dintr-o companie,
care pot furniza date folositoare in programul de stabilitate.
Monitorizarea atenta a bugetului alocat stabilitatii medicamentului
Este surprinzator ca unele companii nu au un buget de stabilitate. Este si mai surprinzator
sa aflam ca exista oameni de stiinta care dezvolta protocoalele de stabilitate pe baza
exclusiva a diferentei de pret. Nu este usor sa elaboram un mecanism pentru evitarea
unui buget de stabilitate despre care putem spune cu siguranta ca ne va costa o suma
fixa de bani. Totusi, desi suma estimata este relativa, poate fi totusi foarte folositoare.
Abilitatile manageriale pentru a coordona si optimiza programul
Piatra de capatai a unui program de stabilitate cost-eficienta de inalta performanta o
constituie abilitatile manageriale care promoveaza si coordoneaza abilitatile personale si
profesionale ale tuturor celor implicati in program.
Perioada de conformitate, termenul de valabilitate si data de expirare
Perioada de conformitate a unui produs medicamentos este definita de cele mai
vulnerabile calitati dependente de timp. Dupa cum a fost indicat si mai devreme,
pierderea activitatii este pentru multe produse, parametrul critic. In acele cazuri in care
alte atribute sunt mai vulnerabile, atributul in cauza va defini perioada de conformitate.
6
Perioada de viata atribuita unui produs este egala sau mai mica decat perioada de
conformitate, fiind de obicei un numar rotunjit convenabil.
Data de expirare plasata pe eticheta oricarui lot indica data la care ia sfarsit perioada de
viata pentru fiecare lot. Astfel, daca produsul este depozitat conform instructiunilor de pe
eticheta, se asteapta ca produsul in cauza sa isi pastreze valabilitatea pana la acea data.
Cateva strategii posibile pentru a imbunatati termenul de valabilitate
Din fericire, multe substante medicamentoase si produse sunt inerent stabile si, astfel, cu
putina dificultate putem justifica o perioada de valabilitate de 3 ani sau mai mult. Totusi,
exista s.m. care sunt mult mai supuse degradarii este nevoie de multa munca pentru a
dezvolta un produs cu o perioada de viata comerciala acceptabila.
Oxidarea in solutie
Reactiile de oxidare sunt relativ rare in formele farmaceutice, ca reactii principale. De cele
mai multe ori oxidarea duce la canitati mici de compusi de degradare neidentificate. Cand
o reactie de oxidare este una dintre reactiile principale, atunci avem de-a face cu o
problema serioasa, iar formularea poate deveni destul de dificila in acest caz. Exemple
notabile sunt constituite de produsele lichide cu vitamina A.
Mecanisme de oxidare
Oxidarea, dupa cum sugereaza si numele, este o interactiune intre s.m., A si oxigenul, iar
reactia ar fi de tipul:
A + O2 -> produsi;
In practica, complexarea metalelor grele (de ex, prin folosirea EDTA), este adesea folosita
de vreme ce, dupa cum am vazut si mai devreme, ionii metalici actioneaza in detrimentul
stabilitatii medicamentului, in ceea ce priveste situatiile oxidative.
Antioxidanti
Functioneaza prin consumptia de oxigen la o viteza mai mare decat viteza la care s.m.
reactioneaza cu oxigenul; in astfel de cazuri acestia vor proteja s.m. pana ce sunt epuizati
complet.
Cataliza, complexare, fotoliza
Cataliza acida si bazica, constituie doar un exemplu de cataliza. Cand discutam despre
acest subiect, totusi descompunerea indusa de metal este preocuparea cercetatorului din
industria farmaceutica. Se pune un mare accent pe eliminarea metalelor, mai ales in
produsele parenterale, deoarece si descompuneri infime ale urmelor de metale pot cauza
o schimbare a culorii, incat produsul sa devina nesatisfacator. Exemple pentru acest caz
sunt injectabilele cu clorhidrat de tiamina si cele cu acid ascorbic.
Complexarea este evident ca, in multe cazuri, medicamentele pot contribui la reactii de
complexare cu una sau mai multe din substantele unei forme farmaceutice. Uneori aceste
lucruri sunt intentionate biodisponibilitatea in anumite cazuri poate fi imbunatatita. In
alte cazuri, stabilitatea unui medicament este afectat favorabil de complexare, desi in
multe cazuri este afectata nefavorabil.
Agentii de complexare cafeina si pilivinilpirolidona erau cei mai intalniti agenti de
complexare folositi in farmaceutica pentru o mare perioada de timp. Recent,
ciclodextrinele au devenit foarte importante.
Ciclodextrinele sunt agenti puternici de complexare, studii numeroase fiind efectuate pe
tema folosirii acestora in solubilizarea si stabilizarea medicamentelor.
7
Fotoliza un mare accent in Codul de Buna Practica din 1993 este pus pe stabilitatea in
prezenta luminii, desi la acest moment, metodele de testare nu sunt finalizate.
Stabilitatea pentru starea de agregare solida stabilitatea medicamentelor din formele
farmaceutice solide este cea mai importanta, de vreme ce formele farmaceutice solide
sunt mai intalnite decat alte forme si pentru ca primele probe clinice sunt de obicei
efectuate asupra acestui tip.
Interactiuni ce implica o faza lichida
Uneori, o s.a. sau un produs de descompunere dintr-o forma farmaceutica solida este
lichid si poate interactiona cu alte ingrediente din forma farmaceutica. Un exemplu tipic il
constituie cercetarile efectuate de Troup si Mitchner (1964) ce implica aspirina si
fenilefrina. Autorii au aratat ca descompunerea fenilefrinei este direct proportionala cu
formarea acidului salicilic. Acestia au aratat ca descompunerea fenilefrinei este o reactie
de acetilare. Acest lucru poate fi privit din mai multe perspective. Trebuie sa existe
umiditate pentru ca hidroliza aspirinei sa aiba loc. Daca acidul saliclic este format prin
interactiunea aspirinei cu urme de apa, atunci acidul acetic forma poate reactiona cu
fenilefrina (R(OH)3), care pune din nou in libertate apa, astfel incat umiditatea nu joaca un
rol cantitativ in reactia globala. Cu alte cuvinte:
C6C4(OCOCH3) +H2O -> C6H4(OH)COOH + CH3COOH;
CH3COOH + 1/3R(OH)3 -> 1/3 R(OCOCH3)3 + H2O
C6H4
-
Dizolvarea importanta dizolvarii este a.i. (din consideratii biofarmaceutice) sunt folosite
Farm. SUA si e necesara pentru aplicarea pentru Noile Medicamente ale formelor
farmaceutice soide. Potrivit cercetarilor efectuate de Noyes si Whitney :
dm/dt= VdC/dt = - kA(S-C)
Unde m este masa nedizolvata, V este volumul de lichid, t este timpul, k este asa n umita
viteza constanta de dizolvare intrinseca (cm/s) si A este aria suprafetei solidului dizolvat.
Higroscopicitatea
Este, desigur, o caracteristica importanta a unei pulberi. Poate fi demonstrat pentru un
compus relativ solubil ca higroscopicitatea este corelata cu solubilitatea (Carstense, 1977,
VanCampen si colab 1980), desi s-a demonstrat ca entalpia solutiei joaca un rol important
in ceea ce este cunoscut drept higroscopicitate (VanCampen si colab, 1983 a,b,c).
Teste de compatibilitate
Inainte de a testa prima formulare a unui nou medicament, cele mai multe grupuri de
cercetare desfasoara teste de compatibilitate (Carstensen si colab, 1964). Principiul este
de a descoperi rapoarte rezonabile pentru amestecul s.m./excipient, pentru a vedea care
excipienti sunt cei potriviti pentru medicament.
Compatibilitatea cu recipientele de conditionare
Studiile asupra compatibilitatii pot include de asemenea si compatibilitatea cu materialele
containerelor. Hourcade si colab (1977), de exemplu, au semnalat ca granisetronul in
concentratii de 1mg/mL, cand este pastrat in seringi de polipropilena era destul de stabil,
pe cand dilutiile de 0,9% NaCl sau de 5% glucoza au dus la o stabilitate de depozit
nesatisfacatoare.
CURS 3 21.10.2013
Cromatografia in controlul si analiza medicamentului
-
Introducere
Cromatografia este una dintre ramurile mari ale analizei instrumentale cu aplicatii largi in
separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si in analiza si
controlul medicamentelor in particular;
Tehnicile cromatografice de analiza sunt tehnici de separare selective si eficiente, putand
fi folosite inclusiv pentru urme de substante;
Tehnicile cromatografice de analiza sunt metode instrumentale performante caracterizate
prin urmatoarele avantaje:
1. Rapiditate;
2. Eficienta;
3. Forta (in ceea ce priveste selectivitatea, sensibilitatea, automatizarea,
miniaturizarea senzorilor si a altor componente, tratarea datelor analitice);
Tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si o faza mobila, iar
componentii unui amestec analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza
mobila (gazoasa sau lichida), cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al
separarii.
La baza tuturor proceselor cromatografice de separare stau 4 procese fundamentale:
1. Adsorbtia pe suporturi solide;
2. Repartitia intre faza stationara si cea mobila;
3. Schimbul ionic;
4. Excluderea difuzia.
Chiar daca principiul separarii poate fi diferit, etapele analizei cromatografice sunt
aceleasi si anume:
1) Pregatirea fazei stationare;
2) Fixarea initiala a analitilor in capul coloanei;
3) Deplasarea selectiva caracteristica analitilor care sunt antrenati de catre faza mobila
in cadrul procesului de developare sau elutie;
10
Faza stationara
11
Este formata din particule fine solide, sferice, pe suprafata carora se produc interactiunile
cu analitii (ex: in cromatografia de adsorbtie);
Este formata din particule fine solide care sunt suportul pe care se fixeaza faza stationara
lichida ca in cromatografia de repartitie;
In coloanele capilare utilizata in cromatografia de gaze, faza stationara este fixata in stare
omogena sub forma unui film sau pelicula pe peretii interiori ai acesteia.
Particulele de faza stationara se caracterizeaza prin cativa parametri printre care
diametrul lor mediu, omogenitatea marimilor si suprafata specifica.
Aplicatiile metodelor cromatografice
Metodele cromatografice au devenit, in prezent, unele dintre cele mai selective metode de
separare cu larga aplicabilitate in toate domeniile analizei;
Cromatografia are aplicatii largi in analiza calitativa care inseamna separare si
identificare.
Cromatografia are aplicatii importante si in analiza cantitativa.
Cromatografie de lichide de inalta performanta
Sub aceasta denumire sunt descrise principalele metode moderne de analiza
cromatografica baze pe repartitia lichid-lichid, pe adsorbtia lichid-solid, pe schimbatori de
ioni si pe procesele de excludere-difuzie;
HPLC se poate practica pe coloana sau pe o suprafata plana, de exemplu pe straturi subtiri
de faza stationara de unde si denumirea de cromatografie planara. Aceasta tehnica se
noteaza prescurtat TLC (thin layer crom...), iar tehnica de inalta performanta HPTLC
(high....)
In HPLC sunt necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere pentru a asigura debite
corespunzatoare ale fazei mobile, avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC
este mica, diametrul particulelor fiind de 3-10 microni; din acest motiv, aparatura utilizata
este mai complicata si, deci, mai scumpa.
Cromatografia HPLC pe coloana
Este tehnica cea mai utilizata in prezent pentru separari, detectii si mai ales pentru
determinari cantitative;
In cadrul acestei metode se inscriu:
Cromatografia HPLC de adsorbtie;
De repartitie;
Cromatografia HPLC de adsorbtie
Aceasta tehnica se practica pe faze stationare de silicagel si alumina (singurele care se
utilizeaza in aceasta tehnica); dintre aceste 2 faze stationare se utilizeaza mai ales
silicagelul deoarece poate fi folosit intr-o varietate mai mare de conditionare;
Ca faza mobila se utilizeaza un solvent organic sau un amestec de 2 sau mai multi astfel
de solventi;
HPLC de adsorbtie se aplica la separarea unor substante organice relativ nepolare datorita
capacitatii metodei de a fractiona amestecul de izomeri de pozitie: derivati disubstituiti in
meta si para ai nucleului aromativ).
HPLC de repartitie
Este cea mai utilizata dintre tehnicile cromatografice in faza lichida si se poate practica
sub forma cromatografiei HPLC lichid-lichid si HPLC lichid-faza grefata sau legata;
In HPLC de repartitie se disting 2 procedee, in functie de polaritatea fazelor stationara si
mobila:
12
Introducere in CSS
Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii, atat in cadrul
cercetarii cat si al multiplelor si variatelor aplicatii ale acesteia, se datoreaza intr-o masura
considerabila folosirii tehnicilor experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a pus
la dispozitie.
In aceasta directie aplicarea metodelor fizice in analiza chimica, proces inceput de la
consituirea acesteia ca disciplina stiintifica a condus la elaborarea unor numeroase tehnici
de laborator cu mare potentialitate, printre care se inscrie si metoda cromatografica cu
diferitele sale variante;
CSS este una dintre vechile si din noile metode de analiza care, alaturi de celelalte
metode cromatografice si fizico-chimice in general contribuie la studiul si identificarea
substantelor chimice naturale si de sinteza.
Generalitati despre CSS
CSS este o metoda fizico-chimica de separare a substantelor dintr-un amestec, pe baza
capacitatii deosebite de distributie intre o faza stationara si una mobila;
Metoda cromatografica se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiala a
substantelor din amestecul respectiv, ca urmare a unor diferente in adsorbtie, repartitie,
solubilitate, presiune de vapori, marimea moleculei etc.
Principiul CSS
Un analit migreaza in susul sau de-a latul unui strat de faza stationara, de obicei silicagel,
sub influenta unei faze mobile (de obicei un amestec de solventi organici) care se
deplaseaza prin faza stationara prin efect capilar;
Distanta parcursa de un analit este determinata de afinitatea sa relativa, pentru faza
stationara vs faza mobila;
Compusii amestecului sunt repartizati intre un adsorbant (faza stationara de obicei
silicagel SiO2) si un solvent (faza mobila) care se deplaseaza prin faza stationara in efect
capilar.
Importanta CSS in analiza medicamentului
Determinarea impuritatilor in produsele farmaceutice din materiile prime sau produse
preparate;
Folosita adesea ca metoda de baza pentru verificarea materiilor prime farmaceutice;
Poate fi folosita pentru validarea curatirii, o treapta in fabricarea produselor farmaceutice.
13
CURS 4 28.10.2013
-
14
Trei probe de codeina sunt analizate cum s-a descris, ceea ce arata daca testele limita de
mai jos au fost trecute sau ratate. Solutiile 1-3 apar in ordine numerica de la stanga la
dreapta.
i-trece deoarece niciun spot din cromatograma solutiei 1 nu este mai intens decat spotul
produs de solutia 2;
ii-nu trece deoarece spotul de la origine este mai intens decat cel produs de solutia 2;
iii trece deoarece desi un spot de deasupra codeinei este mai intens decat spotul solutiei
3, nu exista niciun spot mai intens ca cel al solutiei 2.
Aplicatii ale HPLC
multe teste farmaceutice limita curente ar putea fi efectuate cu un grad mai mare de
acuratete daca s-ar folosi metodele HPTLC.
HPTLC pentru rifampicina, isoniazida si pirazinamida.
Sensibilitate in CSS
Tehnica CSS a fost utilizata pe scara larga in domeniul farmaceutic pentru a analiza o
varietate de aplicatii specifice si utile, de exemplu:
Pentru a identifica prezenta nedorita a unor compusi organici, ce prezinta impuritati
intr-un numar de substante farmaceutce: morfina in clorhidratul de apomorfina;
hidrazina in carbidopa; 3-aminopropan in dexampanthenol;
Substante inrudite prezente in medicamente oficiale si anume: substantele aferente
prezente intr-un numar mare de substante farmaceutice: aminofilina;
Alcaloizi straini prezenti in medicamente alcaloide: sulfatul de atropina; codeina;
Steroizi straini prezenti in medicamente steroidiene.
Introducere in HPLC
HPLC acopera astazi in proportie de aproximativ 80% analiza substantelor moleculare
HPLC reprezinta evolutia unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica care
servea in primul rand la izolarea preparativa a compusilor naturali;
Prin introducerea pompelor si, in consecinta, lucrandu-se la presiuni tot mai ridicate (200
atm), dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici, in coloane
tot mai scurte (3-10 cm) s-a ajuns la configuratia actuala.
Generalitati cu privire la HPLC
HPLC este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este un
lichid iar faza stationara, continuta intr-o coloana, este constituita dintr-un solid cu
granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate
grupari organice.
HPLC este o metoda ce prezinta urmatoarele avantaje:
Usor de controlat cu o precizie cantitativa asigurata prin introducerea exacta a probei;
HPLC este tehnica cromatografica ce a cunoscut cea mai puternica dezvoltare in anii
recenti, ducand la imbunatatirea coloanelor, a detectorilor si a soft-urilor de control;
Varietatea coloanelor si a detectorilor face ca selectivitatea metodei sa poata fi usor
ajustata.
Metodele cromatografice pot fi clasificate in functie de mai multe criterii:
Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentur a denumi o gama exinsa de
sisteme cromatografice care au in comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.
In functie de mecanismele de separare:
Cromatografia de lichide;
Cromatografia de gaze;
15
In
Cromatograma in HPLC
In orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu concentratia,
alteori cu masa componentului aflat in celula de masura, semnal ce poate fi inregistrat in
functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de eluent se numeste
cromatograma.
Elementele de baza ale cromatogramei HPLC:
Picurile cromatografice acestea sunt semnalele valorificabile in analiza calitativa si
cantitativa, in toate metodele cromatografice.
Timpul mort, tM este timpul in care un component, complet neretinut de catre faza
stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pana la detector.
Timpul de retentie, tR o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului
separat de coloana reprezinta timpul scurt de la injectarea probei si aparitia maximului
de concentratie in detector.
Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie;
Timpul de retentie ajustat tR introdus in cromatografie pentru a se putea compara
timpii masurati pe coloane diferite;
Volum de retentie ajustat reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor
de legatura de la coloana la detector.
Principalele etape in HPLC
Solvent -> pompa->injector->coloana->detector->inregistrator (solventul intra in pompa,
din pompa in injector, coloana, din coloana ies pe rand componentii amestecului, vor trece
prin detector si, apoi, se va face o inregistrare a semnalului emis de detector)
16
Parametrii specifici
Timp de retentie, tR este timpul la care apare maximul unui pic, masurat din momentul
introducerii probei si constituie caracteristica calitativa a componentului respectiv;
Inaltimea picului, h, sau aria suprafetei lui, A, constituie parametrul cantitativ, proportional
cu cantitatea de component;
tM este timpul in care elentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara
parcurg distanta pana la detector.
17
CURS 5, 04.11.2013
Puritatea substantelor farmaceutice. Impuritati farmaceutice
Generalitati
Exista un interes din ce in ce mai mare in ceea ce priveste impuritatile prezente in
medicamente (API substante active). In ultimul timp, nu numai profilul puritatii, dar si profilul
impuritatii a devenit esential dupa cum reglementarile in vigoare o specifica. In lumea
farmaceutica, o impuritate este considerate ca orice alt material organic, pe langa s.a. sau
excipienti ce apare in urma sintezei sau din substante chimice nedorite care raman cu API
(active pharmaceutical impurities).
Impurificarea poate fi dezvoltata atat in timpul formularii cat si dupa expirarea timpului de
valabilitate atat a substantelor folosite dar si a preparatelor formulate.
Prezenta acestor substante chimice nedorite, chiar si in cantitate mica, poate influenta
eficacitatea si siguranta produselor farmaceutice. Profilul impurificarii (de exemplu, identificarea,
precum si cantitatea de impuritati din produsele farmaceutice), a castigat in ultimul timp atentia
din partea autoritatilor de reglementare.
Diferite farmacopei, cum ar fi farmacopeea britanica, sau farmacopeea SUA, indiana
precizeaza limitele, nivelurile admisibile de impuritati prezente in substantele utilizate sau
preparatele formulate.
Impurificarea poate fi evitata doar daca fiecare etapa este realizata cu grija, evitandu-se
sinteza prin realizarea mai multor etape odata; in cazul paracetamolului brut exista un test de
limitare pentru p-aminofenol care poate fi un materiale de pronire in unele cazuri sau un
intermediar in altele.
In chimia organica de sinteza, este foarte rar atins randamentul de 100% in obtinerea unui
produs final singur; in obtinerea unui produs final singur exista intotdeauna o sansa de a avea
produsi secundari. Spre exemplu, in cazul producerii paracetamolului brut se poate forma ca
produs secundar paracetamol diacetilat.
Impuritatile pot fi de asemenea rezultate prin degradarea produsului final in procesul de
fabricatie a medicamentelor. Degradarea penicilinei si a cefalosporinelor sunt exemple bine
cunoscute ale produselor de degradare. Prezenta unui inel beta-lactamic, precum si a unei
grupari amino la C6-C7 joaca un rol critic in degradarea lor.
19
Aceste impuritati poseda adesea efecte nedorite farmacologic sau toxicologic, dar pot
avea si beneficii care la administrarea lor pot compensa. Compozitia impuritatilor ne permite sa
tragem concluzii in ceea ce priveste procesul de fabricatie a produselor si falsificarea acestora
care este din ce in ce mai raspandita in toate tarile din lume, prin urmare, este necesar a
controla cu strictete calitatea produselor farmaceutice si a determina concentratia de impuritati
in toate etapele productiei, de la materiile prime la produsul finit.
Surse de impurificare
Impuritatile pot proveni din diverse surse. Sursa cea mai evidenta de impurificare este
sinteza, caz in care intermediarii din s.a. pot constitui impuritati sau pot sa devina o sursa de
alte impuritati care rezulta din acestea.
Orice impuritate prezenta in materia prima este posibil a se regasi in s.a. de interes. In
plus, impuritatile care se refera la substantele inerte (excipientii) si solventii utilizati in timpul
sintezei trebuie sa fie, de asemenea, luati in considerare. Impuritatile pot fi produse in timpul
diferitelor etape ale formularii produsului medicamentos.
Exista posibilitatea ca aceste impuritati sa fie prezente in produsul medicamentos final.
Potentialii produsi de reactie care au legatura cu aceste impuritati trebuie sa fie, de asemenea,
evaluati.
Impuritatile din produsele medicamentoase pot proveni nu numai din s.m. sau din
substantele inerte folosite pentru formularea unui produs medicamentos, ele pot fi introduse in
produsul medicamentos in timpul procesului de formulare sau in urma contactului cu ambalajul.
materialelor volatile, stabile termic, gaz cromatografia (GC), joaca, de asemenea, un rol
important.
Alte tehnici cromatografice si electroforetice, cum ar fi cromatografia cu fluide
supercritice, electroforeza capilara si electrocromatografia capilara pot fi, de asemenea, utilizate.
Spectrostopia de masa (MS) si rezonanta magnetica nucleara se inalta rezolutie (RMN) pot
contribui, de asemenea, la detectarea impuritatilor.
Metode de caracterizare
Metode spectroscopice
Urmatoarele tehnici spectroscopice de masurare au fost utilizate pentru caracterizarea
impuritatilor; cele mai multe dintre aceastea sunt foarte utile ca detectori pentru metodele
cromatografice:
Ultraviolet;
Infrarosu;
Spectroscopia Raman;
Spectroscopia de masa;
Rezonanta magnetica nucleara (RMN).
Spectrometria in UV
Spectrofotometria UV la o singura lungime de unda furnizeaza o selectivitate minima a
analizei; cu toate acestea, datorita accesibilitatii detectorilor campului de diode se pot obtine
simultan suficiente informatii, la diferite lungimi de unda, pentru a asigura o mai mare fiabilitate.
Spectrometria in IR
Ofera informatii specifice privind unele grupari functionale care ofera selectivitate si
permit cuantificarea. Cu toate acestea, datorita nivelului scazut de detectibilitate, este dificil.
Acest lucru necesita abordari mai complexe care sunt, in general, un factor de descurajare
pentru analisti.
Spectroscopia Raman
Se bazeaza pe masurarea radiatiilor electromagnetice difuze care rezulta din iradierea
materiei. Concret, atunci cand un material este iradiat cu o sursa de lumina monocromatica
puternica (de exemplu: laser), o cantitate mica de radiatii este difuzata la o lungime de unda
diferita.
Exista aceeasi diferenta in energia vibrationala dintre fasciculul dispersat si fasciculul
incident care este masurat. Spectroscopia Raman este considerata complementara
spectroscopiei IR, cele 2 tehnici oferind o imagine completa vibrationala asupra materialului.
Spectrometria de masa
A avut un impact semnificativ asupra procesului de dezvoltare farmaceutica in ultimele
decenii. Progresele in proiectarea si eficienta interfetelor care conecteaza direct tehnicile de
separare cu spectrometrie de masa au acordat noi oportunitati pentru monitorizarea,
caracterizarea si cuantificarea s.a. ca atare cat si din formele farmaceutice.
22
pe volt si pe secunda (m2 x V-1 X s-1). Submultiplul curent folosit este centimetrul patrat pe volt si
pe secunda (cm2/VXs).
Separarea chirala
Proprietatile stereochimice ale medicamentelor chirale au fost in multe cazuri factorul de
control privind activitatea acestora. Un enantiomer poate avea o functie biologica. Altii pot fi
inactivi sau avea o alta functionalitate care ar putea avea efecte secundare. In unele cazuri, un
izomer optic poate fi daunator. FDA impune producatorilor de medicamente testarea
enantiomerilor individuali pentru noile medicamente pentru a le cunoaste toxicitatea.
Cromatografia chirala reprezinta separarea cromatografica a compusilor enantiomerici.
Fazele lichide stationare comune nu poseda o selectivitate adecvata pentru separarea
enantiomerica. Adaosul macromoleculelor de ciclodextrina derivatizate la fazele fixe comune
creeaza coloane capilare care au capacitatea de a separa numerosi enantiomeri.
Gaz-cromatografie
Gaz cromatografia este o tehnica extrem de utila pentru cuantificare. Se poate oferi
rezolutia dorita, selectivitate si usurinta de cuantificare. Principala sa limitare, insa, este faptul
ca proba trebuie sa fie volatila sau trebuia sa devina volatila prin derivatizare. Aceasta tehnica
este foarte practica pentru impuritatile organice volatile (OVI).
Cromatografia de lichide de inalta presiune
Este adesea mentionata ca HPLC in zilele noastre. Ambii termeni pot fi abreviati ca HPLC si
termenii pot fi folositi alternativ. Aplicatiile acestei tehnici foarte eficiente au fost semnificativ
extinse prin utilizarea unei varietati de detectori, cum ar fi fluorescenta, electrometria, MS
s.a.m.d.
CSS
Este una dintre tehnicile de separare cele mai utilizate datorita usurintei de utilizare,
costului redus, inaltei sensibilitati, vitezei de separare, precum capacitatii sale de a analiza
simultan mai multe probe. Ea a fost aplicata in disciplinele de biochimie, toxicologie,
farmacologie, stiinta mediului si in chimie. CSS poate fi utilizata pentru separarea, izolarea,
identificarea si cuantificarea componentelor intr-un amestec.
CURS 6, 11.11.2013
Spectrometria de absorbtie UV-VIS in analiza si controlul medicamentelor
IR 700-1100;
Determinarile spectrometrice in acest domeniu se bazeaza pe fenomenul de absorbtie a
radiatiilor cuprinse in acest domeniu spectral de catre speciile chimice analizate.
Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta (sau transmitanta)
cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate, inclusiv pentru analiza multicomponent;
Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor analiti, din
amestecuri cu mai multe componente, dupa prealabila lor separare prin cromatografia de
lichide;
Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si 900 nm. Limita
inferioara se opreste la cca 185 nm datorita aerului care devine opac sub aceasta limita.
Absorbtia luminii
Producerea absorbtiei luminii se explica prin faptul ca in UV-VIS radiatiile au o energie mai
mare decat in IR ceea ce duce la tranzitii electronice de pe anumite niveluri (orbitali) pe
altele;
Tranzitiile electronice se suprapun peste tranzitiile rotationale si peste cele vibrationale
care sunt produse de energii mai mici: deltaE = deltaE rotatie + delta E vibratie + delta E
electronice
La impactul unui foton asupra unei molecule izolate se modifica termenul E electronic
ceea ce determina variatia energiei mecanice totale.
Compusii organici obisnuiti, inclusiv cei medicamentosi, sunt formati din atomi usori,
precum C, H, N, O, iar tranzitiile care se observa pentru acesti compusi sunt determinate
de electroni implicati in legaturile sigma si pi si de electronii n neparticipanti care
formeaza dublete neimplicate in legaturi;
In cursul acestor tranzitii se produc modificari ale polaritatii legaturilor iar spectrele care
se obtin pentru acesti compusi se mai numeste si spectre de transfer de sarcina;
In afara de tipurile de tranzitie mentionate mai sus exista si tranzitii in care sunt implicati
orbitalii moleculari d specifice compusilor anorganici;
Din punctul de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor existenti intr-o
molecula, la tranzitii electronice se disting 4 tipuri de electroni:
1) invelis de electroni inchis, in care electronii nu sunt implicati in legaturi chimice
deoarece au energii de excitare foarte mari; acesti electroni nu contribuie la absorbtia in
UV-VIS;
2) electroni de tip sigma in legaturi covalente sigma care au de asemenea energii mari de
excitare si deci nu contribuie la absorbtii in UV-VIS
3) electronii n, care se gasesc sub forma electronilor neparticipanti, pot fi excitati cu
radiatii UV-VIS si pot contribui la absorbtii in acest domeniu spectral;
4) electroni pi, situati pe orbitali pi, in legaturile duble si triple fiind mai usor excitabili, ei
fiind responsabili pentru majoritatea spectrelor electronice.
Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie. Deplasari bato si hipsocrome.
La originea tranzitiilor electronice stau gruparile cromofore care includ diverse tipuri de
electroni;
Daca o molecula contine mai multi cromofori separati prin cel putin doua legaturi simple,
se poate observa o suprapunere a efectelor gruparilor individuale ;
Este important de precizat ca atat potizia cat si intensitatea si chiar forma benzilor de
absorbtie ale compusilor in solutie sunt influentate de natura solventului. Procesul acesta
se numeste solvatocromie iar modificarile mentionate sunt datorate interactiunilor analitsolvent.
Efectul hisocromic si efectul batocromic
25
Efectul hipsocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai
mici;
Efectul batocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai
mari.
Spectrofotometria UV-VIS
Pentru inregistrarea spectrelor electronice se utilizeaza un spectrofotometru UV-VIS care
este compus dintr-o sursa de radiatii, un sistem dispersiv combinat cu un monocromator si
un detector.
Legea fundamentala a absorbtiei
In spectrometria de absorbtie in UV-VIS se masoara de regula absorbanta care este
proportionala cu concentratia analitului, conform legii Lambert-Beer:
A= epsilon X b X c
In care:
A=absorbanta; b=grosimea stratului de solutie (cm); c=concentratia analitului
determinat; epsilon=absorbanta molara.
Inregistrarea spectrelor
Este una dintre problemele de mare importanta in detectia si dozarea substantelor
medicamentoase;
Inregistrarea spectrelor se poate face fie prin reprezentarea grafica a absorbantei in
functie de lungimea de unda fie a transmitantei in functie de lungimea de unda;
Aceasta inregistrare se face automat, datele experimentale fiind inmagazinate in
calculator, acesta avand programe de prelucrare a datelor;
Inregistrarea spectrelor in UV-VIS se face in solutiile analitilor in solventi potriviti, iar
alegerea solventului in fiecare caz este o problema deosebita;
Spectrometria UV se poate utiliza si in studiul unor reactii chimice care se petrec in
solutie. De exemplu, salicilatul de metil sufera in solutie apoasa alcalina o reactie de
hidroliza din care rezulta acid salicilic, iar cu exces de baza salicilatul alcalin
corespunzator.
Tratarea rezultatelor analitice
Pentru tratarea (prelucrarea sau evaluarea) rezultatelor analitice sunt necesare cateva
cunostinte de analiza statistica, care permit analistului sa inteleaga semnificatia
rezultatelor obtinute si pentru a ordona limitarile fiecarei etape si tehnici de analiza;
Analistul trebuie sa aiba propria lui intelegere cu privire la felul rezultatelor pe care trebuie
sa le raporteze.
Introducere
IR analitic grupeaza metode de identificare si dozare (nedistructive) bazate pe absorbtia
sau reflexia de catre proba a radiatiilor electromagnetice cuprinse intre 0,78 microni (780
nm) si 1000 microni (1 mm) fiind subdivizat in IR apropiat, IR mijlociu si IR indepartat.
26
Regiunea fundamentala situata intre 2,5 si 15 microni este regiunea care furnizeaza cele
mai multe informatii privind structura moleculara, majoritatea spectrometrelor fiind
limitate la masuratori in aceasta regiune;
Spectrele de absorbtie in IR sunt spectre de vibratie ale moleculelor. Atomii situati la cele
doua extremitati ale unei legaturi sunt supusi unei miscari de vibratie.
Prin absorbtie de energie legatura chimica isi creste nivelul energetic vibrational.
Moleculele probei vor absorbi energii din radiatia IR numai la anumite lungimi de unda
dand nastere in spectrul IR unor maxime de absorbtie;
La lungimile de unda la care nu se absoarbe energie, inregistratorul spectrometrului va
inscrie linia zero a spectrului;
Maximele de absorbtie in IR se manifesta in spectru ca benzi (si nu ca linii) deoarece orice
modificare energetica vibrationala este insotia, de regula, de modificari energetice
rotationale si, din acest motiv, spectrele in IR se mai numesc si spectre de vibratie
rotatie ale moleculelor.
Fiecare maxim spectral este asociat unei vibratii corespunzatoare unei anumite legaturi
din molecula probei, insa trebuie mentionat ca orice vibratie a moleculei de nastere unui
maxim de absorbtie intrucat regulile de selectie fundamentale ale mecanicii cuantice
arata ca un maxim apare numai daca vibratia corespunzatoare produce o modificare a
distributiei de sarcina (a marimii sau directiei momentului de dipol).
In absenta momentului de dipol permanent cum este cazul moleculelor simetrice nu apar
benzi de absorbtie in IR. Legatura din acetilena nesubstituita nu se manifesta in IR. In
aceste cazuri se spune ca legatura este transparenta in IR mediu sau inactiva.
Vibratiile pe care le executa o molecula in ansamblu cu pastrarea imobila a centrului sau
de gravitatie se numesc vibratii normale sau fundamentale.
Cresterea numarului de benzi fata de numarul teoretic se datoreaza:
1) Armonicelor;
2) Benzilor de combinare;
3) Rezonantelor Fermi.
Armonicele sunt benzi de intensitate mica care apar la un numar de unda dublu fata de
banda fundamentala;
Benzile de combinare benzi de intensitate mica care apar la nume de unda egale cu
suma sau cu diferenta numerelor de unda a 2 vibratii fundamentale.
Rezonanta Fermi reprezinta scindarea unei benzi fundamentale atunci cand in imediata
ei apropiere se gaseste o armonica sau o banda de combinare;
Scaderea numarului real de benzi fata de cel teoretic se datoreaza:
1) Vibratiilor care nu produc modificari ale momentului de dipol al moleculei;
2) Vibratiilor degenerate care dau benzi la acelasi numar de unda;
3) Vibratiilor situate in afara domeniului IR uzual.
Frecventele de grup
Unele grupe de atomi, in special gruparile functionale din chimia organica, prezinta in IR
benzi de absorbtie caracteristice, intense, situate la frecvente bine determinate numite
frecvente de grup sau caracteristice;
Grupele functionale se comporta ca si cum ar fi izolate de restul moleculei desi aceasta
influenteaza intr-o masura mica pozitia benzilor de grup. Aceste mici deplasari sunt
frecvent utilizate in studiul structurii compusilor organici;
Intensitatea uneori foarte mare a benzilor de grup este rezultatul polaritatii crescute a
gruparilor functionale respective.
Aspecte tehnice ale spectrometriei in IR
In IR aparatura utilizata se subimparte in:
Spectrometre cu transformata Fourier;
27
Analizoare specializate;
Spectrometre de tip dispersiv pentru IR apropiat;
d
e
IDENTIFICAREA SM ORGANICE
- Pentru identificarea s.m. organice in multe cazuri, reactiile de identificare sunt date de o anumita
grupare functionala din molecula fara suficienta specificitate;
- Reactiile specifice sunt mai rare si din aceasta cauza FRX utilizeaza constantele fizice ale substantelor
respective si capata o importanta deosebita metodele fizico-chimice.
REACTIILE DE IDENTIFICARE ALE BARBITALULUI ( VERONAL)
EX. DE IDENTIFICARE A UNOR SA ORGANICE DIN FRX
- 5.5 dietil-2,4,6-(1H,3H,5H)-pirimidinotriona sunt redate in FRX
H
O
N
C2H5
O
C2H5
N
H
-
Barbitalul tratat cu Co(NO3)2 solutie alcoolica si apoi amoniac trece intr-un complex de culoare violeta a
carui structura se presupune a fi urmatoarea: [CoIII(NH3)5OH] (C8H12N2O3)2
Barbitalul tratat cu H2SO4 si formaldehida (reactivul Marquis) la cald, la zona de contact a celor 2
lichide nu apare nicio coloratie.
In aceste conditii pentru caracterizarea exacta a celor 2 subst, cand se face analiza subst respective devin
f importante probele de solubilitate in diferiti solventi si reactia solutiilor si anume :
Barbitalul este greu solubil in apa dar solubil in eter sau cloroform iar solutia apoasa are o reactie slab
acida
Barbitalul sodic este solubil in apa si practic insolubil in eter si cloroform iar solutia apoasa are reactie
alcalina.
Pulberea se trateaza cu apa si apoi se filtreaza. Salicilatul de Na se dizolva usor si va trece in filtrat, in
timp ce fenacetina greu solubila in apa nu se va dizolva si va ramane pe filtru.
In filtrat se identifica salicilatul de Na cu clorura ferica (FeCl 3) cand se obtine un complex colorat in
violet.
Fenacetina se identif cu acid nitric(acid azotic) cand se obtine un pp galben cristalin si cu dicromat de
potasiu in mediu de HCl cand se obtine o coloratie rosie.
ACIZII
- Cu ajutorul acizilor ( in special HCl diluat) se poate realiza separarea unor amestecuri : practic se
utilizeaza apa acidulata cu o cantitate de HCl diluat.
- Asa de exemplu un amestec de fenacetina si codeina se separa prin tratare cu HCl diluat in care
codeina este usor solubila, iar fenacetina insolubila.
HIDROXIZII DE Na SI K
- Ca si in cazul acizilor practic se utilizeaza in apa in care s-a adaugat NaOH sau KOH. In acest fel se
poate separa un amestec de fenacetina si aspirina.
- Fenacetina este f greu solubila in apa si insolubila in NaOH, iar aspirina este greu solubila in apa si usor
solubila in NaOH. Amestecul se trateaza cu apa alcalinizata cu NaOH si apoi se filtreaza.
- In filtrat se identifica aspirina iar pe filtru ramane fenacetina care se va identif prin reactiile
caracteristice.
- Un amestec de codeina si aspirina se separa usor datorita solubilitatii f bune a aspirinei in NaOH,
comparativ cu cea a codeinei.
SOLVENTII ORGANICI
- In multe cazuri se recurge la separarea subst cu ajutorul solventilor organici printre care cei mai utilizati
sunt eterul si cloroformul.
- Asa de exemplu, un amestec de aspirina si salicilat de Na se separa astfel : amestecul se trateaza cu 5 ml
eter si se filtreaza.
- Solventul organic va extrage numai aspirina, salicilatul de Na ramane sub forma de reziduu .
- Solutia eterica se evapora si cu rezidul se fac reactiile pt aspirina. Salicilatul de Na neextras se va identif
cu reactiile caracteristice.
SEPARAREA COMBINATA
In unele cazuri pentru separarea amestecurilor de subst este necesara folosirea a 2 sau mai multi
solventi.
Acest procedeu se aplica mai ales la amestecurile constituite din 3 sau mai multe SM.
Pentru separarea amestecului constituit din antipirina, cafeina si bromura de K se adauga mai intai eter
care extrage antipirina.
Portiunea neextrasa se trateaza cu cloroform la cald care extrage cofeina. Reziduul este constituit din
KBr care se dizolva in apa si se identif .
In amestec de aspirina, fenacetina si cafeina se trateaza cu NaOH care dizolva aspirina.
Se filtreaza si portiunea nedizolvata se trateaza cu apa care dizolva cofeina; reziduul contine fenacetina
care se va identif cu reactiile specifice.
Un amestec constituit din aminofenazona, luminal si cafeina se separa utilizand solubilitatea diferita a
celor 3 subst in apa.
32
Astfel, aminofenazona este solubila in apa, luminalul este f greu solubil in apa iar cofeina este greu
solubila in apa.
Amestecul se trateaza cu o cantitatea mica de apa care dizolva numai aminofenazona. Apoi se adauga
cloroform care extrage cofeina.
Portiunea ramasa nedizolvata dupa extragere cu cloroform se trateaza cu eter care va extrage luminalul.
In multe cazuri asemenea separari sunt utile numai pentru reactiile de identif; pentru determinari
cantitative sunt necesare procedee suplimentare sau daca se utilizeaza procedeele de mai sus operatiunile
trebuie sa fie facute cu mare atentie si extragerea cu un solvent organic se repeta de cateva ori.
In unele cazuri asemenea amestecuri de SM care vin la analiza n-au o tehnica bine pusa la punct si este
necesara toata priceperea analistului pt stabilirea ei.
Sunt situatii cand stabilirea unor tehnici capata caracterul unei cercetari stiintifice.
Este cazul multor retete farmaceutice magistrale, preparate in farmacii care nu au stabilita metoda de
control si pentru stabilirea careia analistul trebuie sa recurga la toate cunostintele sale.
IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR NECUNOSCUTE DE NATURA ORGANICA
In acest caz este necesar sa se execute initial analiza elementara calitativa. Prin cunoasterea elementelor
care intra in compozitia subst organice se obtin indicatii asupra grupelor functionale pe care le contin subst de
analizat.
Iata un tabel sumar, dar orientativ:
- Grupa I care contine elementeleC si H fac parte hidrocarburile saturate, nesaturate si aromatice
- Grupa a II-a (C, H, X) fac parte derivatii halogenati ai hidrocarburilor
- Grupa a III-a (C, H N) cuprinde: amina, imina, nitril, izonitril, hidrazina, hidrazona, alcaloizi,
heterociclu cu N
- Grupa a IV-a (C, H,S) cuprinde mercaptan, tioeter, tiofen
- Grupa a V-a (C, H,S,N) cuprinde tiocianat, tiouree, tiosemicarbazone
Dupa ce se stabileste din care grupa face parte subst de analizat, se procedeaza la analiza functionala
incercand reactiile specifice pt fiecare functiune in parte prevazuta in grupa respectiva, pentru ca prin eliminare
sa se poata stabili gruparea functionala prezenta pe molecula subst de analizat.
Dupa stabilirea exacta a gruparilor functionale prezente pe molecula subst de analizat trebuie determinat
si produsul;
Pentru obtinerea unor rezultate, analiza organica elementara si functionala este corelata cu unele probe
preliminarii sau de tatonare.
Din acestea mentionam :
- Solubilitatea in apa ( la rece si la cald ), alcool , eter, acetona, hidroxizi alcalini, acizi
- Reactia solutiei
- Reactia de culoare cu FeCl3
- Extragerea cu solventi organici
EXTRAGEREA CU SOLVENTI ORGANICI
Subst organica de analizat se aciduleaza cu acid tartric si se extrage de 3 ori cu eter. Se separa prin
decantare. Extractul eteric A poate contine luminal, veronal, rezorcina, bromural, saliprina , fenacetina,a
spirina.
Solutia apoasa ramasa se extrage de 3 ori cu cloroform fierbinte ( cate 20 ml ). Se separa prin decantare.
Extractul cloroformic A poate contine teobromina, cafeina, aminofenazona.
Solutia apoasa ramasa se trateaza cu 20 ml eter si se alcalinizeaza cu putin NaOH diluat. Apoi se extrage
de 2 ori cu eter ( cate 20 ml); se separa prin decantare.
33
Extractul eteric B poate contine anestezina, antipirina, chinina, novocaina, atropina, stricnina.
In afara de aceste probe preliminarii, analistul poate utiliza si constantele fizico-chimice, precum si
metodele moderne fizico-chimice, in special spectofotometria de absorbtie in infrarosu.
METODE CROMATOGRAFICE UTILIZATE IN IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR CE
CONTIN SUNSTANTE ACTIVE ORGANICE
CSS (cromatografia in strat subtire )
Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii atat in cadrul cercetarii cat si
al multiplelor si variatelor aplicatii ale acesteia, se datoresc intr-o masura considerabila folosirii tehnicilor
experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a pus la dispozitie. In aceasta directie aplicarea metodelor
fizice in analiza chimica, proces inceput de la constituirea acesteia ca disciplina stiintifica a condus la
elaborarea unor valoroase tehnici de laborator, cu mare potentialitate, printre care se inscrie si metoda
cromatografica cu diferitele sale variante.
CSS este una din noile metode de analiza, care alaturi de celelalte metode cromatografice si fizicochimice in general contribuie la studiul si identif subst chimice naturale si de sinteza
Limitari ale metodei CSS in ceea ce priveste identif subst active de natura organica :
Sensibilitatea este de multe ori limitata
Nu este adecvata pentru compusi volatili
Are nevoie de mai multa indemanare din partea operatorului decat in cazul HPLC
Cromatografia de gaze cu coloane capilare s-a dovedit a fi f folositoare in identif med din tesuturi si
lichide biologice. Imbunatatirea tehnicilor de introducere a probelor si de prelucrare a coloanelor capilare a
creat conditii de analiza prin cromatografie de gaze cu coloane capilare pt toate med analizate cu coloane
clasice cu umplutura.
Principalele avantaje ale cromatografiei de gaze sunt:
- Inalta frecventa de separare, chiar amestecurile complexe putand fi descompuse in componenti
- Nivel f inalt de sensibilitate in identif componentilor ( de ex doar cateva mg de mostra sunt suficiente pt
o analiza completa)
- Viteza de analiza rapida
- Exactitate a rezultatelor
- Functionarea si cheltuielile de exploatare nu necesita personal cu inalta calificare
- Cost relativ redus al instalatiei
- Viabilitate ridicata
Cromatografia de lichide de inalta performanta ( HPLC)
Acopera azi, in proportie aprox 80%, analiza subst moleculare: organice, organo-metalice si compusi cu
masa moleculara ridicata ( naturali sau sintetici). De aceea, impreuna cu cromatografia de gaze constituie punct
de sprijin important in analizele chimice moderne.
Analiza calitativa in IR
Identif compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale sau a celor speciale propuse de
societati sau edituri.
Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute plecand de la compusi aflati in
aceeasi stare fizica cu cei supusi identificarii.
Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu toate cele
care formeaza spectroteca considerata in vederea stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.
34
CURS 8, 25.11.2013
Metode volumetrice utilizate in analiza medicamentului
Puterea rotatorie
[ ] =puterea rotatorie specifica;
Puterea rotatorie specifica rotatia planului luminii polarizate (rad) determinate de un strat cu grosimea
de 1 m dintr-un lichid sau o solutie care contine 1 kg de s.a. intr-un metro cub de solutie masurata la
temperature t si lungimea de unda lambda.
Unitatea de masura in SI este radian ori metro cub/kg
- In practica se foloseste ca unitate de masura milirad ori m cub/kg;
- FRX defineste aceste unitati conventionale (care se folosesc in practica);
Puterea rotatorie a unui lichid reprezinta unghiul de rotatie a planului luminii polarizate, ezprimata in grade,
la temperature de 20 C (plus minus 5) la o lungime de unda D=589,3 nm, corespunzatoare radiatiei D
monocromatice a Na ape un strat cu grosimea de 1 dm.
Un radian, avand simbolul rad, este o unitate de masura pentru masura unghiurilor.
- Un radian este egal 180C/pi;
- Lungimea unui arc de cerc este egala cu raza inmultita cu masura in radiani a arcului;
- Radianul face parte din SI.
-
Puterea rotatorie specifica a unei substante in solutie marimea unghiului de rotatie a planului
luminii polarizate, exprimat in grade la temperature de 20C plus minus 5, la o lungime de unda
corespunzatoare radiatiei D monocromatice a Na masurata pe Solutia substantei de analizat care
corespunde la 1 g/cm3 de substanta. Se exrpima in [1g/ml];
Puterea rotatorie specifica a unui lichid marimea unghiului cu care este rotit planul luminii
polarizate care corespunde radiatiei D monocromatice a Na la temperature de 20C masurata pentru un
strat cu lungimea de 1 dm raportat la masa volumica. Se exprima in [1g/cm3];
Dpdv al controlului medicamentului polarimetria permite determinarea cu o sensibilitate de plus minu
0,05 unitati de grad si cu o aproximatie de plus minus 0,05C.
35
Inainte de orice determinare polarimetrica, aparatul se aduce la punctul 0 cu tubul polarimetric inchis la
ambele capete;
In cazul unei solutii a unei substante aducerea aparatului la 0 se face cu tubul polarimetric umplut cu
solventul.
Daca substanta este solida se cantareste la balanta analitica o anumita cantitate de substanta in balonul
cotat;
Daca solutia nu este limpede se filtreaza, dupa care se fac determinarile pe solutia limpede;
Se fac 5 citiri la polarimetru dupa care se face media acestor citiri, notand cu plus/minus sensul de
rotire.
D20 = /l X 0 formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru lichide unde:
marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L = lungimea tubului polarimetric (dm);
0 = masa volumica la temperature de 20C exprimata in g/cm3;
D20= X 100/(l X c) = formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru substante in solutie,
unde:
= marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L = lungimea tubului polarimetric (dm);
C = concentratia solutiei in substanta de analizat (exprimata in procente de masa/volum);
C= X 100/l X D20 daca cunoastem puterea rotatorie specifica a unei substante intr-un anumit
solvent, la o anumita temperature, si o anumita lungime de unda putem afla concentratia unei substante
necunoscute, unde:
marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L lungimea tubului polarimetric (dm);
D20= puterea sotatorie specifica (tabele);
La o anumita temperature (20C) si o anumita lungime de unda (589,3 nm); FRX noteaza indicele de
refractive cu nD20.
Indicele de refractive depinde:
De temperatura;
Lungimea de unda;
Presiune;
Natura substantei;
Natura solventului.
In cazul unei solutii daca mentinem toti factorii de mai sus constant, singura variabila este concentratia
s-a constatat ca exista proportionalitate intre valorile indicelui de refractive si concentratie =>
constanta poate fi utilizata ca si criteriu de identitate, puritate si dozare.
Indici oficinali FRX
Indicele de aciditate numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii liberi din 1 g proba de
analizat;
Indicele de ester = numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii grasi rezultati din
saponificarea a 1 g proba de analizat;
Indicele de hidroxil numarul de mg KOH echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1 g
proba de analizat;
Indicele de iod = numarul de g I2 fixat de 100 g proba de analizat;
Indicele de peroxide = numarul de ml de Na2S2O3 ori 10-2 M oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric
prin actiunea peroxizilor din 1 g proba de analizat;
Indice de saponificare nr de mg KOH necesar pentru neutralizarea tuturor acizilor, a acizilor liberi si a
celor rezultati prin saponificarea a 1g proba de analizat.
Principalele metode de analiza utilizate in laborator. Consideratii teoretice si practice
2.1.
Metode titrimetrice volumetrice
2.1.1. Principiu
Metodele titrimetrice volumetrice, numite in continuare volumetrice, reunesc metodele chimice de
analiza in care analitul din solutia de analizat se determina cantitativ prin masurarea volumului de
reactive de concentratie cunoscuta, care se aduce in cantitate stoechiometrica peste acesta.
aA + bB -> cC + dD + . => volum de echivalenta;
stoechiometria reactiei ori concentratie titrant, volum de echivalenta => concentratia probei.
La baza oricarei metode chimice de analiza sta o reactie chimica:
xX + yY + uU + vV + .
Care, pentru a putea fi utilizata in volumetrie, trebuie sa indeplineasca mai multe conditii:
Sa fie cantitativa transformarea, practic totala, a partenerilor de reactie (X, Y) in produsi de reactie (U,
V etc);
Reactia sa fie simpla, cu mecanism cunoscut, fara reactii secundare;
Sa aiba viteza mare de reactie;
Evidentierea neta a punctului final de titrare;
In cursul reactiei chimice are loc practic un transfer al unei particule P (ioni, molecule, electroni) intre
analit si titrant:
X -> U + P;
Y + -> V;
X + U - > U + V.
37
Reactivii in volumetrie
Standardul primar folosit in titrimetrie trebuie sa aiba urmatoarele proprietati:
Puritate mare;
Masa molecular mare pentru ca erorile de cantarie sa fie cat mai reduse;
Stabilitate in aer si in solutie;
Nehigroscopic;
Solubil in solventul folosit la titrare;
Sa reactioneze rapid si stoechiometric cu analitul de interes, fara reactii secundare;
Cost cat mai redus;
Numarul substantelor cu aceste proprietati (tabelul 2.2) este redus, in practica folosindu-se substante
care indeplinesc cele mai multe dintre conditiile enumerate;
In titrimetrie se folosesc urmatoarele tipuri de titranti;
Solutii standard primar se obtin prin cantarirea directa a unui standard primar;
Solutii standard secundar se obtin din substante chimice care nu corespund criteriilor specifice
unui standard primal, dar sunt standardizate cu ajutorul unui standard primar;
Substante ca hidroxidul de sodium sau acidul clorhidric nu pot fi folosite la obtinerea unor solutii
standard primar avand o puritate variabila.
Din acestea se obtin solutii standard secundar care, dupa standardizare, pot fi folosite la
standardizarea altora.
Solutii standard diluate sunt obtinutte prin diluarea solutiilor standard primare si seucndare
standardizate.
Standarde primare si utilizarea lor in titrimetrie
Standard primar
Ftalat acid de potasiu
Iodat de potasiu
Tipuri de titrimetrie
Acido bazica
Redox
Zinc metalic
Colura de sodiu
Complexometrie
Prin reactii de precipitare
Utilizare
Standardizarea
solutiei
de
hidroxid de sodium si de acid
percloric in mediu de acid acetic
glacial;
Standardizarea
solutiei
de
tiosulfat de sodiu
Standardizarea solutiei de EDTA
Standardizarea solutiei de azotat
de argint
Detectia in titrimetrie
- Sesizarea Punctului de echivalenta se poate face prin mai multe metode, cele mai des intalnite fiind
metodele vizuale.
-
Metode vizuale (volumetria chimica) > metode instrumentale (volumetria fizico-chimica) >
modificarea unei insusirii fizice a participantilor la reactia chimica.
38
In titrimetria chimica detectarea PE are la vaza o reactie secundara intre titrant si a subsantei numita
indicator adaugata sistemului, reactie care are loc dupa consumarea completa a analitului. Indicatorul va
suferi o schimbare care poate fi detectata (de exemplu, modificarea culorii):
Analit + titrant -> PE (cantitate stoechiometrica);
Indicator + titrant -> PF punct final
Culoare 1
culoare 2
La PF sesizarea schimbarii se face dupa ce a reactionat o cantitate suficienta de indicator cu titrantul,
ideal aceasta cantitate trebuie sa fie foarte mica;
In titrimetria fizico-chimica se masoara cu ajutorul instrumentelor o insusire fizica a sistemului, cum ar
fi: diferenta de potential, conductibilitate, intensitate de curent, absorbanta etc; corelata cu modificarea
concentratiei analitului sau produsului de reactie in timpul titrarii. Curba de titrare permite determinarea
directa a PE si reprezinta variatia semnalului masurat in functie de volumul de titrant adaugat. In cazul
multor instrumente, aceasta se inregistreaza automat pe masura ce are loc titrarea.
Titrarile bazate pe modificarea unei insusiri fizice a solutiei in cursul reactiei chimice sunt rare (de
exemplu, reactia dintre acidul oxalic si permanganat de potasiu cand are loc modificarea culorii datorita
consumarii permanganatului);
Clasificarea metodelor volumetrice
Clasificarea metodelor titrimetrice volumetrice se realizeaza dupa mai multe criterii (modul de executie
al titrarilor, reactia chimica, modul de detectie a punctului de echivalenta, natura solventului in care are
loc reactia);
In continuare, tratarea metodelor volumetrice se va face in principal tinand cont de clasificarea in
functie de reactia chimica, intr-o abordare coroborata cu celelalte principii de clasificare, accentuand
metodele cu aplicabilitate in laborator.
In functie de reactia chimica, metodele titrimetrice se impart in:
Titrimetria prin reactii cu formare de combinatii complexe (complexometria);
Titrimetria prin reactii de diazotare (nitritometria);
Titrimetria prin reactii de precipitare;
Titrimetria prin formare de compusi greu disociati;
Titrimetria prin reactii redox (redoxometria);
2.1.2. Volumetria prin reactii acido-bazice (protometria)
2.1.2.1 volumetria prin reactii acido-bazice in mediu apos
se bazeaza pe reactii de neutralizare a acizilor cu baze, respectiv, a bazelor cu acizi din medii apoase;
titrosubstante
ca titrosubstante, in volumetria acido-bazica se utilizeaza:
acidul oxalic;
biiodatul de potasiu;
acid benzoic;
carbonatul de sodiu;
boraxul;
iodatul de potasiu.
Indicatori acido-bazici (de pH):
39
indicatori de culoare;
indicatori de fluorescenta;
indicatori turbidimetrici (precipitare);
indicatori de adsorbtie.
Indicatori turbidimetrici
sunt indicatorii care-si schimba brusc solubilitatea in functie de pH-ul solutiei. In general acestia sunt
substante coloidale care la punctul de echivalenta coaguleaza. Se utilizeaza in cazul solutiilor colorate
sau la dozarea acizilor si bazelor slabe. Intervalul lor de viraj este ingust si puternic influentat de
temperatura (ex: izonitrozoacetil p-aminobenzen);
Indicatori de adsorbtie sunt substante care se adsorb (desorb) pe (de pe) suprafata unor coloizi ce se
formeaza in timpul titrarii concomitent cu schimbarea culorii la punctul de echivalenta (exemplu, galben
de tiazol);
Indicatorii de fluorescenta sunt acei indicatori care la o anumita valoarea a pH-ului, in lumina UV
devin fluorescenti sau isi pierd fluorescenta si sunt utilizati in cazul solutiilor puternic colorate sau a
celor netransparente (ex: tetrabromfluoresceina, albastru de timol etc.)
Aplicatii ale protometriei in mediu apos metoda se bazeaza pe o reactie cu schimb de protoni, folosind
fie o solutie titrata de acid pentru dozarea substantelor cu functie bazica fie o solutie titrata de baza tare
pentru determinarea substantelor cu functie acida;
Se aplica s.m. care sunt acizi sau baze relativ tari, solubile in apa sau in solventi miscibili cu apa;
Dozarea acizilor tari: HCl, acid sulfuric, acid azotic;
Dozarea bazelor tari: hidroxizi alcalini, hidroxizi alcalino-pamantosi;
Acizi organici: acid acetic, benzoic, boric, nicotinic, barbituric etc;
Baze organice: amoniac, urotropina, meprobamat etc.
CURS 9, 02.12.2013
Volumetria prin reactii acido-bazice in mediu neapos
- Apa prezinta ca mediu de reactie o serie de dezavantaje:
Multe s.m. sunt insolubile in apa;
Este un solvent care niveleaza taria acizilor tari si a bazelor tari facand imposibila titrarea
acestora din amestecuri utilizand metode directe;
Nu poate releva functiile acide sau bazice ale unor substante in asa fel incat sa fie titrabile, dozarile
directe de acizi sau baze;
Protometria in solutii neapoase este indicata ca metoda cantitativa in determinarea substantelor
medicamentoase inca din 1955 (Farmacopeea US XV);
Protometria in mediu neapos, pe langa faptul ca a extins posibilitatile de determinare cantitativa la
un numar foarte mare si divers de substante, a adus si o interpretare progresista a acestor procese;
40
Teoriile protonica si electronica considera ca fiecare substanta se caracterizeaza printr-o aciditate sau
bazicitate proprie, intrinseca dependenta de structura moleculara a substantei polare, independenta de
solvent;
Proprietatile acide sau bazice ale substantei sunt relevate in solutie, solventul consituind prin actiunea sa
de modificare a aciditatii sau bazicitatii intrinsece, un factor extrinsec.
Erori de titrare mai mici datorita tensiunii superficiale scazute a solventilor organici;
Titrarea unor cantitati mai mici de substanta;
Temperatura nu are o influenta majora asupra titrarii;
Dezavantaje:
Solventi organici toxici CI sa se inhaleze mult timp aceste substante;
Toxicitate;
Manualitate trebuie manipulate mai cu grija, experienta;
Cost crescut comparativ cu apa.
Solventi protici
+ protofilici NH3, etilendiamina (EN), dimetilformamida (DMF), pridina (Py), dioxan, cetonele
(acetona, metil-etilcetona), nitrili (acetonitril), dimetilsulfoxid (DMSO);
+ protogenici acizi carboxilici (acetic glacial, formic, propionic etc);
+ amfiprotici alcooli (metilic, etilic, etilenglicol etc)
R-NH2 + acid acetic -> R-NH3+-CH3COO- -> R-NH3+ + CH3COOIonizare (efect prototropic) disociatie ionica (constanta dielectrica)
Solventi protofilici DMF
R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH3)2NHCHO+
R--(CH3)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH2)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
Ionizare
disociatie ionica
Exemple de interventie a solventului
In protometria in mediu neapos, cresterea caracterului acid sau bazic al SM se realizeaza:
In cazul bazelor prin dizolvarea in solventi protogenici (acizi);
In cazul acizilor prin dizolvarea in solventi protofilici (bazici);
Cresterea caracterului acid/bazic este cu atat mai mare cu cat diferenta dintre valoarea pKa (pKb) ale
solventului si pKa (pKb) a substantei este mai mare;
Solutii titrate
Titrarea substantelor bazice
Solutia titrata: acid percloric 0,1N;
Acid percloric in acid acetic sau dioxan;
Titru stabilit cu ftalat acid de potasiu.
Titrarea substantelor acide
Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1 N;
Metoxid de sodiu in benzen;
Titru stabilit cu acid benzoic.
Indicatori acido-bazici in mediu neapos
Se aleg astfel incat erorile posibile sa fie cat mai reduse -> se va tine seama de:
Mediul de reactie (solvent);
Natura substantei care se dozeaza;
Nuantele prin care trece indicatorul in jurul punctului de echivalenta.
Alegerea indicatorului
Solventi acizi (acid acetic glacial, anhidrida acetica, acid propionic)
Cristal violet in acid acetic glacial;
Solventi bazici (DMF, piridina);
Albastru de brom-timol in DMF;
Solventi neutri (acetona, dioxan, benzen);
Galben de metanil in dioxan.
Mecanismele schimbarii culorii indicatorilor
Cristal violet clasa indicatorilor trifenil metanici
Violet H+ - albastru verde H+ galben.
Concluzii
SM cu caracter bazic:
Solventi: protogenici (acizi);
Solutia titrata: acid percloric 0,1N in acid acetic glacial sau dioxan;
43
Indicator: cristal violet in acid acetic glacial; sau galben de metanil in dioxan.
SM cu caracter acid:
Solventi: protofilici (bazici);
Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1N in benzen;
Indicator: albastru de bromtimol in DMF
Observatii
Pentru alegerea conditiilor optime de reactie este necesara o evaluare a:
Structurii substantei:
Existenta unei singure grupari bazice slabe sau foarte slabe;
Prezenta in aceeasi molecula a doua sau mai multe polaritati bazice mai mult sau mai putin apropiate
ca tarie;
Amestecului din care face parte substanta:
Substanta in care polaritatile acide sau bazice se neutralizeaza sau compenseaza (ex: clorhidratii,
sulfatii, azotatii);
Amestecuri de baze tari si slabe sau amestecuri cu polaritati apropiate;
Forme farmaceutice.
44
Fenazona.
Bazicitatea scade R2NH>R-NH2->R3N>N heterociclic > Ar-NH2
Chinina 2 atomi de azot cu polaritati slabe si apropiate, in apa se comporta ca o baza monovalenta, in acid
acetic glacial se comporta ca o baza bivalenta (acidul acetic echivaleaza ambii atomi de azot).
Vitamina B1 tiamina 4 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza amina primara si azotul tertiar din
ciclul tiazolic; ceilalti doi atomi de azot nu interfera titrarea;
Aminofenazona 3 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza bazicitatea azotului alifatic si bazicitatea
partiala a celor 2 azot din ciclu; dizolvare in acid acetic + dicloretan sau in cloroform -> titrarea azotului din
catena laterala;
-
Compusi cu grupari
Imidice: -CO-NH-CO Amidice - -NH-CO-NH- (derivati barbiturici, sulfamide).
Fenobarbital (titrare cu metoxid de sodiu)
AVANTAJELE DOZARII IN SOLVENTI NEAPOSI
45
Majoritatea SM (acizi sau baze foarte slabe putin sau insolubile in apa) pot fi titrate (dozate) cu acizi sau
baze relativ tari in solventi neaposi anhidri in care, de obicei, sunt mai solubile;
Titrarea poate fi extinsa si la substantele care in solutii neapoase sunt neutre;
Cel mai important este solventul;
Prin utilizarea corecta a unor amestecuri de solventi neaposi pot fi dozate amestecuri de substante
organice medicamentoase cu polaritati acide sau bazice apropiate;
Metoda poate fi aplicata si la dozarea sm slab acide sau bazice din forme farmaceutice;
Solventii neaposi avand o tensiune superficiala mica, picaturile care se strang din biureta au volum mic
-> erori mici de titrare;
Dozarile in mediu neapos permit titrari la diferite temperaturi cu evidentierea punctului de echivalenta
cu ajutorul indicatorului sau prin metode fizice (potentiometric, voltametric).
Electroforeza capilara corespunde unei adaptari particulare a metodei generale de electroforeza. Aceasta
metoda separativa se bazeaza pe migrarea speciilor purtatoare de sarcini electrice globale din proba
aflata in solutie sub efectul unui camp electric si in contact cu un suport corespunzator.
In tehnica clasica obisnuita, larg utilizata in domeniul bioanalitic, se utilizeaza benzi de material plastic
acoperite cu o substanta poroasa impregnata cu un electrolit. Capetele sunt imersate in 2 rezervoare
independente, continand acelasi electrolit si cuplate la electrozii unui generator de tensiune continua.
Proba este depusa sub forma unui strat subtire transversal pe banda, eventual presarata intre 2 placi
izolante. Speciile hidratate prezente migreza intr-un timp variabil cuprins intre cateva secunde pana la
cateva ore spre una dintre extremitatile benzii. Fiecare compus se diferentiaza prin mobilitatea sa.
Detectia speciilor prezente dupa migrare se efectueaza in general prin transferul acestora printr-un
procedeu de contact pe o membrana unde sunt relevate cu ajutorul unor reactivi specifici. Prelucrarea
datelor se face ca si in CSS.
In electroforeza capilara suportul plan din tehnica clasica este inlocuit de un tub capilar deschid la
ambele capete, din sticla de siliciu cu diametrul variind intre 15 si 150 microni. Acest capilar cu
lungimea 20-80 cm este umplut cu un electrolit tampon.
Mobilitatea electroforetica si fluxul electroosmotic
Particulele aflate in suspensie intr-un lichid la fel ca si moleculele solvatate pot fi incarcate cu o sarcina
electrica a carei marime si semn depind de natura lor si a electrolitului si, in particular, de pH.
Aceasta sarcine provine din fixarea pe suprafata lor a ionilor continuti in electrolitul tampon. Sub efectul
diverselor fenomene (agitare, temperatura, vascozitate, diferenta de potential) aceste particule vor avea
viteze de migrare cu atat mai mari cu cat ele sunt mai mici si au sarcina mai mare.
Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de migrare este rezultatul echilibrului intre forta electrica F
care se exercita intr-un camp electric E cu particule de sarcina q si fortele de frecare care decurg din
vascozitatea (niu) a mediului.
Separarea depinde de asemenea de raportul volum/sarcina ionului hidratat. Speciile neutre se separa
greu fiind necesara adaugarea unui agent ionic in electrolit care sa se asocieze cu acesta si sa provoace o
antrenare diferentiata a lor.
Speciile prezente in proba sunt supuse la doua fenomene principale care se manifesta atat pentru ioni cat
si pentru molecule: este vorba, pe de o parte, de mobilitatea electroforetica proprie lor iar, pe de alta, de
fluxul electroosmotic.
Electromigrarea
Toti compusii incarcati electric se deplaseaza in electrolit cu o viteza v care depinde de conditiile
experimentale si de mobilitatea lor electroforetica.
Mobilitatea electroforetica se poate obtine plecand de la electroforegrama, calculand viteza
electroforetica a compusului intr-un camp E si tinand cont de viteza electrolitului.
Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor este curgerea electrolitului numit flux electroosmotic caracterizat prin mobilitatea electro-osmotica.
Electroosmoza
Pentru calcularea mobilitatii electro-osmotice trebuie determinata viteza electroosmotica. Viteza
electroosmotica este raportul intre lungimea capilarului parcursa de un marker neutru in timpul t. Se
utilizeaza ca marker o molecula organica nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care este usor
detectabila prin absorbtia in UV apropiat.
47
Fluxul electroosmotic aflat la originea deplasarii tuturor speciilor prezente in proba depinde de natura
peretelui intern al tubului capilar.
Acest perete de silice este captusit de grupari silanice care se ionizeaza daca pH-ul este mai mare de 3,
formand o suprafata cu pozitii anionice fixe ce creeaza un potential negativ (potential zeta) alaturi de un
strat cationic.
In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca migrarea cationilor spre catod. Acesti ioni sunt
solvatati si antreneaza moleculele de apa din electrolit dirijiandu-le spre catod. Anionii se deplaseaza
intr-o maniera contra-electroosmotica. Daca se trateaza peretele capilar cu un surfactant de tipul
tetraalchilamoniu, polaritatea se inverseaa, ceea ce conduce la o inversare a fluxului electroosmotic.
In general o suprafata a peretelui capilar negativa provoaca un flux electroosmotic dirijat spre catod si
invers, o suprafata pozitiva provoaca o dirijare a acestuia spre anod.
Cunoasterea fluxului electroosmotic este esentiala pentru practica EC pentru obtinerea de rezultate
reproductibile.
Tehnici electroforetice
Tehnicile electroforetice sunt urmatoarele:
A. Electroforeza capilara de zona;
B. EC micelara;
C. EC pe gel:
D. EC prin izofocalizare;
E. EC capilara
EC de zona
Se mai numeste si electroforeza in solutie libera si este procedeul electroforetic cel mai frecvent utilizat.
In acest procedeu capilar este parcurs de electrolit intr-un mediu tampon fie acid (fosfat sau citrat) fie
bazic (borat) sau amfolit (molecule posedand o functie acida si una bazica). Fluxul electro-osmotic
creste cu pH-ul fazei lichide sau poate ramane neutru.
Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii, apoi ansamblul neutru si la sfarsit anionii. Tehnica nu
permite separarea speciilor neutre unele de altele.
48
EC micelara
Se mai numeste si EC electrocinetica micelara.
In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un compus cationic sau anionic pentru formarea de micele
incarcate electric;
Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb compusii neutri mai mult sau mai putin eficace printro afinitate de tip hidrofil/hidrofob;
Acest tip de electroforeza se aplica moleculelor care au teninda de a migra fara separare (polipeptidele).
EC pe gel
Consta in transpunerea electroforezei pe gel de poliacrilamida sau agaroza. Capilarul este umplut cu un
electrolit continand un gel care produce efect de filtrare ce retine moleculele mari si reduce fenomenul
de difuziune.
Metoda se preteaza la separarea a trei clase mari de biomolecule: polipeptide, oligonucleotide
(fragmente de ADN sau ARN) mono si polizaharide.
EC prin izofocalizare
Aceasta tehnica cunoscuta in egala masura ca electroforeza pe suport consta in crearea unui gradient de
pH liniar intr-un capilar cu peretele tratat cu amfolit. Capilarul este introdus in acid fosforic la anod si in
hidroxid de sodiu la catod, fiecare compus migreaza si se focalizeaza la pH-ul care are aceeasi valoarea
cu potentialul lui izoelectric.
Electrocromatografia capilara
Acest tip de separare asociaza electromigrarea ionilor, proprie electroforezei si procesele de repartitie
intre faze prezente in cromatografie.
49