synevo.

ro/electroforeza-hemoglobinei

Electroforeza hemoglobinei
Informatii generale

Hemoglobina reprezinta elementul esential pentru principala functie fiziologica a

eritrocitului: functia respiratorie. Hemoglobina este o cromoproteina porfirinica care
contine fier, in structura sa intrand o parte proteica – globina – si o parte prostetica –
hemul. Globina difera ca structura de la o hemoglobina la alta, ea imprimand specificitate
diverselor hemoglobine cunoscute.

In cursul dezvoltarii organismului de la embrion la adult se succeda mai multe tipuri de Hb;
hemoglobinele embrionare Gower 1, Gower 2 si Portland sunt inlocuite incepand cu cea de-
a 3-a luna de gestatie de catre Hb fetala (HbF), care reprezinta 70-80% din totalul Hb la nou-
nascut, dupa care sinteza sa scade rapid, ajungand la sfarsitul primului an de viata la valori
sub 2% din totalul Hb. Hb A si Hb A 2 sunt caracteristice perioadei adulte de dezvoltare;
sinteza lor incepe inca din perioada fetala, iar dupa nastere ele inlocuiesc rapid Hb F. La
adultul normal, Hb A reprezinta 97-98%, HbA2 2-3%, iar HbF sub 1% 1.

Lanturile polipeptidice α, β, γ si δ ale globinei alcatuiesc hemoglobinele fiziologice (fiecare

molecula de hemoglobina contine doua perechi de lanturi polipeptidice), lantul α fiind
comun celor trei hemoglobine:

HbA = α2 β2

HbA2 = α2 δ2

HbF = α2 γ2.

Ca si in cazul celorlalte proteine structura spatiala a hemoglobinei precum si alte proprietati

moleculare depind de tipul si secventa de aminoacizi care intra in alcatuirea hemoglobinei.
Substitutia unor aminoacizi din lanturile polipeptidice ca urmare a mutatiilor genetice
genereaza variante anormale de hemoglobina ce prezinta o incarcare electrica diferita si in
consecinta mobilitati electroforetice diferite. Pe de alta parte, scaderea ratei de sinteza a
unui tip de lant al globinei da nastere la anomalii cantitative denumite sindroame
talasemice.

Metodele electroforetice sunt utilizate de rutina in screening-ul anomaliior hemoglobinei.

Dintre acestea cea mai cunoscuta este electroforeza Hb in mediu alcalin (pH 8.2-8.6)
folosind ca suport de migrare gelul de agaroza. La pH alcalin hemoglobina prezinta o
sarcina electrica negativa si va migra catre anod. Prin aceasta metoda pot fi separate si
identificate hemoglobinele fiziologice HbA, HBA2, HbF si migreaza de asemenea o serie de
variante de hemoglobina, cum ar fi HbS, HbD, HbG, Hb Lepore, HbC, HbO-Arab, care
genereaza majoritatea hemoglobinopatiilor cunoscute.

1/10
La rularea fiecarui set de probe este folosit un control ce contine hemoglobinele A, F, S si C.
Deoarece este utilizata o coloratie pentru proteine si nu una pentru hem, anhidraza
carbonica (enzima cu un continut crescut in eritrocite) va fi vizualizata suplimentar in
spatele benzii A2. Pentru identificarea fractiunilor Hb pozitia benzilor obtinute este
comparata cu cea a benzilor standard furnizate de materialul de control pozitia benzilor
obtinute fiind comparata cu cea a benzilor standard furnizate de materialul de control (vezi
fig.1). Cuantificarea relativa a benzilor obtinute se face prin scanarea densitometrica a
gelului electroforetic1;3.

Fig. 1 Migrarea fractiunilor Hb la

electroforeza in gel de agaroza la
pH alcalin

Cu toate acestea electroforeza

hemoglobinei in gel de agaroza la
pH alcalin prezinta limitari
importante:

–variatii mari in cuantificarea

HbA2, ceea ce afecteaza
identificarea corecta a beta-
talasemiilor;

– imposibilitatea separarii HbS de

HbD si a HbC de HbE si HbA2 (vezi
fig.1).

Din aceste motive in laboratorul nostru se utilizeaza in prezent electroforeza capilara

pentru separarea fractiunilor Hb. Prin aceasta tehnica, complet automatizata, moleculele
incarcate electric sunt separate pe baza mobilitatii electroforetice proprii intr-o solutie
tampon alcalina. Separarea se produce de asemenea si in functie de pH-ul solutiei
electrolitice si de fluxul electroosmotic.

Sistemul electroforetic este alcatuit din tuburi capilare de silica (SiO2) cu d<100 μ care
functioneaza in paralel ceea ce permite 7 analize simultane pentru cuantificarea unei
fractiuni de Hb. Proba diluata cu solutia hemolizanta este injectata la capatul anodic al
capilarului; se aplica apoi un voltaj inalt pentru separarea fractiunilor Hb care vor fi apoi
detectate la 415 nm de catre detectorul de absorbanta plasat la capatul catodic al
capilarului. Astfel, fractiunile Hb sunt detectate direct si specific la lungimea de unda
caracteristica Hb. In final, pe ecranul analizorului vor fi afisate pozitiile potentiale ale
fractiunilor Hb obtinute (identificate in zonele denumite Z1 →Z15) precum si cuantificarea

2/10
acestora. Prin utilizarea unui tampon cu pH alcalin fractiunile Hb normale sau anormale vor
fi detectate in urmatoarea ordine de la catod la anod (Z1 →Z15): δA’2 (varianta de HbA2), C,
A2/O-Arab, E, S, D, G-Philadelphia, F, A, Hope, Bart, J, N-Baltimore si H.

Electroforegramele rezultate vor fi inspectate vizual pentru a stabili daca s-a obtinut un
profil normal sau modificat (vezi fig.2,3).

Fig. 2 Electroforegrama Hb cu aspect normal (adult)

3/10
Fig. 3 Electroforegrama Hb cu aspect normal (copil de 3 saptamani)

Avantajele utilizarii electroforezei capilare sunt urmatoarele:

–cuantificare mai buna a HbA2 pentru identificarea beta-talasemiilor minore (datorita

mai multor analize simultane);

–diferentierea HbS de HbD precum si a HbC de HbE si HbA2 (aceste fractiuni co-migreaza
la electroforeza Hb in gel de agaroza in mediu alcalin);

–deoarece nu este vizualizata anhidraza carbonica pe eletroforegrama este posibila

identificarea variantelor de HbA2 in zona Z1 (detectarea unei variante de HbA2 este
importanta pentru diagnosticul corect al beta-talasemiilor minore deoarece se insumeaza
la HbA2 normala)2.

Recomandari pentru efectuarea electroforezei de hemoglobina – diagnosticul

hemoglobinopatiilor si sindroamelor talasemice a caror suspiciune este indicata de:

• anemie hemolitica cronica;

• criza ocluziva vasculara de cauza necunoscuta la un pacient provenit din zone cu niveluri
crescute ale Hb S si/sau Hb C;

• sindrom de hidrops fetal de cauza necunoscuta 3;

• aspect sugestiv al hemogramei, cu microcitoza si hipocromie mai severe decat ar fi de

asteptat pentru gradul anemiei si numar de eritrocite la limita superioara a normalului sau
chiar crescut, asociate cu un numar mare de hematii „in tinta” si punctatii bazofile pe frotiul
de sange. In aceasta situatie, pentru diferentierea de deficitul de fier, sunt utile indicele
Mentzer si indicele RDW:

Indicele Mentzer = VEM/nr. de eritrocite (x10 6)

>14 sugestiv pentru deficit de fier;

12-14 echivoc

<12 sugestiv pentru tara talasemica.

Indicele RDW = Indicele Mentzer x RDW (largirea distributiei eritrocitare).

< 220: sugestiv pentru talasemie;

≥ 220: sugestiv pentru anemia feripriva 4.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese) 2.

Specimen recoltat – sange venos 2.

Cauze de respingerea probei–specimen coagulat sau care a depasit perioada de

stabilitate2.

2 4/10
Recipient de recoltare – vacutainer cu K3 EDTA 2.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul 2.

Stabilitate proba –sangele integral este stabil 7 zile la 2-8°C; in nici un caz vacutainerul cu
sange recoltat pe K3 EDTA nu se introduce in congelator!!! (se produce hemoliza)2.

Metoda –electroforeza capilara; la fiecare rulare a probelor se utilizeaza un control HbA2

normal2.

Valori de referinta

Pentru cele 3 fractiuni fiziologice se inregistreaza variatii in functie de varsta 2:

Varsta HbA HbA2 HbF

<2 luni 17.7-54 ≤1.3 46-81

2-3 luni 37.1-70.6 0.4-1.9 29-61

3-4 luni 41-84 1-3 15-56

4-5 luni 68.2-88.6 2-2.8 9.4-29

5-6 luni 74.9-95.6 2.1-3.1 2.3-3.2

6-9 luni 83.5-95.8 1.9-3.5 2.3-1.3

9-13 luni 91.7-96.7 2-3.3 1.3-5

≥13 luni 96.7-97.8 2.2-3.2 ≤0.5

Interpretarea rezultatelor

• in β-talasemia minima si minora valorile Hb A 2 sunt crescute (3.2%- 7%), iar Hb F este
usor crescuta (0.5-6%) in peste 50% din cazuri, restul fiind reprezentat de Hb A (vezi fig.4);

5/10
Fig. 4 Electroforegrama unui pacient cu beta-talasemie minor

• in β-talasemia intermedia, procentul de Hb A 2 este variabil, iar Hb F = 20-80%;

• in β-talasemia majora, valorile de Hb F sunt foarte crescute, situate obisnuit intre 20-90%
din totalul Hb, restul fiind format de Hb A (valori foarte scazute) si HbA2 (valori normale
sau crescute); se caracterizeaza clinic prin tabloul clasic al anemiei Cooley;

• in afara de tipurile amintite, mai exista forme de β- talasemie cu valori normale de Hb A 2 si

Hb F “silent thalassemia” cu indici eritrocitari normali si “almost silent thalassemia” cu indici
eritrocitari modificati) care pot fi puse in evidenta prin tehnici de genetica moleculara3;5;

• δβ-talasemia rezulta din deletia genelor δ si β cu mentinerea integritatii genelor γ, in timp

ce in Aγδβ-talasemia se inregistreaza deletia genelor Aγ, δ si β cu mentinerea integritatii
genei Gγ; heterozigotii prezinta un tablou hematologic similar β-talasemiei minore dar la
electroforeza Hb, procentul de Hb A2 tinde sa fie redus la jumatate iar Hb F este persistent
crescuta intr-o proportie de 5-20%; homozigotii prezinta un fenotip similar β-talasemiei
intermedia iar electroforeza evidentiaza Hb F intr-un procent de aproape 100%; testarea
genetica confirma diagnosticul3;

• Hb Lepore este o hemoglobina anormala, in care lanturile α sunt normale, iar lanturile non-
α au o structura asemanatoare lanturilor δ la capatul N-terminal si lanturilor β la capatul C-
terminal. Sindromul Lepore, foarte asemanator clinic in forma sa heterozigota cu β-
talasemia minora, se caracterizeaza prin prezenta Hb Lepore intr-un procent de 5-10 %, cu
o pozitie asemanatoare HbD la electroforeza capilara (in zona Z6); in forma homozigota,
asemanatoare clinic cu anemia Cooley, Hb Lepore reprezinta 10-20%, restul fiind format de
HbF (Hb A si Hb A2 lipsesc in totalitate) 1;2;

6/10
• persistenta ereditara de Hb F este o entitate asimptomatica clinic si hematologic,
caracterizata prin valori crescute de Hb F, la heterozigoti Hb F = 15-30%, iar la homozigoti
se poate ajunge pana la 100% Hb F, in afara oricarui semn de boala5;

• in forma heterozigota de siclemie (“sickle cell trait”) , electroforeza capilara evidentiaza o

Hb anormala in Z5, Hb S, in proportie de 25-45%, Hb A2 fiind in cantitate normala, iar restul
fiind reprezentat de Hb A (vezi fig.5); cei mai multi pacienti cu tara de siclemie sunt
asimptomatici, cu un frotiu de sange normal sau usor modificat (microcitoza sau hematii
“in tinta”); coexistenta tarei Hb S cu anumite tipuri de talasemii sau alte hemoglobinopatii
modifica tabloul clinic si hematologic precum si electroforeza Hb2;3;

Fig. 5 Eletroforegrama unui pacient cu forma heterozigota de siclemie

• in forma homozigota de siclemie (“sickle cell anemia”) , electroforeza Hb indica prezenta

Hb S in proportie de 90-95%, restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F; tabloul hematologic
este normal la nastere si incepe sa se modifice dupa varsta de 6 luni, pe masura ce Hb F
este inlocuita de Hb S 3;

• in hemoglobinopatia C, la electroforeza Hb in gel de agaroza in mediu alcalin, HbC se

izoleaza ca o fractie anormala, cu migrare foarte lenta, pe linia Hb A2, in aceeasi pozitie cu
Hb E si Hb OArabia, intr-un procent de 38-44%laheterozigoti; pentru diferentierea Hb C de Hb
E si Hb OArabia este necesara efectuarea electroforezei la un pH acid (6-6.2); la
electroforeza capilara HbC este identificata separat in Z2 (vezi fig.6)1;2; prezenta tarei Hb C
nu prezinta semnificatie clinica insa este importanta in consilierea genetica a cuplurilor;
homozigotii pentru Hb C (boala hemoglobinei C) prezinta urmatoarele caracteristici:

7/10
anemie usoara/medie cu microcitoza marcata, numeroase hematii “in tinta” pe frotiul de
sange periferic, iar la electroforeza hemoglobinei se izoleaza Hb C in proportie de 95%,
restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F3;

Fig. 6 Electroforegrama unui pacient cu forma heterozigotade hemoglobinopatie C

• in α– talasemia minora nu exista modificari procentuale ale Hb A, Hb A 2 si Hb F, iar

electroforeza de Hb apare normala la subiectul adult heterozigot, insa dublu heterozigotii
realizeaza “boala Hb H”, cu aspect clinic de talasemie intermedia; la electroforeza Hb in gel
de agaroza la pH alcalin se poate evidentia o fractiune anormala cu migrare rapida (cea
mai apropiata de anod) in timp ce la electroforeza capilara se detecteaza o fractiune
anormala in pozitia Z15 (vezi fig.7) corespunzatoare Hb H (5-30%). Pe frotiul de sange
colorat supravital pot fi observate incluziile HbH (precipitatele de lanturi β), intr-un procent
ridicat de eritrocite (35-90%) cu aspect caracteristic de „minge de golf”1;2. Genetica
moleculara asigura insa diagnosticul de certitudine al tuturor formelor de α– talasemie 3.

8/10
Fig. 7 Electroforegrama unui pacient cu “boala Hb H”

Limite si interferente

Transfuziile de sange pot dilua o eventuala hemoglobina anormala, pentru o perioada de 3-

4 luni, interferand cu rezultatele electroforezei5.

Hiposideremia poate determina obtinerea de valori fals scazute pentru Hb A2; daca exista
o neconcordanta intre rezultatul obtinut pentru HbA2 si suspiciunea clinica de
betatalasemie minor, pacientul va fi tratat cu fier, pana la normalizarea sideremiei, apoi se
va repeta electroforeza de hemoglobina3.

• Interferente analitice

In probele de sange care au depasit perioada de stabilitate se produce o degradare

progresiva a fractiunilor Hb ceea ce poate afecta profilul electroforetic2.

Bibliografie

1. Predescu C. Sindroamele talasemice. In Tratat de Medicina Interna, Hematologie, partea

I (Coordonator Dan

Colita). Ed. Med. Buc., 1997; 779-802.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type:
Catalog.

3. Bain B, J. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 20-25.

4. Glader B. Anemia: General Considerations. In Wintrobe`s Clinical Hematology. Lippincott

Williams & Wilkins,

Philadelphia, 11th edition, 2004, 962.

9/10
5. Thomas L. Hemoglopinopathies. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment
of Clinical Laboratory

Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 ed., 1998; 489-
493.

10/10