Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
format din hematii şi anticorpi antihematie (specifici). Astfel, dacă în serul unui bolnav se
caută anticorpi cu ajutorul unui antigen cunoscut, în cazul unui rezultat pozitiv C’ se va fixa pe
complexul Ag-Ac format, fără a produce modificări vizibile în tubul de reacţie. De aceea,
pentru evidenţierea fixării C´ se adaugă în reacţie complexul imun format din hematii şi
hemolizină (ser antihematii) - numit şi sistem indicator deoarece, dacă nu s-a format primul
complex (anticorpii lipsind din serul bolnavului) C´ se va fixa pe acest complex şi va produce
ruperea hematiilor (imunohemoliza = rezultat negativ). În cazul în care în serul cercetat există
anticorpi faţă de antigenul cunoscut introdus în reacţie nu se va produce hemoliza, C´ fiind
fixat pe acest complex (RFC = pozitiv).
Acest principiu este reprezentat în următoarea schemă:
RFC poate fi lucrat în tuburi sau pe plăci de material plastic cu godeuri. Există mai
multe tehnici pentru efectuarea reacţiei de fixare a complementului, din care se desprind două
metode mai importante: metoda clasică Wassemann, practicată în diagnosticul sifilisului,
brucelozei, tusei convulsive etc. şi metoda Bengston care titrează anticorpii fixatori de
complement pentru diagnosticul tifosului exantematic, rickettsiozelor, al ornitozei şi al
leptospirozei pe lângă diagnosticul serologic al unor viroze).
Schema
Eprubeta 1 2 3 (martor)
-ser de bolnav (ml) 0,1 0,2 0,2
-antigen B-W (ml) 0,3 0,3 --
-complement (ml) 0,3 0,3 0,3
-soluţie sal.fiziol. (ml) 0,8 0,7 1
Citirea se face urmărind apariţia hemolizei (rezultat negativ) sau lipsa ei (rezultat
pozitiv).
Interpretarea rezultatelor
Există o schemă de lucru standard în care se obţin prin diluţii succesive ale serului şi
după adăugarea tuturor componentelor: 100, 125, 166, 250, 333, 500, 625, 833, 1250, 2500
unităţi ASLO/ml.
Titrurile normale de antistreptolizină “O” ating valori până la 166-250 U/ml. Titrurile
peste această limită indică, în antecedentele recente ale pacientului, existenţa unei afecţiuni
streptococice sau poststreptococice: scarlatină, angină, glomerulonefrită, reumatism articular
acut. Aceste titruri crescute pot fi întâlnite şi la purtătorii de streptococ -hemolitic la nivel
amigdalian. Titrul ASLO creşte semnificativ în reumatismul articular acut (RAA), ajungând la
valori maxime între săptămâna a 3-a şi a 6-a de la debutul articular, dar rămâne crescut timp
de 6-12 luni după puseul reumatismal. Titrul ASLO poate fi la valori normale şi în anginele
streptococice dacă determinarea s-a făcut mai devreme de 15 zile de la debutul anginei.
1.6.5.1. Imunofluorescenţa
Metoda directă
Anticorpii monospecifici sunt conjugaţi cu substanţa fluorescentă. Materialul testat
pentru prezenţa antigenului se etalează pe lamă, după care se incubează cu anticorpii
marcaţi. Excesul de anticorpi se îndepărtează prin spălare, preparatul uscat fiind apoi
examinat la microscopul cu fluorescenţă, unde complexele Ag-Ac formate apar ca zone
fluorescente, uşor vizibile (fig. 48).
Fig. 48 – Imunofluorescenţa directă
Metoda indirectă
Este frecvent utilizată şi comportă doi timpi (fig. 49):
- preparatul care conţine antigen se incubează cu anticorpul specific, nemarcat;
- vizualizarea complexului imun format se face prin adăugarea unui indicator
fluorescent, care este serul antiimunoglobulină (corespunzător anticorpului adăugat
în reacţie) marcat.
Iniţial aplicată pentru testări de hormoni şi enzime, RIA s-a extins şi în diagnosticul
bolilor infecţioase, fiind una din cele mai sensibile şi precise metode de detectare şi dozare a
antigenelor şi anticorpilor, prin izotopi radioactivi ( 125I, 3H etc.).
Se practică fie marcarea unuia din reactanţi (antigenul sau anticorpul), fie marcarea
unui ser antiglobulinic care reacţionează cu complexul imun primar. Radioactivitatea
complexului format se măsoară fie în fază lichidă, fie în fază solidă şi este utilizată în principal
pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice, pentru evidenţierea
polizaharidului capsular la pneumococi etc.
În infecţiile virale cunoaşte de asemenea o largă aplicare în: diagnosticul gripei,
infecţiilor hepatice şi în diagnosticul hepatitelor cu virus B (AgHBs, anticorpi anti-HBs).
Succint, etapele unei dozări radioimunologice (fig.50) sunt următoarele:
- peste o cantitate de anticorp de testat, fixat pe un suport se adaugă o cantitate
variabilă de antigen;
- după o etapă de preincubare (şi apoi spălare) pentru formarea complexelor Ag-Ac,
se adaugă o cantitate fixă de anticorp marcat cu radioizotop – 125 I.
Fig. 50 – Principiul metodei în „fază dublă”
Bile din material plastic, acoperite cu anticorp antiHBs, sunt incubate cu eşantioane de
ser de testat. AgHBs, dacă este prezent, se fixează pe anticorp. Se adaugă anticorp antiHBs
marcat 125I, şi în timpul celei de-a doua incubări, aceasta se fixează pe AgHBs, formând
complexul anticorp-antigen-anticorp marcat radioactiv. După spălarea bilei, se măsoară
radioactivitatea, care este cu atât mai ridicată, cu cât cantitatea de AgHBs este mai mare.
Principiul. Antigenul sau anticorpul se cuplează cu o enzimă care are o mare afinitate,
rezultând atât activitatea imunologică cât şi cea enzimatică.
Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activităţii enzimatice faţă de un substrat
specific.
Tub nr. 1 2 3 4 5 6
Diluent (ml) 1,30 1,25 1,20 1,10 1,00 0,70
Ser bolnav dil. 1/40 (ml) 0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 0,80
Sistem hemolitic (ml) 1 1 1 1 1 1
Lizozimul, factor umoral bactericid din sânge, lichide biologice, mucus etc., acţionează
alături de polipeptidele bazice, proteazele lizozomale, interferoni, prin mecanisme neoxidative
asupra microorganismelor patogene.
Efectul lizozimului asupra peretelui bacterian, se poate evidenţia pe culturi de
Micrococcus lysodeikticus în medii lichide sau solide.
Tehnica mai frecvent utilizată este cea pe medii solide (fig. 54), în care se face o
suspensie de Micrococcus, având o densitate de 10 germeni/ml, în agar bacteriologic la pH
7,2 şi la o concentraţie de 2,5%. Suspensia se introduce în agar când acesta are o
temperatură de 45°C. Se toarnă în plăci Petri şi, după solidificare, se practică godeuri în
masa agarului. În patru din aceste godeuri se introduc următoarele concentraţii de lizozim
(soluţie martor, preparată extemporaneu): 25μg; 50μg; 100μg şi 200μg. Probele martor şi cele
de cercetat (ser sanguin, salivă etc.) se introduc în godeuri în cantităţi identice, astfel ca
lichidele să nu se răspândească în afara godeurilor. După 24 de ore se măsoară diametrele
de inhibiţie a soluţiilor martor şi se trasează curba standard (fig. 55) şi totodată diametrele de
inhibiţie ale probelor (unde se face media).
1.7.1.3. Fagocitoza
Evidenţierea fagocitozei
Coloidopexia
Este un test frecvent utilizat pentru a evidenţia activitatea enzimatică a fagocitelor, mai
ales a PMN, celule generatoare de peroxizi de hidrogen şi radicali activi ai oxigenului.
Principiul. Proprietatea fagocitelor de a îngloba colorantul în vacuole fagocitare, unde
sub influenţa unor nucleotid-oxidaze are loc reducerea acestora într-un precipitat insolubil de
formazan (albastru-negru), evidenţiabil prin coloraţia Giemsa.
Metoda cu sânge integral, se practică recoltând 1-2 ml sânge într-o sticluţă cu
anticoagulant (2 mg Na EDTA – uscat). Într-o eprubetă se amestecă:
- 0,08 ml soluţie tampon Michaelis pH 7,4;
- 0,02 ml soluţie NBT 1%;
- 0,1 ml sânge recoltat pe anticoagulant.
După incubarea amestecului la 37°C, timp de 30 de minute, se agită şi se fac frotiuri:
uscate, fixate cu alcool metilic şi colorate Giemsa.
Se examinează cel puţin 100 PMN şi se diferenţiază procentual celulele cu depozite de
formazan (NBT – pozitive).
La o persoană sănătoasă, fagocitele NBT-pozitive, reprezintă 7-14%. Odată cu
creşterea metabolismului oxidativ al neutrofilelor stimulate prin infecţii bacteriene, procentul
lor creşte mult. În infecţiile virale sau stări febrile de origine neinfecţioasă, valorile se menţin
în limite normale.
Chemiluminiscenţa
O metodă alternativă de apreciere a metabolismului oxidativ al PMN este cea prin care
se evidenţiază fenomenul de chemiluminiscenţă cu ajutorul unor aparate (chemiluminometre).
Radiaţiile luminoase (chemiluminiscenţa) generate în timpul fagocitozei sunt
amplificate prin utilizarea unei substanţe intermediare – luminol şi/sau lucigenină – care prin
oxidare emit unde luminoase şi acestea pot fi convertite de aparate, în semnale electrice,
măsurate în milivolţi.
Prin aceste metode de apreciere a activităţii PMN şi a capacităţii bactericide a acestor
celule se pot evidenţia deficienţele funcţionale ale fagocitelor, în principal deficitul activităţii
bactericide, care se traduce clinic prin infecţii repetate, rebele la tratament, care afectează
mai ales ţesuturile profunde, determinând modificări cu aspect de infiltrate granulocitare (boli
cronice granulomatoase).
Realizarea răspunsului imun celular are la bază eliberarea mai multor categorii de
factori solubili: limfokine, factori ajutători şi supresori, factori mitogeni, factori de transfer,
factorul de inhibare a migrării macrofagelor (MIF) şi mulţi alţii.
Pentru explorarea imunităţii celulare se folosesc atât teste „in vitro” cât şi „in vivo”.
Cunoscând procentul acestora în tabloul sanguin, se poate uşor calcula numărul absolut,
raportat la numărul total al leucocitelor/mm³.
Actual, identificarea şi evaluarea subpopulaţiilor limfocitare T, B şi a celulelor NK din
sângele periferic şi din ţesuturi, apelează la anticorpii monoclonali şi la metode de citometrie
în flux care pot identifica aceste celule pe baza markerilor şi a receptorilor specifici fiecărei
populaţii şi subpopulaţii limfocitare.
Fenotipizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor T şi B se poate face pe suspensii
unicelulare din sânge, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, faţă de markerii: CD 2, CD 3, CD
4, CD 19, CD 20 etc. Pentru celulele NK se testează markerii: CD 16 şi CD 56.
Cu ajutorul unei pipete Pasteur sau a unei pipete cu bulă (prelungită cu un tub de
cauciuc pentru a se putea urmări cu uşurinţă toate operaţiunile), se elimină stratul superior,
pentru „decopertarea” inelului limfocitar. Celulele care formează inelul alb sunt aspirate cu
ajutorul pipetei bine efilate şi introduse într-o eprubetă de centrifugă, care conţine mediu de
cultură pentru limfocite. Se vor spăla celulele de 3 ori, prin centrifugare (10 minute la 200
turaţii/s), în mediu de cultură, după ultima spălare aducându-se la concentraţia dorită. Prin
această metodă se obţine o populaţie celulară formată din aproximativ 90% limfocite şi
monocite, iar restul este format din trombocite şi rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate în scop de cercetare şi se referă la:
- separarea macrofagelor şi monocitelor prin aderarea la sticlă;
- separarea macrofagelor după fagocitarea fierului coloidal, cu ajutorul unui magnet;
- separarea prin fixarea liganzilor la receptorii de pe membrană ai limfocitelor, cu
formare de rozete,etc.
Pentru celulele din ţesuturi, mai ales cele limfatice, fenotipizarea se face cu ajutorul
anticorpilor monoclonali cuplaţi cu substanţe fluorescente, iar evidenţierea celulelor astfel
marcate se realizează prin citometrie în flux sau cu microscopul de fluorescenţă.
Prin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili atât proporţiile, cât şi numărul de
celule din sânge. Astfel au putut fi stabilite valorile normale ale unor markeri mai frecvent
cercetaţi, din care fac parte CD 2 şi CD 3 pentru limfocitele T totale (pan T); CD 4 pentru
limfocitele T-helper; CD 8 pentru limfocitele T-citotoxice/T-supresoare şi raportul CD 4:CD 8;
CD 19 şi CD 20 pentru limfocitele B totale; CD 16 şi CD 56 pentru celulele NK totale. Pentru
caracterizarea imunităţii celulare, evaluarea acestor subpopulaţii celulare majore are o
importanţă deosebită atât pentru diagnosticul, cât şi pentru prognosticul unor afecţiuni virale
sau maligne.
Principiul.
Limfocitele, monocitele şi macrofagele au receptori de membrană capabili să lege
specific diferite structuri care se găsesc fie pe membrana unor hematii, fie a unor bacterii.
Ataşarea hematiilor, prin liganzii lor, în jurul limfocitelor care posedă receptori pentru aceştia
iau forma unor rozete, de unde denumirea de “rozetare” dată procesului respectiv.
În funcţie de natura liganzilor, rozetele pot fi: E, EA, EAC, ES.
Rozetele E
Limfocitele T umane au capacitatea de a lega hematiile de oaie prin receptori “E”
formând “rozete E totale “, de mare sau mică afinitate.
În vederea obţinerii unor rezultate comparabile, Comisia Naţională de Imunologie a
precizat condiţiile standard de rozetare a limfocitului T uman cu hematiile de oaie.
Se lucrează pe sânge venos uman recoltat pe heparină (100 UI/ml sânge), urmată de
separarea limfocitelor pe amestec Ficoll-Odiston (3ml amestec şi 8ml sânge diluat ½ în TFS =
tampon fosfat salin), conform tehnicii descrise la 7.2.1.2.
Tehnica rozetării
Rozetarea se face în mediu IC, în tuburi de hemoliză cu diametrul de 10m, în duplicat.
Se introduc 50μl suspensie de limfocite umane şi 100μl suspensie hematii de oaie. Se
adaugă 100μl ser fetal de viţel inactivat şi adsorbit cu hematii. Centrifugare 5 minute la 100
turaţii, incubare 60 minute într-o baie de apă la 29 0C (pentru rozetele de mare afinitate) sau
16-24 ore la +40C (pentru rozetele totale).
Citirea şi interpretarea rezultatelor.
Se face o resuspendare blândă a suspensiei (prin aspirări uşoare cu o pipetă Pasteur
cu tetină). Suspendarea se întinde pe o lamă de microscop, se usucă rapid prin înclinare,
apoi fixare cu alcool metilic şi colorare cu Giemsa. Se citesc minimum 250 celule limfoide
rozetate şi nerozetate şi se calculează procentul de rozetare. Se consideră rozete numai
acelea care au minimum 3 eritrocite aşezate la un limfocit.
Se determină procentul de rozete totale (incubare la +4 0C), cel de mare afinitate
(incubare la 290C) şi cel de mică afinitate (prin scăderea din procentul de rozete totale a
procentului de rozete de mare afinitate).
La om, media valorilor normale este următoarea: rozete E totale (limfocite T totale) =
68 ± 2%, din care rozete E de mare afinitate = 43 ± 2% şi de mică afinitate = 25 ± 2%.
Rozetele EA
Limfocitele sau monocitele au receptori Fc care leagă imunoglobulinele IgG şi/sau IgM
(prin fragmentul lor Fc). Dacă imunoglobulina are funcţie de anticorp pentru hematia de oaie,
atunci se leagă prin fragmentul Fab de hematie şi prin fragmentul Fc de limfocit. Astfel se
formează rozete prin intermediul anticorpilor (rozete EA). Folosind eritrocite de bou şi ser
antieritrocite de bou, se pot identifica toate limfocitele cu receptori Fc.
Rozetele EAC
Limfocitele B, în principal, au receptori pentru fracţiunile
complementului, mai ales pentru C3b, astfel, eritrocite