Sunteți pe pagina 1din 16

fenomenul de imunohemoliză – utilizând deci un complex antigen-anticorp cunoscut,

format din hematii şi anticorpi antihematie (specifici). Astfel, dacă în serul unui bolnav se
caută anticorpi cu ajutorul unui antigen cunoscut, în cazul unui rezultat pozitiv C’ se va fixa pe
complexul Ag-Ac format, fără a produce modificări vizibile în tubul de reacţie. De aceea,
pentru evidenţierea fixării C´ se adaugă în reacţie complexul imun format din hematii şi
hemolizină (ser antihematii) - numit şi sistem indicator deoarece, dacă nu s-a format primul
complex (anticorpii lipsind din serul bolnavului) C´ se va fixa pe acest complex şi va produce
ruperea hematiilor (imunohemoliza = rezultat negativ). În cazul în care în serul cercetat există
anticorpi faţă de antigenul cunoscut introdus în reacţie nu se va produce hemoliza, C´ fiind
fixat pe acest complex (RFC = pozitiv).
Acest principiu este reprezentat în următoarea schemă:

Sistem Compleme Sistem Rezultat


de nt indicator
cerceta
t
Antigen x x hematii Lipsa hemolizei
x
Anticorp x x hemolizin RFC = pozitiv
ă
Antigen x hematii imunohemoliză
x
Anticorp x hemolizin RFC =negativ
ă

RFC poate fi lucrat în tuburi sau pe plăci de material plastic cu godeuri. Există mai
multe tehnici pentru efectuarea reacţiei de fixare a complementului, din care se desprind două
metode mai importante: metoda clasică Wassemann, practicată în diagnosticul sifilisului,
brucelozei, tusei convulsive etc. şi metoda Bengston care titrează anticorpii fixatori de
complement pentru diagnosticul tifosului exantematic, rickettsiozelor, al ornitozei şi al
leptospirozei pe lângă diagnosticul serologic al unor viroze).

Reacţia Bordet – Wassermann

Se lucrează în trei eprubete, cu două cantităţi diferite de ser de bolnav.

Schema

Eprubeta 1 2 3 (martor)
-ser de bolnav (ml) 0,1 0,2 0,2
-antigen B-W (ml) 0,3 0,3 --
-complement (ml) 0,3 0,3 0,3
-soluţie sal.fiziol. (ml) 0,8 0,7 1

Incubare 45 de minute la 37ºC


-sistem indicator
(hemolitic) (ml) 1,0 1,0 1,0

Incubare 30 min. la 37º C

Citirea se face urmărind apariţia hemolizei (rezultat negativ) sau lipsa ei (rezultat
pozitiv).

Tehnica Ida Bengston

Metoda Bengston, adoptată în ţara noastră pentru diagnosticul serologic, titrează


anticorpii fixatori de complement pentru diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, infecţiilor
cu chlamydii etc.
Tehnica Bengston, în care fiecare din componentele ce intră în reacţie este folosită în
volum de 0,2 ml, este aceeaşi pentru toate afecţiunile amintite diferind doar felul antigenului şi
modul de interpretare, de aceea se va descrie doar principiul reacţiei pentru diagnosticul
serologic al tifosului exantematic, al cărui factor etiologic îl constituie bacterii din grupul
Rickettsia.
Serul de cercetat recoltat de la bolnav trebuie să fie steril, limpede, fără hematii, se va
inactiva 30 de minute în baie de apă la 560C.

Antigenul rickettsian se va dilua conform indicaţiei de pe etichetă, astfel încât diluţia de


lucru să cuprindă 4 unităţi antigenice în cei 0,2 ml.
Hemolizina va fi întotdeauna titrată pentru fiecare reacţie astfel ca în 0,2 ml din
această diluţie să se afle 2 unităţi hemolitice.
Suspensia de hematii de berbec 2% proaspăt spălate.
Alexina (complementul) titrată în aceeaşi zi în prezenţa antigenului, este diluată astfel
încât 0,2 ml să conţină 2 unităţi alexice.
Pentru o primă comparaţie se recomandă folosirea unui set martor sigur pozitiv şi altul
sigur negativ.
Regulă. În toate cazurile reacţiile serologice se efectuează pe probe de ser sanguin
perechi. Astfel, de la fiecare bolnav se va recolta sânge în primele zile de boală (proba nr. 1),
se va separa serul şi se va ţine la -20ºC până în ziua prelucrării, iar după aproximativ 14 zile
se va recolta a doua probă de sânge. Cele două probe se vor lucra concomitent, urmărindu-
se creşterea în dinamică a titrului de anticorpi (putând fi utilizate reacţii serologice cu mai
multe tipuri de antigene bacteriene sau virale pe probele perechi de seruri).
Interpretare: creşterea titrului de anticorpi, de cel puţin patru ori, în proba a doua de ser
este semnificativă pentru diagnostic. Titrul reacţiei este dat de diluţia cea mai mare de ser de
bolnav unde se constată absenţa totală a hemolizei.

Particularităţi ale tehnicii RFC


În diagnosticul serologic al febrei Q antigenul reprezintă o suspensie purificată de
Coxiella burneti, cultivată pe sacul vitelin al embrionului de găină, suspensie din care se face
diluţie de lucru conform indicaţiei de pe etichetă.
În diagnosticul serologic al infecţiei cu Chlamydia antigenul este un extract purificat
obţinut dintr-o cultură de Chlamydia pe sacul vitelin al oului embrionat.
Pentru diagnosticul leptospirozei este necesar antigenul Leptospira biflexa – suspensie
concentrată preparată dintr-o tulpină nepatogenă de leptospira.
Tehnica Bradstreet şi Taylor, larg aplicată în ultimul timp în infecţiile virale, infecţii cu
Mycoplasma, febra Q etc. – ca metodă standard după tehnica “la rece”. Aceasta utilizează
titrarea complementului în prezenţa diluţiilor de hemolizină “în tablă de şah”. RFC este
efectuată în plăci sau microplăci cu godeuri.

1.6.4. Reacţia de neutralizare

Acest tip de reacţie se bazează pe proprietatea anticorpilor de a anihila (neutraliza)


efectele antigenelor toxice, litice, infectante prin combinarea Ag-Ac specifică, in vitro şi in vivo.
Astfel, în reacţiile de neutralizare Ag este reprezentat de toxine, enzime, virusuri pe care
anticorpii specifici le pot neutraliza. În laboratorul clinic, acest tip de reacţii se utilizează
pentru determinarea anticorpilor antistreptolizină “O” (reacţia ASLO), dar şi pentru
identificarea infecţiilor bacteriene sau virale.

1.6.4.1. Reacţia ASLO

Este o reacţie de neutralizare pentru determinarea antistreptolizinelor “O”, anticorpi


faţă de streptolizina “O” – antigen de virulenţă al streptococilor. Este reacţia serologică
frecvent folosită pentru diagnosticul retrospectiv al infecţiei streptococice cu streptococ -
hemolitic.
Principiul reacţiei. Serul de cercetat, în diluţii succesive, este tratat cu o cantitate
standard de streptolizină “O” (antigenul) şi după o scurtă incubare, necesară combinării
specifice, se repartizează suspensia de eritrocite ca mijloc revelator. În tuburile în care diluţiile
de ser conţin o cantitate suficientă de antistreptolizine “O” (anticorpi), efectul litic al
antigenului va fi inhibat, ceea ce se traduce prin lipsa hemolizei, iar în diluţiile de ser în care
anticorpii sunt insuficienţi pentru a putea neutraliza streptolizina, efectul litic al acesteia se
observă prin prezenţa hemolizei.

Interpretarea rezultatelor
Există o schemă de lucru standard în care se obţin prin diluţii succesive ale serului şi
după adăugarea tuturor componentelor: 100, 125, 166, 250, 333, 500, 625, 833, 1250, 2500
unităţi ASLO/ml.
Titrurile normale de antistreptolizină “O” ating valori până la 166-250 U/ml. Titrurile
peste această limită indică, în antecedentele recente ale pacientului, existenţa unei afecţiuni
streptococice sau poststreptococice: scarlatină, angină, glomerulonefrită, reumatism articular
acut. Aceste titruri crescute pot fi întâlnite şi la purtătorii de streptococ -hemolitic la nivel
amigdalian. Titrul ASLO creşte semnificativ în reumatismul articular acut (RAA), ajungând la
valori maxime între săptămâna a 3-a şi a 6-a de la debutul articular, dar rămâne crescut timp
de 6-12 luni după puseul reumatismal. Titrul ASLO poate fi la valori normale şi în anginele
streptococice dacă determinarea s-a făcut mai devreme de 15 zile de la debutul anginei.

1.6.4.2. Testarea stării de susceptibilitate – in vivo

Susceptibilitatea faţă de difterie (reacţia Schick) şi faţă de scarlatină (reacţie Dick) se


testează prin urmărirea neutralizării de către anticorpii specifici din sângele bolnavilor
(antitoxine) a unei doze cunoscute din toxina difterică, respectiv din toxina eritrogenă
streptococică, inoculate intradermic. Aceste reacţii vor fi descrise la capitolele care vor trata
diagnosticul în difterie şi respectiv în infecţiile streptococice.

1.6.5. Teste care utilizează vizualizarea complexelor


antigen-anticorp prin artificii tehnice

Sensibilitatea reacţiilor antigen-anticorp utilizate în diagnostic poate fi mărită legând de


anticorp, mai rar de antigen, un marker uşor de identificat, care să nu interfereze cu
proprietăţile imunologice ale reactanţilor. Acest marker poate fi:
- o substanţă fluorescentă (izotiocianat de fluoresceină, rhodamină etc.), în tehnica
de imunofluorescenţă;
- izotopi radioactivi (de obicei 125I), în metoda radioimunotestării (RIA);
- o enzimă (peroxidază, fosfatază alcalină), în testele imunoenzimatice.

1.6.5.1. Imunofluorescenţa

Prin cuplarea unei substanţe fluorescente cu anticorpii se obţin anticorpi fluorescenţi


care, fixându-se pe antigenul omolog, induc complexe imunofluorescente observabile prin
examinarea la microscopul cu fluorescenţă în lumina ultravioletă (UV).
Reacţia de imunofluorescenţă (IF) se poate efectua prin metoda directă sau indirectă.

Metoda directă
Anticorpii monospecifici sunt conjugaţi cu substanţa fluorescentă. Materialul testat
pentru prezenţa antigenului se etalează pe lamă, după care se incubează cu anticorpii
marcaţi. Excesul de anticorpi se îndepărtează prin spălare, preparatul uscat fiind apoi
examinat la microscopul cu fluorescenţă, unde complexele Ag-Ac formate apar ca zone
fluorescente, uşor vizibile (fig. 48).
Fig. 48 – Imunofluorescenţa directă

Metoda indirectă
Este frecvent utilizată şi comportă doi timpi (fig. 49):
- preparatul care conţine antigen se incubează cu anticorpul specific, nemarcat;
- vizualizarea complexului imun format se face prin adăugarea unui indicator
fluorescent, care este serul antiimunoglobulină (corespunzător anticorpului adăugat
în reacţie) marcat.

Fig. 49- Imunofluorescenţa indirectă

Imunofluorescenţa indirectă are o largă aplicare permiţând:


- evidenţierea antigenelor într-un produs, prin acţiunea succesivă a anticorpilor
specifici nemarcaţi, apoi a serului globulinic marcat;
- detectarea anticorpilor într-un ser necunoscut, utilizând antigene cunoscute şi ser
fluorescent antiglobulinic.

Imunofluorescenţa se aplică în bacteriologie pentru identificarea unor germeni


patogeni, de exemplu pentru E. coli serotipurile enteropatogene, Bordetella pertussis,
Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, ca şi a unor virusuri implicate în infecţii
respiratorii.
Probele care se testează prin imunofluorescenţă sunt de obicei exsudate sau raclate
de la nivelul unor leziuni cutanate sau din mucoase, ca şi probe bioptice, amprente din
ţesuturi, culturi de celule infectate, spută, aspirat bronşic, secreţii genitale etc.
Pentru depistarea de anticorpi, metodele imunofluorescente sunt utile în infecţii virale
sau în cele bacteriene cu Mycoplasma pneumoniae, Helycobacter pylori, Treponema
pallidum etc., dar şi în infecţiile parazitare (malarie, tripanosomiază, toxoplasmoză,
pneumocistoză etc.).

1.6.5.2. Radioimunotestarea (RIA)

Iniţial aplicată pentru testări de hormoni şi enzime, RIA s-a extins şi în diagnosticul
bolilor infecţioase, fiind una din cele mai sensibile şi precise metode de detectare şi dozare a
antigenelor şi anticorpilor, prin izotopi radioactivi ( 125I, 3H etc.).
Se practică fie marcarea unuia din reactanţi (antigenul sau anticorpul), fie marcarea
unui ser antiglobulinic care reacţionează cu complexul imun primar. Radioactivitatea
complexului format se măsoară fie în fază lichidă, fie în fază solidă şi este utilizată în principal
pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice, pentru evidenţierea
polizaharidului capsular la pneumococi etc.
În infecţiile virale cunoaşte de asemenea o largă aplicare în: diagnosticul gripei,
infecţiilor hepatice şi în diagnosticul hepatitelor cu virus B (AgHBs, anticorpi anti-HBs).
Succint, etapele unei dozări radioimunologice (fig.50) sunt următoarele:
- peste o cantitate de anticorp de testat, fixat pe un suport se adaugă o cantitate
variabilă de antigen;
- după o etapă de preincubare (şi apoi spălare) pentru formarea complexelor Ag-Ac,
se adaugă o cantitate fixă de anticorp marcat cu radioizotop – 125 I.
Fig. 50 – Principiul metodei în „fază dublă”

În acest sens, este ilustrată şi tehnica radioimunologică pentru detectarea antigenului


de suprafaţă al hepatitei B, AgHBs (fig.51), pentru care se foloseşte principiul „sandwich”, o
tehnică în fază solidă pentru măsurarea cantităţilor de AgHBs din ser sau plasmă.

Fig. 51 – Principiul tehnicii de detectare a AgHBs

Bile din material plastic, acoperite cu anticorp antiHBs, sunt incubate cu eşantioane de
ser de testat. AgHBs, dacă este prezent, se fixează pe anticorp. Se adaugă anticorp antiHBs
marcat 125I, şi în timpul celei de-a doua incubări, aceasta se fixează pe AgHBs, formând
complexul anticorp-antigen-anticorp marcat radioactiv. După spălarea bilei, se măsoară
radioactivitatea, care este cu atât mai ridicată, cu cât cantitatea de AgHBs este mai mare.

1.6.5.3. Teste imunoenzimatice

Principiul. Antigenul sau anticorpul se cuplează cu o enzimă care are o mare afinitate,
rezultând atât activitatea imunologică cât şi cea enzimatică.
Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activităţii enzimatice faţă de un substrat
specific.

Testul ELISA (enzime-linked-immuno-sorbent-assay)

Se cunosc diverse tehnici imunoenzimatice, dintre care în diagnosticul bolilor


infecţioase se aplică preferenţial testul ELISA cu diferite variante:
- tehnica directă pentru determinarea antigenelor (fig.52);
- tehnica dublu sandwich pentru determinarea antigenelor sau anticorpilor (fig.53).

Fig. 52 – ELISA directă. AB – anticorpul specific antigenului din proba de cercetat; A –


antigenul de determinat; AB-E – conjugat anticorp specific antigenului A, cu enzima (E)
Fig. 53 – ELISA dublu „sandwich”. AB – anticorpul specific antigenului din proba de cercetat; A
– antigenul din probă; AB1 – anticorp specific antigenului; AB2-E – conjugat antiimunoglobulină
AB1, cu enzima (E)

Succesiunea etapelor pentru efectuarea testului ELISA este:


- alegerea unui suport solid convenabil;
- imobilizarea antigenului sau anticorpului pe acest suport;
- legarea prin reacţie imunospecifică a anticorpului sau antigenului din proba de testat
pe antigenul şi respectiv anticorpul imobilizat pe suportul solid;
- legarea prin reacţie specifică antigen-anticorp a reactantului marcat enzimatic, de
complexul format anterior, şi fixat pe suport;
- adăugarea în final, a substratului specific enzimei folosite drept marker, producându-
se o reacţie de culoare a enzimei cu substratul, aceasta fiind citită colorimetric.
ELISA se utilizează:
- pentru detectări de antigene bacteriene sau virale, pentru evidenţierea toxinelor:
toxina difterică, toxinele bacteriilor din speciile E. coli toxigene, toxinele stafilococice;
detectarea brucelelor, treponemelor, rickettsiilor etc.;
- pentru detectări de anticorpi antibacterieni (în salmoneloze, bruceloze, rickettsioze
etc.) sau antivirali;
- pentru identificarea şi determinarea cantitativă a anticorpilor antinucleari, antiADN,
complexelor imune circulante şi urmăririi tratamentului în boli cu componentă
autoimună.

1.7. TESTAREA REZISTENŢEI NATURALE


ANTIINFECŢIOASE

Apărarea faţă de infecţie se realizează prin:


- mecanisme nespecifice de rezistenţă naturală ca: barierele cutanate şi mucoase,
factorii umorali, tisulari şi celulari, microbiocenozele, febra, fagocitoza şi inflamaţia;
- mecanisme imunitare specifice: umorale (prin anticorpi) şi celulare (prin limfocite,
celule citotoxice şi citokine).
Aria de investigaţii a acestor parametri este tot mai largă, interesând atât statusul
normal, cât mai ales, definirea stărilor patologice.

1.7.1. Teste de apreciere a rezistenţei naturale

1.7.1.1. Determinarea cantitativă a complementului seric

Dozarea C’ se bazează pe proprietatea acestuia de a hemoliza eritrocitele sensibilizate


(eritrocite învelite cu anticorpi specifici). În laborator, folosim eritrocite de berbec sensibilizate
cu ser hemolitic (ser antieritrocite de berbec).
Multiplele implicaţii ale sistemului C şi ale componentelor sale în rezistenţa naturală a
organismului uman, cât şi în reacţiile biologice favorabile sau nefavorabile, au dus la
introducerea unor tehnici de laborator care să determine valoarea C’ total şi a C3 în serul
sanguin.
Ca punct final al reacţiei se ia hemoliza 50%, pentru că aceasta dă o precizie mult mai
mare dozării complexului decât hemoliza 100%.
Reacţia necesită prepararea reactivilor după reguli stricte. Acestea sunt:
- diluentul – tampon la pH 7,3 diluat 1:5 cu apă distilată;
- eritrocitele de berbec – recoltate pe soluţie Alsever, spălate cu ser fiziologic, se
suspendă 1:60 în ser fiziologic;
- serul hemolitic – într-o diluţie stoc 1:50, se pregăteşte înainte de utilizare;
- sistemul hemolitic – rezultă din amestecul în părţi egale a suspensiei de eritrocite şi
ser hemolitic;
- serul de bolnav – în care se face dozarea complementului, se va recolta proaspăt.
Reacţia
Pentru fiecare ser studiat, se pipetează în câte 6 tuburi, diluent, ser de bolnav şi sistem
hemolitic, după următoarea schemă:

Tub nr. 1 2 3 4 5 6
Diluent (ml) 1,30 1,25 1,20 1,10 1,00 0,70
Ser bolnav dil. 1/40 (ml) 0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 0,80
Sistem hemolitic (ml) 1 1 1 1 1 1

Volumul total de reacţie = 2,5 ml

Incubarea la termostat 37°C, timp de 30 de minute.


Centrifugare la 3000 ture, timp de 3 minute.
Citire la fotometru faţă de un martor de hemoliză 100% (2,5 ml apă amoniacală 0,4% +
1 ml sistem hemolitic). Se măsoară extincţia probelor, apoi se face un calcul pentru
transformarea în procente şi stabilirea hemolizei 50%.
Se poate aplica şi o procedură directă, prin care se determină direct procentul de
hemoliză în tubul de reacţie, prin comparare cu o scară de hemoliză, cuprinsă între 10% şi
90%.
Dozarea complementului seric, aduce informaţii importante în boli renale, boli hepatice,
colagenoze şi boli alergice. Astfel, scade în glomerulonefrita acută, în lupusul eritematos şi în
ciroza hepatică, şi creşte în unele infecţii şi boli neoplazice.

1.7.1.2. Testarea lizozimului

Lizozimul, factor umoral bactericid din sânge, lichide biologice, mucus etc., acţionează
alături de polipeptidele bazice, proteazele lizozomale, interferoni, prin mecanisme neoxidative
asupra microorganismelor patogene.
Efectul lizozimului asupra peretelui bacterian, se poate evidenţia pe culturi de
Micrococcus lysodeikticus în medii lichide sau solide.
Tehnica mai frecvent utilizată este cea pe medii solide (fig. 54), în care se face o
suspensie de Micrococcus, având o densitate de 10 germeni/ml, în agar bacteriologic la pH
7,2 şi la o concentraţie de 2,5%. Suspensia se introduce în agar când acesta are o
temperatură de 45°C. Se toarnă în plăci Petri şi, după solidificare, se practică godeuri în
masa agarului. În patru din aceste godeuri se introduc următoarele concentraţii de lizozim
(soluţie martor, preparată extemporaneu): 25μg; 50μg; 100μg şi 200μg. Probele martor şi cele
de cercetat (ser sanguin, salivă etc.) se introduc în godeuri în cantităţi identice, astfel ca
lichidele să nu se răspândească în afara godeurilor. După 24 de ore se măsoară diametrele
de inhibiţie a soluţiilor martor şi se trasează curba standard (fig. 55) şi totodată diametrele de
inhibiţie ale probelor (unde se face media).

Fig. 54 – Metoda de determinare cantitativă a lizozimului în placa Petri, în funcţie de diametrul


de liză bacteriană (din colecţia autorului).
25, 50, 100, 200 = concentraţiile de lizozim standard introduse în godeuri.
a şi b = probele de cercetat.

Concentraţiile lizozimului în lichidele biologice, se exprimă conform curbei standard,


în μg/ml. Alături de reacţia de fixare a complementului (vezi cap. 1.6.3.3), această tehnică
poate fi utilizată fie pentru identificarea antigenelor specifice de grup, fie pentru
serodiagnosticul unor infecţii respiratorii acute (pneumonii, gripă), a rickettsiozelor sau
leptospirozelor.

1.7.1.3. Fagocitoza

Evidenţierea fagocitozei

Fagocitoza este definită ca proprietatea unor celule de a îngloba şi digera particule


străine (fagein = a mânca) sau macromolecule (pinocin = a bea). Deoarece endocitoza
(înglobarea în celula fagocitară) nu este urmată obligatoriu de omorârea şi digerarea
bacteriilor, în testele de laborator se urmăresc separat cele două procese.
Sunt preferate testele in vivo, deoarece: permit folosirea unor populaţii omogene de
celule fagocitare (polimorfonucleare, macrofage); este eliminată intervenţia în procesul
fagocitar a unor alţi factori (serici) şi se poate studia separat înglobarea şi efectul bacteriilor
intracelular.
Fig. 55 – Reprezentarea grafică a concentraţiei de lizozim standard

In vitro, pentru determinarea procentului de fagocite care au înglobat bacterii, se pune


în contact suspensia de PMN cu o suspensie de cultură bacteriană, în mai multe eprubete.
După incubarea acestui amestec la 37°C, la diferite intervale de timp (15, 30, 60, 120 minute),
se fac frotiuri care se colorează cu coloraţia Giemsa şi se examinează la microscop, notând:
- numărul mediu de microorganisme înglobate pe fagocit;
- procentul de fagocite care au înglobat bacterii.
În vederea cunoaşterii capacităţii de distrugere intracelulară a microorganismelor în
procesul de fagocitoză, se determină numărul de bacterii viabile intracelulare.
Pentru aceasta, după incubarea amestecului de celule fagocitare şi microorganisme
timp de 15 minute la 37°C (perioadă în care are loc înglobarea), se opreşte fagocitoza prin
plasarea eprubetelor la gheaţă. După o uşoară centrifugare timp de 4 minute, fagocitele
sedimentare se spală în soluţie Hanks, şi se incubează la 37°C. După fiecare 15, 30, 60, 120
minute, se ia 0,5 ml din suspensie şi se amestecă cu 0,5 ml soluţie Hanks. După o nouă
centrifugare, se elimină supernatantul şi se lizează fagocitele cu apă distilată sterilă, de la
gheaţă, care conţine şi albumină bovină. Determinarea numărului de bacterii viabile se face
prin cultivarea pe medii de cultură adecvate. Datele statistice arată că neutrofilele ucid în 60
minute 95,8% din stafilococii albi şi 86% din stafilococii aurei hemolitici.
Pentru aprecierea indicelui fagocitar (numărul mediu de particule fagocitate de un
granulocit sau monocit) se pot aplica metode cantitative, mai obiective şi mai rapide, cum
este utilizarea unor particule colorate, ca de exemplu, picăturile de ulei O roşu, acoperite cu
LPS (lipopolizaharide bacteriene), care face posibilă determinarea spectrofotometrică a
fagocitozei. Alte metode se bazează pe marcarea bacteriilor cu izotopi radioactivi sau pe
citometria în flux (când bacteriile sunt marcate cu fluorocromi).

Coloidopexia

Microorganismele sau diferite particule inerte inoculate intravenos la animalele de


laborator (şoareci, cobai), sunt uşor fagocitate de către fagocitele circulante sau fixe.
Experienţele mai frecvent făcute au fost cele cu tuş de China. După diferite intervale de timp
(30, 60, 120 minute), sacrificarea animalului şi efectuarea de secţiuni histologice, au
demonstrat care sunt organele mai bogate în macrofage (ganglionii limfatici, splina, ficatul
etc.), cuprinse în sistemul mononuclear fagocitar.

Testul NBT (Nitrobluetetrazolium)

Este un test frecvent utilizat pentru a evidenţia activitatea enzimatică a fagocitelor, mai
ales a PMN, celule generatoare de peroxizi de hidrogen şi radicali activi ai oxigenului.
Principiul. Proprietatea fagocitelor de a îngloba colorantul în vacuole fagocitare, unde
sub influenţa unor nucleotid-oxidaze are loc reducerea acestora într-un precipitat insolubil de
formazan (albastru-negru), evidenţiabil prin coloraţia Giemsa.
Metoda cu sânge integral, se practică recoltând 1-2 ml sânge într-o sticluţă cu
anticoagulant (2 mg Na EDTA – uscat). Într-o eprubetă se amestecă:
- 0,08 ml soluţie tampon Michaelis pH 7,4;
- 0,02 ml soluţie NBT 1%;
- 0,1 ml sânge recoltat pe anticoagulant.
După incubarea amestecului la 37°C, timp de 30 de minute, se agită şi se fac frotiuri:
uscate, fixate cu alcool metilic şi colorate Giemsa.
Se examinează cel puţin 100 PMN şi se diferenţiază procentual celulele cu depozite de
formazan (NBT – pozitive).
La o persoană sănătoasă, fagocitele NBT-pozitive, reprezintă 7-14%. Odată cu
creşterea metabolismului oxidativ al neutrofilelor stimulate prin infecţii bacteriene, procentul
lor creşte mult. În infecţiile virale sau stări febrile de origine neinfecţioasă, valorile se menţin
în limite normale.

Chemiluminiscenţa

O metodă alternativă de apreciere a metabolismului oxidativ al PMN este cea prin care
se evidenţiază fenomenul de chemiluminiscenţă cu ajutorul unor aparate (chemiluminometre).
Radiaţiile luminoase (chemiluminiscenţa) generate în timpul fagocitozei sunt
amplificate prin utilizarea unei substanţe intermediare – luminol şi/sau lucigenină – care prin
oxidare emit unde luminoase şi acestea pot fi convertite de aparate, în semnale electrice,
măsurate în milivolţi.
Prin aceste metode de apreciere a activităţii PMN şi a capacităţii bactericide a acestor
celule se pot evidenţia deficienţele funcţionale ale fagocitelor, în principal deficitul activităţii
bactericide, care se traduce clinic prin infecţii repetate, rebele la tratament, care afectează
mai ales ţesuturile profunde, determinând modificări cu aspect de infiltrate granulocitare (boli
cronice granulomatoase).

1.7.2. Teste de imunitate celulară

Realizarea răspunsului imun celular are la bază eliberarea mai multor categorii de
factori solubili: limfokine, factori ajutători şi supresori, factori mitogeni, factori de transfer,
factorul de inhibare a migrării macrofagelor (MIF) şi mulţi alţii.
Pentru explorarea imunităţii celulare se folosesc atât teste „in vitro” cât şi „in vivo”.

1.7.2.1. Explorarea imunităţii celulare in vitro


Există mai multe metode experimentale care utilizează limfocite din sânge.

Evaluarea numărului absolut al limfocitelor şi monocitelor

Normal, numărul absolut al limfocitelor sanguine este de 1500-3000/mm³, iar al


monocitelor (macrofage tinere) de 300-600/mm³.

Cunoscând procentul acestora în tabloul sanguin, se poate uşor calcula numărul absolut,
raportat la numărul total al leucocitelor/mm³.
Actual, identificarea şi evaluarea subpopulaţiilor limfocitare T, B şi a celulelor NK din
sângele periferic şi din ţesuturi, apelează la anticorpii monoclonali şi la metode de citometrie
în flux care pot identifica aceste celule pe baza markerilor şi a receptorilor specifici fiecărei
populaţii şi subpopulaţii limfocitare.
Fenotipizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor T şi B se poate face pe suspensii
unicelulare din sânge, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, faţă de markerii: CD 2, CD 3, CD
4, CD 19, CD 20 etc. Pentru celulele NK se testează markerii: CD 16 şi CD 56.

Metodele de separare a limfocitelor şi macrofagelor

Pentru cercetarea in vitro a unor mecanisme care intervin în cooperarea celulară şi


reglarea răspunsului imun este necesară obţinerea claselor şi subclaselor de celule. Pentru
acest scop, au fost imaginate diverse metode de separare a celulelor, dintre care se desprind:

- tehnicile de separare a celulelor bazate pe diferenţe de sedimentare;


- separarea celulelor pe baza unor atribute biologice particulare;
- metode de separare pe baza unor receptori de membrană şi a moleculelor marker
specifice subpopulaţiilor limfocitare şi altor celule cu rol în răspunsul imun.
Tehnicile de separare prin centrifugare în medii cu diferite densităţi (gradient de
densitate), folosesc substanţe care cresc rata de sedimentare a eritrocitelor: Dextran, Ficoll-
Odiston etc.

Separarea de Ficoll-Metrizoat (Odiston), se face prin centrifugare, în care se introduc:


o parte din sângele recoltat pe anticoagulant şi două părţi Ficoll-Metrizoat (fig. 56).
Centrifugarea timp de 20 de minute la 400 turaţii, duce la separarea a patru straturi principale,
precis delimitate:

a- mediu de cultură şi plasmă sanguină;


b- strat de forma unui inel alb, format din limfocite şi monocite;
c- stratul de Ficoll-Metrizoat;
d- sedimentul de hematii şi celule moarte.
Fig. 56 – Aspectul coloanei înainte şi după centrifugare: 1 – înainte de centrifugare sunt două
straturi: unul superior (S), reprezentat de sângele diluat în mediu, şi altul inferior (I), format de
către soluţia de Ficoll-Metrizoat; 2 – după centrifugare apar cel puţin 4 straturi: a- stratul
superior (mediu şi plasmă sanguină); b- stratul sub formă de inel cu limfocite şi monocite; c-
soluţia sub formă de Ficoll-Metrizoat; d- sedimentul de hematii şi celule moarte.

Cu ajutorul unei pipete Pasteur sau a unei pipete cu bulă (prelungită cu un tub de
cauciuc pentru a se putea urmări cu uşurinţă toate operaţiunile), se elimină stratul superior,
pentru „decopertarea” inelului limfocitar. Celulele care formează inelul alb sunt aspirate cu
ajutorul pipetei bine efilate şi introduse într-o eprubetă de centrifugă, care conţine mediu de
cultură pentru limfocite. Se vor spăla celulele de 3 ori, prin centrifugare (10 minute la 200
turaţii/s), în mediu de cultură, după ultima spălare aducându-se la concentraţia dorită. Prin
această metodă se obţine o populaţie celulară formată din aproximativ 90% limfocite şi
monocite, iar restul este format din trombocite şi rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate în scop de cercetare şi se referă la:
- separarea macrofagelor şi monocitelor prin aderarea la sticlă;
- separarea macrofagelor după fagocitarea fierului coloidal, cu ajutorul unui magnet;
- separarea prin fixarea liganzilor la receptorii de pe membrană ai limfocitelor, cu
formare de rozete,etc.
Pentru celulele din ţesuturi, mai ales cele limfatice, fenotipizarea se face cu ajutorul
anticorpilor monoclonali cuplaţi cu substanţe fluorescente, iar evidenţierea celulelor astfel
marcate se realizează prin citometrie în flux sau cu microscopul de fluorescenţă.
Prin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili atât proporţiile, cât şi numărul de
celule din sânge. Astfel au putut fi stabilite valorile normale ale unor markeri mai frecvent
cercetaţi, din care fac parte CD 2 şi CD 3 pentru limfocitele T totale (pan T); CD 4 pentru
limfocitele T-helper; CD 8 pentru limfocitele T-citotoxice/T-supresoare şi raportul CD 4:CD 8;
CD 19 şi CD 20 pentru limfocitele B totale; CD 16 şi CD 56 pentru celulele NK totale. Pentru
caracterizarea imunităţii celulare, evaluarea acestor subpopulaţii celulare majore are o
importanţă deosebită atât pentru diagnosticul, cât şi pentru prognosticul unor afecţiuni virale
sau maligne.

Teste cu formare de rozete

Principiul.
Limfocitele, monocitele şi macrofagele au receptori de membrană capabili să lege
specific diferite structuri care se găsesc fie pe membrana unor hematii, fie a unor bacterii.
Ataşarea hematiilor, prin liganzii lor, în jurul limfocitelor care posedă receptori pentru aceştia
iau forma unor rozete, de unde denumirea de “rozetare” dată procesului respectiv.
În funcţie de natura liganzilor, rozetele pot fi: E, EA, EAC, ES.
Rozetele E
Limfocitele T umane au capacitatea de a lega hematiile de oaie prin receptori “E”
formând “rozete E totale “, de mare sau mică afinitate.
În vederea obţinerii unor rezultate comparabile, Comisia Naţională de Imunologie a
precizat condiţiile standard de rozetare a limfocitului T uman cu hematiile de oaie.
Se lucrează pe sânge venos uman recoltat pe heparină (100 UI/ml sânge), urmată de
separarea limfocitelor pe amestec Ficoll-Odiston (3ml amestec şi 8ml sânge diluat ½ în TFS =
tampon fosfat salin), conform tehnicii descrise la 7.2.1.2.
Tehnica rozetării
Rozetarea se face în mediu IC, în tuburi de hemoliză cu diametrul de 10m, în duplicat.
Se introduc 50μl suspensie de limfocite umane şi 100μl suspensie hematii de oaie. Se
adaugă 100μl ser fetal de viţel inactivat şi adsorbit cu hematii. Centrifugare 5 minute la 100
turaţii, incubare 60 minute într-o baie de apă la 29 0C (pentru rozetele de mare afinitate) sau
16-24 ore la +40C (pentru rozetele totale).
Citirea şi interpretarea rezultatelor.
Se face o resuspendare blândă a suspensiei (prin aspirări uşoare cu o pipetă Pasteur
cu tetină). Suspendarea se întinde pe o lamă de microscop, se usucă rapid prin înclinare,
apoi fixare cu alcool metilic şi colorare cu Giemsa. Se citesc minimum 250 celule limfoide
rozetate şi nerozetate şi se calculează procentul de rozetare. Se consideră rozete numai
acelea care au minimum 3 eritrocite aşezate la un limfocit.
Se determină procentul de rozete totale (incubare la +4 0C), cel de mare afinitate
(incubare la 290C) şi cel de mică afinitate (prin scăderea din procentul de rozete totale a
procentului de rozete de mare afinitate).
La om, media valorilor normale este următoarea: rozete E totale (limfocite T totale) =
68 ± 2%, din care rozete E de mare afinitate = 43 ± 2% şi de mică afinitate = 25 ± 2%.

Rozetele EA
Limfocitele sau monocitele au receptori Fc care leagă imunoglobulinele IgG şi/sau IgM
(prin fragmentul lor Fc). Dacă imunoglobulina are funcţie de anticorp pentru hematia de oaie,
atunci se leagă prin fragmentul Fab de hematie şi prin fragmentul Fc de limfocit. Astfel se
formează rozete prin intermediul anticorpilor (rozete EA). Folosind eritrocite de bou şi ser
antieritrocite de bou, se pot identifica toate limfocitele cu receptori Fc.

Rozetele EAC
Limfocitele B, în principal, au receptori pentru fracţiunile
complementului, mai ales pentru C3b, astfel, eritrocite