METODA SPECTROFOTOMETRICĂ DE ANALIZĂ

Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu măsurarea cantitativă a proprietăților

de reflexie sau de transmisie ale unui material (substanță) în funcție de lungimea de undă. Termenul de
spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care este utilizată radiația electromagnetică din spectrul
infraroșu (IR), vizibil (VIS) și ultraviolet (UV), ea făcând astfel parte din spectroscopia electromagnetică.

În practică, metoda se bazează pe proprietatea de absorbție sau de transmisie a compușilor chimici la

diverse lungimi de undă. Astfel, spectrofotometria este folosită atât ca metodă calitativă pentru
identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție, cât și cantitativă pentru identificarea concentrației
unei substanțe dintr-o soluție. De asemenea, metoda poate fi utilizată pentru determinarea constantei de
echilibru a unei soluții.

Într-o reacție chimică, echilibrul chimic este starea în care ambii reactanți și produși sunt prezenți în
concentrații care nu mai manifestă tendința de modificare în timp. De obicei, această stare se atinge când
reacția directă are loc cu aceeași rată ca și reacția inversă. Ratele de conversie a reacției directe și a celei
inverse sunt diferite de zero dar, fiind egale, nu există modificări nete ale concentrațiilor reactantului și
produsului. Acest proces se numește echilibru dinamic. Din punct de vedere spectrofotometric,
determinarea concentrațiilor reactanților și produșilor într-o astfel de situație, presupune măsurarea
luminii transmise de către soluție.

Orice compus chimic absoarbe, transmite sau reflectă lumină (radiație electromagnetică) în cadrul unui
interval de lungimi de undă. Aparatele destinate acestor măsurători se numesc spectrofotometre.
Spectrofotometrul este un instrument capabil să măsoare cu precizie cantitatea de fotoni (intensitatea
luminii) absorbită de trecerea lor printr-o probă (soluție). Astfel, se poate determina indirect și cantitatea
de substanță (concentrația). În funcție de spectrul lungimilor de undă pe care le emite sursa de lumină,
spectrofotometria are două variante:

- UV/VIS utilizează lungimi de undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400 – 750 nm (VIS).
- IR utilizează lungimi de undă cuprinse între 750 nm – 1000 µm.

Spectrofotometria UV/VIS este utilizată cel mai frecvent în chimia analitică pentru determinarea
cantitativă:

- A soluțiilor ce conțin cationi ai metalelor tranziționale, majoritatea fiind colorate (absorb radiații
electromagnetice din spectrul vizibil) datorită electronilor de pe orbitalii de tip d care pot fi ușor
excitați fiind astfel determinați să execută tranziții cuantice. Culoarea soluțiilor ce conțin astfel de
cationi poate fi însă afectată de prezența unor anioni sau liganzi1. De ex. soluția de CuSO4 de
culoare albastră deschis poate fi intensificată cu ajutorul amoniacului care poate să schimbe
maximul de absorbție.
- A compușilor organici, în special aceia care manifestă un înalt grad de conjugare (sisteme cu orbitali
p în care alternează legături simple cu cele multiple și care, în general, scad energia totală a
moleculei, crescându-i astfel stabilitatea). De ex. ADN, ARN și proteinele absorb radiația
electromagnetică mai ales din spectrul UV și foarte rar din cel vizibil. Pentru aceste determinări, ca
solvent, se folosește de cele mai multe ori etanolul pentru că absoarbe mult mai puțin decât apa în

1
În chimia coordinativă, ligandul este reprezentat de un ion sau o moleculă (grup funcțional) care se leagă la un atom
metalic central formând astfel un complex coordinativ. Legătura dintre metal și ligand, de regulă, implică cedarea
formală a uneia sau a mai multor perechi de electroni ai ligandului. De aceea, natura legăturii ligand-metal tranzițional
poate să varieze între o covalență și o legătură ionică.

1
 aproape toate lungimile de undă. În cazul acestor determinări, mai trebuie ținut cont de polaritatea
solventului și de pH, acestea putând afecta absorbția radiației electromagnetice caracteristice unui
anumit compus organic.
- A complexelor de tip donor-acceptor de electroni2 care sunt colorate suficient de intens pentru a
putea fi astfel identificate cantitativ.

Spectrofotometria IR se bazează pe absorbția lungimilor de undă din intervalul infraroșu, absorbția

făcându-se în concordanță cu caracteristicile structurii chimice. În acest caz absorbția radiației are loc la
frecvențele de rezonanță, cele care se potrivesc cu energia de tranziție a unei legături sau a vibrației unui
grup din cadrul unei molecule. În general o moleculă cu n atomi are 3n-6 moduri normale de vibrație3. O
moleculă liniară are 3n-5 moduri normale deoarece rotirea în jurul axei sale moleculare nu poate fi
detectată. Din considerentele menționate, spectrofotometria IR se împarte în trei variante.

- 800 – 2500 nm (IR apropiat, NIR near-infrared). În acest caz, radiațiile electromagnetice pot induce
excitații sub formă de vibrații armonice4 sau nuanțate și astfel se pot face măsurători cantitative ale
unor grupuri funcționale organice, în special O-H, N-H și C=O.
- 2500 nm – 25 µm (IR de mijloc, mid-infrared). În acest caz, tehnica permite studierea vibrațiilor
fundamentale și a rotațiilor-vibrațiilor asociate acestor structuri. Aceste analize fiind reunite sub
termenul generic de spectroscopie de vibrație vizează identificarea unor molecule organice sau
organometalice.
- 25 µm – 1000 µm. Aceste radiații electromagnetice sunt folosite în cadrul spectroscopiei de rotație,
acest lucru putând să implice întreaga moleculă.

Spectrofotometria în IR este pretențioasă și dificilă deoarece, practic, aproape orice obiect emite în spectrul
IR sub formă de radiație termică, iar cuvele trebuie să fie fabricate din săruri care nu absorb foarte mult în
acest domeniu.

Principiul metodei

În spectrofotometria VIS, absorbția sau transmisia unei anumite substanțe poate fi determinată prin
observarea culorii. O probă care absoarbe toate lungimile de undă din spectrul vizibil apare de culoare
neagră, sau dacă le transmite pe toate în egală măsură apare de culoare albă. Dacă soluția absoarbe lumină
roșie (aprox. 700nm) apare de culoare verde (culoarea complementară).

În practică spectrofotometrul VIS este compus dintr-o sursă de lumină ce emite în spectrul vizibil, un sistem
de lentile cu rol de colimator optic, un monocromator, o cuvă în care este pusă proba de analizat și un
detector fotoelectric (vezi fig.)

2
Un complex donor-acceptor de electroni reprezintă o asociere de molecule sau a unor părți diferite ale unei
molecule foarte mari în care o parte a sarcinii electrice este transferată între entitățile moleculare, iar atracția
electrostatică rezultată se manifestă ca o forță stabilizatoare pentru complexul molecular.
3
Prin modul normal de vibrație a unui sistem oscilant se înțelege un mod de mișcare în care toate părțile sistemului se
mișcă sinusoidal cu aceeași frecvență având între ele o relație în fază fixă. Mișcarea descrisă de modul normal se
numește rezonanță.
4
Armonica unei unde reprezintă o frecvență din componența unui semnal care este un multiplu întreg al frecvenței
fundamentale. Frecvența fundamentală sau fundamentala este definită ca cea mai joasă frecvență a unei forme de
undă periodică. De ex. dacă frecvența fundamentală este f armonicele vor avea frecvențele 2f, 3f, 4f etc. Astfel, toate
armonicele au proprietatea de a fi periodice la frecvența fundamentală, prin urmare, suma armonicelor este și ea
periodică la acea frecvență. Frecvențele armonice sunt egal delimitate de lungimea frecvenței fundamentale și pot fi
găsite prin adăugarea repetată a acestei frecvențe.

2
Principiul spectrofotometriei UV/VIS se bazează pe legea Lambert-Beer. Această lege prevede că cantitatea
de lumină absorbită de o soluție este expresia unei funcții exponențiale a concentrației și a lungimii de
undă în raport cu acea soluție.

Calibrarea metodei pentru o anumită substanță implică două etape distincte:

1. Se determină maximul de absorbție al substanței respective făcând un scanning a lungimilor de

undă în concordanță cu culoarea acesteia. Dacă substanța este incoloră, se identifică o reacție de
culoare specifică acesteia și se analizează produsul colorat.
2. Se determină relația dintre concentrația substanței luată în analiză (sau a produsului rezultat dacă e
vorba de o reacție de culoare) și absorbție. Această determinare se face la lungimea de undă ce
corespunde maximului de absorbție determinat la etapa 1.

OBSERVAȚII

Identificarea lungimii de undă ce manifestă absorbție maximă trebuie realizată pe o probă a cărei
concentrație nu determină la această lungime de undă o absorbție mai mare de 1.

Valorile convenabile pentru absorbție sunt situate între 0,1 și 1. Peste această valoare efectul de umbrire al
particulelor poate modifica corectitudinea rezultatelor. Această situație implică concentrații prea mari în
care particulele componente ale soluției, fiind prea apropiate, se pot afla una în spatele celeilalte și nu
contribuie la absorbție. De aceea, pentru o substanță oarecare, identificarea acestei concentrații se face
prin încercări.