CHIMIE

LUCRARE DE DIPLOMA

- ACID FOLIC -
 CUPRINS

Introducere ………………………………………………………………….4
Capitolul 1.Acidul folic şi derivaţii săi……………………………………………….7
1.1.Scurt istoric……………………………………………………….7
1.2.Grupul acizilor folici ……………………………………………..9
1.3.Structura acidului folic ………………………………………….10
1.4.Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor……………….12
1.5.Derivaţii metabolic activi……..…………………………………17
1.6.Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic…………………...22
1.6.1.Proprietăţi fizice………………………………………...22
1.6.2.Proprietăţi chimice …………………………………….23

Capitolul 2.Folaţii în natură şi organism…………………………………………...24

2.1.Răspândire în natură …………………………………………….24
2.2.Necesarul de folaţi al organismului uman……………………….25
2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism ……...27
2.4.Tratamentul deficitului de folaţi ………………………………..29
Capitolul 3.Metabolismul folaţilor …………………………………………………30
3.1.Extragere, sinteza şi biosinteza folaţilor………………………...30
3.2.Absorbţia, excreţia şi necesităţi…………………………………33
3.3.Rol şi activitate biochimică ……………………………………..36
Capitolul 4.Perturbarea metabolismului folaţilor la om ………………………….45
4.1Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism…………….45
4.2.Folaţii şi sarcina; profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea acidului
folic……………………………………………..…48
4.3.Acidul folic, ţinta terapiei anticanceroase………………………51
4.4.Mecanismul de acţiune şi rezistenţă …………………………….55
4.5.Transportul transmembranar…………………………………….57
4.6.Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază ………………63
Capitolul 5.Rezultate experimentale………………………………………………..66
5.1.Material şi metodă ……………………………………………...66
5.2.Determinarea conţinutului de acid folic…………………………71
5.3.Rezultate şi discuţii ……………………………………………..79
Bibliografie………………………………………………………………...85
 INTRODUCERE

Acidul folic şi derivaţii săi prezintă un larg interes în biologie şi medicină datorită
funcţiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacţii de
importanţă vitală.
Acidul folic participă la formarea timinei şi a bazelor purinice din ADN, deci
deţine un rol fundamental în creşterea şi reproducerea celulară.
Folat-coenzimele sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând
forme biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanţa specială a reducerii
acidului folic şi mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid
tetrahidrofolic, proces ce se desfăşoară în organism sub acţiunea enzimei
dihidrofolatreductază.
Această enzimă “cheie” a metabolismului folaţilor a constituit obiectul unor
numeroase studii biochimice şi histoenzimologice.
Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor
acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanţe ca agenţi
citotoxici şi în consecinţă, aplicabilitatea lor în terapia cancerului.
Dat fiind rolul derivaţilor acidului folic în biosinteza acizilor nucleici şi a
proteinelor, de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicaţiior
acidului folic în diferite situaţii fiziologice (sarcină, copil în creştere) sau patologice
(neoplasme, în particular leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale
pielii). De asemenea, în lucrarea de faţă s-a urmărit o reactualizare privind noile date
apărute în literatura de specialitate în legătură cu această temă: noutăţi referitoare la
mecanismul absorbţiei, transportului şi utilizării folaţilor, la carenţa de folaţi şi
malformaţiile congenitale, la mecanismul de acţiune al medicamentelor antiinflamatoare
nesteroidiene (AINS).
De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce priveşte incidenţa
malnutriţiei la bătrâni (în special la pacienţii vârstnici spitalizaţi pe perioade mai mari, cât
şi la persoane care se hrănesc cu conserve).
Câteva studii au indicat o incidenţă crescută a malnutriţiei la persoanele trecute de
65 de ani. Malnutriţia a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât şi biochimici
(incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidenţă crescută
a anemiei la aceşti pacienţi, anemie datorată unui deficit de folaţi.
Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor
independent de risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic
este o cauză importantă de hiperhomocisteinemie în populaţia generală, scăderea
hiperhomocisteinemiei printr-un tratament simplu şi eficace cu acid folic poate scădea
incidenţa bolii arteriale coronariene.
Ţinând cont de informaţiile menţionate anterior am ales să studiez în partea
experimentală variaţia concentraţiei de acid folic din omogenate tisulare, în funcţie de
vârstă şi organ (ca factori independenţi).
Determinările le-am făcut pe şobolani împărţiţi în trei grupe de vârstă: tineri,
adulţi şi vârstnici şi concentraţiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare
din ficat, creier, rinichi, splină.
Problema variaţiei acidului folic cu vârsta este de importanţă nu atât individuală,
cât socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puţin costisitoare şi
lipsită de riscuri (cel puţin la cei ce prezintă manifestări clinice).
Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în ţară există
puţine studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume
este menţionată tot mai frecvent.
 CAPITOLUL 1. ACIDUL FOLIC ŞI DERIVAŢII SĂI

1.1. Scurt istoric

Primele observaţii cu privire la existenţa unui nou factor alimentar, cu acţiune

vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia
şi granulocitopenia maimuţelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obţinut din
drojdia de bere.
În 1931, L.Wills şi B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ
pe maimuţă, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă
efectul favorabil al unui extract din ficat şi drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale,
concluzionând că această afecţiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a
unei deficienţe alimentare.
În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de
bere este activ şi asupra puilor de găină, stimulând creşterea acestora. A fost numit factor
de creştere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan şi E.M.Parrott reuşesc să descopere în
extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau numele de
“Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină).
În perioada 1939-1940, E.E.Snell şi W.H.Peterson obţin din ficat un factor de
creştere pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi eluare
cu alcool amoniacal şi îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”.
În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuşesc să izoleze din frunzele de
spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creşterea la Streptococcus lactis şi
manifestă proprietăţi vitaminice la animale.
Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuţi de diferiţi cercetători din drojdie,
ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeaşi grupă şi s-a propus denumirea lor
generică de acizi folici.
Termenul de folaţi este utilizat să desemneze toţi membrii familiei acizilor folici
şi a derivaţilor acestora, inclusiv compuşii în care acidul folic este legat de unul sau mai
multe resturi de molecule de acid L-glutamic.
 Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E.L.Wittle,
B.L.O’Dell, J.E.Vandenbelt, J.J.Pfiffner, în 1945, confirmată în acelaşi an prin sinteza de
R.B.Angir şi colab., care menţionează că în componenţa acidului folic intră şi unii
pigmenţi pteridinici izolaţi anterior din aripile fluturilor precum şi acidul p-amino-
benzoic.
În 1962, C.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folaţi şi stabileşte
simptomele care apar în starea carenţială. Totodată stabileşte necesităţile de folaţi pentru
oamenii adulţi.
Ulterior au fost identificaţi, în 1973, de către W.S.Osborne-White şi R.M.Smith
numeroşi factori nutritivi înrudiţi (aproximativ 28) din ficatul de oaie şi şobolan, dintre
care o importanţă deosebită o prezintă acizii folinici în reacţiile de transformilare.
În 1991, G.Wald stabileşte efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor
afecţiuni neuropsihice. În 1992, Butterworth raportează că dozele mari de acid folic
ajunse în sânge reduc riscul apariţiei cancerului cervical la femeile infectate cu
“papilloma virusul” uman.
În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S.U.A. hotărăşte ca toate femeile să
consume zilnic 0,4 miligrame de folaţi pentru a reduce riscul apariţiei unor malformaţii şi
afecţiuni cancerigene.

1.2. Grupul acizilor folici

Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B,

care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic, au acţiune
hematopoetică şi leucopoetică, dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care o
au asupra diferitelor microorganisme şi specii de animale.
Aparţin acestui grup: acidul folic, acidul folinic, acidul tetrahidrofolic, acidul
dihidrofolic, vitamina Bc-conjugată, vitaminele M, U, R etc.
Acidul folinic se mai numeşte şi “citrovorum factor” deoarece este indispensabil
culturilor de Leuconostoc citrovorum. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă
anemia nutriţională la maimuţă, de unde îi derivă şi numele. Vitamina Bc-conjugată
vindecă anemia macrocitară a puilor de găină şi este esenţială pentru creşterea
microorganismelor Lactobacillus casei L. şi Streptococcus faecalis R.
Dintre alţi factori nutriţionali corelaţi cu grupa acidului folic menţionaţi de diferiţi
cercetători fac parte factorul U, factorul R, factorul S, vitaminele B10 si B11 etc., factori
necesari creşterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la
animale. Toţi aceşti factori se pot obţine prin extracte apoase din drojdii, frunze de
spanac, ficat etc., prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi apoi eluate de pe adsorbant cu
diferiţi compuşi. Prin metode fizice şi chimice compuşii din complex pot fi separaţi,
identificaţi şi dozaţi. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roşii şi albe
din sânge, în prevenirea şi tratarea anemiilor, sunt factori de creştere pentru numeroase
organisme; deasemenea au un rol fundamental şi în activarea şi transportul unităţilor C1
active (-CH3, -CH2OH, -C=O, HCOO-, -CH=NH etc.), în biosinteza bazelor azotate, a
acizilor nucleici şi a proteinelor, în metabolismul unor aminoacizi etc.

1.3. Structura acidului folic

Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele
plantelor (folium-frunza). Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic, denumire ce provine
din structura sa chimică. Este identic cu vitaminele Bc, B4, M, U, R, Lactobacillus factor,
precum şi cu cea de Norit eluat factor, pentru că la izolarea sa din produsele naturale se
foloseşte adsorbţia pe cărbune Norit (cărbune activ) şi eluare cu soluţii amoniacale.
Acidul folic are o structură complexă, având molecula compusă din trei
fragmente:
-un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o
grupare hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina);
-un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA);
-un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid
glutamic.
Primele două componente constituie acidul pteroic. Prin adăugarea la acesta a
celui de-al treilea component (un rest de acid glutamic), se obţine acidul pteroil-mono-
glutamic (Pte-Glu), derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid
folic.

OH
5 9 10
4
N CH2 NH CO N CH CH2 CH2 COOH
3
N 6 H
A B COOH
7
H2N 2 N1 N8 Acid p-amino- Acid glutamic
benzoic
Pteridina

Acid pteroic

Acid folic ( pteroilglutamic )

Structura moleculara a acidului folic

Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor
ce rezultă din degradarea sa hidrolitică, în mediul alcalin aerob. În aceste condiţii din
acidul folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară, din care prin
hidroliza ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic.
A doua fracţiune avea structură pteridinică, era fluorescentă şi prezenta caracter
acid.
Utilizarea difracţiei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei
de acid folic dihidratat; acesta are o conformaţie extinsă cu nucleu pteridinic în poziţia
ceto. Oxigenul de la carbonul 4 şi atomul de azot 10 sunt de aceeaşi parte a moleculei,
legându-se de restul moleculei prin legături de hidrogen.
 aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic

1.4. Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor

Folaţii reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a

moleculei de acid folic, structura de bază a grupului.
Derivaţii naturali ai acidului folic diferă între ei prin:
-starea de oxidare a ciclului pteridinic;
-natura substituienţilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10;
-numărul resturilor de acid glutamic din moleculă.
Pteridinele au fost identificate în pigmenţii aripilor fluturilor, pe baza
fluorescenţei intense în U.V. (Hopkins, 1889-1893) şi ulterior au fost izolate o serie de
pteridine (xantopterina, leucopterina, izoxantopterina). Ele sunt prezente şi la
microorganisme şi la animale şi au fost supuse unor ample cercetări care au dus la
stabilirea structurii (H.Wieland, 1925), la sinteza şi la elucidarea rolului lor biologic, de
exemplu: cofactori şi hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12; în biosinteza şi/sau ca
elemente structurale a acizilor folici şi folinici.
Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) şi
unul piramizinic (B).
Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina).
Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte).
Prin ataşarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obţine acidul
pteroilmonoglutamic (Pte-Glu), respectiv acidul folic.
Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ, se
pot obţine diopterina (Pte-Glu2), teropterina (Pte-Glu3), vitamina Bc conjugată (Pte-Glu7).

5 OH
4
3
N 6 N CH3
N N
A B
7
2
N N H2N N N
1 8

Pteridina Pterina
(2 -amino-4-hidroxi-6-metil-
pteridina)

Structura pteridinei si a pterinei

 COOH

CO NH CH

(CH2)2 (CH2)2
OH
5 9 10
4
N CH2 NH CO N CH COOH
3N H
A B 6
COOH
7
H2N 2 N1 N8
Diopterina(Pte-Glu2)

COOH

CO NH CH

(CH2)2 (CH2)2 COOH

OH
5 9 10
4
N CH2 NH CO N CH CO NH CH
3N H
A B 6
COOH (CH2)2
7
H2N 2 N1 N8
COOH
Teropterina(Pte-Glu3)

COOH

CO NH CH

(CH2)2 (CH2)2
OH
5 9 10
4
N CH2 NH CO N CH COOH
3N H
A B 6
COOH
7 6
H2N 2 N1 N8
Vitamina Bc - conjugata
(Pte-Glu7)

Structura unor compusi pteroidici si folici

 OH
10
N CH2 N CO N CH (CH2)2 COOH
N H
A B COOH
CH3
H2N N N
Acidul-N10-metil-folic

OH
10
N CH2 N CO N CH (CH2)2 COOH
N H
A B COOH
C
H2N N N H O
Acidul-N10-formil-folic

OH
10
N CH2 NH COOH
N
A B
H2N N N
Acidul pteroic (Pte)

OH
10
N CH2 N COOH
N
A B CH3
H2N N N
Acid-N10-metil-pteroic
(Rhizopterina)
OH
10
N CH2 N COOH
N
A B C
H2N N N H O
Acid-N10-formil-pteroic
(Factor SLR)

Structura unor compusi pteroidici si folici

 OH OH
N OH N CH CH CH3
N N
OH OH
H2N N N H2N N N
Xantopterina Biopterina

Structura xantopterinei si a biopterinei

Acidul pteroic nu prezintă activitate de creştere asupra L.casei şi nici antianemică.

Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are
activitate limitată de creştere asupra microorganismelor, dar, prezintă proprietăţi
antianemice. A fost obţinut din diferite produse biologice. Are substituit un radical formil
la N10 al acidului folic. Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra creşterii
microorganismelor L.casei şi Str.faecalis R.
Diopterina se găseşte sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic şi sub
formă de acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Primul acid este eficace în tratarea anemiei
macrocitare la om şi atenuează la canceroşi simptomele dureroase.
Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numeşte şi factor de creştere. Este
utilizat în tratamentul tumorilor maligne.
Rizopterina este un factor de creştere pentru Streptococcus faecalis R (SLR), dar
nu are acţiune asupra Lactobacillus casei şi nici asupra anemiei puilor de găină. Este un
derivat al acidului pteroic. S-a obţinut prin sinteză din acid pteroic şi acid folic. S-a izolat
din lichidul de fermentare de la Rhizopus nigricans.
Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid
glutamic substituite la acidul pteroic. Reprezintă forma predominantă sub care se găseşte
acidul folic în ţesuturi. Vitamina Bc conjugată nu are o acţiune directă asupra anemiei
macrocitare la om şi nici nu stimulează creşterea la L.casei şi Streptococcus lactis R.
Prezintă acţiune curativă în anemia puilor de găină. Sub acţiunea unei enzime hepatice
numită vitamina-Bc – conjugaza, vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil glutamic
activ.
Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găseşte acidul
folic în alimentele naturale. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare şi la
maimuţă. Enzima vitamin – Bc conjugaza are acţiune carboxipeptidazică a fost iniţial
izolată din ficat, iar ulterior şi din rinichi de porc, pancreas (pui de găină), de la gâşte şi
din materiale vegetale (cartofi, migdale). Microorganismele nu conţin această enzimă şi
de aceea nu pot utiliza vitamina Bc conjugată.

1.5. Derivaţii metabolic activi

Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular, formele

metabolic active fiind constituite din compuşii rezultaţi din:
A. Reducerea acidului folic în poziţiile 5, 6, 7, 8 rezultând acid dihidrofolic şi
acid tetrahidrofolic.
Carbonul asimetric din poziţia 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru
diferite funcţii metabolice şi mai ales permite trecerea în formele dihidro, în schimb, se
pare că gruparea NH2 din poziţia 2 a nucleului pteridinic deţine rolul fundamental în
coordonarea moleculei de folat cu funcţie de coenzimă.
Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape
succesive; întâi se obţine acidul dihidrofolic (FH2) şi apoi acidul tetrahidrofolic (FH4),
sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductaza.
 OH
N CH2 NH CO N CH CH2 CH2 COOH
N H
COOH
H2N N N
Acid folic

DHFR

OH
H
N CH2 NH CO N CH CH2 CH2 COOH
N H
COOH
H2N N N
Acid dihidrofolic

DHFR

OH
H
N CH2 NH CO N CH CH2 CH2 COOH
N H
COOH
H2N N N
H
Acid tetrahidrofolic

Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei

Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină

sau paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6, în
prezenţa acidului ascorbic. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic:
5, 6 H2 Pt. Glu. ;
7, 8 H2 Pt. Glu. ;
5, 8 H2 Pt. Glu. ;
dintre care numai acidul 7, 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat şi este
stabil.
 Acidul dihidrofolic este uşor degradat prin expunerea la aer sau sub acţiunea
bazelor. Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic şi tiolic îl
protejează.
Spectrul de absorbţie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime
la lungimea de undă de 282 nm, precum şi la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care
nu este fluorescent, derivaţii săi în forma redusă posedă spectre de absorbţie carecteristice
în UV.
Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în poziţiile 5, 6, 7, 8. Poate fi
stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0,2-0,5% sau cu compuşi ce conţin
grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluţie 0,2-1 M).
Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic).
Spectrul de absorbţie al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime, la lungimea de
undă de 298 nm, iar în absenţa agenţilor reducători maximul de absorbţie variază între
limitele 270-298 nm.

Spectrul de absorbţie al derivaţilor acidului folic la diferite pH-uri

Compusul Maximul de absorbţie la diferite pH-uri (în nm)

Acid Neutru Bazic
Folat 292 280 257
Dihidrofolat 282 282, 310 283
Tetrahidrofolat 272 270, 298 -
N5 – formil FH4 - - 282
N5, N10 – metenil FH4 348 x x
N10 – formimino FH4 xx 258 255
N5, N10 – metilen FH4 292 293 297
N5 – metil FH4 - 290 -

- Valoarea nu este cunoscută;

x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluţie neutră sau bazică;
xx compusul se transformă în N5, N10 – metenil FH4 în soluţie acidă.

B. Substituirea de grupări monocarbonate în poziţiile N5 sau N5, N10 sau

N10. Mai jos sunt reprezentate structurile celor mai importanţi derivaţi ai acidului
 folic, metabolic activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4; N5, N10 – metilen – FH4;
N5, N10 – metilenil – FH4.
Structura generală a derivaţilor N5–substituiţi în care R poate fi:
 -CH3 în N5 – metil – FH4;
 -CHO în N5 – formil – FH4;
 -CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai jos
Structura generala a derivatilor acidului folic N5 - substituiti

COOH
OH CH2 10
5
N 9 N CO N CH
N CH2 H
CH2
H2N N NH
CH2

COOH

Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic

C. Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă.

Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea –
COOH din poziţia γ a unui rest se leagă de gruparea – NH2 a altui rest de acid glutamic.
Mai des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) şi n = 5 (acid
pteroilpentaglutamic) în celule animale şi
n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante.

OH
H
N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 COOH
N n
COOH
H2N N N

2-amino, 4-hidroxi acid p-aminobenzoic poliglutamic

6-metil pteridina
 Structura pteroilpoliglutamatilor

1. 6. Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic

1. 6. 1. Proprietăţi fizice

Acidul folic este o substanţă solidă, cristalină de culoare galbenă, greu solubil în
apă (0.16mg/100ml), piridină, în fenol, în metanol, în acid acetic glacial şi insolubil în
cloroform, benzen, eter şi acetonă. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Este optic activ
dextrogir (+) 16˚, iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil, cu ionii metalelor grele
formează compuşi complecşi (cu Fe 3+ roşu, Cu2+ verde, Co2+ galben), iar în mediul bazic
formează săruri cu metalele alcalinopământoase. Acidul folic se descompune sub
influenţa luminii şi a razelor UV, rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic şi alţi
compuşi proveniţi din catena laterală. Spectrul său de absorbţie în ultraviolet este
asemănător cu cel al xantopterinei. Acidul folic se prezintă sub formă de plăcuţe galbene,
lenticulare, subţiri, birefringente, cu punct de topire la 250˚C. Prin autoclavare 30min,
pierde 70% din activitate la pH = 1. La 100˚C, sub acţiunea acizilor se descompune în
acid p – aminobenzoil – glutamic şi partea pteridinică modificată. Solubilitatea acidului
folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin adăugare de glicocol.
Soluţiile neutre sunt mai stabile, iar cele alcaline se oxidează cu uşurinţă. Este
incompatibil cu substanţe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează. Cu Ca2+
formează o sare insolubilă, iar în soluţie alcoolică este incompatibilă cu clorhidraţi,
FeSO4, preparate acide, siropuri acide, gume şi mucilagii vegetale. Este inactivat de
acidul ascorbic, acidul nicotinic, vitaminele B1, B2, sulfamide, etc.

1. 6. 2. Proprietăţi chimice

Dintre proprietăţiile chimice ale acidului folic menţionăm posibilitatea reducerii ciclului
pteridinic în derivaţi di – şi tetrahidrofolici; ataşarea la o serie de enzime prin intermediul
grupării – NH2 din poziţia 2 (legături peptidice); transportul de unităţi monocarbonate în
poziţiile N5, N10; atomul de carbon din poziţia 6 conferă stereospecificitate moleculei.

CAPITOLUL2.FOLAŢII ÎN NATURĂ ŞI ÎN ORGANISM

2.1. Răspândire în natură

Acidul folic şi derivaţii săi au o largă răspândire în alimente. Se găsesc în cantitate

mare în ficatul animalelor, în frunzele plantelor superioare, în special în spanac, în
mazăre, germeni de grâu, drojdii, sfeclă, lămâi şi în unele microorganisme.
 Conţinutul substanţelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11,5μg/g,
iar în frunzele mature de 6-7 μg/g. În ierburi, conţinutul acidului folic variază între 3-7,5
μg/g. Cele mai mari cantităţi de acid folic şi de folaţi se găsesc în regnul animal. În ficatul
de bou se găsesc 290 μg%, în ficatul de pui se găsesc 370 μg%, iar în cel de porc 220 μg
%. Cerealele conţin în medie 35 μg%, iar dintre fructe lămâile 80 μg%, bananele 30 μg%,
portocalele 33 μg%. Legumele au un conţinut mai redus, fiind cuprins între 8 şi 25 μg%.
O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează
stabilirea necesităţilor pentru om şi animale.
Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile în toate alimentele uzuale. Ficatul şi
muşchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate, dar şi sursele vegetale constituie un
aport însemnat. Laptele de vacă conţine cantităţi mici de acid folic.
În timpul preparării alimentelor o parte din folaţi se distrug, dar în acelaşi timp se
eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Cele mai multe
forme de folaţi nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin
uscare la temperatura camerii până la 70% din activitatea folaţilor în decurs de 3 zile.
Cantităţi mari de folaţi se pierd în timpul extragerii, la prepararea hranei în soluţii apoase
şi prin fierbere. Uneori pierderile totale se ridică până la 85 - 90%.

2. 2. Necesarul de folaţi al organismului uman

Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg
zilnic.
Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi, dar această valoare poate creşte în
anumite stări fiziologice (sarcină, pubertate) sau patologice (neoplazii, dermatoze
cronice, etc.)
Comisia F. A. O.- O. M. S. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de
acid folic: 60 μg/zi pentru sugari, 100 μg/zi de la 1 –12 ani, 200 μg/zi între 13 – 19 ani şi
peste 200 μg/zi pentru adult.
Folaţii existenţi în natură sunt conjugaţi cu mai multe molecule de acid glutamic,
acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală; lanţul acid
poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă, împiedică absorbţia vitaminei
ca atare. Pentru a fi absorbiţi, poliglutamaţii alimentari trebuie să fie hidrolizaţi la
monoglutamaţi. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal, sub acţiunea unei
conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă şi zinc-dependentă. După
aceea monoglutamaţii rezultaţi vor fi absorbiţi printr-un mecanism activ facilitat de
glucoză.
Această absorbţie poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folaţi. În cursul
transportului lor intraenterocitar monoglutamaţii sunt metilaţi şi apoi reduşi la dihidro- şi
tetrahidrofolaţi sub acţiunea dihidrofolatreductazei.
La individul normal, aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este
absorbit, indiferent de doza administrată. La o doză mai mică de 200μg
/zi, excreţia urinară este minoră sau absentă. În schimb, la doze mai mari, aceasta poate
deveni considerabilă, şi anume: 6% pentru 1mg/zi; 10% pentru 2mg/zi; 50% pentru
50mg/zi, până la 80% pentru 15mg/zi.
Sângele conţine aproximativ 1mg% folaţi, cea mai mare parte (90%) aflându-se în
eritrocite, la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolaţii.
Există proteine ce leagă folaţii în plasmă, dar rolul lor este încă neclar.
Folaţii plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) şi
sunt transportaţi în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse
(FH4). Odată ajuns în celulă, folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării
N5-CH3 într-o reacţie de transfer a grupării metil. Forma poliglutamată pare a fi forma în
care celulele reţin şi depozitează folaţii.
În organism folaţii sunt depozitaţi în toate ţesuturile, dar cu precădere la nivelul
rinichilor, pancreasului şi mai ales ficatului. Rezervele normale de folaţi sunt estimate
între 5-20mg, din care jumătate în ficat; ţinând seama de necesarul zilnic minim de folaţi
(50μg), reiese faptul că rezervele organismului permit menţinerea unei hematopoeze
normale timp de 2-4 luni. Totuşi, în caz de creştere importantă a necesităţilor (stări
septice, traumatisme grave), timpul scurs până la apariţia manifestărilor hematologice şi
mai ales a trombopeniei, poate fi mai scurt (15 zile sau mai puţin).
Pierderea folaţilor se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din
piele şi tractul intestinal, ca şi prin bilă, urină, transpiraţie şi salivă. Rata pierderii este de
doar 1-2% din totalul rezervelor hepatice, dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a
vitaminei B12 deoarece cantitatea minimă de folaţi necesară a fi absorbită zilnic este de
100 de ori mai mare decât cea a vitaminei B12, iar turn-over-ul folaţilor este mult mai
mare, simptomele deficienţei de folaţi se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale vitaminei
B12. Deficitul va fi totuşi aparent doar după câteva luni de la apariţia tulburării primare de
aport, absorbţie sau utilizare.

2.3.Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism

Manifestările clinice ale deficitului de folaţi implică celulele din ţesuturile cu rată
de multiplicare rapidă, şi mai ales sângele şi mucoasa intestinală. Manifestările
neurologice ce apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin
potenţialul lor de ireversibilitate) sunt mai puţin frecvente.
Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică,
datorată unei eritropoeze ineficiente.
Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la
hematopoeză de tip megaloblastic, asincronism de maturaţie nucleo-citoplasmatic
(nucleii sunt mai puţin maturi decât era de aşteptat, cromatina nucleară este dispersată).
În măduva osoasă apar mitoze anormale, hipercelularitate, metamielocite gigante şi
scăderea raportului mieloido/eritrocitar. Precursorii anormali sunt distruşi prematur în
măduva osoasă, rezultând anemie prin eritropoeză ineficientă, bilirubină indirectă
crescută şi hemosiderină normală sau crescută.
În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ3),
hemoglobină scăzută sau chiar normală faţă de numărul de eritrocite scăzut (datorită
VEM crescut, acesta fiind şi motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine
suportate de către aceşti pacienţi); frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză,
poikilocitoză şi macrocitoză.
În ceea ce priveşte celelalte serii celulare sanguine, modificările sunt mai rare, dar
şi mai precoce: numărul leucocitelor şi al plachetelor poate fi scăzut, iar apariţia PMN
hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru
anemie megaloblastică.
 Pe frotiul de măduvă osoasă se observă, deasemenea, precursori anormali ca
mărime şi morfologie şi pentru seria granulocitară, iar clinic se poate constata un sindrom
hemoragipar sau o scădere a imunităţii celulare.
Valorile plasmatice ale folaţilor sunt scăzute (normal 6-20ng/ml), dar aceste valori
pot reflecta variaţii recente în aportul dietetic. Măsurarea folaţilor eritrocitari este în acest
sens o măsurătoare cu grad crescut de precizie, nefiind supusă acestor fluctuaţii. Frecvent
deficitul de folaţi este asociat cu deficitul de B12 (evidenţiat prin testul Schilling).
Clinic, anemia se manifestă prin slăbiciune, ameţeli, palpitaţii, angor, insuficienţă
cardiacă, tahicardie. Culoarea tegumentelor este palidă, cu nuanţă subicterică, rareori
apare purpura (datorită trombocitopeniei), iar uneori splina şi ficatul pot fi uşor mărite.
A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive, reflectând afectarea
proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folaţi.
Pacienţii prezintă o limbă zmeurie (roşie, lucioasă, depapilată, dureroasă), anorexie (cu
uşoară scădere în greutate), diaree, steatoree, etc.
Manifestările neurologice şi psihice includ cel mai frecvent un tablou de
polinevrită senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal), se mai poate observa un
sindrom depresiv, anxietate, demenţă sau psihoză.
Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate, anemie
macrocitară normocromă aregenerativă), a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză
megaloblastică), a nivelului de folaţi plasmatic (mai puţin concludent) sau eritrocitar (se
mai pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină, excreţia urinară de formiminoglutamat
în exces) şi excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal).
Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunţită cu privire la dietă şi
explorarea funcţiei intestinului subţire.

2.4. Tratamentul deficitului de folaţi

Tratamentul deficitului de folaţi este un tratament de substituţie, pe toată durata

vieţii (sau până la excluderea cauzei primare).
Folaţii sunt utilizaţi în scop terapeutic sub formă de:
- acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg)
 - acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluţie pentru
injectare parenterală, dar la fel de eficace şi pe cale orală.
O doză de 50-100μg/zi permite obţinerea unui răspuns hematologic, dar doze mai
importante, de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta
rezervele organismului. Această doză, administrată pe cale orală, este suficientă chiar şi
în caz de malabsorbţie.

CAPITOLUL 3. METABOLISMUL FOLAŢILOR

3.1. Extragere, sinteza şi biosinteza folaţilor

Acidul folic se poate obţine în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat,
spanac, drojdii, cojile cerealelor,etc) prin extracţie cu apă la pH 3, adsorbţie pe cărbune
activ (norit), eluţie cu soluţie amoniacală 2,8%, purificat prin readsorbţie pe cărbune,
eluare cu anilină şi precipitare cu acetat de plumb, AgNO3, acid picric, baritină, etc. În
prezent se realizează iniţial inactivarea enzimelor, care distrug cofactorii naturali prin
încălzirea rapidă a materialului la 95˚C, în prezenţă de tampon ascorbat sau amestec cu
uree 6M si cloroform. Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de
ioni şi separare prin eluare în gradient de concentraţie cu soluţii amoniacale sau de
anilină.
Prin sinteză acidul folic se obţine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)-
glutamic, cu aldehida 2,3-dibrompropionică şi cu compusul 2,4,5-triamino-6-
hidroxipiridinclorhidrat în prezenţă de NaOH, O2 şi acetal.

Br CH2
H2N N OH
HOOC (CH2)2 CH NHCO NH2 + CH Br +
O N
NH2
COOH C
H
NH . 2HCl
2
Acid p-aminobenzoil-L(-)-glutamic Aldehida 2,3-
6-hidroxi-2,4,5-triamin
dibromoproprionica
pirimidin clorhidrat

+ 4 NaOH
Acid folic + 2 NaCl + 2NaBr + H2O
1/2 O2

Schema sintezei acidului folic

În produsele naturale acidul folic se găseşte în stare liberă în cantitate relativ

redusă, deoarece se găseşte în cantitate mai mare sub formă de compuşi chimici diferiţi,
unii cu mai multe resturi de acid glutamic, care au însă aceeaşi importanţă nutritivă
pentru organismele vii.
Prin experienţe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secţiunile
hepatice din mediul de reacţie, în prezenţa acidului ascorbic, se obţine acidul folinic, care
este un derivat formilat al acidului formic. Acidul folinic obţinut prin sinteză este de două
ori mai puţin activ decât cel natural, deoarece prin sinteză se obţin 2 stereoizomeri din
care numai unul este activ.
Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obţine “in vitro” prin formilarea şi hidrogenarea
sa la temperatură ridicată, în prezenţa acidului ascorbic, iar “in vivo” sub acţiunea
piridinnucleotidreductazei şi a vitaminei C, se formează iniţial acidul dihidrofolic (FH2),
care prin hidrogenare trece în acidul folinic.
 Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. Până
în prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme şi pe animale, cu
ajutorul unor inhibitori. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale.
Biosinteza acidului folic este stimulată de acidul ascorbic.
Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze
acidul folic din precursori mai simpli, prin reacţii de condensare, sub acţiunea unor
enzime. Astfel, extractele celulare de E. coli, realizează biosinteza acidului folic din acid
glutamic, acid p-aminobenzoic şi 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida, iar
extractele de Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca şi compuşi pteridinici
2-amino-4-hidroxi-6 hidroximetilpteridina şi 2-amino-4-hidroxi-6-
carboxildehidropteridina în prezenţa ATP şi a ionilor de Mg2+. Biosinteza acidului folic
se realizează mai repede dacă compusii pteridinici conţin acidul pirofosforic la C-9.
În experienţele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezenţa
ATP, HS-CoA şi acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic
al acidului p-aminobenzoic, care reacţionează cu acidul glutamic şi formează compusul
p-aminobenzoilglutamic. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic.

O
+ HSCoA
H2N COOH + ATP H2N C AMP
- P-P - AMP

Acid p-aminobenzoic Acid p-aminobenzoil-

adenilmonofosforic
COOH COOH

O (CH2)2 (CH2)2

H2N C SCoA + NH2 CH H2N CONH CH

- HSCoA

COOH COOH
Acid p-aminobenzoil - SCoA
Acid glutamic Acid p-aminobenzoilglutamic

OH
N CH3
N
+
H2N N N

Pterina
Acid folic
 Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium

Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid

dihidrofolic, iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să
transforme acidul dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.

OH NADP+ OH NADP+ OH
N R H
N + N R N R
NADPH +H N + N
NADPH +H
H
H2N N N CH2 CH2
H2N N N H2N N N
Acidul folic
H H
Acidul dihidrofolic Acidul tetrahidrofolic

Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic

Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidenţă atât la animale, cât
şi la microorganisme în prezenţa ATP, FAD, Mg2+, acid ascorbic şi a unor enzime
specifice. În ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezenţa ATP si Mg2+
realizează transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.

ATP
Acid N-5-tetrahidrofolic Acid N-10-tetrahidrofolic + ADP + P
Mg2+

3.2. Absorbţie, excreţie şi necesităţi

Acidul folic în stare liberă, ca acid pteroilmonoglutamic este uşor şi rapid absorbit
de organism în cantităţi de până la 15-20mg/zi. Absorbţia are loc mai ales incepând din
partea proximală a intestinului subţire şi continuă, pe toată lungimea sa, cu un consum de
energie, cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantităţi fiziologice
mici. Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. În multe produse
alimentare acidul folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. Din aceşti
derivaţi acidul folic este absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor compuşi.
În tubul digestiv şi în rinichi, s-a pus în evidenţă existenţa unor sisteme enzimatice
hidrolizante (conjugaze) care scindează complexele acidului folic. Absorbţia acidului
folic poate fi perturbată şi micşorată de diferiţi compuşi cum sunt: difenilhidrantoina,
pirimidine, cicloserine, etanol, glicocol, serina, homocisteina şi metionina.
Se consideră că acidul folic, precum şi derivaţii acestora, sunt convertiţi în
mucoasa intestinală sub acţiunea unor acidfolicreductaze în derivaţi metilici (CH3-FH4),
forme sub care trec în sângele venei porte şi apoi la ficat.
Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici şi folinici existenţi la oamenii adulţi,
aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g), de unde prin circulaţia sanguină se
aprovizionează toate organele şi ţesuturile. Imediat după absorbţie şi parţial chiar în
timpul absorbţiei, acidul folic este convertit în diferiţi compuşi metabolici activi cum
sunt:
- acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4);
- acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4);
- acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4);
- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4);
- acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4).
În toţi aceşti derivaţi apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4), care
joacă rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unităţi C1.
Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine
transportoare, având în sânge o concentraţie de 300ng/ml. Folaţii se găsesc în cantitate
mai mare în eritrocite, cu variaţii normale între 160-640ng/ml de eritrocite. Conţinutul
folaţilor din eritrocite, se menţine relativ constant şi reflectă gradul de aprovizionare a
întregului organism cu aceşti compuşi. Cantitatea de folaţi din sânge scade în bolile de
cancer (leucemii), carenţa folinică şi anemie pernicioasă, în ciroza alcoolică, anemii
gravidice, etc. Plasma sanguină conţine 5-20ng/l, iar eritrocitele conţin cantităţi de 30 de
ori mai mari de folaţi.
În sânge şi ţesuturi, acizii folici suferă procese de interconversiune şi de
catabolizare. Acidul folic se transformă mai ales în derivaţi tetrahidrofolici. În eritrocite
acidul folic prin metabolizare dă naştere la acid p-aminobenzoilglutamic şi la un derivat
aldehidic al pterinei. În ficat, acidul folinic se degradează în compuşi similari, reacţia
fiind activată de acidul glutamic şi inhibată de acidul ascorbic. Tot la nivelul ficatului se
transformă acidul folic în acid N-10-formil-folinic.
Eliminarea folaţilor şi a metaboliţilor acestora se face în cantitate mai mare prin
fecale, aproximativ 200-500μg/zi la omul adult, cuprinzând aproximativ 20% din
cantitatea ingerată şi partea neabsorbită produsă de flora intestinală.
Excreţia prin urină este mică, aproximativ 2-5 μg/zi, dar creşte prin administrarea
de doze orale, după saturarea organismului cu folaţi. Eliminarea folaţilor prin urină
reprezintă sub 1% din cantitatea acestora în organism.
Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp),
aproximativ 90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot
corpul în decurs de 3 minute, iar aproximativ 2% se elimină prin urină. Dacă însă se
măresc dozele până la 150μg/kg corp, până la 90% din cantitatea administrată se elimină
prin urină, în decurs de 6-12 ore, sub formă de acid folic sau derivaţi apropiaţi sub aspect
structural.
La o dietă normală, corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi,
cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg, cantitate suficientă
pentru trei sau patru luni, dacă este blocată absorbţia. O altă cale de eliminare a acidului
folic este cea cutanată. Prin transpiraţie se elimină cantităţi destul de însemnate de folaţi,
precum şi prin bilă.

3.3. Rol şi activitate biochimică

Acizii folici, sub formă de acizi tetrahidrofolici, reprezintă coenzimele unor

sisteme enzimatice, implicate în activarea şi transportul unor fragmente monocarbonice
(C1) sub formă de hidroximetil (-CH2OH), formil (-COH), formiat (HOOC-), metil (-
CH3), formimino (CH=NH), care iau parte la reacţii deosebit de importante pentru
organism.
Formele coenzimatice active, care poartă fragmente sau radicali cu un atom de
carbon, sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte:
- acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4);
- acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4);
- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-FH4);
- acid N-5, 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10-CH2-FH4);
- acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4).
 O H
C
OH
N CH2 N CO N CH (CH2)2 COOH
N H
A B COOH
H2N N N
Acidul-N10-formiltetrahidrofolic

COOH
OH CH 10
5
N 9 N CO N CH
N + CH2 H
CH2
H2N N NH
CH2

COOH
Acid N5, N10- meteniltetrahidrofolic

COOH
OH CH2 10
5
N 9 N CO N CH
N CH2 H
CH2
H2N N NH
CH2

COOH
Acid N5, N10- metilentetrahidrofolic

Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic

Derivaţii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obţine pe două căi

principale:
-tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic (FH4);
-transferul direct al acestor unităţi pe FH4. Ca substanţe donatoare de unităţi C1, cele mai
active sunt serina, histidina, xantina, metionina, colina, betaine, nicotina, timina, acidul
glutamic etc. Ca acceptori de grupări C1 funcţionează glicocolul, colamina, nornicotina,
uracilul, homocisteina, gliconamidoribozida, acidul folic etc.

Existenţa acidului N-5-formil-tetrahidrofolic, care este inert, sub aspect

coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uşor transformat
O
H C + FH4 + ATP N 10 CHO FH4
OH

O
H C + FH4 N 5,N CH2 FH4
H ADP+P
+ATP
Acid N-5-tetrahidrofolic Acid N5, N10 -metenil-tetrahidrofolic
Mg2+

Acid N-10-formil-tetrahidrofolic
+H2 O
pe cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic, iar acesta cu apa dă acidul N-10-
formil-terahidrofolic care este cel mai activ metabolit.

Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma şi prin reacţia directă dintre

aldehida formică şi FH4:

O + ATP
FH 4
+ H C Acid N-10-formil-FH4
H

Reacţia este catalizată de formiltetrafolatsintetaza, care a fost izolată din ficatul de

porumbel şi din diferite microorganisme. Fragmentele monocarbonice sunt, sub aspect
metabolic, interconvertibile, deoarece pot trece reciproc una în alta, sub acţiunea unor
sisteme enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezenţă de NADP+şi NAD+.

NADPH + H+ NADH + H+
NADP+ O NAD+ +O O
CH2OH C C
H - H2O OH
Hidroximetil Formil Formiat
NADP+ NADH + H+
NADPH + H+ NAD+
 Transportul fragmentelor C1 de la o substanţă la alta se realizează de acidul
tetrahidrofolic şi derivaţii săi menţionaţi anterior.
Dintre reacţiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice, face parte şi
transformarea serinei în glicocol în prezenţa piridoxalfosfatului (PALP):

CH2 OH
CH2 NH2
H2N CH + FH4 + Acid N5 , N10 -metilen-tetrahidrofolic
COOH
COOH Glicocol
Serina

Din histidină, se obţine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care

transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic.

COOH COOH
Catabolizare + FH4
Histidina HC NH CH NH (CH2)2
incompleta

(CH2)2 H2N CH

COOH COOH
Acid formiminoglutamic Acid glutamic

+ Acid N5-formimino-tetrahidrofolic

Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4), sub acţiunea unei

ciclodezaminaze, formează acidul N-5,N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5,N-10=CH-
FH4). Acelaşi mecanism de reacţie se produce şi la transformarea xantinei în
formiminoglicocol.
 Glicocolul, printr-o reacţie de transaminare, formează acid glicoxalic, care
cedează gruparea formil acidului glutamic, în prezenţă de NAD+ cu formare de acid N-
formil-glutamic.

COOH COOH

O (CH2)2
C + (CH2)2
+ NAD+ O + CO 2 + NADPH + H
+
H
H2N C CH NH C
COOH H
Acid glioxalic COOH
COOH
Acid glutamic Acid formilglutamic

Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 şi se formează acidul

folinic, care este mai puţin activ. Acesta în prezenţa ATP se transformă în acidul N-10-
formil-tetrahidrofolic.

COOH COOH
(CH2)2
+ FH4 (CH2)2
O + Acid N-formil-tetrahidrofolic
CH NH C
H H2N C
COOH
COOH
Acid formilglutamic Acid glutamic

ATP
Acid N-10-formil-tetrahidrofolic
Mg2+

Coenzimele folinice, care au fixate unităţi C1, se comportă ca donori în reacţiile

care necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH, -CHO, -CH=NH, HCOO-, -CH3. În
funcţie de felul compuşilor care se sintetizează în urma transferului de unităţi C 1,
participă la reacţie una sau alta din formele active.
 În reacţiile cu cedare de radicali formil vor funcţiona ca donori acizii N-10-formil-
FH4 şi N-5, N-10=CH-FH4. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5, N-
10-CH2-FH4, iar ca donori de radicali CH3 funcţionează acidul N-5-CH2-FH4 şi uneori
acidul N-5,N-10-CH2-FH4.
Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroşi în procesul de biosinteză a
bazelor şi a nucleotidelor purinice, în biosinteza colinei, betainei, nicotinei, etc. În
procesul de biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil, localizate la C-
2 si C-8 al nucleului purinic. Dintre compuşii intermediari care se formează în procesul
de biosinteză a bazelor purinice, în urma primirii unor unitaţi C1 active fac parte :
-formilglicinamidoribozida(FGAR)
-formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR)
Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice, ce iau parte
la formarea acizilor nucleici, rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în procesele
de creştere şi reproducere celulară.
Acidul N-5,N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN, deoarece se
comportă ca o coenzimă în reacţia de transformare a uracilului în nucleozide şi nucleotide
în timină. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) şi
acestea se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide, respectiv nucleozide. Transformarea
uracilului în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor), care reprezintă
cărămizile de bază în biosinteza acidului deoxiribonucleic.
În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-5-
CH3-FH4 la homocisteină.

CH2 SH CH2 S CH3

CH2 CH2
+ N-5-CH3 FH4 + FH4
H2N CH H2N CH

COOH COOH
Homocisteina Metionina

În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil şi nu

transferul acesteia de la alţi donori. Metionina are rol însemnat în formarea
colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (S-
adenozilmetionina).
Dintre reacţiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4,e
importantă trasformarea betainei în serină.

COOH COOH COOH

- CH3 + [O]
+ CH3 CH3
CH2 N (CH3)3 CH2 N CH2 N
CH3 CH2OH
Betaina
Dimetilglicina Hidroximetilsarcozina

FH4CH2OH COOH COOH

FH4 + [O]
CH2 NH CH3 CH2 NH CH2OH
Sarcozina Hidroximetilglicocol

FH4-CH2OH COOH FH4 CH2 OH

FH4 FH4-CH2OH
CH2 NH2 H2N CH
Glicocol FH4-CH2OH
FH4 COOH
Serina

Ultima reacţie este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma
în glicocol, constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH.
Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în
stimularea creşterii unor microorganisme (Str. faecalis), iar efectul optim al acidului folic
asupra acestor microorganisme se obţine când se administrează împreună cu vitamina
B12. Datorită acestor corelaţii se consideră că acidul folic funcţionează direct sau indirect
ca o coenzimă în biosinteza timinei. Unele microorganisme transformă uşor uracilul în
timină sau citozină, dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. În prezenţa
formiatului marcat cu 14C, acesta se regăseşte în atomul de carbon al grupării metil din
timină.
Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic, pe lângă transformarea glicocolului în serină, şi
a homocisteinei în timină, contribuie activ la transformarea uracilului în timină şi a
metioninei în creatină precum şi la biosinteza inelelor porfirinice. Prin administrarea de
formiat marcat cu 14C se regăseşte în hem, numai la animalele tratate cu acid folic, nu şi
la cele aflate în carenţă de folaţi.
Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei, a cărei diminuare ar duce la o
creştere a acetilcolinei, cu influenţă negativă asupra hematopoezei, dar inhibă activitatea
tirozinazei şi a xantinoxidazei. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor
porfirinice şi a nucleoproteidelor. La maimuţe cu deficienţe de acid folic, conţinutul
nucleoproteidelor scade în mod accentuat, iar situaţia se redresează prin administrare de
acid folic.
Acidul folic este un factor important pentru creşterea animalelor tinere şi pentru
microorganisme. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Asigură
funcţionarea optimă a sistemului nervos. A manifestat efecte antiteratogene la animalele
tratate cu pirimetamină.
 CAPITOLUL 4. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAŢILOR LA OM

4.1. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism

Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple, implicând

aportul de acid folic, necesităţile metabolice crescute (sarcină, anemie cronică hemolitică,
neoplasm), malabsorbţia (sprue, medicamente-fenitoina, barbiturice, etanol) sau
interferarea căilor metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat, etanolul) şi altele.
Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de
vitamină B12. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport alimentar
nediversificat (conserve, regimul “tea and toast”) şi ocazional adolescenţii- alcoolicii şi
toxicomanii. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile alcoolice,
acestea având conţinut de acid folic scăzut (berea, vinul) sau practic nul (băuturile
distilate). În alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea utilizării acidului
folic.
Necesităţile metabolice crescute de folaţi apar atât în condiţii fiziologice (sarcină,
perioadele de creştere în copilărie şi adolescenţă) precum şi în condiţiile patologice de
creştere a ratei de multiplicare a ţesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală,
măduva osoasă).
Astfel, în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori faţă
de normal, iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare faţă de
primipare. Pentru un organism sănătos şi o dietă raţională, echilibrată, necesităţile
suplimentare nu constituie un impediment. Anemia ce apare in timpul sarcinii este
rezultatul unui consum crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanţi ca:
alimentaţie deficitară, ignoranţa, etc. Important de reţinut este că anemia poate fi
anterioară sarcinii şi o agravează prin necesităţile crescute; existând cazuri în care anemia
din perioada iniţială a sarcinii se datorează unor deficienţe alimentare sau
menometroragiilor.
Cauza principală a deficienţei de folaţi în sarcină este reprezentată de creşterea
sintezei de ARN, ADN asociată cu dezvoltarea fătului, placentei şi uterului, precum şi cu
expansiunea masei eritrocitare a mamei. Pot interveni şi alţi factori precum: anorexia,
reducerea absorbţiei de folaţi şi creşterea necesarului favorizată de infecţiile urinare
frecvente. Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic, determinând creşterea de
aproximativ 5 ori a posibilităţii de apariţie a deficienţei de acid folic în ultimul trimestru
al sarcinii.
Lipsa acidului folic, necesar pentru sinteza ADN, determină tulburări de maturaţie
şi multiplicare celulară, cu repercursiuni asupra produsului de concepţie, mergând de la
malformaţii ale tubului neural, pâna la avort. Rolul acidului folic în etiologia defectului
de tub neural precum şi metodele de profilaxie ale acestor malformaţii prin suplimentarea
dietei femeii gravide sunt foarte importante.
În condiţii patologice, necesităţile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei
eritropoeze foarte active (de ex. anemia hemolitică cronică). Malabsorbţia poate duce la
un deficit de acid folic în condiţiile unui aport de folaţi normal; ea are drept cauză
afecţiuni ale intestinului (sprue tropical, enteropatia glutenică etc.), alcoolismul cronic
sau medicamente ce acţionează probabil pe această cale (fenitoina, barbiturice).
Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului, unor rare
deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). În
celulele în care aceşti inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea
deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) şi drept consecinţă
are loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanţurile de ADN într-o proporţie ce va
depăsi cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc, excizează şi repară eroarea, rezultând
astfel false lanţuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică.

I aport inadecvat dieta neechilibrată(alcoolici, adolescenţi, copii în

creştere)
II necesităţi crescute 1.sarcina
2.copilărie
3.neoplasm
4.eritropoeză crescută(anemie hemolitică cronică)
5.boli cronice exfoliative ale pielii
6.hemodializă
III malabsorbtia 1.sprue tropical
2.enteropatie glutenică
 3.medicamente:fenitoina, barbiturice
IV interferarea căilor 1.inhibitori DHFR(Metotrexat)
metabolice 2.etanol
3.rare deficite enzimatice (DHFR)

Cauzele deficitului de folati

4.2. Folaţii şi sarcina; profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea

acidului folic

Datorită rolului fundamental al folaţilor în replicarea celulară, s-a stabilit pentru

prima oară în 1964, de către Hibbard că deficitul de folaţi, cunoscut deja ca fiind
răspunzător de hematopoeza anormală, ar putea induce modificări şi asupra produsului de
concepţie şi a placentei, putând (mai ales dacă apare la începutul gestaţiei) da avorturi
spontane sau malformaţii. În ultimul timp, interesul cercetătorilor a fost focalizat mai ales
spre relaţia deficit de acid folic –malformaţii ale tubului neural (prima asociere în acest
sens a fost facută de Hibbard, 1965, când 66% dintre mamele cu produs de concepţie
afectat au avut concentraţii crescute de acid forminoglutamic în urină). Un studiu
prospectiv privind nivelul folaţilor eritrocitari la gravide în primul trimestru de sarcină a
arătat o incidenţă semnificativ crescută a malformaţiilor la gravidele cu nivel al folaţilor
eritrocitari redus (<130μg/ml).
Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost
obiectul unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 şi
finalizat în 1991 (MRC Vitamin Study Group 1991); astfel, una din patru femei având în
antecedente o sarcină afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de
minimum 12 săptămâni înaintea concepţiei şi în timpul primelor 3 luni de sarcină. Riscul
apariţiei malformaţiilor de tub neural la produsul de concepţie a fost semnificativ mai mic
la gravidele ce au primit acid folic faţă de lotul martor.
Confirmarea efectului protector al suplimentării folaţilor în profilaxia recurenţei
malformaţiilor de tub neural susţine utilitatea administrării de folaţi la femeile ce aparţin
unei grupe de risc (din punct de vedere al apariţiei malformaţiilor neurale fetale) şi pune
problema extinderii administării profilactice a folaţilor la toate femeile gravide.
 Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folaţi sub valorile
recomandate (300μg de folaţi/zi), dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs
de concepţie normal; oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a
apartenenţei gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere, făcând foarte
greu o profilaxie ţintită.
Cele trei mari direcţii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folaţi şi a
consecinţelor acestuia, sunt: educaţia generală privind dieta (cu o atenţie specială privind
grupurile cu cerinţe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice, sindroame de
malabsorbţie, tulburări metabolice), suplimentare a alimentelor cu acid folic şi
administrarea suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt
timp.
Din punct de vedere al avizului privind dieta, se recomandă consumul crescut de
legume proaspete, spanac, fulgi de porumb, lapte (de exemplu o supă de spanac conţine
aproximativ 125 μg, o porţie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg). Astfel, se
combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic
scăzut, accentul fiind pus pe alimentele populare şi nici foarte scumpe. Orientarea
populaţiei pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară, atât în
perioada antenatală, cât şi în şcoli şi în rândurile adolescenţilor.
Suplimentarea artificială cu folaţi a alimentelor comerciale disponibile
pune problema libertăţii de opţiune şi a posibilelor reacţii adverse, precum neuropatia
datorată unui exces de acid folic la vârstnici. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu
precădere de către populaţia ţintă, iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim
protector (pentru a evita aportul excesiv de acid folic); cele mai frecvente alimente
îmbogăţite în folaţi sunt pâinea (există deja pâine suplimentată cu conţinut în folaţi
120μg/100 grame), iar fulgii de porumb sunt fortificaţi la 250 μg/100g (75μg/porţie
medie); aceste evaluări aparţin Expert Advisory Group şi sunt valabile pentru produse
alimentare in Marea Britanie.
Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru
marea masă a populaţiei, întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia
probabil de consult şi tratament adecvat. Din nefericire, în general concepţia nu este
planificată şi numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal.
 Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi)
în scop profilactic, dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze
“fiziologice” (0,5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. Astfel, deşi nu se cunosc
posibilele reacţii adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate, se
recomandă doze mici pentru mamele cu risc mic şi doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu
risc crescut. În orice caz, suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepţiei şi
continuată primele 8-12 săptămâni de sarcină. Un efect protector, dar de intensitate mai
mică, poate fi obţinut şi dacă suplimentarea este începută mai tarziu, chiar la începutul
gestaţiei.
În concluzie, dozele sugerate au fost stabilite empiric şi nu se ştie dacă efectul
protector al folaţilor împotriva apariţiei malformaţiilor este la fel de cert ca şi cel
împotriva recurenţei lor. Deşi nu s-au evidenţiat încă reacţiile adverse pentru doze mari,
ele pot apărea abia după mulţi ani, aşa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene
ale vitaminei A (1990). Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării
dozelor farmacologice dacă nu există o justificare clară.
Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc
crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică şi poate fi obiectul unor cercetări
ulterioare la noi în ţară.

4.3. Acidul folic, ţinta terapiei anticanceroase

Terapia antineoplazică depăşeşte în vechime vârsta de 50 de ani. Dacă înainte de

1940 cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental, astăzi
chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Principalul progres al
ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenţi antineoplazici descoperiţi, ci în
dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri
terapeutice mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente, incluzând
agenţi antineoplazici şi stimulatori ai răspunsului biologic; înţelegerea mecanismelor de
acţiune ale medicamentelor, lucru care duce la prevenirea sau micşorarea efectelor toxice;
aprofundarea mecanismelor de rezistenţă la terapie; creşterea întrebuinţării terapiei
adjuvante (prevenirea recidivelor şi distrugerea micrometastazelor, după radioterapie
şi/sau chirurgie) şi neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau chimioterapie
sau chirurgie pentru scăderea masei tumorale); lărgirea cunoştinţelor despre iniţierea
tumorală, diseminarea, implantarea şi creşterea metastazelor.
Antimetaboliţii sunt substanţe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacţiilor
enzimatice ale metabolismului intermediar, sau cu analogi inactivi ai substraturilor
reacţiilor specifice. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului
celular. Antimetaboliţii nu sunt administraţi obişnuit ca medicatie unică, datorită
specificităţii de fază şi a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte
multiple.
Acidul folic reprezintă o ţintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală, datorită
rolului său esenţial în sinteza precursorilor ADN. Formele reduse de acid folic
(tetrahidrofolaţi) sunt necesare pentru sinteza purinelor şi a timidilatului. N10-formil-FH4
şi N5, N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului
inozinic, precursorul adenilatului (AMP) şi guanilatului (GMP). Într-o altă cale
metabolică importantă, N5, N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil şi doi atomi de
hidrogen pentru sinteza timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. Farber şi colab. au propus
că analogii acidului folic pot inhiba proliferarea celulelor maligne, o ipoteză care a fost
confirmată de testele iniţiale, cu aminopterină (acid 2,4 diamino 4 dezoxifolic), în 1948.
Acest compus a fost înlocuit mai târziu cu derivatul său N10 metilat, metotrexatul (MTX).
Antifolaţii ocupă un loc important în terapia antineoplazică; aceştia au produs
prima remisie temporară a leucemiei (Farber et al. 1948) şi prima vindecare a unei tumori
solide, coriocarcinomul (Hertz, 1963). Procentajul crescut de remisiuni complete ale
coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. Interesul pentru
antifolaţi a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari combinate cu
leucovorină (acid folinic, factor C), care scade efectul toxic al metotrexatului. Folosirea
dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic,
tumori ce nu răspund la doze mici. MTX este folosit şi în terapia psoriazisului, o boală
non-neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă, anormală a celulelor epidermoide
(McDonald 1981). În plus, antifolaţii sunt inhibitori puternici ai reactivităţii imune
mediate celular, având şi rol de agenţi imunosupresori ce se folosesc în transplantele de
organe, în tratamentul artritei reumatoide şi în granulomatoza Wegener (Jackson 1984,
Chabner et al. 1985).
Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaştere
clinică, ca medicament eficace, cu toxicitate acceptabilă. În ultimii 20 de ani au fost
testaţi clinic noi compuşi antifolaţi, cum ar fi diaminopirimidinele şi chinazolinele. Cel
mai recent dintre acestea este trimetrexatul, un antifolat chinazolinic lipofil, care ocoleşte
obligativitatea din cazul folaţilor şi a metotrexatului de a folosi transportul activ.
Trimetrexatul are activitate puternic antiparazitară şi efecte antineoplazice, testate încă în
ambele specialităţi. Un alt folat din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10-etil-5-
diazo-aminopterina), un inhibitor potent al dihidrofolat reductazei, care posedă transport
şi poliglutamare îmbunătăţite faţă de metotrexat. Trimetrexatul şi 10-EDAM au
demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul carcinoamelor de intestin, plămân.
MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS),
alături de toţi ceilalţi antimetaboliţi. În general, drogurile CCS s-au dovedit eficace
împotriva malignităţilor hematologice şi a altor tumori în care proliferează o proporţie
relativ crescută de celule.
O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistenţa la drog. Unele
tipuri tumorale, cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistenţă
primară, adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. Rezistenţa dobândită se
dezvoltă în diferite tipuri de tumori iniţial sensibile la tratament. Experimental, se poate
observa apariţia unei rezistenţe specifice pentru un anumit drog, care apare datorită
fenomenului de amplificare genică. Alteori se observă un fenotip cu rezistenţă multiplă,
după expunerea la un singur agent. Acesta este frecvent asociat cu creşterea expresiei
genei MDR 1 pentru o glicoproteină membranară (glicoproteina-P), implicând efluxul
medicamentului. Această proteină transportoare, care apare atât în celule normale cât şi în
celule tumorale, foloseşte energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine, nefiind
limitată doar la agenţii antineoplazici. Un alt mecanism de rezistenţă multiplă implică
modificări calitative şi cantitative în topoizomeraza II, enzima care repară leziunile
produse în ADN de medicamentele antineoplazice.
Principalele mecanisme de rezistenţă cunoscute sunt:
- transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987);
- producţia de forme de DHFR alterată, care are afinitate scăzută pentru
inhibitor (Thill et colab. 1988);
- creşterea concentraţiei intracelulare a DHFR;
- scăderea abilităţii de a sintetiza poliglutamaţi de MTX;
- scăderea activităţii timidilat-sintetazei (Curt 1985).

NH2 COOH

N CH2 N CO N CH
N H
R CH2
H2N N N
CH2

COOH
Aminopterina R= - H
Metotrexat R= - CH3

Cl
NH2 COOH

N CH2 N CO N CH
N H
CH3
CH2
H2N N N Cl
CH2
Diclormetotrexat COOH

NH2 COOCH2CH3

N CH2 N CO N CH
N H
CH3
CH2
H2N N N
CH2

NH2 COOCH2CH3
Dietilesterul metotrexatului
N
H2N Cl
N
Cl
2,4-Diamino 5(3',4' diclorfenil)
6 metilpirimidina - DDMP

Analogi ai folatilor de interes clinic

 Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor

4.4. Mecanisme de acţiune şi rezistenţă

Activitatea antitumorală a analogilor de folaţi este rezultatul substituţiei unei

grupări amino cu una hidroxil în poziţia 4 a inelului pteridinic, schimbare care transformă
molecula de folat din substrat, într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima cheie a
metabolismului folic intracelular, dihidrofolatreductaza (DHFR).
Pentru a întelege acţiunea metotrexatului şi a altor antifolaţi, este necesar să se
determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaţilor. Derivaţii acidului folic
sunt coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolaţi. În reacţia timidilat
sintetazei (TS), acidul N5, N10 metilen FH4 este convertit la DHF. Acest cofactor inactiv
devine apoi substrat pentru DHFR, care transferă doi atomi de hidrogen de la cofactorul
NADPH la DHF pentru a forma FH4. În celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat,
inhibiţia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat în
formă inactivă, de DHF, ceea ce are ca rezultat inhibiţia sintezei purinelor şi timidilatului.
Astfel, citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo
a purinelor şi a sintezei timidilatului, iar importanţa relativă a fiecărui efect variază la
diferitele tipuri de celule cultivate in vitro şi, probabil, la celulele normale şi maligne in
vivo.
Borsa şi Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului faţă de limfocite de
şoarece poate fi crescută prin administrarea de purine, probabil datorită creşterii efectului
antitimidilat al MTX. Totuşi, în modelele de limfom L5178, MTX a avut un efect
antipurinic letal. În general, întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în prezenţa
unor nivele crescute de timidilat sintază şi se produce prin consumarea rezervelor de
folaţi reduşi necesare sintezei acestora. Deoarece legarea strânsă de DHFR şi depleţia
consecutivă a folaţilor reduşi sunt esenţiale pentru mecanismul de acţiune a MTX,
activitatea timidilat sintazei modulează citotoxicitatea MTX. Inhibiţia timidilat sintazei
(prin administrarea F-pirimidinelor şi reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul
folaţilor reduşi şi reduce citotoxicitatea MTX. Importanţa activităţii timidilat sintazei în
determinarea citotoxicităţii MTX a fost confirmată recent de Tattetersall şi colaboratorii,
care au investigat capacitatea timidinei de a proteja culturi de celule mamare împotriva
unei doze letale de MTX. Când a fost administrată cu două ore înaintea MTX, timidina a
protejat ambele linii celulare, normale şi maligne. Măsurarea rezervelor intracelulare de
nucleotide a demonstrat că timidina realizează o depleţie a rezervei de dUMP (prin
inhibiţia cu TTP a dCMP deaminazei) şi încetineşte reacţia timidilat sintazei, conservând
astfel folaţii reduşi şi păstrând sinteza de novo a purinelor. MTX-ul poliglutamat are un
efect inhibitor puternic şi direct asupra timidilat sintazei şi a enzimelor sintezei purinelor;
prin aceste efecte inhibitorii pot contribui direct la citotoxicitatea drogului.
Evenimentele care conduc la acţiunea citotoxică a MTX, începând cu
transformarea membranelor celulare, transformarea în derivaţi poliglutamaţi, legarea de
DHFR, deleţia folaţilor reduşi intracelulari şi inhibiţia sintezei ADN constituie paşi
importanţi în determinarea răspunsului la tratament şi a toxicităţii acestui medicament.

4.5.Transportul transmembranar

Traversarea de către antifolaţi a membranelor celulare a fost studiată cu multă

atenţie datorită legăturii dintre anomaliile de transport şi rezistenţă. Studiile clasice ale lui
Goldman şi colab. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ sensibil la
temperatură, dependent probabil de o proteină transmembranară. Influxul poate fi
observat şi în vezicule membranare izolate.
Aportul celular de folaţi se produce prin cel puţin două mecanisme independente:
folaţii reduşi sunt internalizaţi printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu
afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic, întâlnit în majoritatea celulelor, iar
acidul folic şi 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care leagă
folatul (FBP folate binding protein). FBP leagă folaţii cu afinitate crescută (Kd de ordinul
nM) şi apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de
receptori. Se pare că FBP acţionează la concentraţii scăzute de folaţi (<50 nM) iar
carrierul la concentraţii normale sau crescute.
Macromoleculele care leagă folaţii au fost izolate din membranele unor celule de
mamifere, dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport. Mecanismul transportor al MTX în
celulele leucemice murinice şi umane este deasemenea utilizat de folaţii reduşi naturali,
incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). MTX şi folaţii reduşi
concurează, deci, pentru a intra în celulă. În plus, printr-un proces cunoscut sub numele
de heteroschimb, MTX intracelular liber este forţat să iasă din celule atunci când intră în
celule cantităţi crescute FH4 extracelular.
Gena RFC e localizată distal, pe braţul lung al cromozomului 21. Afinitatea
“carrier”-ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule
tumorale (murine şi umane), în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este
oarecum mai scăzută Km=87 μM. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor
tumorale este considerată ca fiind explicaţia persistenţei mai îndelungate a MTX liber
intracelular şi poate contribui la selectivitatea acţiunii antifolaţilor împotriva tumorilor,
faţă de celulele normale. Acumularea MTX în celulele tumorale poate fi influenţată de
alţi agenţi antitumorali, incluzând medicamente frecvent utilizate ca antifolaţi în terapiile
combinate. Vincristina creşte MTX intracelular, inhibând efectul medicamentului.
Concentraţia vincristinei necesară pentru a produce acest efect (10μM) nu este uşor
obţinută în timpul chimioterapiei clinice, care produce frecvent niveluri sanguine maxime
ale vincristinei mai mici de 0,1μM. Influxul MTX este inhibat de ouabaină,
glucocorticoizi şi cefalotin, în timp ce acumularea este crescută de probenecid, prin
inhibarea efluxului. Nici una dintre aceste interacţii nu a dovedit că afectează chimio
terapia clinică.
Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influenţează puternic procesul de
transport. Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX
de 3 ori mai mare şi o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în
faza staţionară de creştere. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori.
Dependenţa transportului de ritmul de creştere poate contribui la creşterea citotoxicităţii
MTX pentru celulele care se divid rapid, dar şi mărirea necesarului de folaţi reduşi în
fazele de creştere rapidă pentru a contribui la aceasta. În continuare la procesul de
transport activ cu afinitate crescută, descris mai sus, un al doilea mecanism de intrare
apare la concentraţii crescute ale drogului (peste 20μM). Acest al doilea proces poate fi
difuzie pasivă, sau un proces realizat pentru un “carrier” specific. Alte aspecte ale acestui
proces de transport sunt lipsa competiţiei dintre MTX şi FH4 pentru intrare, precum şi
absenţa heteroschimbului dintre MTX si FH4. Mecanismul de intrare explică abilitatea
celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la concentraţii extracelulare crescute şi
reprezintă o motivaţie raţională a utilizării dozelor crescute de MTX în chimioterapie. Un
studiu recent a lui Henderson şi Zeveny a evidenţiat doar o singură cale de influx cu
afinitate crescută pentru concentraţii de până la 50μM, dar trei sisteme de eflux pentru
MTX. Cel mai important dintre acestea pare să fie acelaşi care mediază şi influxul de
MTX. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la bromosulfonftaleină, în timp
ce a treia a fost insensibilă la această substanţă şi la inhibitori competitivi ai MTX.
Contribuţia acestor componente la eflux poate fi modificată în funcţie de prezenţa
extracelulară a anionilor glucozei, sau a inhibitorilor metabolici. Acumularea şi
persistenţa drogului în tumori faţă de ţesutul normal determină în mod clar durata sa de
acţiune în teritorii specifice. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari şi o
persistenţă mai îndelungată a drogului în celulele leucemice ale murinelor, sensibile la
MTX, faţă de epiteliul intestinal, în timp ce linia celulară sarcomatoasă 180 rezistentă, a
acumulat concentraţii mai scăzute de drog, a avut perioade mai scurte ale inhibiţiei
sintezei ADN şi a fost neafectată în experimentele chimioterapice. Analiza specifică in
vitro a ratelor de preluare a medicamentului de către celulele leucemice a evidenţiat o
relaţie pozitivă similară între răspunsul la medicament şi transport.
Există diferenţe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverşi
antifolaţi. Antifolaţii chinazolinici au o rată de eflux mai crescută. Aceste diferenţe se
corelează cu acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor şi aminopterinei faţă de
MTX, după doze echimolare în vivo. Importanţa transportului MTX în determinarea
răspunsului clinic este nesigură. Alte mecanisme de rezistenţă, în special creşterea
concentraţiei de DHFR ca urmare a amplificaţiei genice, au fost observate în tumori
umane şi murinice expuse la creşteri treptate ale concentraţiei drogului in vitro care poate
fi un mecanism la fel de important şi în practica clinică. Înţelegerea rezistenţei la
antifolaţi la nivel clinic rămâne incompletă. Au fost propuse noi investigaţii, cu scopul de
a ocoli rezistenţa cauzată de deficienţa de transport. Antifolaţii liposolubili, cum sunt
esterii de MTX, diaminopirimidinele, triazinaţii şi trimetrexatul au o excelentă activitate
antitumorală în culturile de celule în tratamentul experimental al tumorilor la rozătoare şi
ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport. Dibutilester-MTX are deasemenea
proprietatea neobişnuită de a inhiba încorporarea timidinei în ADN, aparent datorită
inhibiţiei transportului nucleozidelor. Diesterii MTX sunt rapid hidrolizaţi la compusul de
bază în plasma de şoarece, dar sunt mai stabili în plasma maimuţei, câinelui şi omului;
când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiţi la derivaţi α şi γ
monobutilici, fiind inhibitori stabili şi eficace ai DHFR. Proprietăţile de transport ale
monobutilesterilor nu au fost încă definite. Conjugaţii de MTX şi polilizină, care sunt
toxici pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient, oferă şi
posibilitatea de a ocoli rezistenţa la transport. Deoarece conjugatul polilizin-MTX nu
inhibă direct DHFR şi toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea simultană de
leucovorină, este probabil că şi compusul suportă liza intracelulară, cu eliberarea
antifolatului.
Shen şi colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză şi prin liza
enzimatică ce apare în lizozomi. Astfel, conjugatul polilizină-MTX este transportat
printr-un sistem “carrier” independent. Tiamin pirofosfatul, care inhibă transportul MTX,
protejează fibroblaştii de şoarece de toxicitatea MTX, dar nu de aceea a polilizin-MTX.
Deşi acidul folic este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea
MTX, este incapabil să salveze o murină rezistentă la transport de efectele polilizin-
MTX, probabil deoarece, ca şi MTX, acidul folic este incapabil să intre în celulele
rezistente la transport.
O altă încercare de a depăşi rezistenţa la transport este încapsularea MTX în
vezicule fosfolipidice bistrat, numite lizozomi. Aceste plachete microscopice ce conţin
medicament pot, teoretic, transporta MTX la suprafaţa celulară, unde intrarea poate fi
făcută prin pinocitoză, sau prin contopirea membranelor celulare şi lipozomice.
Lasserman şi colab. au reuşit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene, conţinând
MTX, spre celulele mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaţa lor
imunoglobuline cu afinitate pentru haptene. Deşi lipozomii localizau celule ţintă
mielomatoase cu acurateţe nu a fost observată nici o inhibiţie a încorporării deoxiuridinei,
deoarece conţinutul veziculelor nu a putut intra în celulă. Deşi rezultate încurajatoare cu
lipozomi încărcaţi cu MTX au fost raportate pe modele animale, majoritatea dovezilor
sugerează că îmbunătăţirea supravieţuirii provine de la întârzierea nespecifică a
clearence- lui plasmatic şi nu din transportul selectiv al medicamentului la tumora. O
excepţie posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare a MTX in lipozomi
termolabili. Dacă tumora este apoi incălzită, eliberarea preferenţială a MTX apare la
sediul tumorii, ducând la o activitate terapeutică îmbunătăţită.

NH2 COOH

N CH2 N CO N CH
N H
CH3 CH2
H2N N N
CH2 COOH

O C N CH
H
CH2

COOH

MTX – γ - aspartat
Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ - peptidice

Un alt experiment a fost folosit de Heath şi colab., folosind MTX-γ aspartat,

conţinut în lipozomi înveliţi în anticorpii specifici antitumorali. Acest analog de MTX are
capacitate limitată de a traversa membrana celulară şi este de 200 de ori mai puţin toxic
decât MTX, datorită transportului deficitar. Citotoxicitatea a apărut doar prrin eliberarea
intracelulară a drogului via lipozomi îmbrăcaţi cu anticorpi specifici pentru fibroblaşti
murinici L 929. În mod ideal, va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane
comune în scopul de a face acest experiment util din punct de vedere clinic.

4.6. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază

Caracteristicile fizice ale legării NADPH şi a MTX de DHFR au fost stabilite prin
studii cristalografice cu raze X şi prin determinarea secvenţelor de aminoacizi ale
enzimelor naturale şi ale celor modificate chimic. Au fost studiate enzime bacteriene şi de
la mamifere; secvenţele de aminoacizi posedând similitudini puternice în poziţiile
implicate în legarea cofactorilor sau a inhibitorilor. În general, MTX este legat printr-o
porţiune lungă, hidrofobă, formată din izoleucina-7 (sau leucina-7), alanina-9, leucina-31,
fenilalanina-34 şi alte reziduuri. Două interacţii mai importante participă la potenţarea
legării 4-amino-antifolaţilor:
a) oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de hidrogen
cu gruparea 4-aminei ;
b) gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protonează
atomul N al MTX, dar nu şi pe cel al substratului fiziologic (FH4). În
plus, substratul fiziologic pare să se lege de enzimă într-o configuraţie
răsturnată, în comparaţie cu inhibitorul.
În prezenţa NADPH-ului în exces, afinitatea de legare a MTX de reductază a fost
estimată între 1nM şi 1pM. Această afinitate este crescută de pH-ul acid, potenţată de
ionii de K+ şi oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. În condiţiile unui pH scăzut, a
excesului de NADPH şi a unei afinităţi scăzute a inhibitorului faţă de enzimă, legarea
este stoechiometrică, ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă
de enzimă. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil, supravieţuind
electroforezei în gel şi filtrării în gel.
NADH are deasemenea capacitatea de a acţiona ca şi cosubstrat pentru DHFR în
locul NADPH, pentru reducerea folatului şi a dihidrofolatului. Spre deosebire de
NADPH, NADH nu asigură legarea MTX de DHFR. Importanţa raportului dintre NADH
şi NADPH în determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită.
Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un
complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. Procesul a fost denumit inhibiţie strâns
legată şi lentă. Alţi analogi de folaţi, incluzând diaminopirimidinele, trimetroprimul şi
aminopterina urmează acelaşi proces cinetic, de “legare strânsă şi lentă”, în timp ce
pteridinele ce nu au gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi
clasici ai enzimei. Cinetica a fost evaluată folosind şi modele de simulare .
În terapeutică, MTX acţionează ca un inhibitor cu legare strânsă, dar reversibil. În
condiţiile unor concentraţii crescute de substrat competitiv şi la un pH normal, este
necesar un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiţii complete a
enzimei. În culturile de celule şi în sisteme acelulare, 3H-MTX (MTX marcat cu 3H)
legat de enzimă poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog,
fenomen ce indică o disociere lentă, dar stabilă a MTX de pe enzimă. Acestă disociere
lentă este considerabil mai rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în
prezenţa unui exces de NADPH. Motivul acestei diferenţe este încă neclar, dar poate fi
rezultatul diferenţelor din mediul ionic, de legare prin complexe cu afinitate scăzută a
drogului cu DHFR şi NADP+, sau doar cu enzima. Deci este necesar un exces de drog
liber, nelegat, pentru a menţine inhibiţia totală a DHFR şi a sista sinteza timidilatului. De
exemplu, dacă se incubează celule tumorale cu cantităţi crescute de MTX pentru a
permite titrarea totală a enzimei şi apoi se scoate drogul nelegat din soluţie, sinteza
timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenţei MTX intracelular legat de enzimă.

CAPITOLUL 5. REZULTATE EXPERIMENTALE

În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina

concentraţia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat, rinichi, creier,
splină) la şobolanii albi; acest studiu a fost
realizat în scopul aflării variaţiei concentraţiei de acid folic în funcţie de:
- vârstă;
- organ.
Pentru curba de etalonare am folosit:
- metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare;
- reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic.
 Concentraţiile acidului folic în funcţie de vârstă şi de organ le-am estimat prin
metoda descrisă de Lowry (Lowry, 1951), cu ajutorul acidului fosfomolibdenowolframic.

Determinarea concentraţiei de acid folic la şobolani

5.1. Material şi metodă

Animale şi dietă
Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de şobolani albi, de sex masculin, fiecare
grup constând în cinci şobolani de vârstă şi greutăţi apropiate, astfel:
1)-primul grup: şobolani tineri, cu vârsta mai mică de şase luni şi greutate mai mică de 50
de grame;
2)-al doilea grup: şobolani adulţi, cu vârste cuprinse între şase luni şi un an şi greutate
cuprinsă între 100 grame şi 125 grame;
3)-al treilea grup: şobolani bătrâni, cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult şi greutate
mai mare de 125 grame.
Toţi şobolanii au fost supuşi la aceeaşi dietă.

Prepararea omogenatelor tisulare

Toate operaţiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaţii
biochimice se fac la 0-4˚ C. Sticlăria de lucru, eprubetele şi cupele de centrifugă, soluţiile
de spălare şi mediile de omogenizare au fost păstrate la gheaţă şi au fost reci în momentul
întrebuinţării.
Animalele de laborator au fost decapitate şi apoi supuse exsanguinării.
S-au izolat organele necesare experimentului: ficat, rinichi, creier şi splină, iar
apoi s-au presat uşor pe hârtie de filtru, pentru a îndepărta sângele. S-au cântărit foarte
repede.
Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menţinut în
gheaţă) cu soluţie rece de NaCl 0,15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede.
Apoi, cu o foarfecă s-a mărunţit bine organul şi s-a spălat cu NaCl 0,15M, pâna ce
soluţia de spălare a rămas limpede.
 Pentru omogenizare 5 ml de soluţie de NaCl 0,15M au fost adăugaţi pe gramul de
ţesut (cu scopul de a obţine un omogenat de concentraţie 10%).
Ţesuturile uşor poterabile (ficat şi creier) au fost omogenizate la 1500rpm, timp
de 2 minute, într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Ţesuturile mai dure
(rinichi şi splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută.
Omogenatele obţinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o
prealabilă echilibrare). Sunt sedimentaţi:
-nucleii;
-celulele întregi;
-debriurile celulare;
-hematiile.
Supernatantul se decantează şi se păstreaza în gheaţă pentru alte determinări
biochimice.
Pentru a putea compara şi interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe
omogenate, materialul biologic s-a standardizat în două moduri:
-prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de
preparare);
-prin raportare la conţinutul proteic al omogenatului.

Standard de preparare
Iniţial organul sau fragmentul de organ se cântăreşte. În funcţie de greutatea sa se
realizează omogenate de 10-20%, diverse soluţii de omogenizare.
Standardizarea se obţine preparând totdeauna omogenate de aceeaşi concentraţie.

Raportarea la conţinutul proteic

Este metoda de standardizare cea mai utilizată.

Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare

(metoda biuretului)
-sensibilitate de 0,25-10mg/ml omogenat
 Principiu:

Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră

caracteristică, a cărei intesitate este direct proportională cu concentraţia proteinelor din
probă.

Reactivi:

1.reactivul biuret;
2.NaOH 10%.
Reactivul biuret se prepară astfel:
-tartrat de sodiu şi potasiu –9g;
-CuSO4·5H2O –3g;
-KI-5g;
Se dizolvă şi se aduce la 1000ml cu NaOH 0,2N.
Reactivul preparat corect este de culoare albastră. Se păstrează timp nelimitat.
Dacă reactivul este contaminat cu alte substanţe apare un precipitat roşcat şi nu se mai
foloseşte.

Tehnica

Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluţii limpezi, ele prezintă o anumită

turbiditate, dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacţia de culoare.
Se face pentru fiecare determinare şi un martor de turbiditate.

Martor de culoare Martor de turbiditate Proba

2 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată 1,8 ml apa distilată
0,2 ml omogenat 0,2 ml omogenat
1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10% 1 ml NaOH-10%
3 ml reactiv biuret 3 ml apa distilată 3 ml reactiv biuret

Se agită bine. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei, după care se

citeşte extincţia la lungimea de undă de 540 nm, cu grosimea stratului de 10 nm.
 Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare , iar extincţia martorului
de turbiditate faţă de cea a apei distilate.
Calculul cantităţii de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare diferenţei
dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon

-se prepară o soluţie standard de albumină serică de bou;

-se pregăteşte o scară de diluţii de concentraţii cunoscute cuprinse între 0,25-60 mg/ml ;
-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior ;
-se reprezintă grafic modul de variaţie a extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei de
proteine

Concentraţie (mg/ml) Extincţie (p/c-t/H2O)*

60 0,617
30 0,320
15 0,166
7,5 0,090
3,75 0,042
1,875 0,024
0,9375 0,012
0,46875 0,006
0,234375 0,003
*)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de
turbiditate faţă de cea a apei distilate

5.2.Determinarea conţinutului în acid folic

Reactivi
 -fosfat dibazic de potasiu soluţie 3%;
-permanganat de sodiu 0,4%;
-azotit de sodiu soluţie 2%;
-acid clorhidric soluţie 5N;
-acid sulfamic soluţie 5%;
-diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluţie 0,1%.

Tehnica

Proba Martor de turbiditate Martor de culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml omogenat 2,5 ml KmnO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml apă 0,5 ml KMnO4
Se lasă 2-3 minute
0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2
0,5 ml HCl 0,5 ml HCl 0,5 ml HCls
Se agită puternic şi se lasă 2 minute
O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic O,5 ml acid sulfamic
Se agită puternic până la îndepărtarea NO2
0,5 ml NED 0,5 ml NED 0,5 ml NED

Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare şi a martorului de

turbiditate faţă de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în cuvă
de 10 mm.
Calculul cantităţii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare
diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.

Curba etalon:

-se prepară o soluţie standard de acid folic;

 -se pregăteşte o scară de diluţii cu concentraţii cunoscute cuprinse între 1,2023-
130 μg/ml;
-se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior;
-se reprezintă grafic modul de variaţie al extincţiei în funcţie de concentraţia
soluţiei de acid folic.

Concentraţie Extincţie Extincţie

μg/ml p/t* p/c –t/H2O
130 1,226 1,2648
108,33 1,0508 1,0728
86,66 0,8756 0,8555
65 0,6198 0,565
43,33 0,3585 0,2905
21,66 0,2758 0,1766
10,83 0,1555 0,0718
7,22 0,1394 0,0431
3,61 0,1180 0,0303
*)extincţia probei faţă de cea a martorului de turbiditate
**)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului
de turbiditate faţă de a apei distilate.

Măsurarea cantităţilor de acid folic din omogenatele tisulare

Concentraţiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen

diamina), o metodă de bază, spectrofotometrică. Această metodă se foloseşte ca tehnică
de dozare în industria farmaceutică (Atanasiu şi colab., 1989)
.
Reactivi
-_monofosfat de potasiu –3%;
- permanganat de potasiu –0,4% ;
- NaNO2 -2%
- acid hidrocloric – 5%;
- acid sulfamic –5%
 - NED-0,1%

Tehnica

Proba Martor de culoare

2,5 ml omogenat 2,5 ml K2HPO4

0,5 ml KMnO4 0,5 ml KMnO4

Se lasă 2-3 minute

0±,5 ml HCl 0,5 ml HCl

0,5 ml NaNO2 0,5 ml NaNO2

Se agită şi se lasă 2 min

0,5 ml acid sulfamic 0,5 ml acid sulfamic

Se agită până când N2 este complet înlăturat

0,5 ml NED 0,5 ml NED

 Se lasă 10 minute

Se citeşte extincţia faţă de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm;

concentraţia de acid folic corespunzătoare acestei extincţii s-a calculat prin raportarea la
curba standard (prin metoda expusă anterior).
Rezultatele obţinute s-au exprimat atât în funcţie de greutatea iniţială a organului
(μg de acid folic/g de ţesut), cât şi în funcţie de concentraţia de proteine din omogenat
(μg de acid folic/mg de proteine).

Măsurarea concentraţiei de proteine din omogenat

Concentraţia de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry,

1951), metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”).

Reactivi

Reactivul A: - 4g NaOH;
-10g sare Seignette;
-apă distilată până la 1000ml;
Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O;
-apă distilată până la 1000 ml;
Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0,5 ml reactiv B;
Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic.

Tehnica
 Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată, iar apoi se adaugă 5ml
reactiv C şi 0,5ml reactiv Folin-Ciocâlteu; întregul amestec a fost agitat şi după aceea
lăsat timp de 30 de minute. Extincţia s-a citit la o lungime de undă de 660 nm, faţă de un
martor ce conţinea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Rezultatele au fost
deasemenea raportate la o curbă etalon, curbă construită pe baza unor concentraţii
proteice cunoscute (prin metoda descrisă anterior).
 OH
N CH2 NH CO N CH CH2 CH2 COOH
N H
COOH
H2N N N
KMnO4

OH
N COOH
N
+ PRODUSI
H2N N N

2-amino-4-hidroxi-6-carboxipteridina

U.V. - CO2

OH
N
N

H2N N N

2-amino-4-hidroxipteridina

1/2 O2

OH
N
N Isoxanthopterina
H2N N N OH

HCl 5N
HNO2

OH
N
N

HO N N OH

2,4,7-trihidroxipteridina
 OH
N
N

HO N N OH

2,4,7-trihidroxipteridina

H3NO3S

HO N NH2
CHO
+
COOH NH2
Acid glioxilic OH
2,4-dihidroxi-5,6-diaminopirimidina

Naftil-
etilen-
diamina

Compus violet

5.3.Rezultate şi discuţii

Variaţia concentraţiei de acid folic: în funcţie de vârstă şi organ

Acid folic Proteine

Concentraţie Concentraţie
(valoare ±eroare) (valoare±eroare)

Organ Grupa de μg de acid folic/g μg de acid mg de proteină/ml

vârstă de ţesut folic/mg de omogenat
proteine
 tânăr 431,48±4,76 25,74±1,76 2,80±0,99
Ficat
adult 322,07±3,36 30,12±1,12 2,71±0,43
bătrân 195,52±2,83 18,54±2,55 2,11±0,33
 tânăr 333,13±8,08 27,93±6,54 2,13±0,41
Rinichi
adult 208,57±4,54 20,37±3,88 1,25±0,13
 bătrân 227,31±2,03 46,73±9,07 1,13±0,13

tânăr 336,36±9,23 29,04±1,43 2,06±0,72

Creier
 adult 110,48±3,17 27,81±2,87 1,61±0,33

bătrân 27,08±2,31 7,44±2,77 1,23±0,27

tânăr 120,73±1,68 20,03±3,88 1,07±0,04

Splină

adult 109,03±9,74 17,08±2,53 1,13±0,17

 450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Ficat Rinichi Creier Splina
Tineri 431.8 333.13 336.36 120.73
Adulti 322.07 208.57 110.48 109.03
Batrani 195.52 227.31 27.08 91.53

bătrân 91,53±3,83 6,41±1,74 1,25±0,28

Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de ţesut

50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Ficat Rinichi Creier Splina
Tineri 25.74 27.93 29.04 20.03
Adulti 30.12 20.37 27.81 17.08
Batrani 18.54 46.73 7.44 6.41
Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/mg prot.

450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Tineri Adulti Batrani
Ficat 431.48 322.07 195.52
Rinichi 333.13 208.57 227.31
Creier 333.36 110.48 91.53
Splina 120.73 109.03 27.08

Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut

Variaţia concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă

Din studiul grafic al variaţiei concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă

(exprimată în μg de AF/g de ţesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulţi şi
spre bătrâni, cu excepţia concentraţiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. În acest
caz particular concentraţia de acid folic scade de la tineri la adulţi, ca apoi să crească
paradoxal la şobolanii bătrâni.
Sunt două posibile explicaţii prentru aceste variaţii neaşteptate.
1) prezenţa unei concentraţii crescute de folaţi în omogenatul de rinichi la tineri;
2) prezenţa unei concentraţii scăzute de proteine în acest omogenat.
Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. Această ipoteză
s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraţiilor proteinelor din
omogenatul de rinichi de la tineri şi de la adulţi.
 În ceea ce priveşte concentraţiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a
obţinut o scădere a concentraţiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime) de
la tineri spre adulţi.

Variaţiile concentraţiilor de acid folic în funcţie de organ:

Din toate tipurile de reprezentări grafice, pe grupe de vârstă, rezultă faptul că

indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de ţesut sau μg
acid folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folaţi s-a obţinut în omogenatul de
ficat; aceste rezultate sunt în concordanţă cu studiile histologice făcute anterior (Onicescu
şi colab., 1979) şi cu nivelul activităţii metabolice din ficat (implicând metabolismul
hepatic a unei singure unităţi carbonice).
S – au obţinut cantităţi mult mai mari de acid folic în ficat şi rinichi, faţă de valorile
corespunzătoare din splină şi creier.
 50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Tineri Adulti Batrani
Ficat 25.74 30.12 18.54
Rinichi 27.93 20.37 46.73
Creier 29.04 27.81 7.44
Splina 20.03 17.08 6.41

Variaţiile concetraţiilor de acid folic în funcţie de organ (exprimate în μg AF/mg de

proteine)

Concluzii
În acest studiu s-a dovedit o incidenţă crescută a deficitului de acid folic la bătrâni,
deficit cauzat în principal de malnutriţie. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a
demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la
bătrâni (ca de exemplu deficite imunologice şi neuropsihiatrice). Tabloul clinic nespecific
al malnutriţiei la bătrâni (care este adesea greşit diagnosticată) însoţit de deficienţă de
folaţi induc homocisteinemia şi se asociază cu un risc crescut cardiovascular. Aceste
observaţii sunt argumente în favoarea următoarelor concluzii:
1) stării nutriţionale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare importanţă decât
unui diagnostic de rutină
2) soluţia este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienţii cu risc de a
dezvolta o deficienţă de acid folic, la pacienţi instituţionalizaţi la geriatrie, la
pacienţii ce consumă mâncare conservată etc.); această soluţie este atât sigură cât
şi ieftină (singura reacţie adversă a fost observată la epileptici).
BIBLIOGRAFIE

Acuna J., Yoon P., Erickson J.D., Centers for Diseases Control and Prevention, 1999
Adams M.J Jr., Khoury M.J., Scanlon K.S., Stevenson R.E., Knight G.J., Haddow J.E.,
Sylvester G.C., Cheek J.E., Henry J.P., Stabler S.P., Allen R.H.-Teratology, 51, 311-317,
1995
Atanasiu V.-Acidul folic şi derivaţii săi în lumea vie, 34-70, 1997
Atanasiu V., Iacoban S., Stanciu B., Nitescu I.-Journal Medical Biochemistry, 2, 20-25,
1997
Atanasiu V., Niculescu I., Niculescu O., Iacoban S., Truţia E.-Romanian Journal of
Physiology, 34, 18-20, 1997
Atanasiu V., Stanciu B.- Spitalul, 3, 15-18, 1997
Atanasiu V.- Conference Book, International Biology, 1995
Berry R.J., Li Z., Erickson J.D., Li S., Moore C.A., Wang H., Mulinare J., Zhao P., Wong
L.Y., Gindler J., Hong S. X., Correa A., Hao L., Gunter E.-New England Journal of
Medicine, 341,30-32, 1999
Botto L.D., Khoury M.J., Mastroiacovo P., Castilla E.E., Moore C.A., Skjaerven R.,
Mutchinick O.M., Borman B., Cocchi G., Czeizel A.E., Goujard J., Irgens L.M.,
Lancaster P.A.L., Martiinez-Friias M.L., Merlob P., Ruusinen A., Stoll C., Sumiyoshi Y.-
American Journal of Medical Genetics, 71, 8-15, 1997
Botto L.D., Mastroiacovo P.- Clinical genetics, 53, 456-459, 1998
Botto L.D., Moore C.A., Khoury M.J., Erickson J.D.-New of Medicine, 341, 1509-1519,
1999
Botto L.D., Mulinare J.- American Journal of Epidemiology, 150, 323-324, 1999
Botto L.D., Yang Q.- American Journal of Epidemiology, 151, 862-867, 2000
Buehler J.W., Mulinare J.- Pediatric Annals, 26, 535-539, 1997
Castilla F., Cardenas J.- Bioquimica, 478-483, 1995
Carr F., Medina W.D., Dube S., Bertino J.R.-Blood, 62, 180-185, 1983
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
47, 773-778, 1998
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
49, 1-4, 2000
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
48, 914-917, 1999
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
47, 131-134, 1998
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
46, 721-723, 1997
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
45, 793-795, 1996
Centers for Diseases Control and Prevention- Morbidity and Mortality Weekly Report,
44, 694-699, 1995
Chu E., Takimoto C.H.,Voller D., Grem J.L., Allegra C.J.-Biochemistry, 32, 4756-4760,
1993
Cline M.J., Stang H., Mercola K., Morse L., Ruprecht R., Browne J., Salser W.-Nature,
284, 422-425, 1980
Cragan J. D., Roberts H.E., Edmonds L.D., Khoury M.J., Kirby R.S., Shaw G.M., Velie
E.M., Merz R.D., Forrester M.B., Williamson R.A., Krishnamurti D.S., Stevenson R.E.,
Dean J.H.-Teratology, 56, 37-49, 1997 26) Curtin N.J., Morris A.L.-Biochemistry
Pharmacology, 37, 2113-2120, 1986
Daniel W.W.-Biostatistics, 207-216, 1987
Djerassi I., CieselkaW., Kim J.S.-Cancer Treatment Report, 61, 751-752, 1977
Drews C.D., Yeargin-Allsopp M., Decoufle P., Murphy C.C.-American Journal of Public
Health , 85, 329-324, 1995
Edincott J.A., Ling V.-Biochemistry Journal, 291, 855-860, 1993
Fanin R., Banerjee D., Volkenandt M., Waltham M., Li W.W., Dicker A.P., Schweitzer
B.I., Bertino J.R.-Molecular Pharmacology, 44, 13-21, 1993
Forrester M.B., Merz R.D., Yoon P.W.-American Journal of Epidemiology , 148, 1206-
1211, 1998
Fridland A.-Cancer Research, 34, 1883-1888, 1974
Freisheim J.H., Kumar A.A., Blankenship D.T.-Chemistry and Biology of Pteridines,
419-424, 1979
Glode L.M., Pitman S.W., EnsmingerW.D.-Cancer Research, 39, 3707, 1979
Jackson R.C., Hart L.I., Harrap K.R.-Cancer Research, 36, 1991-1997, 1980
Jackson R.C.-Molecular Pharmacology, 18, 281-286, 1985
Jaharko D.S., Fung W.P., Yang K.H.-Cancer Research, 41, 1549-1558, 1977
Khoury J.M., James L.M., Erickson J.D.-Teratology, 49, 273-281, 1994
Khoury M.J., Shaw G.M., Moore C.A., Lammer E.J., Mulinare J.-American Journal of
Medical Genetics, 61, 30-36, 1996
Kuenneth C.A., BoyleC., Murphy C.C., Yeargin –Allsopp M-Pediatric and Perinatal
Epidemiology, 10, 186-196, 1996
Lary J. M., Edmonds L.D.- Morbidity and Mortality Weekly Report CDC Surveillance
Summaries, 45, 15-26, 1996
Lary J.M., Edmonds L.D.-Teratology, 56, 19-30, 1997
Lawrence J.M., Petitti D.B., Watkins M., Umekubo M.A.-Lancet, 354, 915-916, 1999
Lipski P.S.- Age Ageing, 22, 15-18, 1993
Lynberg M.C., Khoury M.J., Lu X, Cocian T-American Journal of Epidemiology, 140,
244-255, 1994
Lyon Daniel K., Veto L.L.- Centers for Diseases Control and Prevention, 1999
Mersereau P.-Small Talk, 12, 1-2, 4-5, 2000
Miller J.W.-Biochemistry Journal, 298, 1994
Moore C.A., Li S., Li Z., Hong S.X., Gu H.Q., Berry R.J., Mulinare J., Erickson J.D.-
American Journal of Medical Genetics, 73, 113-118, 1997
Mulinare J., Erickson J.D.-Teratology, 56, 17-18, 1997
Mulinare J.-Cereal Foods Word, 40, 58-61, 1995
Oakley G. P. Jr.-JAMA, 274, 1717-1718, 1995
Oakley G. P. Jr., Adams M.J., Dickinson C.M.-Journal of Nutrition, 126, 7510-7515,
1996
Oakley G.P. Jr.-Reproductive Toxicology, 11, 579-581, 1997
Oakley G.P. Jr-American Journal of Clinical Nutrition, 65, 1889-1890, 1997
Olney R., Mulinare J.-Mental Retardation and Developmental Disabilities Research
Reviews, 4, 241-246, 1998
Onicescu D., Atanasiu V.-Histochemistry, 61, 109-110, 1979
Onicescu D., Atanasiu V.-Review Romanian Biochemistry, 26, 1989
Ou C.Y., Stevenson R.E., Brown V.K., Schwartz C.E., Allen W.P., Khoury M.J., Rosen
R., Oakley G.P., Adams M.J.- American Journal of Medical Genetics, 63, 610-614, 1996
Posey D.L., Khoury M.J., Mulinare J, Adams M.J.Jr, Ou C.Y.-Lancet 347, 686-687,
1996
Roberts H.E., Moore C.A., Cragan J.D., Fernhoff P.M., Khoury M.J.-Pediatrics, 96, 880-
883, 1995
Rotherb K.G.-Analitical Biochemistry, 103, 152, 1980
Sostman H.D., Matthay R.A., Putman C., Smith G.W.J.-Medicine, 55, 371-388, 1976
Stoller R.G., Hande K.R., Jacobs S.A., Rosenberg S.A., Chabner B.A.-New England
Journal Medicine, 297, 630-634, 1977
Taylor I.W., Tattersall M.H.-Cancer Research, 37, 1602-1607, 1977
Voet J., Voet D.-Tetrahydrofolate Cofactors: Metabolism of C1 Units, 761-764, 1995
Watkins M.-Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews, 4,
282-290, 1998
Watkins M.L., Erickson J.D., Thun M.J., Mulinare J., Heath C.W. Jr.- American Journal
of Epidemiology, 152, 149-162, 2000
Watkins M.L., Erickson J.D., Mulinare J.-New England Journal of Medicine, 341, 923-
924, 1999
Watkins M.L., Scanlon K.S., Mulinare J., Khoury M.J.-Epidemiology, 7, 507-512, 1996
Zaharho D.S., Fung W.P., Yang K.H.-Cancer Research, 37, 1602-1607, 1977
Zachariae H., Kragballe K., Sogaard H.-British Journal Dermatology, 102, 407-412, 1980
Zi Houn, Grant S.C., Kris M.G., Young C.W., Sirotnak F.M.-Cancer Investigation, 11,
36-45, 1993