CUPRINS

Capitolul I.:
OBIECTIVELE ACTIVITĂŢII LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE.
Organizarea laboratorului de microbiologie. Norme de protecţia muncii...............7

Capitolul II :
STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA……………………………………………..9

Capitolul III:
RECOLTAREA ŞI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE…….….20

Capitolul IV:
EXAMENUL MICROSCOPIC……………………………………………….….27

Capitolul V:
CULTIVAREA ŞI IZOLAREA BACTERIILOR.................................................33

Capitolul VI:
TESTAREA SENSIBILITĂŢII IN VITRO LA SUBSTANŢE
ANTIBACTERIENE ŞI ANTIFUNGICE………………………………………..41

Capitolul VII:
METODE IMUNOLOGICE DE UZ CURENT …………………………………48

Capitolul.VIII:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STAFILOCOCICE………………………….55

Capitolul IX:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STREPTOCOCICE………………………....62

Capitolul X: DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE NEISSERII…...70

Capitolul XI:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACILI
GRAM POZITIVI…………………………………………………………………74

Capitolul XII:
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS (Dr Arghir Oana)…………………………………………….79

5
Capitolul XIII:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACILI
GRAM NEGATIVI……………………………….………………………….....83

Capitolul XIV:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACTERII ANAEROBE
(Dr. Barbu Adina) ………………………………………………………………89

Capitolul XV:
DIAGNOSTICUL SIFILISULUI……………………………………………….93

Capitolul XVI:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE CHLAMYDIA SI
MYCOPLASMA………………………………………………………………102

Capitolul XVII:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR GENITALE …………..…………………107

Capitolul XVIII:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE LEVURI
(CANDIDA).......................................................................................................112

Capitolul XIX
DIAGNOSTICUL INFECŢIEI CU TRICHOMONAS VAGINALIS...............117

Capitolul XX:

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE.

DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR CU HERPESVIRUSURI………………..119

Capitolul XXI
DIAGNOSTICUL HEPATITELOR VIRALE.................................................124

Capitolul XXII
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIEI HIV............................128

BIBLIOGRAFIE.................................................................................................132

6
 Capitolul I
OBIECTIVELE ACTIVITĂŢII LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE
Organizarea laboratorului de microbiologie
Norme de protecţia muncii

Principalele obiective ale activităţii în laboratorul de microbiologie sunt:

Izolarea şi identificarea microorganismelor prezente în produsele biologice şi
aprecierea patogenităţii acestora.
Testarea sensiblităţii la antibiotice şi chimioterapice a tulpinilor patogene
izolate.
Diagnosticul serologic: identificarea şi titrarea în serul pacienţilor a
antigenelor şi anticorpilor dezvoltaţi împotriva unor agenţi infecţioşi bacterieni,
virali, parazitari.
Efectuarea unor studii epidemiologice şi de cercetare pe baza rezultatelor
obţinute în intervale de timp semnificative (ani, sezoane).
Activitatea didactică, de realizare a lucrărilor practice cu studenţii şi a
stagiilor medicilor rezidenţi.

Structura generală a unui laborator de microbiologie trebuie să cuprindă

Spatiul destinat laboratorului
- Sala de asteptare
- Spatiu de recoltare de sânge
Spaţiul destinal microbiologiei este separat de restul laboratorului , accesul fiind
restricţionat la personalul laboratorului şi semnalizat printr-un afiş special. Acest
spaţiu cuprinde:
- Spatiu de recoltare produse patologice şi primire probe pentru microbiologie;
- Camera de pregatire medii pentru microbiologie, cu suprafata de 8. m2;
- Cameră de lucru pentru microbiologie, cu suprafaţa de 12 m2;
- spaţiu de sterilizare;
- spaţiu de depozitare materiale;
- vestiar pentru personal;
Toata suprafaţa laboratorului trebuie pardosită cu materiale lavabile. (linoleum cu
proprietăţi antibacteriene destinat traficului intens)
Pereţii trebuiesc zugraviţi cu material lavabil, iar în spaţiul destinat bacteriologiei,
aceştia trebuiesc placaţi cu faianţă sau linoleum antibacterian.
Circuitele funcţionale
Spaţiul trebuie compartimentat astfel încât să fie asigurate circuitele funcţionale:
Accesul în laborator se face printr-o intrare separată. Din sala de aşteptare există
acces direct la grupul sanitar, dotat cu două compartimente, unul destinat
personalului şi altul destinat pacienţilor.
Din sala de aşteptare trebuie să existe accesul la sala de recoltă.
7
 Sala de recoltă trebuie să fie alături de spaţiul de lucru, facilitând astfel
transportul probelor.
Dotări.
Laboratorul de microbiologie trebuie să fie dotat cu:
- mese de bacteriologie cu blat de faianţă
- Hotă cu flux laminar vertical,
- autoclav, lampă sterilizatoare cu UV,
- termostat (etuvă termoreglabilă), frigider, congelator,
- bec Bunsen, ansă bacteriologică
- lupă de laborator, microscop, lame, lamele,
- pipete sterile de unică utilizare, indicator pH,
- medii de cultură deshidratate, plăci Perti sterile de unică folosinţă;
- sticluţe de urocultură, coprorecoltoare, tampoane de recoltat exudate, toate
sterile şi de unică utilizare.
Pentru imunologie sunt necesare: Microscop, centrifugă, frigider, congelator,
cititor ELISA, spectrofotometru, pipete automate.

Norme de protecţia muncii în laboratorul de microbiologie

Accesul în laboratorul de microbiologie este restrâns la persoanele care lucrează
în laborator. Pacienţii şi alte persoane care transportă probe au acces numai până la
sala de recoltă şi spaţiul de primire probe bacteriologice.
Nu se mănâncă, nu se bea şi nu se fumează în laborator, decât în spaţiul cu
destinaţie specială.
În trimpul lucrului trebuie purtat echipamentul de protecţie: halat, mănuşi,
eventual mască, ochelari.
În legătură cu folosirea becului Bunsen, trebuie avut grijă să nu existe scăpări de
gaze.
Trebuie avută grijă la manipularea substanţelor dezinfectante corozive, tip
amestec sulfocromic, ce pot produce arsuri cutanate.

8
 Capitolul II
STERILIZAREA ŞI DEZINFECŢIA

Definiţii:
Prin sterilizare se înţelege orice metodă fizică sau chimică prin care sunt
distruse microorganismele, atât formele vegetative cât şi formele de rezistenţă
( sporii ) de la nivelul unui substrat.
Rezultatul unei proceduri de sterilizare este starea de sterilitate: un substrat steril,
complet lipsit de microorganisme vii, atât formele vegetative cât şi formele de
rezistenţă
Obţinerea stării de "sterilitate", precum şi menţinerea ei (până în momentul
utilizării) conferă siguranţă maximă , probabilitatea teoretică a existenţei
microorganismelor fiind ≤ 10‾6 .
Prin dezinfecţie se înţelege procesul prin care sunt distruse majoritatea
microorganismelor(în proporţie de până la 99 %) de pe obiectele din mediul inert,
cu excepţia formelor de rezistenţă (sporilor bacterieni). Substanţele utilizate în
acest scop se numesc dezinfectante.
Dezinfecţia se aplică în cazurile în care curăţenia nu elimină riscurile de răspândire
a infecţiei, iar sterilizarea nu este necesară.
Reducerea numărului de microorganisme de la nivelul pielii, mucoaselor şi
ţesuturilor vii se numeşte antisepsie. Substanţele folosite în acest scop se numesc
antiseptice. Unele substanţe pot fi folosite atât ca dezinfectante, cât şi ca
antiseptice, în concentraţii diferite.
Decontaminarea se referă la procesul sau tratamentul care se aplică
dispozitivelor medicale utilizate, având scopurile următoare: diminuarea populaţiei
de microorganisme, prevenirea uscării produselor biologice, protecţia personalului
care-l manipulează, protecţia mediului împotriva contaminării

Metodele de sterilizare se clasifică, după agentul sterilizant, în

a. Sterilizare prin metode fizice:
Sterilizarea prin căldură
Sterilizarea prin filtrare
Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor
b. Sterilizarea chimică

Sterilizarea prin căldură.

Căldura este un agent relativ ieftin şi foarte eficient. Se pretează la
sterilizarea prin căldură toate materialele termorezistente.

Sterilizarea prin căldură uscată:

9
STERILIZAREA PRIN ARDEREA ÎN FLACĂRĂ (ARDEREA LA ROŞU)
este utilizată în bacteriologie, pentru ansa bacteriologică metalică. Ansa se ţine cu
vârful în flacăra becului Bunsen, până se înroşeşte, apoi încă 5-10 secunde. La
temperatura la care metalul este incandescent, toate microorganismele sunt distruse
prin carbonizare.
Atenţie: flacăra este mai fierbinte spre vârf. Dacă ansa este încărcată (conţine
produs biologic sau cultură bacteriană), ea se introduce la început în porţiunea
inferioară a flăcării, până la arderea produsului, apoi se ridică uşor spre vârful
flăcării. În acest mod persoana care manipulează ansa evită să se stropească cu
materialul ce poate sări din ansă.
Instrumentele metalice tăietoare sau înţepătoare din oţel inoxidabil pot fi
deteriorate dacă se sterilizează prin această metodă, datorită decălirii oţelului.

STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUVĂ TERMOREGLABILĂ

Sterilizatorul cu aer cald este un cuptor ( cuptor Pasteur) cu pereţi dubli, între
care se gaseşte sursa de căldură. Pereţii interiori sunt perforaţi, pentru a permite
circulaţia aerului cald. Sterilizatorul poate fi cu sau fără ventilator. El are în mod
obligatoriu un afişaj mecanic sau electronic pentru temperatură şi timp, care
permite fixarea şi urmărirea parametrilor de funcţionare. ( Fig. 1)
Agentul de sterilizare este aerul uscat şi cald , la 180°C, care acţioneaţă 1
oră efectiv, din momentul atingerii temperaturii de sterilizare în interiorul
încărcăturii.

Fig.II.1. a. Pupinel. 1.b. Principiul de funcţionare al

pupinelului

10
 La sterilizatorul cu aer cald se sterilizează sticlăria şi instrumentarul care nu
suportă sterilizarea cu aburi sub presiune (oţel ne-inoxidabil: cromat). Sterilizatorul
cu aer cald este contraindicat pentru materiale textile, lichide şi cauciuc.
Obiectele de sterilizat sunt spălate, uscate şi ambalate în hârtie specială
( sticlăria de laborator) sau cutii metalice ( instrumentarul metalic).
Cutiile metalice cu instrumentar se introduc închise în incinta sterilizatorului
cu aer cald.
Durata menţinerii sterilităţii materialelor ambalate în cutii metalice este de
24 de ore de la sterilizare, cu condiţia menţinerii cutiilor metalice închise.
Durata menţinerii sterilităţii materialelor în ambalaje de hârtie sudate este de
2 luni de la sterilizare, cu condiţia menţinerii integrităţii lor şi a manipulării
acestora numai prin intermediul coşului.
La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu aer cald se folosesc mănuşi .
Se lipeşte o etichetă sau banderolă pe capac pentru a identifica dispozitivele
medicale şi materialele sterilizate. Se notează data şi ora sterilizării.
Se notează în caietul de sterilizare: data, conţinutul cutiilor (pachetelor),
temperatura la care s-a efectuat sterilizarea, durata, rezultatele indicatorilor chimici,
semnătura persoanei responsabilizate cu sterilizarea, observaţii.

Sterilizarea prin căldură umedă:

STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE – AUTOCLAVAREA
Principiul sterilizării cu abur sub presiune este de a expune fiecare la
contactul cu aburul la temperatura şi presiunea pentru timpul specificat: 121°C la
1,01 atmosfere timp de 30 minute, până la 134°C la 2 atmosfere, timp de 30
minute.Timpul de sterilzare se măsoară din momentul atingerii temperaturii
efective în interiorul încărcăturii
Prin autoclavare se pot steriliza: Instrumentar medical metalic , textile,
sticlărie, cauciuc, plastic termostabil,apă şi soluţiilor apoase, medii de cultură

Se pot utiliza 2 tipuri de autoclave:

1. Autoclave cu pre şi post vacuumare.
Realizează sterilizara optimă a instrumentarului chirurgical din oţel
inoxidabil şi singura metodă posibilă pentru sterilizarea materialului moale
(textile), cauciucului, sticlăriei. Este folosit şi în decontaminarea deşeurilor din
laborator (deşeuri infecţioase).
2. Autoclave fără post vacuumare. Sunt folosite pentru sterilizarea mediilor
de laborator şi lichidelor în flacoane. Timpul de pătrundere al aburului este
prelungit datorită eliminării incomplete a aerului.
La încheierea ciclului complet de sterilizare se aşteaptă să se răcească, se
evacueză aburul, apoi se deschide uşa autoclavului. Nu se deschide niciodată
sterilizatorul cu abur sub presiune înainte ca temperatura să fie sub 100°C. La

11
extragerea pachetelor din sterilizatorul cu abur sub presiune se folosesc mănuşi din
bumbac.
Cutiile, casoletele, şi pachetele sterilizate se depozitează temporar pe o
suprafaţă special destinată materialului steril şi se aranjeză în dulapuri special
destinate depozitării materialului steril.
Cutiile, casoletele, coşurile, navetele cu pachetele sterilizate se etichetează
(banderolează) notându-se data, ora, sterilizatorul cu abur sub presiune la care s-a
efectuat sterilizarea, persoana care a efectuat sterilizarea.

Fig.II.2 a. Autoclav vertical – model clasic

2.b. Autoclav orizontal

12
Controlul sterilizării se poate face face prin metode fizice, chimice şi biologice.
a. Verificarea temperaturii: Se citeşte temperatura termometrului sau
temperatura afişată pe monitor. Temperatura se notează în caietul de sterilizare.
La autoclav: verificarea presiunii la manometru şi a temperaturii.
b. Verificarea indicatorilor fizico-chimicici:
- virarea culorii la benzile adezive cu indicator fizico-chimic.
- virarea culorii la indicatorii fizico-chimici “integratori. Indicatorul
integrator plasat în interiorul cutiilor metalice indică dacă au fost îndeplinite
condiţiile pentru o sterilizare eficientă – temperatura atinsă în interiorul
pachetului şi timpul de expunere. În situaţia în care virajul nu s-a realizat,
materialul se consideră nesterilizat şi nu se utilizează.

O dată pe lună Se utilizează indicator biologic cu Bacillus subtillis pentru

controlul eficacităţii sterilizării.
Pentru sterilizarea la pupinel pot fi utilizaţi indicatori biologici cu Bacillus subtillis
preparaţi industrial, comercializaţi, care conţin 106 UFC sau preparaţi în laborator.
Acestea se plasează în mijlocul incintei sterilizatorului cu aer cald, odată cu
celelalte pachete pentru sterilizat. Se realizează ciclul complet de sterilzare. La
sfârşitul ciclului, indicatorii biologici se extrag din cutie şi se incubează 48 ore la
56°C, la laborator. Laboratorul va emite un buletin de analiză cu rezultatul
constatat.
Pentru controlul sterilizării la autoclav sunt admişi indicatorii biologici cu
forme diferite de condiţionare:
 Indicatori biologici cu Bacillus stearothermophylus impregnaţi pe suporţi de
bumbac în concentraţii de 106 UFC.Aceştia se pun în interiorul unei cutii-
test. Cutia-test se introduce în autoclavă odată cu materialul de sterilizat şi se
realizează ciclul complet de sterilizare. La sfârşitul ciclului, indicatorul
biologic este trimis la laborator, unde este extras, însămânţat şi incubat;
citirea se face la 7 zile.
 Controlul bacteriologic al sterilizării la autoclav cu indicator tip“Stearotest
120”, pentru controlul sterilizării la autoclavă la temperatura de 120°C cu o
durată de 30 minute
Acest produs este o suspensie de spori de Bacillus stearothermophyllus în
soluţie nutritivă, cu indicator de pH. Conţinutul fiolelor de “Stearotest 120” este
limpede de culoare violet. Fiolele de tip“Stearotest 120” se introduc în autoclavă
printre dispozitivele medicale şi materialele supuse sterilizării . Se efectuează
sterilizarea, la 120°C, timp de 30 min; după sterilizare fiolele sunt aşezate într-un
incubator de 56°C.
Citirea şi interpretarea rezultatelor:
-menţinerea aspectului (culoare, transparenţă) nemodificat arată o sterilizare
corectă;
 -virajul la galben al indicatorului de pH şi o uşoară opalescenţă a
conţinutului indică o sterilizare sub parametrii de eficienţă optimă (au rămas spori
viabili s-au cultivat şi au modificat aspectul produsului).
La 6 luni Se efectuează verificarea aparatului de către un tehnician
autorizat.

STERILIZAREA PRIN FILTRARE

Sterilizarea prin filtrare reprezintă trecerea unui lichid printr-un filtru cu porii
având dimensiuni mai mici decât ale bacteriilor sau ale virusurilor ( ultrafiltrare).
Filtrele bacteriologice sunt de mai bulte tipuri:
Filtre Seitz, din azbest
Filtre Chamberland, din porţelan poros
Filtre din sticlă Yena, etc
Filtrele se sterilizează prin autoclavare. Lichidul de sterilizate este aspirat cu
ajutorul unei pompe de vid.
În situaţiile în care în laboratoare este necesar lucrul în condiţii aseptice
(prelucrare produse ce conţin M.tubreculosis, tehnică PCR), se utilizează incintele
asptice cu protecţie suplimentară – hote cu flux laminar. Aceste au un spaţiu de
lucru, cu pereţi de sticlă şi un compartiment superior metalic, care conţine 2-3 filtre
( foltru din fibră poliamidică şi 1-2 filtre HEPA). Circulaţia aerului se face cu
ajutorul unui ventilator

STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAŢIILOR

Radiaţiile ionizante (α,β,χ,X) au o bună capacitate sterilizantă, dar sunt
nocive pentru organismul uman. De aceea se folosesc numai în activitatea
industrială şi nu sunt folosite în activitatea medicală.
Radiaţiile neionizante – UV sunt folosite pentru sterilizarea suprafeţelor şi
aerului în laboratoare, săli de operaţie, pentru sterilizarea apei în bazine. Lămpile
de UV trebuie folosite în laboratorul de bacteriologie câte 10 minute, de mai multe
ori pe zi, după evacuarea prealabilă a personalului din încăpere.

STERILIZAREA CHIMICĂ : STERILIZATOARE CU OXID DE ETILENĂ

Sterilizarea cu oxid de etilenă se utilizează numai atunci când nu există alt
mijloc de sterilizare adecvat pentru obiecte şi echipamente termosensibile.
Materialul medico-chirurgical care se sterilizează cu oxid de etilenă:
Obiecte din material plastic şi materiale compozite, termosensibile şi pentru
care se cunoaşte perioada de timp necesară desorbţiei; polielietilenă, teflon, latex,
silicon, acetatul de etilenvinil, poliuretan, polipropilen. Echipamentul medical
constituit din părţi de PVC (policlorura de vinil) sterilizat iniţial cu radiaţii
ionizante sau raze gamma nu va fi resterilizat cu oxid de etilenă, deoarece PVC
eliberează compuşi toxici - etilen clorhidrină.
 Oxidul de etilenă este un gaz inodor, toxic, a cărui prezenţă nu este
percepută în aer. În amestec cu aerul, este exploziv pornind de la concentraţia de
3% V-V. Prin inhalare: oxidul de etilenă poate provoca iritaţia căilor respiratorii şi
depresia sistemului nervos central , iar prin contact: reacţii de iritaţie a pieli şi
mucoaselor la personalul care efectuează sterilizarea.
Materialul supus insuficient tratamentului de desorbţie utilizat la bolnavi
poate cauza fenomene hemolitice, stenoze traheale, colaps cardiovascular şi
fenomene alergice. De aceea, sterilizatoarele cu oxidul de etilenă trebuie să aibă
inclus în ciclul de sterilizare desorbţia la sfârşitul programului.
Sterilizarea cu oxid de etilenă se va realiza în spaţii ventilate, destinate numai
pentru această activitate.

DEZINFECŢIA
1.DEZINFECŢIA CHIMICĂ. SUBSTANTE DEZINFECTANTE SI
ANTISEPTICE
Eficienţa unei proceduri de dezinfecţie depinde de natura substanţei
dezinfectante folosite fiind direct proporţională cu concentraţia acesteia şi
timpul de acţiune, în timp ce prezenţa materiilor organice ( sânge, urină, materii
fecale, culturi bacteriene) şi a formelor sporulate reduc efectul dezinfectant.
Spre deosebire de sterilizare, care este un termen cu semnificaţie absolută
( steril sau nesteril), dezinfecţia poate fi de diferite grade: dezinfecţie înaltă,
medie şi slabă.
Dezinfecţia înaltă este orice procedură care reuşeşte să inactiveze formele
vegetative ale bacteriilor, virusurile, paraziţii şi ciupercile microscopice.
Dezinfectante puternice:
 Glutaraldehida: soluţie apoasă 2%
 Formaldehida: soluţie apoasă 8%
 Amestecul sulfocromic: acid sulfuric+ bicromat de potasiu+ apă
 Peroxidul de hidrogen 3-6%
 Acidul peracetic în diferite concentraţii
 Hipocloritul de sodiu
Timpul de acţiune necesar pentru ca aceste substanţe să realizeze o dezinfecţie de
nivel înalt este de minim 20 minute. Este absolut necesar să se respecte
instrucţiunile de folosire ale fiecărui preparat comercial , aşa cum sunt specificate
de producător.
Dacă dezinfectantele puternice acţionează un timp suficient şi pe substratul
respectiv nu există spori bacterieni, se poate realiza o sterilizare chimică.
Dezinfectante cu putere medie:
Realizează distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor în formă
vegetativă, a celor mai multe virusuri şi fungi, dar nu şi a sporilor bacterieni.
Substanţele chimice care realizează dezinfecţia de nivel intermediar sunt:
 Iodofori ( compuşi iodaţi): combinaţii ale iodului cu o substanţă
stabilizatoare sau transportatoare. La diluarea în apă, din aceste complexe se
eliberează iodul liber, cu acţiune antimicrobiană 50-150 mg /1000ml ( 5-
15%). Exemple de substanţe transportatoare: compuşi cuaternari de amoniu,
polivinilpirolidonă, detergenţi.
 Compuşi cloruraţi: eliberează Cl liber şi ClO2. Conţin 0.5-5 g Cl /1000ml.
Cloramina, hipocloritul
 Alcooli: etilic, izopropilic 70% vol/vol .
 Compuşi fenolici: 0.5-3% în apă
 Detergenţii
Detergenţi neutri folosiţi pentru: mobilier, pavimente, veselă şi spălarea
manuală a textilelor.
Detergenţi alcalini sau “decapanţi folosiţi pentru pavimente .
Detergenţi acizi sau “detartranţi” utilizaţi pentru materiale cu depuneri de
piatră: ceramică, pavimente placate cu materiale care suportă acizi, sticlărie de
laborator, bazine, bazinete, urinare.
Detergenti-dezinfectantii sau detergentii cationici sunt produse a caror
proprietate principala este cea de curatare si secundar dezinfectanta.
Timpul de contact necesar al substanţei chimice cu substratul tratat este de 10
minute.

Dezinfectante slabe:
Pot distruge cele mai multe bacterii în forma vegetativă, unele virusuri, unii
fungi, dar nu distrug microorganisme rezistente, ca Mycobacterium tuberculosis,
sau sporii bacterieni.
 Compuşi cuaternari de amoniu
 Dezinfectante care conţin fenoli, iodofori şi agenţi de spumare;
Timpul de contact necesar al substanţei chimice cu substratul tratat este de sub
10 minute.
În funcţie de suportul tratat, se pot folosi următoarele metode de aplicare a
dezinfectantelor chimice
Imersie (recipiente pentru recoltarea produslor patologice, instrumente, pipete,
lame de microscop), ştergere (mese de lucru în laborator, aparate, pavimente),
stropire , pulverizare ( uşi, ferestre).

Pregatirea in vederea sterilizarii a materialului medico-chirurgical utilizat

cuprinde mai multe etape:
 Curatare/decontaminare (predezinfectie) echipamentelor: realizată imediat
după utilizarea acestora, cât mai aproape de locul utilizării.
- diminuează populaţia de microorganisme
- previne uscarea produselor biologice
- contribuie la protecţia personalului care-l manipulează
- contribuie la protecţia mediului împotriva contaminării
Se realizează în două etape
1. faza de pretratament, realizată prin imersia dispozitivelor utilizate, în
soluţie de detergent - dezinfectant (cu acţiune de detaşare a murdăriei
grosiere de pe substrat şi acţiune bactericidă)
2. faza de curăţare manuală sau mecanică

Clatire riguroasă sub jet de apă potabilă;

Dezinfectie, utilizand un dezinfectant adecvat, dintre cele cu putere înaltă sau
medie;
Clatire cu apă;
Uscare cu prosop curat sau aer comprimat.

ANTISEPTICELE sunt preparate cu proprietăţi antimicrobiene, ele distrug, sau

inactivează microorgnismele de la nivelul ţesuturilor vii. Ele reduc temporar de pe
piele şi mucoase numărul de microorganisme.
Utilizarea antisepticelor permite:
- realizarea îngrijirilor aseptice,
- reducerea transmiterii germenilor, de la bolnav la bolnav, prin intermediul
mâinilor,
- tratarea infecţiilor locale cutanate si mucoase.
Substanţe antiseptice
 Alcooli: etanol, izopropanol 70% vol/vol –35% vol/vol
 Compuşi iodaţi 1-2%: alcool iodat, tinctură de iod, betadina:povidone-
iodine 7,5-10%
 Compuşi cloruraţi: Clorhexidina ( 0,75-4%), Hexaclorofen (1-3%)
 H2O2 3%
 Compuşi coloraţi:Violet de genţiana, albastru de metilen, fucsina
 Permanganat de potasiu
 Nitrat de argint 0,1%
 Clorura de benzalkonium:soluţie alcoolică 0,1-0,2% (piele), soluţie apoasă
0,1-0,2%(plăgi)
soluţii oftalmice: 0,01%, instilaţii vezică urinară şi uretră: 0,005%
 Săpunuri şi detergenţi
2. DEZINFECŢIA PRIN MIJLOACE FIZICE
Dezinfecţia prin căldură
- Căldura uscată: flambarea
Flambarea constă în trecerea unui obiect prin flacără. Este utilizată în laborator,
pentru eprubete de sticlă, lame de microscop, etc. Nu se foloseşte pentru
instrumente medico-chirurgicale.
- Căldura umedă: fierberea şi pasteurizarea
Fierberea în apă la temperatura de 100°C timp de minim 20 minute realizează
distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor patogene. Fierberea apei şi
alimentelor reprezintă o metodă de prevenire a bolilor transmisibile cu poartă de
intrare digestivă.
Pasteurizarea: este o metodă de dezinfecţie a lichidelor, la temperaturi cuprinse
între 55 - 95°C. După expunere, de durată variabilă, sunt distruse 90 – 95% dintre
formele vegetative ale microorganismele patogene.
Dezinfecţia prin spălare la temperatura de 60 - 95°C este un proces complex
la care, pe lângă acţiunea căldurii umede, se adaugă şi acţiunea detergenţilor sau a
altor substanţe, cât şi acţiunea mecanică de spălare. Acest procedeu se foloseşte la
spălarea şi dezinfecţia lenjeriei, veselei, sticlăriei de laborator, instrumentarului.

Dezinfecţia cu raze ultraviolete

Indicaţii: dezinfecţia suprafeţelor netede şi aerului în boxe de laborator, săli de
operaţii, alte spaţii închise, pentru completarea măsurilor de curăţenie şi
dezinfecţie chimică.
Lămpile destinate dezinfecţiei pot fi fixe sau mobile, cu tuburi de UV între 15 şi
30 W, prevăzute să funcţioneze în absenţa omului (cu radiaţie directă) sau în
prezenţa omului (cu radiaţie indirectă, ecranată şi fără emisie de ozon).

Exemple de produse comerciale de detergenţi dezinfectanţi şi dezinfectanţi

Virkon ( Antec international)– detergent-dezinfectant; amestec de peroxizi,
surfactant, acizi organici şi săruri anorganice. Poate fi folosit pentru suprafeţe
dure ( faianţă, pavimente), în laboratoareele medicale pentru aparatura de
laborator, cuve, centrifugi, pipete.
Biguacid S ( Antiseptica) – dezinfectant-detergent, conţine didecyl-dimethyl –
ammonium-chlorid şi biguanină. Poate fi folosit pentru suprafeţe, pavimente,
grupuri sanitare.
Combi-instruments ( Antiseptica) – dezinfectant-detergent lichid pentru
instrumentar chirurgical şi dinlaboratoare ( sticlă, porţelan, metal, cauciuc, mase
plastice). Conţine: glutaraldehidă, clorură de benzalkonium, didecyl-dimethyl –
ammonium-chlorid.
Big Spray ( Antiseptica) – amestec de ethanol – propanol – poyhxanide. Spray
dezinfectant, utilizat prin pulverizare, pentru dezinfecţia suprafeţelor din sali de
operaţie, ambulanţe,mobilier, haine, saltele, perne.
Mikrozid Liquid ( Shulke &Meyer) - amestec de etanol şi propanol .
Dezinfectant pentru suprafeţe, grupuri sanitare.
Lysetol AF ( Shulke &Meyer) - conţine: guanidinacetat, fenoxipropanol,
clorură de benzalconiu. Dezinfectant pentru instrumentarul medico-chirurgical.
Perform FF ( Shulke &Meyer) - conţine peroximonosulfat de potasiu, benzoat
de sodiu, acid tartric, săpun. Indicat în dezinfecţia şi curăţarea suprafeţelor şi
obiectelor de inventar lavabile.
Terralin ( Shulke &Meyer) - amestec de clorură de benzalconiu şi propanol.
Poate fi folosit pentru curăţirea şi dezinfecţia pardoselilor, pereşilor, grupurilor
sanitare şi obiectelor de inventar lavabile.

Fig.II.3.Simboluri pentru modul de utilizare a dezinfectantelor (Shulke &Meyer)

Fig.II.4.Simbol pentru dezinfecţia mainilor (Shulke

&Meyer)
Exemple de produse comerciale de antiseptice
Desmanol ( Shulke &Meyer) conţine digluconat de clorhexidină şi propanol.
Utilizat pentru dezinfecţia igienică şi chirurgicală a mâinilor.
Desderman N ( Shulke &Meyer) - conţine etanol, bifenilol, polyvidone,
isopropyl. Indicat pentru dezinfecţia igienică şi chirurgicală a mâinilor.
Primasept Med ( Shulke &Meyer) –conţine bifenilol şi propanol. Utilizat pentru
dezinfecţia igienică a mâinilor.
 Capitolul III
RECOLTAREA ŞI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE

Recoltarea produselor patologice în scopul examenului microbiologic

reprezintă o etapă extrem de importantă , de corectitudinea căreia depinde în mare
măsură exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, în
momentul corespunzător, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul în condiţii
optime şi cât mai rapid spre laborator sunt absolut necesare .
Principii generale
Recoltarea probelor trebuie făcută de medic sau sub îndrumarea acestuia.
Se utilizează numai recoltoare sterile, pe care vor fi menţionate datele de
identificare: numele pacientului, secţia, produsul şi data recoltării, înainte de a se
face prelevarea.
Recoltarea unui produs biologic în vederea evidenţierii florei microbiene
trebuie efectuată, pe cât posibil, înaintea administrării tratamentului cu antibiotice .
Din produsul biologic se va recolta porţiunea sau fragmentul cu aspect
patologic, caracteristic.
Prelevarea trebuie făcută în momentul optim, în sensul posibilităţii prezenţei
unui număr cât mai mare de microorganisme şi în funcţie de evoluţia clinică a bolii.
Cantitatea de produs trebuie să fie suficientă pentru a permite efectuarea mai
multor examene.
Transportul probelor recoltate la laborator trebuie să fie făcut în timp cât
mai scurt, pentru a evita modificările cantitative şi calitative ale florei, sub acţiunea
deshidratării, modificărilor de temperatură, pH, etc. În probele păstrate prea mult
timp, microorganismele mor datorită deshidratării, temperaturii prea scăzute, sau,
din contră, unele medii ( urina) sunt favorabile multiplicării excesive a florei
iniţiale.
În cazul în care transportul poate dura mai mult timp sau nu există
posibilitatea însămânţării imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de
conservare şi transport.
Transportul probelor se va face în containere speciale, inscripţionate cu
menţiunea material infectant, manipulate de persoane instruite, evitându-se
răsturnarea containerelor şi vărsarea materialelor .

Hemocultura
Prelevarea unei probe de sânge pentru cultivarea pe medii adecvate –
hemocultura- are indicaţie în suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau
endocardită bacteriană. De asemenea hemocultura este indicată în stările febrile
prelungite fără o cauză decelabilă.
Este foarte important ca puncţia venoasă să fie făcută în condiţii de asepsie,
folosind pentru dezinfectare pielii la locul puncţiei venoase alcool 80-95% şi
compuşi iodaţi: tintură de iod, betadină , ce vor fi lăsaţi să acţioneze pe piele minim
1 minut. Persoana care recoltează va purta mănuşi sterile.
Vor fi recoltate cel puţin trei probe, fie într-un interval de 24 h , în
suspiciunea de endocardită, fie la intervale de timp determinate de evoluţia clinică,
în general în plin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singură probă este
insufucuentă pentru stabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul
acesteia.
Volumul de sânge indicat a se recolta pentru hemocultură este de 20 ml la
adult şi 1-5 ml la copii, în funcţie de vârsta acestora. Sângele se recoltează cu
seringa şi se descarcă imediat în mediile de cultură lichide speciale. Se foloseşte de
regulă un set de două medii de cultură: aerobe şi anaerobe. Raportul optim sânge:
mediu de cultură este de 1: 10 ( flacoanele cu medii pentru hemocultură au în
general 100 ml, pentru adulţi şi 20 ml pentru copii ). În cazul în care pacienţii au
primit deja antibiotice, există medii de cultură aerobe şi anaerobe cu inhibitori de
antibiotice. Totuşi este de preferat ca măcar primele prelevări să se facă înaintea
instituirii tratamentului antibacterian sau antifungic.
Incubarea hemoculturilor se face la 370 C, timp de 7 zile. În sistem clasic, se
fac treceri pe medii solide la fiecare 24 h. Hemocultoarele automate efectuează
citiri cu ajutorul unei fotocelule ce înregistrează modificarea turbidităţii mediului
prin creşterea bacteriană, la intervale de timp de 15-30 minute. Confirmarea
pozitivării hemoculturii precum şi identificarea tulpinii izolate se face tot prin
trecere pe medii de cultură solide. Dacă după 7 zile hemocultura nu s-a pozitivat,
rezultatul definitiv va fi negativ ( hemocultură sterilă ).

Catetere intravasculare
Menţinerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezintă o sursă
importantă de episoade de bacteriemie şi de infecţii la locul de inserţie al
cateterului. După scoaterea cateterului, vârful de cateter – segmentul distal, de 3-5
cm, secţionat aseptic şi introdus într-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul
de bacteriologie . Aici, peste vîrful de cateter se toarnă 2-3 ml bulion steril, astfel
încât să fie complet acoperit şi va fi menţinut astfel 24 h. Din bulion vor fi făcute
treceri pe medii de cultură solide.

Lichidul cefalorahidian ( L.C.R. )

Examenul lichidului cefalorahidian este indicat în suspiciunea de
meningită:febră, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc.
Recoltarea L.C.R. se face prin puncţie lombară, în condiţii de asepsie strictă,
după dezinfecţia pielii cu betadină sau alţi compuşi iodaţi. Prelevarea se face în
seringă, fără a aspira, apoi descărcat în flacoane sterile cu dop, sau-şi în medii de
cultură lichide pentru hemocultură.
 Este de preferat să existe flacoane diferite: pentru cultură, pentru examenul
biochimic şi examenul microscopic. Dacă nu există decât un singur flacon, atunci
mai întâi se efectuează însămânţarea ( cultura), apoi examenul biochimic şi cel
microscopic.
La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. În
meningitele bacteriene apare tulbure, gălbui sau verzui. Culturile se fac pe medii
solide , dar pot fi făcute şi în medii lichide de hemocultură, în special la analizorul
automat .
Apoi, din L.C.R. se numără elementele ( celulele), în camera de numărat
Fuchs-Rosenthal. Valoarea normală a numărului de elemente celulare este mai
mică de 5 elemente la 1 ml, acestea fiind în special limfocite. Dacă numărul de
celule depăşeşte limitele fiziologice, este necesară efectuarea unu frotiu colorat
Giemsa pentru aprecierea raportului dintre mononucleare şi polinucleare. În
meningitele bacteriene, numărul de celule creşte la câteva sute sau chiar mii la 1ml,
predominente fiind polinuclearele. În meningitele virale, fungice şi în meningita
tuberculoasă, numărul de elemente este mai redus şi chiar dacă în primele ore
există o predominenţă a polinuclearelor, ulterior raportul se inversează cu
predominenţa mononuclearelor .
L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul este
separat şi va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei,
clorurilor.
Din sediment se efectuează 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram şi la nevioe
Ziehl-Neelsen.
Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice în LCR
sunt recomandate arunci când există modificări semnificative ale LCR: leucocite,
glucoză scăzută, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observă florăi sau pacientul a
fost tratat în prealabil . Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sau
Cryptococcus neoformans

Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul

sinovial, lichidul pericardic.
Aceste lichide se recoltează de regulă prin puncţie transcutană, în condiţii de
asepsie riguroasă, în cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, orice
microorganism de pe piele care contaminează proba duce la rezultate complet
eronate. Lichidul peritoneal se poate recolta şi intraoperator, cu tamponul steril.
Dacă lichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din
produsul patologic. În caz contrar, se fac culturi aerobe şi anaerobe.
 Bila
Recoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, după colecistectomie,
direct din vezica biliară cu tamponul steril sau în seringă.
Tubajul duodenal se efectuează dimineaţa pe nemâncate, cu sonda Einhorn
introdusă pe nas sau pe gură, după ce bolnavul a făcut gargară cu ser fiziologic. Se
introduce sonda până la diviziune 45, apoi se culcă bolnavul pe parte dreaptă şi se
continuă introducerea sondei până la diviziunea 60. Se aspiră pe sondă iniţial bila
A, bilă amestecată cu suc duodenal. Se introduc pe sondă 30 ml soluţie de sulfat de
magneziu sau sulfat de sodiu 40%, cu efect coleretic şi colagog. Se aspiră apoi bila
B, de culoare verde închis, vâscoasă ( bila veziculară), apoi bila C, mai deschisă la
culoare şi mai fluidă ( bila hepatică). Pentru examenul bacterilogic se foloseşte bila
B, 10-20 ml.
Din bila B se fectuează culturi aerobe şi anaerobe.
Din eşantioane de bilă A, B şi C se efectuează preparate între lamă şi lamelă
pentru examenul parazitologic.

Exudatul faringian şi exudatul nazal

Exudatul faringian se recoltează cu tamponul steril, de unică folosinţă.
Recoltarea se face dimineaţa pe nemîncate, înainte ca pacientul să se spele pe dinţi,
să-şi facă toaleta bucală sau să bea ceva. De asemenea, recoltarea se face înaintea
oricărui tratament cu antibiotice sau local ( badijonări cu substanţe antiseptice,
antifungice sau antibacteriene).
Pacientul este aşezat cu faţa spre lumină , i se indică să deschidă gura cât
poate de mult şi cu ajutorul unui apăsător de limbă se presează limba astfel încât să
se evidenţieze peretele posterior al oro-faringelui şi tonsilele palatine. Se
examinează macroscopic rapid oro-faringele şi cu o mişcare rapidă, blîndă dar
precisă se şterg cu tamponul peretele faringian şi tonsilele. Nu se ating peretele
superior al palatului şi nici limba .( Secreţia linguală este o investigaţie aparte, când
se recoltează tot cu tamponul strict de pe suprafaţa limbii ).
Exudatul nazal se recoltează în mod similar, cu tampon steril , din fiecare
fosă nazală.
Exudatul faringian şi cel nazal se transportă la laborator şi se însămânţeazp în
cel mai scurt timp posibil, evitându-se uscarea tamponului şi efectul temperaturii
scăzute, care duc la moartea florei bacteriene, în special a streptococilor şi
pneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii de
conservare şi transport.

Secreţiile conjunctivale, otice, secreţiile de plagă

Secreţia conjunctivală se recoltează cu tamponul steril, dimineaţa, înaintea
efectuării toaletei şi înaintea aplicării de coliruri sau de creme oftalmice .
Prelevarea se va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit în
ser fiziologic steril.
Secreţia otică se recoltează cu tamponul steril din conductul auditiv , înainte
de aplicare oricărui tratament cu antibiotice sau antiseptice.
Secreţiile de plagă se vor recolta cu tamponul steril, înainte de toaleta plăgii.
Dacă plaga este profundă şi secreţia abundentă, se va recolta cu seringa sterilă şi o
probă pentru cultură în anaerobioză.

Sputa
Sputa poate fi recoltată prin expectoraţie într-un recipient steril (gradat, de
unică folosinţă). Pacientul este instruit ca dimineaţa, după un acces de tuse , să
expectoreze în recipientul steril, evitând să amentece sputa cu saliva. Acest lucru
este dificil de realizat, principalul neajuns al metodei este că produsele sunt
frecvent contaminate cu floră din cavitatea bucală.
Probele de spută recoltate în cursul bronhoscopiei sunt ferite de acest
inconvenient, contaminarea cu floră bucală fiind practic neglijabilă. Această
metodă este cea mai recomandabilă.
La copiii mici, care nu ştiu să expectoreze şi înghit sputa. Aceasta poate fi
recoltată prin tubaj gastric urmat de introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat
de aspiraţie. În lichidul aspirat va fi şi sputa înghiţită, dar micobacteriile şi fungii
conţinuţi pot fi de origine gastrică

Urina
Recoltarea urinei pentru urocultură este indicată în suspiciunea de infecţie
urinară. Recoltarea se poate face în mai multe moduri.
În majoritatea cazurilor, urina se recoltează în timpul primei micţiuni de
dimineaţă, “din mijlocul jetului”. Pacienţii sunt instruiţi ca înainte de prima
micţiune să efectueze o toaletă genitală riguroasă, cu apă şi săpun, apoi să se
şteargă cu tifon steril, iar femeile care au secreţii genitale abundente să-şi introducă
un tampon intravaginal. Aceste măsuri sunt absolut necesare pentru a evita
contaminarea probei de urină cu floră de la nivelul mucoasei genitale.
Recoltarea se face în flacoane steile, de unică folosinţă. Pacientul va începe
să urineze, pentru ca prima porţiune a jetului să elimine flora existentă la nivelul
uretrei terminale; apoi va întrerupe voluntar micţiunea; va deşuruba flaconul steril
şi a doua parte a jetului ( mijlocul jetului) o va urina direct în flacon – 2-3 ml. Va
astupa flaconul. Va termina micţiunea normal, în toaletă.
La bolnavii care nu-şi pot controla micţiunea ( copii mici, adulţi inconştienţi)
şi la cei la care oricum se efectuează sondaj vezical evacuator ( adenom de prostată,
etc.) recoltarea urinii pentru urocultură se face pe sondă. Aici există însă pericolul
introducerii în vezica urinară a florei de la nivelul uretrei terminale sau chiar floră
exogenă.
 Puncţia suprapubiană transcutanată permite recoltarea unei probe de urină
direct din vezica urinară.
Urina fiind un excelent mediu de cultură, ea va fi păstrată la temperatura
camaerei maximum 2h până la însămânţare, sau la frigider maxim câteva ore.

Materiile fecale
Materiile fecale se recoltează în scopul efectuării coproculturii sau a
examenului coproparazitologic.
Coprocultura este indicată în bolile diareice, în febra tifoidă şi paratifoidă şi
pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face
în coprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare şi transport.
La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recoltează din scaunul emis
spontan, într-un recipient steril, fără urme de detergenţi sau dezinfectanţi. Cu
linguriţa cu care este prevăzut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o
cantitate mică din probă, în special cu sânge sau mucus, dacă există. Proba fa fi
introdusă în coprorecoltor, în mediul de conservare şi transport Carry-Blair.
Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton ,
introdusă 10-12 cm la copil şi 16-18 cm la adult, şi aspirând prin presare la capătul
distal al sondai. Aceasta va fi apoi descărcată în ser fiziologic sateril sau în mediu
Carry-Blair dun ciprorecoltor.
Pentru suspecţii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea meteriilor
fecale se va face după administrarea unui purgativ salin ( sulfat de sodiu şi de
magneziu).
Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face în mod similar, proba
introducându-se într-un coprorecoltor de unică utilizare fără mediu de conservare şi
transport.

Secreţiile genitale: secreţia vaginală şi secreţia uretrală.

Secreţia vaginală se recoltează pe masa ginecologică. Este de preferat ca
feneia să se afle în primele 5-10 zile după menstruaţie, pentru a evidenţia mai bine
parazitul Trichomonas vaginalis. Ce tamponul steril se recoltează secreţie din vagin
şi din fundul de sac posterior, iar dun secreţia acumulată pe valvă, se depun probe
pe 2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspăt şi pentru frotiuri. Pentru
preparatul proaspăt lamele şi serul fiziologic folosit trebuie ţinute la termostat la 37
O
C, iar examinarea microscopică să fie făcută în 10-15 minute de la recoltare.
Frotiurile se colorează Albastru de metilen şi Gram. Culturile se fac pe geloză-
sânge, geloză chocolat , Muller-Hinton sau Thayer-Martin şi AABTL.
Secreţia uretrală la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundentă. La
bolnavii cu uretrite cronice este mult mai redusă. Ea se recoltează dimineaţa,
înainte de micţiune. După un masaj uşor al uretrei anteroare, ca să se exprime
câteva picături de secreţie (picătura matinală). Cu un tampon steril se recoltează
pentru cultură, apoi se depune câte o picătură pe 2-3 lame de microscop, pentru
examenul direct şi pentru frotiuri.
În vederea sepistării parazitului Trichomonas se poate exmina sedimentul
urinar al primului jet de urină recoltat de dimineaţă.

Scuame cutanate, fire de păr

Scuamele cutanate se recoltează prin raclare uşoară, cu o lamă de bisturiu,
din regiunea periferică a leziunii, apoi se introduc într-o eprubetă sterilă. Firelele de
păr modificate se recoltează cu pensa prin smulgere, apoi se introduc într-o placă
Petri sterilă. Unghiile parazitate se taie cu o foarfece dezinfectată şi se introduc
într-o placă petri sterilă.
Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice şi eventual
bacteriologice.
 Capitolul IV
EXAMENUL MICROSCOPIC

Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de

vizibilitate a ochiului liber, între care şi microorganismele.
A. Microscopul fotonic posedă o sursă de iluminat, un condensor care
reglează intensitatea luminii, un sistem de lentile care amplifică imaginea, şi
platina, suprafaţa pe care se aşează preparatul microscopic.
Lentila obiectiv ( numită în mod curent obiectivul ), este cea din apropierea
platinei . Un microscop are mai multe lentile obiectiv, cu putere de amplificare
diferită ( 10X, 20X, 40X, 100X) fixate pe un dispozitiv mobil numit revolver. În
funcţie de necesităţi, prin rotirea revolverului se utilizează obiectivul dorit.
Lentilele ocular ( sau ocularele), sunt cele din apropierea persoanei care face
examinarea. Ele sunt de obicei 7X sau 10X.

O c u la r e

R e v o lv e r

O b ie c t i v

C ondensor
D ia fr a g m a M a c r o v iz a
M ic r o v iz a
S u r s a d e l u m in a
C o n t r o lu l m is c a r ii
in p la n o r iz o n ta l

Fig.IV.1. Schema unui microscop optic

 Mărirea obţinută cu ajutorul microscopului optic ( puterea de mărire a
microscopului ) este egală cu puterea de mărire a lentilei obiectiv înmulţită cu
puterea de mărire a lentilei ocular:
Tabel IV.1. Puterea de mărire a microscopului
Obiectiv Ocular Mărire
20 X 7X 140
40 X „ 280
100 X „ 700
20 X 10 X 200
40 X „ 400
100 X „ 1000

O altă caracteristică a unui mocroscop este limita de rezoluţie, distanţa cea

mai mică între două puncte necesară pentru ca acestea să fie vizibile.
Microscopul optic foloseşte o sursă de lumină cu radiaţii din spectrul vizibil,
iar fasciculul de raze are un sens ascendent, paralel cu axul optic principal şi
străbate direct preparatul microscopic. Limita sa de rezoluţie este de 0,2 µm.
Microscopul cu fond întunecat ( ultramicroscopul) realizează luminarea din
lateral a preparatului; în obiectiv nu pătrund decât razele reflectate de marginile
celulelor ( bacteriilor, de exemplu), care apar albe, strălucitoare, refringente, iar
fondul este negru ( întunecat). Aceste microscoape pot fi realizate din microscoape
optice, prin înlocuirea condensorului cu un condensor special, prevăzut cu un disc
opac central . Microscopul cu fond întunecat permite examinarea preparatelor
proaspete, necolorate (Treponeme, Leptospire) şi permite studiul obiectelor
transparente.
Microscopul cu contrast de fază foloseşte transformarea diferenţei de fază
a luminii care travresează un preparat în diferenţă de intensitate, sesizabilă cu
ochiul liber. Este folosit la studiul preparatelor cu celule vii , preparatelor
proaspete necolorate şi al celor slab colorate : Ricketsii, Treponeme, Leptospire.
Microscopul cu fluorescenţă – la care sursa de lumină foloseşte radiaţii din
domeniul U.V. apropiat spectrului vizibil şi vizibil. Se bazează pe fenomenul de
flurescenţă - fenomenul de emitere a unor radiaţii luminoase din spectrul vizibil de
către o celulă sau substanţă, dacă aceasta este supusă acţiunii unei radiaţii excitante
externe, cu durata mai mică de 107 sec. Fluorescenţa celulelor sau
microorganismelor poate fi:
- primară ( naturală), proprie celulei respective
- secundară, sau rezultată prin cuplarea celulei respective cu o substanţă
fluorescentă numită fluorocrom.
Cei mai imporanţi fluorocromi sunt: Izotiocianatul de fluoresceină,
Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat colorat cu fluorocromi trebuie
examinat întotdeauna în paralel cu un preparat similar necolorat ( martor),
 pentru a face diferenţa între fluorescenţa preparatului colorat de cea naturală
a unor celule.
Microscopul cu florescenţă este folosit în bacteriologie, virusologie,
parazitologie şi imunologie ( imunofluorescenţa).

Microscopul electronic foloseşte lentile electronice: câmpuri magnetice,

electrice sau electromagnetice, care acţionează asupra unui fascicul de electroni
acceleraţi, pe care îl poate focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are o
putere de rezoluţie de 100.000 ori mai mare decât a uni microscop optic.
Principalele tipuri de microscoape electronice sunt :
- M.E. prin transmisie – folosit pentru examinarea unor preparate
transparente la trecerea unui fascicul de electroni. Schematic, este format
dintr-o sursă de electroni acceleraţi ( tub electronic), sistem de lentile
condensor ( câmpuri electrice sau magnetice), portobiect, lentilă obiectiv,
lentilă proiector (tot electromagnetică) şi ecran de observaţie fluorescent
sub acţiunea electronilor.
- M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeţelor obiectelor solide.
Este format dintr-o sursă de electroni acceleraţi, un sistem de baleiere a
fasciculului de electroni pe suprafaţa preparatului de examinat, un sistem
de detecţie a electronilor emişi de pe suprafaţa preparatului, un sistem de
amplificare video şi un tub cinescopic. Ambele tipuri de M. E. Sunt dotate
cu un sistem ce asigură vid înaintat pe tot traiectul parcurs de electroni,
traiect ce se găseşte într-o structură închisă numită coloana microscopului
electronic.
Preparatele microscopice pentru microscopia fotonică utilizate în
microbiologie

În vederea examenului microbiologic, preparatele microscopice pot fi

efectuate atât din produsele patologice, cât şi din culturi.
Preparatele microscopice pot fi de două feluri:
- preparate proaspete ( native), între lamă şi lamelă
- preparate uscate, fixate şi colorate – frotiurile

Preparatul proaspăt
Materiale necesare: lame de microscop curate,degresate şi uscate
Lamele de microscop
Pipete, ansă bacteriologică, bec Bunsen, ser fiziologic steril , soluţie Lugol
Tehnica de execuţie: dacă produsul patologic este lichid sau cultura bacteriană este
în mediu lichid, cu pipeta sterilă se ia o picătură din acestea şi se depune pe o lamă
de microscop. Se acoperă cu o lamelă. Se examinează cu obiectivul 40 X.
- Dacă produsul patologic este solid sau cultura bacteriană este pe mediu
solid, pe lama de microscop se depune o picătură de ser fiziologic steril,
 apoi ansa sterilă se încarcă cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene, se
emulsionează în picătura de ser fiziologic, apoi se acoperă cu lamelă şi se
examinează cu obectivul 40X..
Este folosită pentru examinarea bacteriilor, paraziţilor, fungilor
Avantajele preparatului proaspăt:
- este uşor de executat şi se efectuează rapid
- evidenţiază forma şi mobilitatea microorganismelor ( viabilitatea celor
mobile)
- preparatul poate fi examinat şi la microscopul cu cu câmp întunecat sau la
microscopul cu contrast de fază.
Dezavantaje:
- microorganismele sunt vii, deci există posibilitatea contaminării
- dacă examinarea nu se face în 10-15 minute, preparatul se usucă şi
examinarea devine imposibilă
- nu poate fi păstrat.

Frotiul
Materiale necesare
Lame de microscop curate,degresate şi uscate
Pipete, ansă bacteriologică, bec Bunsen, ser fiziologic steril
Tehnica de execuţie:
Etapele efectuării unui frotiu sunt:
a. întinderea frotiului
b. uscarea
c. fixarea
d. colorarea
a. întinderea frotiului: dacă produsul patologic este lichid sau cultura
bacteriană este în mediu lichid, cu pipeta sterilă se ia o picătură din acestea şi
se depune pe o lamă de microscop. Dacă produsul patologic este solid sau
cultura bacteriană este pe mediu solid, pe lama de microscop se depune o
picătură de ser fiziologic steril, apoi ansa sterilă se încarcă cu produs sau cu
2-3 colonii microbiene şi se emulsionează în picătura de ser fiziologic
urmărind să se obţină o suspensie omogenă şi nu prea densă . Apoi, cu ansa,
prin mişcări concentrice, se întinde picătura în strat subţire.
b. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea bruscă, la
temperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu , cu distrugerea
morfologiei şi structurii celulelor.
c. Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul în sus peste flacăra
becului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizează aderarea frotiului de lamă ,
astfel încât nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de spălare din timpul
colorării, asigură omorârea microorganismelor şi creşte susceptibilitatea
acestora la coloranţi.
 d. Colorarea este o etapă esenţială în executarea unui frotiu. Coloraţiile cel mai
frecvent folosite în bacteriologie se clasifică în :
- coloraţii simple: coloraţia cu albastru de metilen ( A.M.)
- coloraţii duble: coloraţia Gram
- coloraţii speciale: coloraţia Ziehl-Neelsen, Coloraţia Del Vechio,
coloraţia pentru capsulă, coloraţia pentru spori, coloraţia pentru flageli,
etc.

Coloraţia cu albastru de metilen este o coloraţie simplă, rapidă, neagresivă

asupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare şi recolorare , şi care
permite o orientare rapidă asupra prezenţei şi morfologiei baceriilor. De
asemenea, permite vizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar
în jurul acestora.
Tehnica coloraţiei albastru de metilen:
- frotiul bine uscat şi fixat se acoperă cu soluţie albastru de metilen 1%,
timp de 2-3 minute
- se scurge colorantul şi se spală cu apă
- se usucă în stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic bacteriile şi levurile apar colorate albastru închis,
iar celulele eucariote: leucocite, celule epiteliale, etc, în albastru deschis, cu
nucleii mai închişi.

Coloraţia Gram este cea mai utilizată coloraţie în bacteriologie. Imaginată

în 1884 de danezul Hans Christian Gram , a suferit mici adaptări de-a lungul anilor,
dar în esenţă a rămas neschimbată. Permite vizualizarea marii majorităţi a
bacteriilor, cu încadrarea în categoriile morfologice: coci, bacili, etc. şi
diferenţierea lor în cele două mari clase : bacterii Gram-pozitive şi bacterii Gram-
negative.
Timpii coloraţiei Gram ( modificată de Hucker):
- frotiul uscat şi fixat se acoperă cu soluţie de Violet de genţiana sau Cristal
violet , 1-3 minute
- se scurge colorantul şi se spală cu apă
- se acoperă frotiul cu soluţie Lugol , 1 minut
- se scurge Lugolul şi se spală cu apă
- decolorare cu alcool-acetonă 25 secunde (strict)
- se spală cu apă
- se acoperă frotiul cu soluţie fuxină 10% diluată extemporaneu, 1 minut
- se scurge colorantul şi se spală cu apă
- se usucă în stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic, unele bacterii apar colorate în violet – Gram
pozitive, altele apar colorate în roz- Gram negative.
 Diferenţa de colorabilitate se datorează structurii diferete a peretelui celular
la cele două categorii de bacterii: Unele au peretele format din mai multe straturi de
peptidoglican, impenetrabil pentru alcool-acetonă, astfel încât violetul nu este
extras din celulă. Altele au peretele format din puţine straturi de peptidoglican şi
bogate în lipide, care se solubilizează în alcool-acetonă, permiţând decolorarea
violetului şi colorarea cu fuxină.

Coloraţia Ziehl-Neelsen evidenţiază bacterii acid-alcoolo rezistente, din

genurile Mycobacterium şi Nocardia.
Reactivi necesari:
- Fuxină fenicată Ziehl 1%
- soluţie alcool-acid ( alcool 96% şi acid aclorhidric sau azotic )
Timpii coloraţiei Ziehl-Neelsen
- frotiul uscat şi fixat se acoperă cu fuxină Ziehl 1% şi se încălzeşte dosul
lamei ( cu flacără de alcool) până la emisia de vapori, de 3 ori câte 5
minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului
- se lasă să se răcească
- se varsă colorantul şi se spală cu apă
- de colorare cu acid-alcool timp de 2-3 minute
- se spală cu apă
- se acoperă cu albastru de metilen pentru recolorare 1 minut
- se spală, se usucă în stativ la temperatura camerei
La examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo- rezistenţi apar coloraţi în roşu.
Celelalte bacterii, precum şi celulele eucariote din frotiurole efectuate din produsele
patologice, apar colorate în albastru.
Mecanismul coloraţiei este pătrunderea fuxinei fenicate în bacterii la cald şi legarea
acesteia de acizii micolici din peretele celular. La temperatura camerei, peretle
celular al acestor bacterii este impenetrabil atât la amestecul decolorant, cât şi la
colorarea cu A.M.
 Capitolul V
CULTIVAREA ŞI IZOLAREA BACTERIILOR

Mediile de cultură
Mediile de cultură sunt medii care permit dezvoltarea in vitro a bacteriilor.
Primele medii de cultură au fost obţinute pornind de la bulionul de carne, medii
complexe cu compoziţie incomplet cunoscută. În prezent se utilizează medii
sintetice, cu o compoziţie bine precizată. Ele se comercializează fie gata preparate
şi turnate, gata de folosire, fie sub formă deshidratată, urmând a fi rehidratate,
sterilizate şi apoi turnate în plăci Petri sau tuburi, în funcţie de utilitatea lor. ( Fig.
V.1. şi V.2.)

Fig.V.1. Medii deshidratate şi suplimente selective (Oxoid)

Fig.V.2. Medii turnate în plăci Petri şi în tuburi (Oxoid)

 Mediile de cultură trebuie să îndeplinească anumite cerinţe:
- să conţină substanţele nutritive organice necesare bacteriilor:
proteine, peptone, hidrocarburi, folosite ca surse de energie, de azot,
carbon, etc.
- Să conţină săruri minerale: cloruri, sulfaţi, fosfaţi, oligoelemente
( Fe, Ca, Zn, Mg, Mn, Co )
- Să fie bine hidratate, apa fiind un element indispensabil creşterii
bacteriilor
- pH-ul să fie adecvat, în general neutru, dar existând şi medii cu ph
alcalin, favorabil anumitor specii.
- Factorii de creştere sunt necesari anumitor bacterii: coenzime,
aminoacizi, baze purinice sau pirimidinice .
- Sterilitatea mediilor este o condiţie esenţială pentru evaluarea
corectă a unei culturi din produsele biologice.

Clasificarea mediilor de cultură

În funţie de starea de agregare, mediile de cultură se clasifică în:
- medii lichide
- medii solide
- medii semisolide
Mediile lichide conţin hidrolizate proteice, cu conţinut variabil în aminoacizi
şi peptone, de exemplu apa peptonată şi bulionul. Pornind de la acest două medii
de bază, se pot obţine alte medii lichide prin adaosul altor substanţe.
Mediile solide conţin geloză sau agar, polizaharid extras din algele marine
Gelidum sp., solubil în apă şi care la temperatura de 90 O C se topeşte complet şi
rămâne în stare lichidă până la scăderea temperaturii la 40O C. La această
temperatură se solidifică sub forma unui gel transparent care, reîncălzit se
lichefiază din nou. Mediile solide se obţin din medii lichide prin adaosul de agar, în
concentraţie de 1.5%.
Mediile semisolide au o concentraţie de agar de 0.5%.
În funcţie de complexitatea structurii, există:
- medii simple, ce conţin un număr redus de componente şi pe care
pot creşte bacteriile nepretenţioase; exemplu: geloza nutritivă ( geloza simplă)
- medii complexe, ce conţin sânge, ser, ascită, oligoelemente şi alte
suplimente necesare creşterii bacteriilor pretenţioase; exemplu: geloza sânge
În funţie de utilitatea mediilor de cultură, acestea se clasifică în:
Medii uzuale, folosite de rutină, pe care cresc majoritatea speciilor
bacteriene de interes medical, folosite pentru însămânţarea majorităţii produselor
patologice: bulionul, geloza nutritivă, geloza sânge.
Medii de îmbogăţire folosite pentru produsele paucimicrobiene şi care
permit, după incubare, dezvoltarea şi înmulţirea preferenţială a acelor bacterii aflate
în număr mic. Aceste medii sunt medii lichide, bogate în substanţe nutritive. Cele
mai folosite sunt: bulionul nutritiv, bulionul cu extract de creier şi cord. Dacă la
aceste medii se adaugă, ele devin medii selective favorabile unor anumite specii:
streptococ, pentru stafilococ (Chapmann lichid), pentru bacilul difteric ( OST), etc.
Medii diferenţiale şi selective . Mediile diferenţiale conţin substanţe
( zaharuri, aminoacizi)care sunt substrate ale unor reacţii metabolice şi substanţe
indicatoare, ce evidenţiază dacă tulpina bacteriană testată are sau nu capacitatea de
ale utiliza. (vezi tabel V.1)

Tabel V.1. Aspectul virării culorii la principalii indicatori

Substanţa indicatoare Culoarea iniţială Culoarea după virare
Albastru de brom-timol Albastru-verzui la pH Galben la pH 6
7.6
Roşu neutru Roz - Orange la pH Roşu la pH ≥ 8
≤6,8
Roşu fenol Roşu la pH 8.4 Galben la pH 6.8

Mediile selective conţin substanţe inhibante: antibiotice, săruri biliare,

compuşi coloranţi, care permit dezvoltarea unui număr mic de specii sau chiar ale
unei singure specii.
Unele medii posedă atât sistemul selectiv cât şi sistemul diferenţial.
Exemple:
- mediul AABTL , mediul Mac Conkey – medii diferenţiale
- mediul Chapmann solid – mediu selectiv pentru stafilococi;
- mediul ABE ( agar, bilă, esculină) – mediu selectiv pentru identificarea
enterococilor.
- mediul ADCL, mediul Salmonella-Shigella – medii selective şi diferenţiale pentru
enterobacterii
Medii pentru anaerobi . Culturile pentru anaerobi pot fi făcute în medii
lichide cu adaus de substanţe reducătoare ( exemplu: bulion thioglicolat cu hemină
şi Vit.K) , cu incubare în atmosferă obişnuită, sau pe medii solide ( Schaedler blood
agar ) cu incubare în anaerobioză. ( fig. )
Medii pentru antibiograme: medii nutritive care permit creşterea
majorităşii speciilor bacteriene; se urmăreşte ca inhibiţia creşterii să fie datorată
strict antibioticelor. Exemple: Muller-Hinton solid pentru testarea susceptibilităţii
antimicrobiene , Muller-Hinton solid cu adaus de Na Cl 2% pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice a stafilococilor, Muller-Hinton solid cu sânge pentru
testarea sensibilităţii la antibiotice streptococilor
Medii pentru identificare biochimică sunt medii ce conţin un zahar
( glucoză, lactoza, zaharoză, maltoză, etc) sau alte substrate biochimice: uree, citrat,
lizină sau medii cu mai multe substrate: TSI ( triple sugar iron), MIU ( triptofan,
uree) , MILF ( triptofan, lizină, fenil-alanină) şi diferiţi indicatori de culoare. După
însămânţatarea cu tulpina de cercetat şi incubare, virajul culorii indică
metabolizarea substanţelor respective.
Există şi galerii miniaturizate cu 12-20 medii de identificare biochimică.
Medii de conservare şi transport. Compoziţia lor este echilibrată în aşa fel
încât să menţină în produsele patologice viabilitatea microorganismelor şi aspectul
cantitativ original. Sunt în general medii semisolide. Exemplu: mediul Carry-Blair.

Însămânţarea mediilor de cultură

Trecerea unei cantităţi din produsul biologic sau dintr-o cultură pe un mediu
în vederea izolării microorganismelor se numeşte însămânţare.
Însămânţarea mediilor lichide se poate face cu ansa sterilă, cu pipeta sterilă
sauprin descărcarea directă a seringii atunci când produsul este recoltat în seringă
( sânge, LCR).
Pentru însămânţarea cu ansa, aceasta se sterilizează în flacăra becului
Bunsen, dacă nu este o ansă sterilă de unică folosinţă, se încarcă cu produs
biologic, apoi flaconul sau tubul cu mediu lichid se destupă, se flambează gura
acestuia. În continuare flaconul sau tubul se înclină uşor, se descarcă ansa pe
peretele acestuia apoi prin mişcări uşoare se dispersează inoculul în masa mediului.
( Fig. V.3.)

Însămânţarea mediilor solide. Se depune o cantitate mică din produsul

patologic (cu tamponul, pipeta, sau cu ansa) pe suprafaţa mediului, într-o margine a
plăcii Petri. Apoi cu ansa sterilă se face dispersia în vederea obţinerii de colonii
izolate (fig. V.4.).
Dispersia poate fi făcută pe toată suprafaţa plăcii sau într-un sector de placă
marcat în prealabil. Se poate face o dispersie simplă, în zig-zag (fig. V.5.)sau o
dispersie în cuadrant sau pentagon deschis (fig.V.6).
Însămânţarea mediilor solide turnate în tuburi în pantă se face cu ansa,
descriind un zig-zag pe suprafaţa pantei dinspre porţiunea inferioară spre porţiunea
superioară a pantei.
Mediile turnate drept în tub se însămânţează prin înţeparea mediului cu ansa
în zona centrală şi retragerea ansei pe acelaşi traseu.
Însămânţarea mediilor anaerobe. Mediile se toarnă în tuburi Weinberg,
pentru ca raportul dintre suprafaţa mediului şi volum să fie redus. Mediile se fierb
în prealabil timp de 20-30 minute pentru regenerare (eliminarea oricăror urme de
oxigen din mediu). După răcire, se trece la însămânţare, cu pipeta sau cu ansa , în
profunzimea mediului. După însămânţare, peste mediu se adaugă 2 ml ulei de
parafină steril ce împiedică contactul direct al mediului cu aerul ( oxigenul).
 Dacă se folosesc sistemele de incubare în anaerobioză, însămânţarea se face
în mod obişnuit pe medii solide (Schaedler blood agar), se introduc în dispozitivul
special, alături de plicul cu substanţa reducătoare peste care s-au turnat 10 ml apă.
Se închide ermetic dispozitivul şi se incubează. ( Fig.V.7.)
Incubarea mediilor însămânţate se face în termostat, la 37, timp de 24-24h,
cu unele excepţii, cum ar fi hemoculturile ( 7 zile) sau culturile pentru
Mycobacterium tuberculosis ( 2-6 săptămâni)
Bacteriile cu necesităţi crescute de CO2 se incubează într-o atmosferă
îmbogăţită în acest gaz, obţinută prin aprinderea unei lumânări în vasul în care se
găsesc plăcile însămânţate. Flacăra se stinge când oxigenul necesar arderii a fost
consumat, acesta fiind înlocuit cu CO2. (Fig. V.8.)

Fig.V.3. Însămânţarea mediilor lichide (după Benson J.H.)

Fig.V.4. Poziţia ansei pentru însămânţarea pe mediul solid (după Benson J.H.)

Fig. V.5. Dispersia simplă

 Fig.V.6. Dispersia în cuadrant deschis

Fig.V.7. Dispozitiv pentru culturi anaerobe şi schema de funcţionare (Oxoid)

Fig.V.8. Incubarea în atmosferă îmbogăţită în CO2

 Aspectele creşterii bacteriene in vitro
În mediile de cultură lichide, creşterea bacterienă se manifestă prin
tulburarea uniformă a mediului, la care se poate adăuga formarea unui văl la
suprafaţa mediului sau/şi a unui depozit pe fundul tubului.
Unele bacterii produc şi eliberează în mediu pigmenţi extracelulari (de
exemplu bacilul piocianic eliberează pigmenţi verzui – piocianina, pioverdina).
Pe mediile solide bacteriile cresc sub forma unor „colonii” - grupuri ,
grămezi vizibile cu ochiul liber, rezultate din multiplicarea unie singure bacterii sau
a unui număr mic de bacterii aflat în acelaşi loc pe suprafaţa mediului, numit
unitatea formatoare de colonii ( UFC sau CFU – colony forming unit).
Pentru caracterizarea creşterii, trebuiesc urmărite colonii izolate, din cultură
tânără, de 24h, care au toate elementele caracteristice. În culturile vechi aspectul
coloniilor se modifică, nemaifiind caracteristic.
La examinarea unei culturi, trebuie precizat dacă este vorba despre o cultură
pură sau mixtă, în acest caz fiind descrise fiecare tip de colonie în parte.
Tipul coloniei: există 4 tipuri de colonii:
S – smooth-neted, cu margini regulate, suprafaţă netedă, convexă, lucioasă
R – rough – rugos, cu margini neregulate, suprafaţă rugoasă, aspect
deshidratat
M- mucoase, cu tendinţa la confluare şi care se detaşază greu de pe suprafaţa
mediului, filante.
G – glosy –plate, transparente, cu aspectul unor picături de apă
Mărimea coloniilor
Foarte mici, punctiforme, greu vizibile, cu diametrul de aproximativ 1 mm.
( exemplu coloniile de streptococ)
Medii ( exemplu coloniile de stafilococ)
Mari, sau foarte mari cu diametrul de 3-4 mm şi mai mult, uşor vizibile, de
exemplu coloniile enterobacteriilor
Transparenţa şi culoarea
Coloniile pot fi transparente, semitransparente sau opace
Culoarea este dată de pigmenţii intracelulari: coloniile pot fi incolore sau
pigmentate ( albe, galbene, gri, oranj, etc)
Hemoliza pe mediul geloză – sânge
- hemoliză completă, sub forma unei zone clare, bine delimitate
- hemoliză parţială, verzuie ( viridans), mai slab delimitată.
Alte caractere
Producerea de pigmenţii extracelulari difuzibili în mediu
Miros specific
Migrarea pe suprfaţa mediului
Virarea culorii mediilor diferenţiale, etc
 Capitolul VI
TESTAREA SENSIBILITĂŢII IN VITRO LA SUBSTANŢELE
ANTIBACTERIENE ŞI ANTIFUNGICE

Testarea sensibilităţii in vitro la substanţele antibacteriene se numeşte

antibiogramă. Testarea sensibilităţii in vitro la substanţele antifungice poartă
numele de antifungigramă. Efectuarea lor reprezintă un moment important al
activităţii în laboratorul de microbiologie iar utilizarea rezultatelor acestor testări
permite un tratament ţintit, corect şi eficient.

Antibiograma difuzimetrică standardizată (metoda Kirby-Bauer)

Materiale necesare
Mediul de cultură utilizat este de regulă Muller-Hinton, mediu nutritiv şi
fără substanţe inhibitoare, cu pH 7,2-7,4. O excepţie o reprezintă antibiograma
pentru streptococi, la care mediul utilizat este geloza-sânge. Mediul se toarnă în
plăci Petri în strat de 4 mm grosime.
Inoculul bacterian este reprezentat de o suspensie cu densitatea de 0,5 Mc
Farland ( aproximativ 108 microorganisme / ml ), efectuat din cultura pură a
tulpinii ce urmează a fi testate. Această densitate se realizează cu aproximativ 2-3
colonii la 2 ml bulion , dar obligatoriu se verifică şi se ajustează la un densitometru.
Discurile cu antibiotice conţin cantităţi standardizate din fiecare antibiotic.
Vor fi folosite 2-3 antibiotice din fiecare clasă şi câteva antibiotice de rezervă. Ele
vor fi alese în funcţie de tulpina bacteriană testată şi eventual de sediul infecţiei , de
exemplu:
 setul de antibiotice la care se testează stafilococii,
 setul de antibiotice la care se testează streptococii,
 setul de antibiotice pentru bacilii Gram-negativi,
 setul de antibiotice pentru bacteriile izolate din infecţiile urinare.

Fig.VI.1.Trusă pentru antibiograma prin metoda difuzimetrică (Bioanalyse)

Tehnica de lucru:
Suspensia bacteriană este însămânţată uniform pe toată suprafaţa mediului,
fie cu ajutorul unui tampon steril, fie prin inundarea plăcii urmată de îndepărtarea
excesului de inocul prin aspirare cu o pipetă sterilă.

Fig.VI.2. Insamânţarea placii pentru antibiogramă (după Benson J.H.)

Se lasă mediul 15-20 minute să se usuce.

Se aplică comprimatele cu antibiotice, fie manual cu o pensă sterilă fie cu
aplicatorul mecanic, la distanţă de minim 30 mm între discuri şi 25 mm de
marginea plăcii.

Fig.VI.3. Aplicarea microcomprimatelor cu antibiotice (după Benson J.H.)

Se lasă pe masa de lucru încă 15 minute, după care se incubează la 37 0C, cu

capacul în jos, 24 h.
Citire şi interpretare
În timpul incubării antibioticele difuzează radiar în mediu. Un antibiotic
eficient asupra tulpinii bacteriene testate realizează o zonă de inhibiţie a creşterii cu
atât mai mare cu cât acţiunea sa se manifestă şi la concentraţii mai mici, dar şi în
funcţie de mărimea moleculei acestuia şi de capacitatea de difuziune.
 Cu ajutorul unei rigle gradate se măsoară în mm diametrul zonei de inhibiţie
a fiecărui antibiotic. Prin compararea cu datele din tabele furnizate de producătorii
discurilor utilizate, se face evaluarea rezultatelor, pentru fiecare antibiotic fiind
apreciată sensibilitatea tulpinii ca sensibil ( S), intermediar sensibil ( I ) sau
rezistent ( R).
Prezenţa de colonii în interiorul zonei de inhibiţie semnifică dezvoltarea
rezistenţei secundare, interpretarea fiind R indiferent de mărimea diametrului zonei
respective.
Posibile surse de eroare: nerespectarea densităţii inoculului, nerespectarea
purităţii culturii, excesul de umiditate al mediului.

Fig.VI.4. Citirea antibiogramei (după Benson J.H.)

Antibiograma prin metoda diluţiilor

Antibiograma prin diluţia antibioticului în mediu lichid
Metodă cantitativă, ce permite determinarea concentraţiei minime inhibitorii
(CMI) şi concentraţiei minime bactericide (CMB) a unui antibiotic faţă de tulpina
testată. Este o metodă laborioasă, rezervată cercetării şi situaţiilor în care este
necesară administrarea de doze mari de antibiotice ( endocardite, septicemii).
Tehnica de lucru:
I: Se pregăteşte o serie de eprubete cu cantităţi egale de mediu Muller-Hinton
lichid ce conţin diluţii crescânde dintr-un antibiotic. Se foloseşte un martor de
creştere – eprubetă cu mediu dar fără antibiotic.
În eprubete se adaugă cantităţi egale din suspensia bacteriană standard de
testat.
Se incubează peste noapte la 37O C.
Citire şi interpretare:
În tubul martor, fără antibiotic trebuie să existe creştere bacteriană )
( tulburarea mediului); eprubetele în care mediul este limpede semnifică , prin lipsa
multiplicării bacteriene, sensibilitatea la antibioticul testat.
Ultima diluţie care a inhibat creşterea corespunde CMI.
II: Din epubetele cu mediu clar se însămânţează câte un sector de mediu Muller-
Hinton solid , fără antibiotic. După incubare, se notează ultima diluţie la care
bacteriile nu au crescut pe mediul solid, aceasta corespunzând CMB.
Antibiograma prin diluţia antibioticului în mediu solid
Se prepară soluţiile stoc de antibiotic, cu concentraţii de 5,120 µg/ml, din
care se vor face diluţii binare, apoi diluţia finală 1:10 în geloză topită Muller
Hinton. Apoi geloza se toarnă în plăci Petri în strat de 4 mm grosime, obţinându-se
medii solide cu diferite concentraţii de antibiotic. Pentru testarea streptococilor, la
geloza topită se adaugă 5% sânge defibrinat de cal sau de berbec.
Însămânţarea mediului se vaface cu ansa calibrată de 0,001 ml, care se
încarcă cu suspensie dun cultura de testat cu densitatea de 0.5 McFarland.
Se însămânţează şi un mediu fătă antibiotic, pentru controlul creşterii.
CMI este dată de cea mai mică concentraţie de antibiotic la carenu se observă
colonii bacteriene pe suprafaţa de inoculare.

Metoda miniaturizată API de diluţii în mediu lichid foloseşte galerii de testare a

sensibilităţii, ce conţin antibiotice în stare deshidratată.
Există diferite tipur i de teste
• antibiograme convenţionale, cu două concentraţii limită şi incubare de 18-24h
• antibiograme rapide, Rapid ATB, cu incubare de 4h, pentru stafilococi şi
enterobacterii.

Principiul metodei
Testele se bazeaza pe determinarea ratei de creştere a bacteriilor în prezenţa
antibioticului.
Galeriile sunt confecţionate din material plastic transparent şi conţin 32
godeuri .
Primele două godeuri nu conţin antibiotic şi servesc drept martor de creştere.
Lipsa creşterii sau creşterea insuficientă în acestea invalideaza rezultatele.
Celelalte godeuri conţin antibiotice în formă deshidratată, în diferite concentraţii.
În funcţie de tipul de antibiogramă, tulpina izolată poate fi testată la una sau mai
multe concentraţii ale unui antibiotic. Godeurile trebuie inoculate cu o suspensie
bacteriană în mediu special ATB medium sau NaCl 0,85%.
Galeriile sunt apoi incubate un interval de timp corespunzãtor- 4h sau 24h la 37OC.
Citirea automatã a galeriilor
Măsurarea creşterii se face turbidimetric. Cititorul face măsurătorile şi le
transferă apoi în computer, care stabileşte profilul corespunzător ( Rezistent,
Sensibil, Intermediar sensibil ).

Interpretarea rezultatelor
În general sunt testate două concentraţii limită, stabilite pe baze
bacteriologice, farmacocinetice şi terapeutice. Aceste concentraţii permit aprecierea
sensibilitătii unei tulpini astfel:
Sensibil - creşterea bacteriană este inhibată la ambele concentraţii;

Intermediar - creşterea bacteriană este inhibată numai de concentraţia mai mare.

Rezistent - creşterea bacteriană nu este inhibată de nici una din concentraţii.
Când antibioticele sunt testate la o singurã concentraţie, rezultatul se exprimă
în
Sensibil sau Rezistent.
Fig.VI.5.: Schema de utilizare a galeriei Rapid ATB STAPH ( Bio-Merieux)
E-Test este o tehnică cantitativă de determinare a sensibilităţii la subsranţele
antimicrobiene. E-Test se bazează pe o combinaţie între metodele diluţiei şi
difuziei, cuantificând direct sensibilitatea prin determinarea valorii CMI
(concentraţia minimă inhibitorie).
E Test constă în stripuri de plastic poros ce conţin un antibiotic în
concentraţii descrescătoare, calibrat cu o scală de citire a CMI în µg/ml. Stripul se
aplică pe suprafaţa mediului inoculat în prealabil cu o suspensie standard din
tulpina de testat.
Incubarea: la 370C 24 de ore.
Citirea: CMI se citeşte la punctul de inhibiţie completă a creşterii.
Exemplu: Testarea stafilococilor la Vancomicină prin metoda E-Test în
conformitate cu normele NCCLS:
Mediul: Muller-Hinton
Inoculul: suspensie bacteriană cu densitatea de 1 McF

Interpretare:

S I R
≤ 4 µg/ml 8-16µg/ml ≥ 32µg/ml

Fig.VI.6. Determinarea CMI prin E-test

 Capitolul VII
METODE IMUNOLOGICE DE UZ CURENT

REACTIILE DE AGLUTINARE, HEMAGLUTINARE,

HEMAGLUTINOINHIBARE
Principiul reacţiilor de aglutinare este formarea de legături încrucişate între
imunoglobulinele G ( IgG) bivalente sau imunoglobulinele M ( IgM) pentavalente
şi antigenele cu multipli determinanţi antigenici ( epitopi). Aceasta face ca o
moleculă de imunoglobulină să reacţioneze cu determinanţii antigenici mai multor
celule sau de pe suprafaţa mai multor particule , producând agregarea (aglutinarea)
şi eventual sedimentarea acestora.
Reacţiile sunt foarte sensibile şi specifice.
Excesul de antigene nu inhibă reacţia, spre deosebire de excesul de anticorpi,
care poate produce fenomenul de pro-zonă.
Aglutinarea directă este cea în care celulele sau particulele sunt aglutinate
direct de anticorpi. Hematiile, bacteriile, fungii şi alte microorganisme pot fi
aglutinate direct de anticorpii specifici.
Testele de aglutinare directă pot fi efectuate atît pentru detecţia unor
antigene pe suprfaţa celulelor; de exemplu antigenele de grup ABO sau Rh, fie
pentru detecţia anticorpilor în ser exemplu: prezenţa hemaglutininelor la rece;
prezenţa anticorpilor anti-neutrofile
Aglutinarea indirectă ( pasivă) se referă la aglutinarea unor antigene
adsorbite artificial pe suprafaţa unor celule (hematii) sau particule insolubile
( latex, carbon)
Reacţiile de aglutinare indirectă sunt folosite:
-fie pentru detectarea anticorpilor în probe de ser, folosind antigenele
corespunzătoare de pe suprafaţa unor celule sau adsorbite pe suprafaţa unor celule
sau particule . Exemple :reacţii de latex-aglutinare pentru: ASLO ( anti-treptolizina
O), F.R. (factor reaumatoid), ANA, SLE (anticorpi antinucleari); RPR-carbon
pentru anticorpii anti-cardiolipinici.

Fig. VII.1.Schema reactiei de aglutinare indirecta RPR-carbon

 - fie pentru detectarea unor antigene solubile, folosind anticorpii
corespunzători fixaţi pe suprafaţa unei celule sau particule ( revers-
aglutinare): Exemplu: prin metoda latex –aglutinării, se poate determina
simultan: Coagulaza legată sau „clumping factor”, Proteina A, şi
polizaharidele capsulare ale S.aureus. Reactivul latex conţine particule de
latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari,
fibrinogen şi IgG .
Atunci când antigenele sunt adsorbite pe suprafaţa hematiilor, reacţia se numeşte
hemaglutinare.
O altă categorie de reacţii de hemaglutinare se referă la aglutinarea hematiilor sub
acţiunea unor virusuri ( virusuri hemaglutinante) Reacţia poate fi folosită la
detectarea şi cuantificarea virusurilor dintr-o probă.
Prezenţa anticorpilor antivirali în ser determină inhibiţia hemaglutinării.
Reacţia de hemaglutinoinhibare este folosită pentru diagnosticul indirect al unor
infecţii virale şi pentru măsurarea titrului anticorpilor antivirali.

Fig. VII.2. Reactia de revers aglutinare: latex-aglutinare

I: Schema; II: Rezultat pozitiv(A) , negativ(B)
 Fig. VII.3. Schema reactiei de hemaglutinare

Hemaglutinarea directă: testul Coombs direct ( TCD)

În tuburi sau în placa cu godeuri se realizează diluţii seriate , în ser fiziologic,
ale unui ser ( imun antieritrocitar): ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, …etc. Se adaugă un ser
control pozitiv şi un ser control negativ.
În fiecare tub sau godeu se adaugă suspensia de hematii, astfel încât concentraţia
finală de celule să fie de aproximativ 1%.
Se agită uşor şi se lasă apoi nemişcate, la temperatura camerei, 1-2 h
Reacţia pozitivă apare sub forma unei pelicule despuse uniform pe fundul tubului
sau al godeului
Reacţia negativă apare sub forma unui buton de hematii depus pe fundul tubului
sau al godeului.

Fig. VII.4. Testul Coombs ( După Roitt)

 Pentru ca reacţia să fie interpretabilă, se citesc martorii pozitivi şi negativi, care
trebuie să fie ca atare.
Titrul este dat de ultima diluţie de ser care a determinat o reacţie pozitivă, fiind egal
cu inversul acesteia.
Semnificaţia diagnostică a TCD:
- AHAI idiopatică cu Ac la cald, inclusiv AHAI medicamentoasă
- AHAI cu Ac la rece
- Transfuzia de sânge incompatibil
- Alte cauze de AH: hepatite virale, pneumonia virală, mononucleoza infecţioasă,
meningita, LES şi alte boli autoimune, tumori ( chist ovarian)
Cauze de eroare:
Reactivul antiglobulină umană necorespunzător şi conservat necorespunzător, Sânge
coagulat şi conservat la frigider în prezenţa cheagului
Hiperproteinemie ( mielom)
Nerespectarea optimului termic al reacţiei
Testele pentru detecţia anticorpilor aglutinanţi în ser se fac prin punerea în
contact a unor diluţii binare de ser cu cantitaţi egale de antigen. Reacţiile au loc în
tuburi mici , în cantităţi de 0.2 – 0.5 ml din fiecare reactant. După câteva ore de
incubare, aglutinarea este completă şi tuburile sunt examinate, cu ochiul liber sau
cu lupa pentru observarea aglutinatelor. Există şi varianta aglutinării pe lamă sau
placă cu godeuri.

R. de hemaglutinare pasivă (indirectă ):

Exemplu: TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)

TPHA este o reacţie de hemaglutinare indirectă folosită pentru depistarea

anticorpilor îndreptaţi împotriva antigenelor specifice ale treponemelor patogene.
Principiu:
Hematii aviare pe suprafaţa cărora au fost adsorbite antigene de Treponema
pallidum ( suşa Nichols) sunt suspendate într-un diluent care împiedică aglutinarea
nespecifică.
Hematiile astfel sensibilizate, puse în contact cu serul unui pacient ce posedă
anticorpii corespunzători, vor aglutina. Reacţia poate fi efectuată calitativ sau
cantitativ.
 Tehnica imunoenzimatică ELISA
Metoda ELISA presupune adsorbţia unuia dintre componenţii imuni
Ag sau Ac pe un suport solid. Imunoadsorbţia permite fixarea ulterioară a
reactanţilor din faza lichidă, care urmează să fie identificaţi ( tehnici calitative ) sau
dozaţi ( tehnici cantitative).
Etapa finală este o reacţie enzimatică, relevată printr-o modificare de
culoare. Citirea se face spectrofotometric, iare interpretarea se face în funcţie de
valoarea adsorbanţei (intensitatea culorii), martorii +, - şi valoarea de prag.
METODE
a) metoda ELISA INDIRECTĂ
b) metoda ELISA COMPETITIVĂ
c) metoda ELISA de tip sandwich

Exemple:
Dozarea anticorpilor
a) Metoda ELISA INDIRECTĂ – presupune următorii timpi:
 Alegerea unei truse cu antigene specifice anticorpilor de dozat (adsorbite
pe suportul solid reprezentat de placa cu godeuri)
 Adiţia probei de ser.
 Incubare. Anticorpii care recunosc antigenele se fixează de aceştia şi
rămân ataşaţi
 3-5 spălări succesive, pentru a îndepărta Ac nefixaţi (necorespunzători
Ag)
 adăugarea conjugatului: Ac anti-imunoglobuline umane cuplaţi cu o
enzimă (peroxidază)
 incubare
 3-5 spălări succesive
 adăugarea substratului enzimei
 incubare. Probele pozitive se colorează, intensitatea reacţiei fiind direct
proporţională cu cantitatea de ac din proba de ser
 stoparea reacţiei şi citirea
 Fig. VII.5. Schema unei reacţii ELISA indirecte pentru determinarea
anticorpilor în ser

b) Metoda ELISA COMPETITIVĂ

 Faza solidă este identică
 Proba de ser nediluată se adaugă concomitent cu conjugatul
 Prezenţa anticorpilor în probă blochează fixarea conjugatului.
 Adăugarea substratului enzimatic şi reacţia de culoare.
 Interpretare: intensitatea culorii este invers proporţională cu cantitatea
de anticorpi din probă.

Fig. VII.6. Schema unei reacţii ELISA de tip competitiv

c) Metoda ELISA de tip sandwich

Se bazează pe faptul că Ac sunt del puţin bivalenţi
La faza solidă se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din probă. Conjugatul – Ac-
enzimă , ocupă valenţele libere ale Ac din probă ( Ac de dozat între 2 straturi de Ag)

Fig. VII.7. . Schema unor reacţii ELISA de tip sandwich

 Teste rapide imunocromatografice

Aceste teste pe principiul sandwich utilizează anticorpi monoclonali marcaţi

şi fixaţi pe suporturi solide – benzi de nitroceluloză, sub formă de stripuri sau
incluse în casete. Dacă antigenul căutat este prezent în probă reacţionează cu
anticorpii marcaţi, iar complexul migrează de-a lungul membranei cromatografice
care conţine anticorpi policlonali în regiunea TEST. Fixarea complexelor imune
determină apariţia unei linii în regiunea CONTROL, şi a unei alte linii în regiunea
TEST
În absenţa antigenului în probă, apare doar linia din zona CONTROL.
Pe acelaşi principiu dar cu antigenul fixat la faza solidă metoda este folosită
pentru identificarea prezenţei unor anticorpi

Fig. VII.8.Schema unor teste rapide imunocromatografice

Fig. VII.9. teste rapide imunocromatografice: stripuri şi casete

 Capitolul VIII
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STAFILOCOCICE

Prelevarea produsului patologic se face cu tamponul steril, ştergând cu o

uşoarã apãsare zona afectatã a tegumentului, în cazul leziunilor cutanate. Tot cu
tamponul steril se recolteazã puroi din leziunile deschise superficiale sau dupã
evacuarea chirurgicalã a colecţiilor profunde. Prelevarile trebuiesc efectuate
inaintea oricarui tratament cu antibiotice .
Examenul direct.
Din produsele patologice se pot efecta frotiuri colorate Albastru de metilen,
care se examineazã la microscopul optic, cu obiectivul 100 x cu imersie.
Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, cu diametrul de 0.8-1 micrometri,
grupaţi tipic in ciorchine, dar şi în grãmezi, lanţuri scurte, sau izolaţi. Ei sunt in
general necapsulaţi.

Caractere de culturã
Însămânţarea produselor necontaminate şi a celor moderat contaminate se
face în bulion şi pe gelozã sânge.
Stafilococii sunt bacterii nepretenţioase, care cresc şi pe geloza simplã,
nutritivã, dar se preferã geloza sânge pentru observarea hemolizei. Se foloseste
geloza cu sange defibrinat de berbec 7% si nu cu sange de om, care contine
inhibitori nespecifici si eventual anticorpi antistafilococici.
Nu este indicata la prima izolare folosirea unui mediu selectiv (Chapmann
sau Baird -Parker), care ar putea falsifica rezultatele prin selectarea exclusiva a
S.aureus, chiar in cantitate mica, neputandu-se face deosebirea dintre o colonizare
si un proces infectios real.
Daca produsul patologic este lichid de vărsătură, materii fecale, sau
alimente , în cazurile de toxiinfecţie alimentară, atunci este indicată folosirea
mediilor selective hiperclorurate Chapmann lichid şi solid
Dupa o incubatie de 18-24h la 37 oC se obtine o cultura abundenta si
caracteristica.
Cultura in bulion are un aspect tulbure, omogen.
Cultura pe geloza -sange: colonii cu diametrul de 1-3 mm, de tip S (smooth),
bombate, lucioase, opace, cu consistenta cremoasa. Pigmentul auriu, caracteristic
speciei S.aureus apare dupa 24 sau 48h.
Alte specii care pot produce colonii pigmentate sunt: S.saprophiticus
(citreus) , S.hominis, S.haemoliticus si S.hyicus, subsp.chromogenes. Pigmentii
sunt carotenoizi, iar culoarea variaza de la galben la oranj.
S.epidermidis, S.simulans, S.intermedius, S.hyicus, subsp.hyicus, produc colonii
nepigmentate (albe ) Exista tulpini de S.aureus nepigmentate sau care si-au pierdut
capacitatea de a produce pigment datorita unor factori nefavorabili din mediu. De
aceea testul coagulazei este obligatoriu.
Hemoliza: pe mediul geloză-sânge, coloniile de S.aureus pot fi înconjurate
de o zonã clarã de hemolizã completã.
Dintre speciile de stafilococi coagulazo-negativi mai pot produce hemoliza
completã S.haemoliticus si S.intermedius.
În caz de aspect necaracteristic , verificarea culturii se face prin frotiu din
culturã purã colorat Gram şi prin evidenţierea producerii de catalazã.
Testul catalazei. Catalaza - enzimă ce eliberează O2 din H2O2 este prezentã
la genurile Micrococcus si Staphylococcus şi absentã la Streptococaceae. Se poate
determina pe lamã sau în tub. Câteva colonii de stafilococ de pe un mediu de
culturã fãrã sânge se emulsioneazã în într-o picãturã de H 2O2 pe o lamã de
microscop sau în 1 ml. H2O2 într-un tub de reacţie. Eliberarea bulelor de gaz indicã
prezenţa catalazei.

Teste de evidenţiere a caracterelor de patogenitate.

1. Coagulaza.
Coagulaza legatã (clumping factor).-se determinã printr-o reacţie de
aglutinare pe lamã
- O picãturã de plasmã de iepure sau umanã citratatã se depune pe lama şi se
amestecã cu conţinutul unei anse incãrcatã cu colonii dintr-o culturã de stafilococ.
Citirea se face după 10 secunde. Acţiunea coagulazei se manifestã prin apariţia de
mici coaguli, datoritã precipitãrii fibrinogenului în fibrinã.

Coagulaza liberã se determinã printr-o reacţie de coagulare în tuburi. -se

folosesc tuburi de hemolizã sterile, în care se introduc câte 0.5 ml plasmã recoltatã
pe un alt anticoagulant decât citratul, de ex.pe EDTA.
-se adaugã 0.1 ml din cultura in bulion, sau o colonie de pe geloza simplã
-se incubeazã tuburile la 37o .
Coagulaza liberã acţioneazã asupra substanţei protrombin-like,
declanşând reacţiile ulterioare ale coagulãrii.
-reacţia se citeşte dupã 4,18 şi 24h.
-coagularea se prezintã sub 3 aspecte: -coagulare în masã
-aspect de “cap de meduza”
-aspect de grunji în lichid clar
Orice grad de coagulare indică reacţie pozitivă.
În timp ce coagularea pe lamã este un test rapid, de screening, coagularea în
tub dã rezultatul definitiv.(Lenette).

2. Prezenţa proteinei A
 Proteina A se identificã printr-o reacţie de latex-aglutinare, singurã sau
împreuna cu clumping factor.
Cu ajutorul trusei Pastorex Staph Plus, ( BIORAD, Marne la Coquette,
France), prin metoda latex –aglutinării, se poate determina simultan:
a). Coagulaza legată sau „clumping factor”
b). Proteina A, cu afinitatea pentru fragmentul „cristalizabil” ( Fc) al
imunoglobulinelor de clasă IgG
c) polizaharidele capsulare ale S.aureus.
Reactivul latex conţine particule de latex de culoare roşie sensibilizate cu anticorpi
monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen şi IgG
Metoda: 1-3 colonii de stafilococ (de pe mediul geloză sânge, geloză simplă
sau mediu hiperclorurat cu adaos de manitol) se emulsionează într-o picătură de
reactiv latex, înt-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizează prin mişcări
uşoare de rotaţie timp de 30 secunde.
Citirea şi interpretarea: prezenţa aglutinării – reacţie pozitivă. Agregatele de
latex pot fi de diferite mărimi, pe fondul unui mediu clar; absenţa aglutinării şi
aspect uniform-lactescent – reacţie negativă.
Reacţia se efectuează întotdeauna cu martori: pozitiv şi negativ, pentru a se putea
valida rezultatul.
3. Determinarea DNA-azei termostabile
Metoda clasicã -printr-o reacţie de culoare
-se utilizeazã geloza cu adaus de ADN şi albastru de toluidinã ca indicator de pH;
-în gelozã se taie godeuri în care se adaugã cultura de stafilococ de 18h în bulion,
inactivatã prin fierbere 15 minute la Bain- Marie;
-se incubeazã 2-4 h la 37oC;
Acţiunea enzimei asupra ADN şi fragmentarea acestuia determinã
virarea culorii indicarorului în roz.

O metodã mai specificã, mai rapidã dar mai costisitoare este prin reacţia de
sero-neutralizare cu anticorpi anti DNA-azã stafilococicã . Rezultatul se poate citi
dupa 4 h .

Alte teste accesorii pentru S.aureus.

Fermentarea manitei în anaerobiozã.Se foloseste geloza semisolidã cu
adaus de manitã 1 % şi indicator de pH- albastru de toluidinã sau roşu neutru. Se
inoculeazã tulpina de studiat şi se incubeazã 24-48 h la 37 o C.
S.aureus fermenteazã manita atât în aerobiozã ,cât şi în anaerobiozã
SCN fermenteazã manita strict aerob.
Producerea de acetoinã ( reactia Voges-Proskauer )
 Producerea de acetoinã din glucozã sau piruvat este o altã reacţie de
diferenţiere între S.aureus şi alte specii ce pot fi ocazional coagulazo-pozitive: S.
intermedius, S.hyicus, precum şi între S. aureus şi SCN.

Punerea în evidenţã a toxinelor

Enterotoxinele
Cele 7 enterotoxine (A,B,C1,C2,C3,D,E ) sunt antigenice şi pot fi
diferenţiate serologic, prin tehnici de imuno-difuzie, aglutinare, RIA, ELISA.

Exfoliatinele A şi B se pot determina prin metode imunologice:CIEF

(contraimunoelectroforeza) , ELISA.
Leucocidina se poate determina prin metode imunologice, ex.latex-aglutinare.

Diagnostic indirect
Diagnosticul indirect are o valoare practicã limitatã.
Titrul antistafilolizinelor alfa poate prezenta interes în cazul infecţiilor
profunde sau cronice, valorile normale fiind <2 UI/ml.
Cãutarea anticorpilor anti-peptidoglican sau anti-acizi teichoici prin imuno-
electroforezã sau imuno-difuzie în gel poate avea indicaţii în focare infecţioase
inaccesibile culturii şi endocardite cu hemoculturi negative,dar nu existã antigene
bine standardizate.

Teste biochimice de identificare a principalelor specii de stafilococi

Producerea de acid din diverse zaharuri

Fermentarea zaharurilor se poate determina clasic, prin cultivarea pe gelozã
cu adaus de diferite zaharuri şi indicator de culoare,sau folosind sisteme comerciale
de identificare biochimicã: API - staph , API staph – ident, Staph-trac-strip şi alte
sisteme automatizate şi miniaturizate de diagnostic ex. Micro-scan-Combo-panel
Aceste sisteme permit un diagnostic exact de specie şi efectuarea de antibiograme
cantitative (CMI si CMB ) la un numãr mare de antibiotice
Tabel VIII.1. Diagnosticul diferenţial între principalele specii de stafilococ
Caracter S.aureus S.epidermidi S.saprofiti S.interme S.hyicus
s cus -dius
Coagulaza + - - +/- var
Rezistenţa la - - + - -
novobiocinã
Manitol + - var Var -
Pigment + - var Var -
Acetoinã + - -
Beta-galacto- - +
zidaza
Maltoza + Var -
Fosfataza + + -
Trehaloza + - +
Xiloza - - -
Sucroza + + +

Antibiograma si determinarea rezistenţei la Meticilină

Testarea sensibilitãţii la antibiotice a tulpinilor stfilococice se poate face
convenţional, prin metoda difuzimetrica sau prin metoda dilutiilor , cu evidentierea
CMI şi CMB.
De asemenea,existã sisteme miniaturizate sau/şi automatizate pentru antibiograme
prin metoda diluţiilor (Murex, API: Bio-Merieux, Baxter)
Setul de antibiotice folosit poate varia în funţie de scopul
determinãrii (test de rutinã , cercetare ), localizarea infecţiei (cutanatã , osoasã,
proces septicemic, infecţie urinarã ), sistemul folosit.
Asociatia americanã de laborator clinic recomandã urmãtoarele
antibiotice pentru testãrile de rutinã:
-Amikacina (sau:Gentamicina,Kanamicina,Netilmicina,Tobramicina)
-Cephalotin
-Chloramphenicol
-Clindamicina
-Eritromicina
-Meticilina,Oxacilina sau Nafcilina
-Penicilina G
-Tetraciclina
-Trimetoprim-Sulfametoxazol
-Vancomicina,Teicoplanina ( antibiotice de rezervă)
 -Nitrofurantoin, Sulfizoxazol şi Trimetoprim, numai pentru
infecţii urinare.
Laboratorul nostru mai foloseşte , pentru metoda clasicã Kirby Bauer şi alte
antibiotice: -- Rifampicina, Norfloxacina, Ciprofloxacin, Ofloxacina ( sau alte
fluorochinolone), Lincomicina, Cefuroxim (generatia a II-a), Ceftazidim
(generatia a III-a), Linezolidul
Tulpinile meticilino-rezistente de S.aureus (MRSA) pot fi depistate cu mare
acurateţe astfel:
a).Metoda difuzimetricã: însãmânţare în panzã a inoculului pe gelozã Muller-
Hinton suplimentatã cu Na Cl 4% şi aplicarea de microcomprimate cu Meticilinã
10 micrograme/ml, Oxacilinã sau Nafcilinã 6 micrograme/ml. Inoculul de 106CFU
se însãmânţeazã în pânzã pe suprafaţa plãcii şi se incubeazã 24-48 h la 35-35 0 C.
Creşterea lentã la o temperaturã inferioarã 37oC, mareşte sensibilitatea testului.
b). Metoda microdiluţiilor, cu determinarea CMI, foloseşte bulion Muller-
Hinton suplimentat cu cationi bivalenţi şi NaCl 2%. MRSA demonstreazã CMI la
meticilinã de >16 micrograme/ml, iar la Oxacilinã şi Nafcilinã de >10
micrograme/ml.

Sisteme de tipare epidemiologică

Biotiparea se foloseşte mai ales pentru stafilococii coagulază negativi,
dar dã rezultate valoroase şi pentru S.aureus. Antibiogramele trebuie
standardizate pentru a oferi rezultate comparabile.
Tiparea fagicã. Folosită din 1952, oferă rezultate valoroase şi astăzi pentru
tulpinile de S.aureus. Metoda constă în stabilirea grupului de bacteriofagi la care
este sensibilă tulpina izolată (lizosensibilitate), cu ajutorul unui set de fagi activi pe
S.aureus de origine umanã.
Determinarea profilului plasmidic (tiparea plasmidicã) al tulpinilor
izolate, prin electroforeza în gel de agar a ADN tratat cu enzime de restricţie
permite identificarea de populaþii clonale stafilococice cu noi caractere, în special
referitoare la rezistenþa multiplã la antibiotice,ce poate fi codificatã de 5-10
plasmide diferite,transferabile.
Analiza ADN cromozomial prin electroforeza în câmp tranvers alternant a
ADN tratat cu enzime de restricţie, şi folosirea de sonde nucleotidice, permite
identificarea genelor ce codificã anumite caractere: producerea de toxine, rezistenţa
la antibiotice.
 Fig. VIII.1. Stafilococi pe frotiu colorat Gram din produs patologic (K.Tomae)

Fig. VIII.2. Colonii de Staphylococcus aureus pe geloza sange (K.Tomae)

Figura VIII.2. ( a, b) Latex-aglutinare pe lamă pentru clumping factor, proteina A

şi polizaharizii de suprafaţă ( Bio-Rad)

Figura VIII.3. – Galerie API – staph

 Capitolul IX
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STREPTOCOCICE

Definiţie şi caractere generale: familia Streptococcaceae cuprinde coci

Gram-pozitivi, izolaţi şi grupaţi în lanţuri de diferite lungimi sau perechi, imobili,
nesporulaţi, aerobi facultativ anaerobi; sunt catalază-negativi şi oxidazo-negativi.
Streptococii sunt bacterii pretenţioase nutritiv, ce necesită pentru creşterea in vitro
medii complexe, nutritive, mediul de elecţie fiind geloza-sânge. ( Fig. IX.1., IX.2.)
Există mai multe genuri de streptococi cu importanţă pentru om: Genul
Streptococcus, genul Enterococcus, genul Lactococcus. Apartenenţa la familia
Streptococcaceae a fost stabilită pe criterii fenotipice şi de biologie moleculară.

Principalele criterii de clasificare a streptococilor, care reprezintă şi criterii

de identificare sunt: aspectul hemolizei produsă pe mediul geloză-sânge şi prezenţa
antigenului de grup Lancefield.
În funcţie de hemoliză, se deosebesc:
- streptococii β-hemolitici, care produc hemoliză completă, sub forma unei
zone clare, bine delimitate, cu diamentrul în general mare în raport cu
marimea coloniilor.
- Streptococii α-hemolitici, produc hemoliză parţială, verzuie ( viridans), mai
slab delimitată.
- Streptococii α’-hemolitici, produc o zonă de hemoliză incompletă delimitată
de o zină înustă de hemoliză incompletă
- Streptococii nehemolitici (γ).
Clasificarea Lancefield se bazează pe prezenţa antigenului de grup –
polizaharidul C, de la nivelul peretelui celular. În funcţie de cest antigen ,
streptococii aparţin grupelor A-H şi K-W. Există şi streptococi negrupabili, care nu
posedă antigenul de grup, de exemplu streptococii viridans .
Majoritatea speciilor întâlnite la om sunt saprofite – condiţionat patogene şi fac
parte din flora normală a tegumentului, tractului respirator, digestiv, genital. Specia
obligat patogenă este Streptococcus pyogenes, dar şi această specie poate fi izolată
şi de la purtători sănătoşi.
Streptococcus pyogenes
Streptococul β-hemolitic de grup A determină:
- infecţii respiratorii: faringite, angine
- infecţii cutanate: impetigo, erizipel, infecţii de plagă, in special la arşi
- celulite, fasceita necrozantă
- scarlatină
- febra puerperală, şoc toxic
 Fig. IX.1. Streptococi - frotiu colorat Gram (după K.Tomae)

Fig. IX.2. Colonii de streptococ β-hemolitic pe mediul geloză-sânge (după

K.Tomae)

Fig. IX.3. Testul la bacitracina (după K.Tomae)

 Recoltarea şi însămânţarea produselor patologice. Produsele patologice pot fi
: exudat faringian, exudat nazal, secreţie de plagă, etc, în funcţie de localizarea
infecţiei. Acestea se recoltează pe cat posibil înaintea administrării de
antibiotice.
Însamânţarea se face, în cel mai scurt timp de la recoltare. Când acest lucru
nu este posibil, pentru a preveni uscarea tampoanelor, acestea se introduc în
mediu dr conservare şi transport sau în 2 ml bulion steril. Mediul de elecţie
este geloza-sânge, cu 7% sânge defibrinat de berbec. Incubarea se face la 37 0 C,
timp de 24 h.
Caracterele de cultură: Streptococii cresc sub forma unor colonii mici ( cu
diametru de aproximativ 0,5 mm), de tip S: rotunde lucioase, convexe, cu
margini regulate; mai rar, pot fi colonii mucoide sau de tip glossy, sau colonii
mai mari de 5 mm.
Hemoliza este completă, de tip β.
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultură pură evidenţiază coci
Gram-pozitivi grupaţi în lanţuri de lugimi diferite.
Testul catalazei – negativ
Testul oxidazei - negativ
Identificarea grupului: testul la bacitracină pozitiv ( sau Bacitracină pozitiv
şi Biseptol negativ)
Reacţii de aglutinare sau de precipitare cu seruri de grup.

Diagnosticul bolilor post-streptococice: RAA, GNA se face prin

determinarea ASLO ( Anti-streptolizina O)
Principiul metodei : reacţie de aglutinare indirectă
Anti-streptolizina-O ( ASLO) reprezintă anticorpii specifici împotriva unei
enzime extracelulare produse de Streptococcus pyogenes (Streptococul β-hemolitic
de grup A): hemolizina sau streptolizina O. Anticorpii ASLO pot fi detectaţi în
serul unei persoane cu infecţie streptococică de la o sătămână la o lună de la
debutul infecţiei.
ASLO în ser în cantitate de ≥ 200 UI / ml produc în contact cu o suspensie
de particule de latex acoperite cu streptolizină O, o reacţie de aglutinare pe lamă
vizibilă cu ochiul liber.
Compoziţia kitului:
Reactiv: suspensie de particule de latex acoperite cu streptolizină O
Control negativ: ser cu ASLO ‹ 200 UI / ml
Control pozitiv: ser cu ASLO › 200 UI / ml
Carduri de reacţie de unică folosinţă.
Reactivii sunt gata de utilizare. Ei se păstrează la frigider şi vor fi aduşi la
temperatura camerei înainte de utilizare.
 Serurile de testat se recoltează în tuburi vacuumate fără anticoagulant.
Serurile trebuie să fie clare. Serurile hemolizate şi cele lipemice nu sunt adecvate
pentru a fi analizate. Serurile pit fi păstrate la frigider (2-8O C) maximum 7 zile.

Procedura de lucru
1. Se aduc reactivii şi serurile de cercetat la temperatura camerei.
2. Se pipetează cîte 50 μl din controlul negativ , pozitiv şi din fiecare ser de
cercetat în cercuri separate de pe cardul de reacţie.
3. Se agită delicat flaconul cu reactiv latex până la omogenizarea suspensiei.
Ţinând flaconul în poziţie verticală, se depune cîte o picătură de reactiv
latex în fiecare cerc, lângă ser.
4. Se amestecă cele două picături cu beţişoare separate pentru fiecare probă.
5. Se agită manual sau mecanic prin mişcare rotativă 100 r.p.m. 2 minute.
Citire şi interpretare
Examinarea se face timp de 1 minut după oprorea rotirii.
Rezultat pozitiv: prezenţa de aglutinate vizibile indică ASLO ≥ 200 UI / ml
Rezultat negativ: absenţa aglutinatelor indică ASLO ‹ 200 UI / ml
Serurile de control trebuie să prezinte reacţii pozitive, respectiv negative pentru
validarea celorlalte reacţii.
Serurile de testat pozitive la testul calitativ vor fi titrate. Se vor face diluţii
binare în ser fiziologic şi se vor repeta testele. Titrul ASLO este dat de cea mai
mare diluţie care a prezentat reacţie pozitivă, şi anume inversul diluţiei X 200 UI /
ml. ( 400 UI / ml, 800 UI / ml, etc).
Valori normale: ASLO ‹ 200 UI / ml
Creşterea în dinamică a titrului ASLO sau un titru ASLO ≥ 800 UI / ml
indică o posibilă boală poststreptotocică.
Scăderea în dinamică a titrului ASLO sub tratament, până la normalizare este
un indicator al eficienţei acestuia.

Streptoccus agalactiae – Streptocul de grup B

Streptococcus agalactiae este condiţionat patogen. Se găseşte la aproximativ
30% dintre persoanele sănătoase în flora intestinala, naso-faringiană şi flora
vaginală, în special la gravide.
Poate produce infecţii la nou născut: meningita neonatală şi pneumonia
neonatală, cu atât mai severe cu cât nou născutul este prematur şi membranele au
fost rupte de mai mult de 48h. Cele două afecţiuni se pot complica cu septicemie.
La adult produce infecţii respiratorii şi genitale, urinare, cutanate, şi mai rar
pneumopatii, meningită, septicemie.
 Caractere de cultură – pe geloză sânge produc coloniide tip S sau M, mici,
transparente, incolore, înconjurate de hemoliză completă.
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultură pură evidenţiază coci
Gram-pozitivi grupaţi în lanţuri de lugimi diferite. ( aspectul microscopic şi al
culturii este identic cu S.Pyogenes).
Diferenţa faţă de S.Pyogenes se face astfel:
Testul la Bacitracină şi Biseptol: S. agalactiae este rezistent atât la Bacitracină cât
şi la Biseptol.
Produce hidroliza hipuratului
CAMP-test – pozitiv: producerea unei proteine ( factorul CAMP), care
interacţionează cu α- hemolizina stafilococică şi determină hemoliza completă.
Identificare serologică prin reacţii de precipitare sau de aglutinare cu serul de
grup B.

Streptococii de grup C sunt identificaţi preliminar ca Streptococi β-

hemolitici rezistenţi la Bacitracină şi sensibili la Biseptol, identificarea de
certitudine făcânduăse prin precipitare sau aglutinare cu ser de grup C.
Alţi streptococi β-hemolitici ce pot fi ocazional implicaţi în infecţii la om sunt cei
de grup F şi G. Aceştia se identifică prin reacţii de precipitare sau aglutinare cu
seruri de grup şi pe baza unor reacţii biochimice

Streptococii de grup D sunt streptococi care au habitatul normal în

intestinul uman: enterococii, precum şi specii non-enterococice. Enterococii au fost
incluşi într-un gen aparte, genul Enterococcus, cu 12 specii, dintre care prezintă
interes medical E. Fecalis, E. Fecium şi E. Durans
Pe geloză sânge,enterococii cresc sub forma unor colonii mici, transparente
sau semitransparente, cu hemoliză de tip γ , mai rar α sau β.
Microscopic, enterococii apar ovalari, cu diametrul de 0,5-1 µm, grupaţi în
perechi sau lanţuri scurte.
Majoritatea tulpinilor sunt mobile.
Aglutinează cu serul de grup D.
Testul la bilă-esculină. Mediul agar-bilă-esculină ( ABE) se însămânţează cu
tulpina streptococică. După incubare de 24 h la 37o C, apariţia unei coloraţii negre
pe mai mult de jumătate din mediul însămânţat semnifică reacţie pozitivă. Toţi
streptococii de grup D sunt pozitivi la acest test.
Toleranţa la mediu hipersalin . Acest test permite diferenţierea enterococilor
de alţi streptococi de grup D. Doar enterococii se dezvoltă uşor, în 24 h pe mediu
hiperclorurat ( Na Cl 6,5%).
Alte teste folosite în identificarea enterococilor: testul de hidroliză a
argininei, testul de hidroliză a hipuratului, fermentarea unor zaharuri.
 Creşterea la 50 o C ( E. Fecalis, E. Faecium), creşterea în mediu alcalin, cu
pH:9,6.

Streptococii viridans
Pe mediul geloză-sânge produc hemoliză incompletă, verzuie de tip α
Nu aglutinează cu serurile de grup
Se diferenţiază de pneumococi, care produc acelaşi tip de hemoliză , prin
testul la Optochin, negativ pentru streptococii viridans şi pozitiv pentru
pneumococi.
Speciile pot fi diferenţiate între ele pe baza unor recţii biochimice:
fermenterea unor zaharuri – manitol şi sorbitol, hidroliza ureei, a esculinei şi
argininei.

Diagnosticul infecţiilor pneumococice

Streptococcus pneumoniae (pneumococul) este o specie de streptococi de
formă lanceolată, grupaţi în perechi (diplo),imobili, încapsulaţi, alfa-hemolitici. Ca
toţi streptococii alfa-hemolitici, nu posedă antigen specific de grup, dar pe baza
antigenelor capsulare sunt grupaţi în 80 de serotipuri.

Fig.IX. 4. Pneumococi în spută (după K.Tomae)

Pneumococii sunt sensibili la acţiunea bilei şi sărurilor biliare, care-i lizează.
De asemenea , la pneumococi apare fenomenul de autoliză, în culturile vechi în
mediu lichid.
Pneumococii sunt bacterii condiţionat patogene, ce determină pneumonia
pneumococică, otită medie, mastoidită. Pneumonia se poate complica cu pleurezie,
bacteriemie şi consecutiv bacteriemiei: meningită, endocardită, mai rar artrită
septică.
Principalel produse patologice în care se poate identifica Str. pneumoniae
sunt: sputa, exudatul faringian, secreţie otică, L.C.R., hemocultură.
Frotiul colorat Gram din produsul patologic se efectuează pentru spută şi
L.C. R. Pneumococii apar Gram-pozitivi, de formă lanceolată, grupaţi în diplo,
încapsulaţi. Alături de ei, pe aceste frotiuri apar leucocite polinucleare,
pneumococii fiind situaţi extracelular. În coloraţia albastru de metilen sete
evidenţiată bine capsula pneumococilor, ca un halou clar în jurul perechilor de coci.
 Cultura pe mediul geloză-sânge : peumococii produc colonii mai mari decţt
ceilalţi streptococi, aplatizate, cu marginile ridicate şi centrul deprimat, înconjurate
de hemoliză viridans.
Testul la optochin : 2-3 colonii din cultura primară se însămânţează în
pânză pe un sector de placă cu geloză-sânge. În centrul sectorului se aplică un
microcomprimat cu 5µ optochin ( etil-hidro-cupreină). Se incubează 24 h la 37 O C.
Pneumococii sunt foarte sensibili la optochin, în jurul comprimatului formându-se
o zonă de inhibiţie de minim 10 mm diametru. ( Fig. IX.4.) Ceilalţi streptococi
viridans sunt rezistenţi la Optochin sau formează o zonă de inhibiţie foarte mică.
Biloliza: în două eprubete se pipetează câte 1 ml cultură în bulion din tulpina
streptococică obţinută în cultura primară. În prima eprubetă se adaugă 1 ml bilă
sterilă sau 1 ml soluţie 10% de săruri biliare ( dezoxicolat de sodiu). În cea de a
doua eprubetă se adaugă 1 ml ser fiziologic steril. După 30 min, în primul tub se
observă clarificarea mediului, datorită lizei bacteriilor. Dacă reacţia rămâne
negativă, se pot introduce tuburile în termostat, la 37 O C , apoi se repetă citirea.
Fermentarea inulinei – test biochimic facultativ, nefiind strict specific
pentru pneumococ.
Aglutinarea cu seruri antipneumococice şi cu seruri specifice de tip este o
metodă rapidă de identificare a antigenelor capsulare. Se efectuează prin metoda
latex-aglutinării.
Reacţia de umflare a capsulei – se realizează pe lamă, prin punerea în contact
a1-2 colonii bacteriene cu ser antipneumococic.
Antibiograma este necesară. Deşi pneumococii sunt sensibili la Penicilină,
alte beta lactamice, macrolide, etc, există un procent de aproximativ 10% tulpini
intermediar sensibile şi rezistente la aceste antibiotice.
Fig. IX.5. Colonii de Streptococcus pneumoniae pe geloza sange (după K.Tomae)

Fig. IX.6. Testul la optochin (după K.Tomae)

 Capitolul X

DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE NEISSERII

Cocii Gram-negativi cuprind genurile: Neisseria, Branhamella, Moraxella,

Kingella şi Eikenella

Genul Neisseria
Genul cuprinde Coci Gram-negativi cu formă reniforma (de boabe de fasole),
grupati în diplo ( perechi) cu părţile concave faţă în faţă, sunt imobili, nesporulaţi,
ce pot prezenta capsulă. Posedă enzima citocrom-oxidază. Sunt aerobi, dar in vitro
cresc mai bine în atmosferă îmbogăţită cu CO2.

- două specii patogene: N. meningitidis şi N. gonorrhoeae

- specii saprofite: N. sica, N. flava, N. lactamica.

Neisseria meningitidis ( meningococul)

Neisseria meningitidis colonizează iniţial nazofaringele, determinând o

rinofaringită uşoară sau o stare de portaj ( asimptomatică). De la acest nivel
bacteriile pot trece în circulaţia generală: bacteriemie, meningococemie tranzitorie
cu febră, stare generală modificată, ce se poate fie rezolva sponatan în 1-2 zile, fie
se poate complica cu o meningită acută. Debutul meningitei meningococice poate fi
brusc su insidios. În meningita acută manifestările clinice sunt febra, starea
generală alterată, semnele de hipertensiune intracraniană: cefalee, vărsături, semne
de iritaţie meningeală: fotofobie, redoarea cefei. Meningele suferă un proces
inflamator acut, insoţit de un exsudat bogat în leucocite PMN.
Septicemia evoluează cu febră înaltă, şoc, purpură, coagulare intravasculară
diseminată ( CID). Forma fulminantă: sindromul Waterhouse-Friderichsen apare la
5 - 15 % din cazuri şi are o rată înaltă a mortalităţii.

Diagnosticul de laborator
Produsele patologice ce trebuiesc recoltate în suspiciunea unei infecţii
meningococice sunt: secreţie nazo-faringiană, L.C.R., hemocultură. Recoltarea se
va face înaintea administrării de antibiotice
Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram efectuate din L.C.R. pot
evidenţia prezenţa de leucocite polinucleare şi a cocilor Gram negativi cu formă
reniformă, grupati în perechi cu părţile concave faţă în faţă, încapsulaţi, cu
localizare predominent extraleucocitară. LCR prezintă o reacţie inflamatorie:
leucocite 100-1000 / μl, proteinorahie, hipoglucorahie (glucoza mai mică de 60%
din valoarea simultană a glicemiei).
 Cultura se va face pe medii nutritive, Neisseriile fiind bacterii pretenţioase:
geloză-sânge şi geloză chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin. Exudatele
nazo-faringiene se însămânţează pe mediile selective Muller-Hinton +supliment
HYL sau Thayer-Martin cu Vancomicină, Colistin, Trimetroprim sau Nistatin.
Incubarea se face la 37O C, în atmosferă cu 5-10% CO2. Citirea se va face la 24 şi
48h.
Coloniile sunt mici – 0.5-1mm, de tip S sau M, transparente sau opace, albe-gri.
Coloniile suspecte se verifică prin testul oxidazei ( pozitiv) şi frotiu colorat
Gram ( coci Gram-negativi). Testul catalazei este de asemenea pozitiv.
Identificarea biochimică este necesară pentru precizarea speciei şi se bazează
pe fermentarea zaharurilor glucoză, maltoză, lactoză şi zaharoză sau fructoză cu
producerea de acid. Pentru N. meningitidis reacţiile sunt: glucoză, maltoză
pozitive, lactoză şi zaharoză sau fructoză negative.
Grupul serologic poate fi identificat prin reacţii de latex- aglutinare pe lamă cu
seruri anticapsulare polivalente, apoi monovalente.
Alte metode de diagnostic imunologic sunt: imunofluorescenţa indirectă ( cu
anticorpi monoclonali), coaglutinare din produsul patologic ( anticorpi anti-
membrană externă).
Diagnosticul prin metode de biologie moleculară : PCR ( polimerase chain
reaction) sunt relativ rapide şi foarte specifice dar au un cost ridicat, nefiind
accesibile deocamdată pentru diagnosticul de rutină . PCR poate identifica prezenţa
unui număr foarte mic de bacterii în LCR
Antibiograma este obligatorie, datorită apariţiei de tulpini rezistente în speial la
beta-lactamice. Antibiograma se efectuează pe mediul Muller-Hinton sau Muller-
Hinton îmbogăţit cu sânge.

Neisseria gonorrhoeae ( gonococul)

Gonococii sunt patogeni specifici omului. Se transmit pe cale sexuală. Nou
născuţii din mame infectate se pot contamina in timpul naşterii. Infecţiile transmise
pe cale sexuală afectează mucoasa uretrală sau rectală la bărbaţi, mucoasa
endocervicală, glandele Skene şi Bartholin la femei. Infecţia diseminată poate
afecta diferite ţesuturi.

Diagnosticul de laborator

Produsele patologice recoltate în suspiciunea de gonoree sunt secreţia

uretrală şi/sau rectală la bărbaţi; secreţia cervicală, a glandelor Bartholin şi Skene
la femei.
 În suspiciunea de artrită septică se recoltează lichid sinovial. În oftalmia nou-
născutului se recoltează secreţie conjunctivală. Acestea trebuiesc recoltate înainte
de instituirea tratamentului cu antibiotice.

În suspiciunea de infecţie sistemică se recoltează hemocultură

Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram din secreţii evidenţiază ( în

peste 90% din cazuri în uretrite şi aproximativ 50% din cazuri în cervicite) prezenţa
de numeroase leucocite polinucleare şi a cocilor Gram negativi cu formă reniformă,
grupati în diplo cu părţile concave faţă în faţă, neîncapsulaţi, cu localizare
predominent intraleucocitară. Prezenţa acestui aspect este sufucientă pentru
diagnosticul prezumptiv de infecţie gonococică.

Cultura şi identificarea este necesară pentru confirmarea diagnosticului şi

precizarea speciei, având în vedere că şi alte specii nepatogene de Neisseria pot
ocazional habita mucoasele genitale.
Cultura se va face pe medii nutritive, Neisseriile fiind bacterii pretenţioase:
geloză-sânge şi geloză chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin. Incubarea se
face la 37O C, în atmosferă cu 5-10% CO2. Citirea se va face la 24 şi 48h. Coloniile
sunt mici – 0.5-1mm, de tip S sau M, transparente sau opace, albe-gri. Coloniile
suspecte se verifică prin testul oxidazei ( pozitiv) şi frotiu colorat Gram ( coci
Gram-negativi). Testul catalazei este de asemenea pozitiv.
Identificarea biochimică este necesară pentru precizarea speciei şi se bazează
pe fermentarea zaharurilor glucoză, maltoză, lactoză şi zaharoză sau fructoză cu
producerea de acid. Pentru N. meningitidis reacţiile sunt: glucoză pozitiv, maltoză
lactoză şi zaharoză sau fructoză negative.

Diagnosticul imunologic poate fi făcut prin:

-imunofluorescenţă directă, cu anticorpi monoclonali cuplaţi cu fluorocromi
- ELISA pentru antigene ale N. gonorrhoeae
- biologie moleculară: PCR sau LCR ( Ligase chain reaction) pentru detecţia
DNA propriu N. gonorrhoeae.

Antibiograma este indicată datorită apariţiei tulpinilor rezistente la Penicilină.

Trusa de antibiotice care va fi folosită va cuprinde: Penicilină, Amoxicilină,
Amoxicilină+ac. Clavulanic, Ceftriaxon, Cefixim, Doxiciclină, Spectinpmicin,
Gentamicin, Clindamicin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Pefloxacin.
Fig.X.1. Neisseria gonorrheae în Fig. X.2. Cultură de N. gonorrheae
secreţie uretrală pe geloză-chocolat

Fig. X.3. Fermentarea zaharurilor la N. gonorrhoeae

Fig. X.4. Antibiograma pentru o tulpină de Neisseria gonorrhoeae

 Capitolul XI
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACILI GRAM-
POZITIVI

Genul Corynebacterium. CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE

Genul Corynebacterium cuprinde bacili Gram pozitivi nesporulaţi, imobili,
drepţi sau uşor încurbaţi, cu extremităţile îngroşate, în formă de măciucă, coloraţi
neuniform. Pot prezenta incluziuni de polimetafosfat (granulaţiie metacromatice
Babeş-Ernst) care se colorează în roşu cu albastru de metilen. Au o grupare
caracteristică în formă de litere chinezeşti sau palisade. ( Fig.1.)

Principala specie patogenă pentru om este C.diphteriae ( bacilul difteric).

Există şi specii saprofite, numite corineformi sau difteromorfi.
Caractere de cultură: C. Diphteriae este o bacterie pretenţioasă. Creşte şi
pe geloza-sânge, dar creşte mai bine pe medii speciale: mediul selectiv Tinsdale cu
telurit de potasiu cu ser, mediul electiv Loffler , mediul de îmbogăţire OCST ( cu
ou, cistină, ser, telurit) sau OST ( cu ou, ser, telurit)
Majoritatea speciilor cresc la 37 o C, în aerobioză sau în atmosferă cu 5%
CO2. După aspectul coloniilor pe geloza sânge cu cistină şi telurit se disting 3
variante: var. gravis, var. mitis, var. intermedius, numite astfel deoarece s-a
considerat că determină forme grave, uşoare , respectiv medii de boală.
Grupul Corynebacterium diphteriae cuprinde 3 specii toxigene:
C.diphteriae ( cu biotipurile gravis, mitis, intermedius şi belfanti), C.ulcerans şi
C.pseudotuberculosis.
C.diphteriae poate fi izolat atât de la bolnavii de difterie cât şi de la purtătorii
sănătoşi. Difteria este deteminată de formele toxigene ale bacteriei şi se manifestă
în principal prin faringită, amigdalită cu false membrane, adenopatie
laterocervicală, semne de toxicitate sistemică. Tulpini netoxigene de C.diphteriae
pot determina manifestări clinice locale uşoare: faringită, amigdalită, dar şi
endocardită.
C.ulcerans produce infecţii cutanate şi ale ţesuturilor moi şi poate fi izolat de
la bolnavi din leziuni , dar şi la purtători sănătoşi din nazofaringe.
C.pseudotuberculosis are habitatul natural animalele ( oi, cai) şi ocazional
produce infecţii cutanate, ale ţesuturilor moi şi limfadenită necrozantă la om.
Recoltarea produselor patologice depinde de natura infecţiei:
- în suspiciunea de difterie se recoltează trei tampoane cu secreţii
faringiene, cel mai corect din zonele profunde, după detaşarea cu grijă a falselor
membrane şi un tampon nazal.
- În cercetarea portajului două tampoane faringiene şi un tampon nazal.
- În infecţiile cutanate sau cu altă localizare se recoltează de la nivelul
leziunilor respective şi obligatoriu un tampon nazal şi unul faringian.
Din tampoanele faringiene se efectuează:
 - frotiuri – minim 2, colorate Gram şi albastru de metilen
- însămânţare pe geloză-sânge
- însămânţare pe medii medii solide speciale: mediul Tinsdale
- însămânţare în mediul se îmbogaţire lichid OST sau OCST
Tamponul nazal se introduce în mediul se îmbogaţire lichid OST sau OCST
Examenul microscopic este foarte important, mai ales în context clinic şi
epidemiologic.
Pe frotiul colorat Gram se pot observa leucocite sugestive pentru inflamaţie
şi bacili Gram pozitivi nesporulaţi, imobili, drepţi sau uşor încurbaţi, cu
extremităţile îngroşate, în formă de măciucă, coloraţi neuniform, grupaţi în formă
de litere chinezeşti sau palisade. ( fig.2)

Pe frotiul colorat A.M. se pot observa corpusculii metacromatici coloraţi în

roşu.
Culturile se citesc după 37 şi 48h şi pot prezenta următoarele aspecte:
Pe mediul Tinsdale modificat
- colonii opace de culoare neagră, datorită producerii de H2S, de 1-2
mm, de tip R, cu margini crenelate şi striaţii radiare dând aspectul de floare de
margaretă ( var gravis) ( fig.3.)

- Colonii opace de culoare cenuşie sau neagră, de mărimi diferite, cu

margini regulate şi suprafaţa lucioasă sau granulară, mamelonată ( var
intermedius).
- Colonii transparente de tip S, cenuşii sau negre, de 1-2 mm, cremoase,
care prin învechire devin rugoase ( var mitis, belfanti)
În toate variantele coloniile sunt înconjurate de un halou cafeniu, bine
delimitat.
Corineformii sunt inhibaţi sau dacă totuşi cresc determină colonii lipsite de
haloul specific.
Cultura este cerificată prin frotiuri colorate A.M. şi Gram.
Din coloniile suspecte şi din cultura în OCST se fac teceri pe mediul
Loeffler. Pe mediul Loeffler C.diphteriae creşte sub forma unor colonii albe
semicremoase, granulare.
Identificarea biochimică şi enzimatică a speciei şi precizarea biotipurilor
se bazează pe : testul catalazei , pirazinamidazei, cistinazei, ureazei, reducerea
nitraţilor şi fermentarea unor zaharuri. Acestea pot fi realizate prin metode clasice
sau pe kituri comerciale cum ar fi galeriile miniaturizate API CORYNE ( Bio-
Merieux).
 Fig.XI.1. C. diphteriae – prezenţa granulaţiilor şi gruparea în formă de litere
chinezeşti ( după www.geocites.com – Atlas of Bacterial pathogens)

Fig.XI.2. C.diphteriae – coloraţie Gram (www.geocites.com – Atlas of Bacterial

pathogens)

Fig.XI. 3. Aspectul coloniilor de C.diphteriae var gravis (www.

Anne.decoster.free.fr)

-
 Testarea toxigenezei poate fi făcută in vitro prin testul de imunodifuzie
Elek, sau in vivo prin testul de patogenitate pe cobai.
Testul Elek are ca principiu reacţia de precipitare între toxina produsă de
tulpinile de Corynebacterium însămânţate şi antitoxina din serul antidifteric, depusă
în şanţuri ştanţate în mediu sau sub forma unor benzi de hârtie îmbibate în ser
aplicate perpendicular pe striurile de însămânţare. Apariţia după 24-48h a unor linii
de precipitare în unghiul dintre acestea este reacţia pozitivă şi confirmă producerea
de toxină de către tulpinile respective. ( Fig.4)

Fig.XI.4. Testul Eleck (www. Anne.decoster.free.fr)

Prin tehnici de biologie moleculară poate fi evidenţiată gena tox+ .

Antibiograma. Deşi C.diphteriae este sensibil la penicilină şi Eritromicină,
considerate antibiotice de elecţie, antibiograma este totuţi indicată, folosind aceste
antibiotice, alături de alte beta-lactamice, trimetoprim, rifampicină, lincomicină,
clindamicină.

GENUL BACILLUS. Bacillus anthracis

Genul Bacillus, cu peste 40 specii cunoscute, cuprinde bacili Gram –pozitivi

mari, de 1 µm – 3-8 µm, cu extremităţile drepte, grupaţi în lanţuri, imobili,
sporulaţi.
Cei mai mulţi sunt saprofiţi, putând fi întâlniţi în aer, sol, de ex. Bacillus cereus şi
Bacillus subtilis. Ocazional în urma contaminării cu sporiaceste specii pot
determina infecţii de plagă, infecţii ale arsurilor, oftalmii, bacterieme, septicemie,
toxiinfecţii alimentare.
Bacillus anthracis este principala specie patogenă şi produce antraxul, o
antropozoonoză. În funcţie de poarta de intrare, se cunosc 3 forme clinice: antraxul
cutanat, antraxul pulmonar, antraxul digestiv. Toate cele 3 forme clinice se pot
complica cu septicemie şi meningită, cu evoluţie letală.
Diagnosticul antraxului.
Produsele patologice sunt: secreţie sau puroi, spută, sânge, LCR, materii
fecale. Bacillus antracis este o bacterie ce rezistă bine în produsul patologic
recoltat, cu sau fără mediu de conservare şi transport.
Examenul microscopic al unui frotiu din produsul patologic evidenţiază
bacili Gram -pozitivi, cu morfologie caracteristică ( fig.XI.5.)

Fig. XI.5.: Bacillus anthracis ( după K.Todar)

Cultura produselor patologice nomal sterile ( sânge, LCR, ţesuturi) se face

pe geloză nutritivă sau geloză-sânge, 24h la 37 O C în aerobioză, bacteriile nefiind
pretenţioase.
Produsele patologice cu floră de asociaţie abundentă necesită însămânţare pe medii
selective cum este geloza PLET ( polimixină, lizozim, EDTA, taliu acetat) sau
distrugerea bacteriilor vegetative asociate prin diferite metode: tratarea termică,
tratarea cu alcool, astfel încât în probă să rămână doare formele sporulate .
Pe mediul geloză-sânge dezvoltă colonii mari de tip R, alb-cenuşii, nehemolititce,
cu aspect de cap de meduză. Se deosebesc de coloniile de B.cereus prin aceea că
acestea produc în jurul lor o zonă mare de hemoliză completă.
Pe geloză – ser dezvoltă capsulă.

Identificarea biochimică şi enzimatică şi pe baza unor caractere specifice:

- mobilitate - absentă
- capsula - +
- gelatina - digestie lentă
- lapte turnesolat - coagulare lentă
- hemoliza - absentă
- lecitinaza - + /-

Reacţia Ascoli este utilizată pentru diagnostic la cadavre. Aceasta presupune:

- extragerea dintr-un fragment de ţesut a antigenelor termostabile ( 5 min la
100o C, urmată de filtrare)
- filtratul – utilizat pentru o reacţie de precipitare în tub cu ser anti-cărbunos
 Capitolul XII
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS

Genul Mycobacterium include bacili aerobi , cu dimensiuni de 2-5 µm /

0.3µm, drepţi sau uşor încurbaţi, imobili, nesporulaţi, neîncapsulaţi. Ei sunt numiţi
bacili acid-alcoolo rezistenţi ( BAAR), datorită proprietăţilor tinctoriale specifice.
Mycobacteriile nu se colorează în coloraţiile uzuale şi nici nu se decolorează, la
temperatura camerei. Această proprietate se datorează prezenţei cerurilor în
structura peretelui celular.
M. tuberculosis este strict aerob. M. Bovis şi africanum pot fi microaerofili.
Există două specii obligat patogene pentru om:
- M.tuberculosis, care determină tuberculoza
- M. Leprae, care preoduce lepra.
Tuberculoza la om mai poate fi produsă şi de alte specii, ca M. Bovis şi M.
Africanum.
M. ulcerans poate determina infecţie cutanată.
Alte specii, numite micobacterii atipice, sunt saprofite, condiţionat patogene,
putând determina infecţii în special la bolnavii imunodeprimaţi: M. Kansanii, M.
Avium. M. intracelularae, M fortuitum, M. Chelonei.
Tuberculoza poate afecta orice organ, dar cea mai frecventă este
tuberculoza pulmonară. Tuberculoza pulmonară primară afectează în special
subiecţi tineri: copii sau adulţi tineri. Tuberculoza secundară este caracteristică
adulţilor. Alte forme de tuberculoză -tuberculoza extrapulmonară- sunt: tuberculoza
ganglionară, tuberculoza osoasă, tuberculoza uro-genitală, tuberculoza digestivă,
tuberculoza S.N.C., tuberculoza cutanată, tuberculoza asociată H.I.V., produsă
adesea de mycobacterii atipice.
Recoltarea produselor patologice se va face în funcţie de localizarea
infecţiei: spută, lichid de aspiraţie sau lavaj bronşic, lichid pleural, probe obţinute
prin biopsie, urină, lichid de spălătură gastrică, LCR, lichid pericardic, lichid
peritoneal. În tuberculoza miliară se recomandă şi hemocultura.
În suspiciunea de tuberculoză pulmonară se recomandă recoltarea a trei
probe de spută succesive, obţinute dimineaţa.
Recoltarea se va face în recipiente sterile cu capac, evitându-se contaminarea
mediului, şi urmărind protecţia personalului medical implicat.
De asemenea, laboratoarele în care se desfăşoară diagnosticul microbiologic
al tuberculozei acesta se va desfăşura în spaţii separate, cu dotare adecvată.
Prelucrarea produselor patologice în vederea izolării mycobacteriilor
presupune anumite reguli generale:
- eliminarea sau reducerea numerică a celorlalte microganisme în produsele cu
floră de asociaţie, prin decontaminarea acestora;
 - eliberarea mycobacteriilor aflate intracelular sau cuprinse în mase de mucus
este necesară în special pentru spută ( fluidificarea sputei);
- concentrarea produselor paucibacilare, în vederea examinării microscopice.
Decontaminarea se realizează cu soluţii de NaOH sau clorură de benzalconiu.
Mucoliza se realizează cu N-acetil-L-cisteină. (NALC)
O metodă ce utilizată este decontaminare-fluidificare cu soluţie NaOH 4%
50ml+ citrat de sodiu 0.1M 50 ml + 0.5 g NALC pulbere. Soluţia se păstrează la
rece. În momentul folosirii se amestecă în părţi egale cu produsul patologic, se
centrifughează 15 minute la 2200 g, se aruncă supernatantul şi din sediment se
fac frotiuri. (Lenette)
Examenul microscopic al frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen din produsele
patologice se efectuează cu obiectivul 90X sau 100X cu imersie. Se urmăreşte
prezenţa celulelor epiteliale şi a macrofagelor de la nivelul tractului respirator, a
leucocitelor, semnificând reacţia inflamatorie şi a bacililor acid-alcoolo
rezistenţi ( BAAR). În cazul în care există semne certe de inflamaţie se
examinzează în zig-zag întreaga suprafaţă a frotiului, cel puţin 100 cîmpuri
microscopice.

Fig. XII.1. M. Tuberculosis în spută (www.CDC.gov)

Mycobacteriile apar ca bacili cu dimensiuni de 2-5 µm / 0.3µm, drepţi sau uşor

încurbaţi, imobili, nesporulaţi, neîncapsulaţi, coloraţi în roşu în coloraţia Ziehl-
Neelsen. ( fig. XIII.1.) La tulpinile foarte virulente, bacilii prezintă aranjamente în
lanţuri paralele sau corzi, datorită prezenţei chord –factorului.
O altă metodă de colorare este cea cu fluorocromi: auramină, rhodamină.

Cultivarea
Cultivarea produselor patologice în scopul izolării mycobacteriilor se face pe
medii speciale, mediul de elecţie fiind Lowenstein-Jensen, cu amidon, glicerină,
ou, verde malahit şi eventual antibiotice: Penicilină, acid nalidixic ( mediu
selectiv). Mediul Lowenstein-Jensen se toarnă în tuburi în pantă, iar după
însămânţare tuburile se parafinează pentru a împiedica deshidratarea pe perioada
incubării. Pot fi folosite şi medii de îmbogăţire
Incubarea se face în aerobioză, la 370 C. Atmosfera cu 5-10% CO2 în prima
săptămână favorizează creşterea mycobacteriilor, în special la prima izolare.
Examinarea culturilor se face zilnic timp de o săptămână, apoi săptămânal timp
de 12 săptămâni. Mycobacteriile patogene sunt bacterii cu creştere lentă, între 2-8
săptămâni, timpul lor de generaţie fiind de 20-24h. cu.
Aspectul culturii: Pe mediul Lowenstein, mycobacteriile prezintă două tipuri de
creştere:
- creştere eugonică ( M. Tuberculosis, M. africanum), sub forma unor colonii
mari, de tip R conopidiforme, de culoare alb-gălbuie, colonii ce se dezvoltă
în 2-6- săptămâni, în medie după 3 săptămâni.
- Creştere disgonică, ( M. Bovis), colonii mici, de tip S, alb-gălbui, care apar
după 4-8 săptămâni.
Mycobacteriile saprofite au creştere rapidă , după 3-7 zile formează colonii mici,
de tip S, rareori de tip R sau cu aspect intermediar.
Identificarea biochimică
Pe lângă durata de creştere ( rapidă sau lentă ) şi producerea de pigmenţi,
identificarea de specie se face în mod clasic pe baza unor teste biochimice. Cele
mai utilizate sunt: testul catalazei la 680 C, testul producerii de niacină, reducerea
nitratului, hidroliza Tween 80, hidroliza T2H ( acidul thiofen-2-carboxilic),
susceptibilitatea la PAS ( acidul p-amino-salicilic) şi toleranţa la NaCl 5%.
Alte metode de identificare: studiul cromatografic al acizilor graşi din
peretele celular sau identificare genomică prin metoda PCR.
Antibiograma
Antibiograma pentru M. Tuberculosis se deosebeşte de cea efectuată pentru
bacteriile cu creştere rapidă.
Antibiogramele pe mediu solid, indiferent de metodă, presupun compararea
dezvoltării bacililor inoculaţi pe un mediu martor fără antibiotice cu cea pe medii
cu antibiotice incluse. Antibiograma directă se realizează prin însămânţarea unui
inocul omogenizat şi decontaminat din produsul patologic bogat în bacili.
Rezultatele se obţin mai rapid,în 4 săptămîni şi populaţia de bacili testată este
reprezentativă pentru situaţia in vivo. Antibiograma indirectă presupune testarea
unui inocul standardizat din cultura obţinută în prealabil. Rezultatele se obţin mai
tărziu, după 10 săptămâni, dar este mai eficientă pentru produsele sărace în bacili,
iar standardizarea este mai bună. Există mai multe metode: metoda concentraţiilor
absolute, metoda proporţiilor, metoda raportului rezistenţelor
Antibiograma pe mediu lichid ( Middlebrook) a reprezentat un mare progres,
permiţând automatizarea şi detecţia precoce prin metoda radiometrică, a creşterii
mycobacteriilor în mediile lichide, fără şi cu adaus de antibiotice.
 Antibiograma se efectuează în special pentru antituberculoasele majore,
urmărindu-se C.M.I. ( de exemplu HIN- 0.2 mg/l, RMP 2 mg/l, EMB 2,5 mg/l,
PZA 100 mg/l, SM 2 mg/l).
Prin metode de genotipare se poate identifica rezistenţa la Rifampicină,
considerată ca marker al rezistenţei multiple la antibiotice.
Diagnosticul serologic
Determinarea anticorpilor de tip Ig G şi Ig A anti-M. Tuberculosis poate fi
efectuată prin metoda ELISA, dar sensibilitatea şi specificitatea acestor teste nu
este unanim acceptată ca fiind suficient de mare pentru confirmarea diagnosticului.
Intradermoreacţia la tuberculoproteine ( IDR la PPD) este un test de
hipersensibilitate cutanată, de tip IV ( întârziat). Acest test se efectuează numai la
categorii de persoane expuse la risc crescut şi înainte de efectuarea revaccinării
BCG.
Testarea se efectuează cu 0,1 ml PPD conţinând 2 UI, injectat intradermic în
treimea mediană a feţei anterioare a antebraţului. Citirea reacţiei se face după 72h.
Se măsoară zona de eritem, se apreciază prezenţa induraţiei şi eventual a
veziculelor.
Anergicii ( IDR ≤ 9mm) se consideră neinfectaţi. Alergicii ( ≥ 10 mm în
absenţa cicatricei vaccinale şi ≥ 15 mm în prezenţa cicatricei vaccinale ) sunt
controlaţi radiologic.
IDR la PPD este un test de depistare, dar confirmarea infecţiei tuberculoase
se face prin metoda combinată a examenului radiologic şi examenului bacteriologic
(microscopie, cultură,) sau/şi PCR.
 Capitolul XIII
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACILII GRAM
NEGATIVI

Familia Enterobacteriaceae
Familia Enterobacteriaceae este formată din peste 200 specii de bacili
Gram – negativi, cu habitat natural tractul intestinal al omului şi animalelor. Au
dimensiuni variabile, dar cuprinse între 10 – 16 µm lungime şi 0.3 µm diametru,
aerobi facultativ anaerobi; unii mobili datorită unor cili peritrichi, alţii imobili;
majoritatea neîncapsulaţi, iar unii încapsulaţi; nesporulaţi.

Fig. XIII.1. Aspect de microscopie electronică a E.coli ( K.Todar)

Caracterele biochimice cele mai importante sunt: fermentarea glucozei şi

absenţa citocrom-oxidazei ( oxidază-negativi).

Examenul microscopic
Cultura. Enterobacteriaceele se dezvoltă cu uşurinţă pe medii de cultură
simple sau complexe, solide sau lichide. În funcţie de produsul patologic (urină,
diverse exudate, secreţii de plagă), dacă se suspectează prezenţa acestora, cultivarea
se face de la început pe 2-3 medii, dintre care 1 mediu uzual şi 1-2 medii selective
şi diferenţiale pentru enterobacterii. Dacă este o coprocultură, aceasta se va efectua
numai pe medii diferenţiale şi selective.
În bulion Enterobacteriaceele se dezvoltă tulburând uniform mediul, unele
specii putând forma sediment sau văl.
Pe mediul geloză-sânge enterobacteriile formează colonii mari, bine vizibile,
1-3 mm diametru, semitransparente, în general de tip S. Unele tulpini pot produce
hemoliză.
Klebsiella şi uneori E.coli, mai rar alte specii dezvoltă colonii mari, mucoase
– tip M, bombate, lucioase, cu tendinţa la confluare.
Genul Proteus datorită mobilităţii deosebite, are capacitatea de a migra pe
suprafaţa mediilor solide şi deşi dezvoltă colonii, produce fenomenul de migrare cu
aspect de valuri pe suprafaţa mediului, urmat de invazia completă a suprafeţei
plăcii.
Mediile selective şi diferenţiale. Există numeroase astfel de medii, care în
general conţin substanţe inhibante ce împiedică dezvoltarea bacteriilor Gram-
pozitive şi a ciupercilor şi inhibă migrarea bacteriilor din genul Proteus. De
asemenea conţin un sistem diferenţial format din lactoză şi un indicator de culoare
ce virează în urma modificării pH-ului.
Cele mai utilizate sunt:
- dintre mediile slab selective şi diferenţiale:
o Mediul AABTL ( agar-albastru de brom timol lactoză ) sau
o Mediul Mc Conkey ( săruri biliare, cristal violet, roşu neutru, lactoză)
- dintre mediile cu selectivitate medie şi diferenţiale:
o Mediul ADCL ( agar, deoxicolat de Na, citrat, lactoză)
o Mediul Salmonella-Shigella ( săruri biliare+ verde briliant, lactoză,
roşu neutru)
- dintre mediile puternic selective:
o mediul Wilson-Blair, cu verde briliant.

Identificarea biochimică a tulpinilor izolate se bazează pe identificarea

anumitor caractere metabolice. În acest scop sunt folosite medii de identificare
semisolide, sau galerii de identificare cu 12-20 reacţii biochimice în mediu lichid
( de exemplu galeriile API ) Vezi fig.

Fig. Galeria API 20E (Bio-Merieux)

Cele mai importante reacţii biochimice sunt

- Fermentarea glucozei, lactozei şi zaharozei (mediul TSI – triple sugar Iron)
- producerea de H2S ( TSI)
- capacitatea de a utiliza citratul ca unică sursă de carbon ( mediul Simmons
cu citrat),
- producţia de indol ( mediu MIU – mobilitate, indol uree)
- descompunerea ureei ( MIU)
- producerea de lizin-decarboxilază ( mediu cu lizină, MILF)
la acestea se adaugă şi prezenţa sau absenţa mobilităţii.
Identificarea serologică permite precizarea prezenţei antigenelor somatice
O, a celor de înveliş K, V-W şi a antigenelor flagelare H la enterobacteriile
flagelate. Pe baza lor se poate stabili cu precizie specia şi tipul tulpinii identificate.
Antibiograma este obligatorie în toate cazurile în care se izolează o tulpină
bacteriană din familia Enterobacteriaceae. Acestea au o sensibilitate variabilă la
antibiotice şi multiple mecanisme de instalare a rezistenţei secundare.

GENUL ESCHERICHIA: E.coli

Cultura:
Pe mediul geloză-sânge formează colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm
diametru, semitransparente, în general de tip S, uneori de tip M. Unele tulpini pot
produce hemoliză.
Pe mediul AABTL: colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm diametru, semitransparente,
în general de tip S, uneori de tip M, lactozo-fermentative (L+): de culoare galbenă
şi producând virajul culorii mediului de la verde la galben.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, uneori M,
lactozo-fermentative (L+): de culoare roşie şi producând virajul culorii mediului de
la oranj deschis la roşu.

Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultură:

bacili Gram negativi.

Identificarea biochimică:
Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză + - + - + - -
Zaharoză v

Alte teste
Identificarea antigenelor somatice pentru tulpinile enteropatogene ( EPEC)
prin reacţii de aglutinare sau de latex-aglutinare .
Identificarea toxinelor prin teste ELISA, latex aglutinare sau
seroneutralizare.
Identificarea serologică a tulpinilor enteroinvazive ( EIEC)
Testarea cacterelor de patogenitate ale ECEH : producerea de enterocolită
hemoragică la purcel. Efect citopatic în culturi celulare ( celule Vero).
Teste de biologie moleculară: PCR pentru detectarea genelor de patogenitate.

GENUL KLEBSELLA
Cultura:
Pe mediul geloză-sânge formează colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm
diametru, semitransparente, de tip M .
Pe mediul AABTL: colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm diametru, semitransparente,
de tip M, lactozo-fermentative (L+): de culoare galbenă şi producând virajul culorii
mediului de la verde la galben.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip M, lactozo-
fermentative (L+): de culoare roşie şi producând virajul culorii mediului de la oranj
deschis la roşu.
Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultură:
bacili Gram negativi.

Identificarea biochimică pntru K. pneumoniae:

Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză + + - - + + +
Zaharoză v

Alte teste
Identificarea antigenelor capsulare prin reacţii serologice de aglutinare.
Lizotiparea –testarea sensibilitţii tulpinilor de Klebsiella izolate la un set de
fagi litici, în special în scopuri epidemiologice .

GENUL PROTEUS
Cultura:
Pe mediul geloză-sânge formează colonii de talie medie (1-2 mm diametru),
de tip S, greu vizibile datorită fenomenului de migrare în valuri şi de invazie a
plăcii.
Pe mediul AABTL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozo-
nonfermentative (L-): incolore sau de culoare verzuie. Culoarea mediului rămâne
nemodificată. Uneori se observă fenomenul de migrare.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozo-
nonfermentative (L-): incolore sau de culoarea mediului. Culoarea mediului
rămâne nemodificată.
Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultură:
bacili Gram negativi.

Identificarea biochimică:
Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză v + v +++ + + +
Zaharoză v
GENUL SALMONELLA
Diagnosticul este bacteriologic şi serologic.
Diagnosticul bacteriologic. În febra tifoidă şi paratifoidă, în funcţie de stadiul
evolutiv al bolii se recoltează următoarele produse patologice:

BOLNAVI BOLNAVI BOLNAVI BOLNAVI CONVA PURTA

LES- TORI
CENTI CRONICI
SAPT. I SAPT. II SAPT. III SAPT. IV
HEMOCULTURA
+++ ++ + +/- - -
COPROCULTURA
+ ++ +++ + +/- +/_
UROCULTURA - -/+ + + +/- -
MEDULOCULTUR + + + +/- - -
A
BILICULTURA +/- +

Coprocultura la suspecţii de febră tifoidă se recoltează numai din scaunul

emis spontan, iar la purtători după administrarea de purgativ salin. Se foloseşte
coprorecoltor cu mediu de conservare şi transport Carry Blair.
Cultivarea se face pe medii selective şi diferenţiale şi într-un mediu de
îmbogăţire cu selenit de sodiu. Se va utiliza şi mediul selectiv Wilson Blair.
Pe mediul AABTL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozo-
nonfermentative (L-): incolore sau de culoare verzuie. Culoarea mediului rămâne
nemodificată..
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozo-
nonfermentative (L-): incolore sau de culoarea mediului, cu centrul negru ( H2S).
Culoarea mediului rămâne nemodificată.
Pe mediul Wilson-Blair colonii de culoare verde închis cu halou în jurul lor.

Identificarea biochimică:
Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză - + - + + +/- ++/-
Zaharoză -

Identificarea serologica a tulpinilor izolate se face prin aglutinare cu seruri

polivalente anti-O, apoi cu seruri monovalente anti-O, seruri anti-H si anti-Vi.
Se poate folosi lizotipia ca metodă de diferenţiere în cadrul serotipurilor.
GENUL SHIGELLA
Diagnosticul de laborator al disenteriei bacilare se bazează pe efectuarea
coproculturii. Aceasta se recoltează dun scunul emis spontan, de preferinţă din
zonele cu aspect modificat: cu mucus şi sânge. La bolnavii cronici şi purtători
recoltarea se face cu sonda Nelaton sterilă, prin aspirare din colonul sigmoid. Se
mai pot recolta probe direct de la nivelul leziunilor rectosigmoidiene cu ocazia
examinării endoscopice.
Se va folosi mediul de conservare şi transport Carry Blair.
Cultivarea se face pe medii selective şi diferenţiale (AABTL, ADCL).
Incubarea se va face 24h, unele tulpini necesitând 48h. Creşterea este sub forma
unor colonii de tip S lactozo-non-fermentative.
Identificare biochimică
Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză - - -/+ - - - -
Zaharoză v

Tulpinile confirmate biochimic ca aparţinând genului Shigella vor fi testate

prin reacţii de aglutinare cu seruri polivalente ( Flexner, Sonne, Large-Sachs ,
Boyd), apoi cu seruri monovalente.
Caracterele de patogenitate ( enteroinvazivitatea şi producerea toxinei
Shiga).

GENUL YERSINIA
În pestă produsele patologice ce se recolteză sunt: puroi din bubon, spută,
sânge pentru hemocultură.
Hemocultura se efectuează în mod obişnuit, cu treceri ulterioare pe geloză-
sînge, mediu favorabil creşterii Y. Pestis şi pe medii selective şi diferenţiale.
Identificare biochimică
Mediu TSI Uree Indol Mobilitate Lizină Citrat H2S
M. Simmons
Glucoză +
Lactoză - - - + - - -
Zaharoză -
Transformă nitraţii în nitriţi.
Identificarea de specie este confirmată prin aglutinare cu ser specific.

În infecţia cu Yersinia enterocolitica se efectuează coprocultura şi

hemocultura. Diagnosticul serologic pune în evidenţă în 90% din cazuri anticorpi
anti Y. Enterocolitica ce persistă în ser în titru ridicat 2-4 luni.
 Capitolul XIV:
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACTERII ANAEROBE

Bacteriile anaerobe sunt bacterii hipersensibile la acţiunea oxigenului.

Majoritatea anaerobilor nu posedă enzimele clasice citocromi, catalaze şi
perioxidaze, producându-se energia propie în cursul proceselor fermentative.
Sensibilitatea anaerobiilor la oxigen este varialbilă. O mare parte din
anaerobi tolerează 0,1-5%O2 –anaerobi moderaţi, alţii nu tolerează nici 0,1%O 2 –
bacterii extrem de sensibile la oxigen. Aceste bacterii extrem de sensibile la oxigen
sunt bacterii comensale ale tubului digestiv şi ale pielii.

Anaerobii se împart în 2 mari grupe:

- anaerobi sporulaţi
- anaerobi nesporulati

Bacili Gram negativi nesporulaţi

1. BACTEROIDES
2. PORPHYROMONAS
3. PREVOTELLA
4. FUSOBACTERIUM

Coci Gram pozitivi

1. PEPTOSTREPTOCOCCUS
2. PEPTOCOCCUS

Coci gram negativi

1. VEILLONELLA

Bacili gram pozitivi nesporulaţi

1. ACTINOMYCES
2. ARACHINIA
3. BIFIDOBACTERIUM
4. PROPIONIL BACTERIUM
5. EUBACTERIUM

Bacili gram pozitivi sporulaţi

1. CLOSTRIDIUM

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cu bacterii anaerobe nesporulate

Bacteriile anaerobe nesporulate includ coci şi bacili Gram pozitivi,

coci şi bacili Gram negativi, fiind prezente pe tegumente şi pe mucoasele tractului
respirator superior, bucală, vaginală şi digestivă făcând parte din microbiota
indigenă a acestor regiuni. În anumite condiţii de alterare a capacităţii
antiinfecţioase a gazdei, unele specii pot cauza infecţii, de obicei mixte ( în
asociaţie cu bacterii aerobe facultativ anaerobe sau cu alţi anaerobi).
Infecţiile de la nivelul plăgilor şi mucoaselor lezate pot evolua cu stare
bacteriemică şi septicemică. Cele mai frecvente specii întâlnite în septicemii aparţin
genurilor Bacteroides şi Fusobacterium. Propionibacterium şi Peptostreptococcus
pot cauza în anumite condiţii favorizante endocardite subacute.

Diagnosticul bacteriologic
Recoltarea şi transportul produselor patologice
Produsele patologice (puroi, spută, secreţie gingivală) recoltate din infecţii
mixte cu bacterii anaerobe au adesea nu aspect caracteristic: culoare gris murdar,
uneori şocolatie, cu miros fetid sau putrid.
După prelevare produsele trebuie transportate la laborator într-un interval de
timp cât mai scurt pentru a nu altera viabilitatea speciilor oxigen sensibile.
Produsele destinate izolării bacteriilor anaerobe vor fii introduse după recoltare în
containere anaerobe.
În cazul puroiului se poate folosi procedeul „seringă anaerobă” care asigură
supravieţuirea bacteriilor cel puţin 30 minute.

Examenul microscopic direct

În frotiurile colorate gram, cocii gram pozitivi au un aspect alungit,
asemănător coccobacililor fiind dispuşi în perechi, grupuri mici sau în lanţuri.
Dimensiunea lor variază de la 0,3-0,5μm la 0,7-1,2 μm. Cocci gram negativi apar
izolaţi, grupaţi câte doi având talie mică, de 0,3-0,58 μm. Bacilii gram negativi sunt
polimorfi iar cei gram pozitivi ramificaţi.
Izolarea se face în condiţii strict
Cultura
anaerobe. Înaintea însămânţării recipientele cu mediul lichid se fierb la baie
de apă 15-30 minute şi apoi se răcesc brusc la jet de apă. Însămânţarea se face cu
ansa în profunzimea mediului.
După însămânţare la suprafaţa mediului se depune un strat de parafină steril
pentru menţinerea condiţiilor de anaerobioză.
Anaerobioza mai poate fi realizată prin procedee chimice, adică introducerea
în mediul de cultură a unei substanţe chimice reducătoare ca acidul thioglicolic.
Produsele contaminate vor fi însămânţate pe agar sânge.
Incubarea se face în termostat la 37oC, în recipiente speciale. În anaerostate
oxigenul este îndepărtat prin combinare cu hidrogenul, formînd H 2O în prezenţa
unui catalizator de platină. În absenţa anaerostatului se poate utiliza metoda cu
pirogalolul alcalin. Pe faţa exterioară a capacului cutiei Petri se fixează cu banda
adezivă un pacheţel din hârtie de filtru ce conţine substanţe reducătoare. Se ia
cealaltă parte a cutiei Petri şi se răstoarnă deasupra capacului. Se fixează zona de
contact a celor 2 părţi a cutiei Petri cu parafină solidă topită creându-se astfel în
interior un spaţiu închis ermetic. Coloniile cresc lent în 3-5 zile şi sunt mici, de tip
S translucide sau opace, înconjurate uneori de o zonă de hemoliză.

Identificarea speciilor se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, de cultură,

biochimice.

Sensibilitatea la antibiotice
Bacteriile anaerobe nesporulate sunt în general sensibile la beta-lactamine,
cloramfenicol, clindamicină, tetracicline şi metronidazol. Sensibilitatea la
antibiotice a florei anaerobe nesporulate poate varia însă de la o tulpină la alta chiar
în cadrul aceleiaşi specii, de aceia antibiograma este necesară în toate cazurile
clinice severe.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cu bacterii anaerobe sporulate

CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Morfologie: bacili Gram pozitivi, lungi, cu capete rotunjite, sporulaţi,
mobili. Sporul este oval, terminal sau subterminal, deformant.
Patogenitate : Sporii contaminează alimentele: legume, carne. În alimentele
conservate sau în mezeluri are loc germinarea ( anaerobioză, păstrare la
temperatura camerei) şi producerea de toxină – toxina botulinică – o neurotoxină.
Are 8 serotipur, serotipurile A, B, E, F provoacă botulismul la om. Toxina este
termolabilă şi poate fi distrusă prin fierbere 20 minute.

CLOSTRIDIUM TETANII
Morfologie: bacili Gram pozitivi, lungi şi groşi 8 0.8-1.2 µm / 3-9µm cu
capete rotunjite, sporulaţi, mobili . Sporul este subterminal, deformant.

Produce diferite enzime proteolitice: peptidaze, gelatinază. Nu fermentează

glucidele. Produce hemolizină.
Patogenitatea bacilului este determinată de toxina sa. Toxina tetanică este o
exotoxină, cu două componente. Tetanolizina – hemolizină, şi tetanospasmina –
care, fixată la nivelul receptorilor gangliozidici de la nivelul neuronilor SNC,
blochează eliberarea inhibitorilor mediatorilor chimici, cu contractură musculară.
Diagnosticul de laborator constă în însămânţarea produsului patologic ( ca
atare sau inactivat la 80 0C 30 min), pe geloză – sânge, în anaerobioză, 4-5 zile. Se
observă producerea fenomenului de migrare şi hemoliza.
Fig. XIV.1. a.Actinomyces
(www.geocites.com) b.Propionilbacterium

Fig. XIV.2.a Fusobacterium b.Peptostreptococcus

Fig. XIV.3. Clostridium tetani (www.geocites.com)

 infecţiilor produse
Capitolul
de treponeme
XV şi leptospire
Diagnosticul de laborator al

GENUL TREPONEMA cuprinde trei specii patogene pentru om:

T.pallidum, T.pertenue şi T. Carateum.
Treponema pallidum include bacterii spiralate, subţiri ( 5-15 µm lungime
şi 0.2 µm diametru), cu spire regulate, la distanţă de aproximativ 1µm între ele.
Prezintă mişcări active, în jurul axei, de pendulare, de progresie şi de flexie.

Fig. XV.1. Treponema- imagine de microscopie electronica ( e-Medicine –

Syphillis)

Treponemele nu se colorează în coloraţia Gram , ci doar prin metoda de

impregnare argentică sau cu fluorocromi. La examinarea în câmp întunecat ,
treponemele apar albe, refringente, strălucitoare.
Treponemele patogene nu sunt cultivabile pe medii artificiale, ci doar pe
testicul de iepure. Treponema Reiter, o treponema saprofită înrudită antigenic cu T.
pallidum, este cultivabilă in vitro în condiţii de anaerobioză.
Structura antigenică.este complexă.Principalele antigene sunt:
- cardiolipina antigen de natură fosfolipidică, prezent la toate treponemele
( patogene şi nepatogene), precum şi în unele ţesuturi animale sau umane.
- Antigene proteice , comune tuturor treponemelor utilizate în RFC
- Antigene ale corpului bacterian, foarte specifice, caracteristice
treponemelor patogene.
- Antigene de suprafaţă, determină apariţia de anticorpi ce reacţionează în
RIF.
Patogenitate: sifilisul
Sifilisul este o boală specifică omului. Transmiterea se face
- pe calea sexuală,
- prin transfuzii sau manipulare de produse patologice contaminate
- transmitere de la mamă la făt
Diagnosticul de laborator
• Detectia directa a Treponemei pallidum prin microscopia in camp
intunecat sau imunofluorescenta directa este indicata cand sunt prezente leziuni, în
special în sifilisul primar. Treponemele nu se colorează în coloraţiile uzuale.
• Cultivarea pe medii artificiale nu este posibila.
• Diagnosticul serologic este cel mai folosit, fiind indicat în special în
sifilisul secundar şi terţiar

Microscopia in camp intunecat / Imunofluorescenta directa

- Examenul microscopic in camp intunecat se recomanda pentru
serozitatea din leziunile de sancru
- Imunofluorescenta directa este utila pentru leziuni bucale si anale
Produsul patologic este reprezentat de serozitatea din sancru sau celule
lezionale obtinute prin raclaj viguros al leziunii.
La examinarea în câmp întunecat , treponemele apar albe, re fringente,
strălucitoare. ( Fig XV.1 )

Fig XV.2 Aspectul treponemelor la examenul microscopic în câmp întunecat

(K.Tomae)

Avantaje:
- Sunt primele care dau rezultate pozitive, inainte de pozitivarea testelor
serologice
- se obtin rezultate in timp scurt.
Dezavantaje
- microscopia in camp intunecat necesita examinarea imediata si un
medic cu experienta in microscopie.
- Imunofluorescenta necesita reactivi relativi scumpi, microscop cu
lampa UV si medic cu experienta in microscopia pentru IF
 - Rezultate fals negative se pot obtine daca pacientul a inceput
tratamentul cu antibiotice pe cale generala

Diagnosticul serologic
- este indicat in sifilisul secundar, metodele serologice fiind unicele
metode de diagnostic de laborator in sifilisul latent si tertiar
- exista doua tipuri de teste serologice:
- a. care folosesc antigenul cardiolipina ( non-treponemice) : VDRL,
RPR-carbon
- b. Care folosesc antigene treponemice specifice: TPHA, FTA-abs.
( fluorescent treponemal antibody absorption), imunoenzimatic ELISA, si teste
rapide imunocromatografice, TPPA ( Treponema pallidum particle agglutination)

Teste non-treponemice
- teste de screening
- rapide si simple din punct de vedere tehnic
- VDRL este util pentru LCR
- Utile ce indicator de reinfectie
- Pot fi efectuate cantitativ, urmarind scaderea titrului ca urmare a unui
tratament adecvat
Dezavantaje:
- apar la 1-4 saptamani dupa aparitia sancrului
- dau rezultate fals pozitive in boli virale, parazitare ( malarie), lepra,
autoimune ( LES, tiroidita), sarcina, hepatite cronice, neoplasme in stadiu avansat
- rezultate fals negative in pana la 40% din cazuri in sifilisul primar si
25% din cazuri in sifilisul secundar

Teste treponemice
- Testele care utilizează antigene extrase de la treponemele patogene
sunt teste specifice. Acestea sunt folosite ca teste de confirmare, ori de cate ori
VDRL sau RPR sunt pozitive
- TPHA si FTA-abs sunt foarte sensibile si reprezinta testele de electie
Dezavantaje:
- Reactii incrucisate cu treponematozele non-veneriene ( pinta, pianul ),
boli tropicale
- Nu pot fi folosite in testarea LCR
- Nu pot fi folosite in monitorizarea raspunsului la tratament sau
aprecierea reinfectiei

PCR ( reactia de amplificare a genomului) este disponibila in anumite centre

specializare.
 In sifilisul congenital
La nou nascutii cu sifilis congenital sau suspiciune de sifilis congenital, se
recolteaza LCR inainte de inceperea tratamentului. Pot exista semnele clinice
( malformatii congenitale, hepatomegalie, splenomegalie).
La mamă se efectueaza teste serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-
abs.
La copil se efectuează
- testele serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-abs.
- Examenul LCR pentru prezenta treponemelor si a anticorpilor ( VDRL sau
RPR).

RPR carbon
Principiu
RPR ( rapid plasma reagin) este o reacţie de aglutinare între antigenele
reprezentate cardiolipina adsorbită pe suprafaţa unor particule de carbon şi
anticorpii anticardiolopinici –“ reaginele” – din serul bolnavilor de sifilis.
Tehnica testului calitativ
Sângele se recoltează, pe nemâncate, prin puncţie venoasă, în vacuum fără
anticoagulant. Se separă serul care trebuie să fie limpede, serurile lipemice sau
hemolizate nefiind adecvate. Serurile se pot păstra prin congelare la minus 20O C.
Se folosesc plăcuţe de carton plastifiat, de unică utilizare, ce au imprimate
cercuri cu diametrul de 18 mm.
Se utilizează obligatoriu un ser control pozitiv şi un ser control negativ.
În momentul efectuării testului serurile şi reactivii trebuie să fie la
temperatura camerei.
În fiecare cerculeţ se pipetează, cu vârfuri separate sau cu pipetele de
unică utilizare din trusă, cîte 50 µl ser în fiecare cerculeţ : ser control pozitiv, ser
control negativ şi serurile de cercetat. Se dispersează fiecare ser pe întreaga
suprafaţă a cerculeţului.
Suspensia antigenică se omogenizează prin agitarea 10-15 secunde a
sticluţei-dispenser. Cu sticluţa în poziţie verticală se depune câte o picătură de
antigen în fiecare cerculeţ, peste ser.
Se agită prin mişcări rotative, cu rotatorul automat la 100 rpm sau
manual, timp de 8 minute. ( Fig. XV.3.)
 Fig.XV.3. Executarea reacţiei RPR- carbon

Citirea rezultatelor se face strict după oprirea rotaţiei.

Rezultat pozitiv: aglutinare prezentă, în orice grad. Minimă, moderată,
sau marcată, intensă. Serul se clarifică şi se observă grunjii de culoare neagră.
Rezultat negativ: lipsa aglutinării, cu prezenţei undei de antigen. ( Fig.
XV.4.)

++++ +++ ++ + Negativ

Fig. XV.4.: Modelul de interpretare a reacţiei RPR- carbon

Toate serurile pozitive trebuiesc testate printr-o metodă alternativă.

 Testul cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 5 cerculeţe.
Se pregătesc serurile de cercetat în diluţii binare: 1.2, 1:4, 1.8, 1:16.
Se pipetează câte 50µl ser nediluat şi serurile dilute în cîte un cerculeţ. În
continuare se procedează similar cu testul calitativ.
Citirea şi interpretarea: Ultima diluţie de ser la cere se mai observă
aglutinare dă titrul reacţiei. De exemplu Reacţie pozitivă, diluţia 1.4

TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)

TPHA este o reacţie de hemaglutinare pasivă (indirectă) folosită pentru
depistarea anticorpilor îndreptaţi împotriva antigenelor specifice ale
treponemelor patogene.
Principiu:
Hematii aviare pe suprafaţa cărora au fost adsorbite antigene de
Treponema pallidum ( suşa Nichols) sunt suspendate într-un diluent care
împiedică aglutinarea nespecifică.
Hematiile astfel sensibilizate, puse în contact cu serul unui pacient ce
posedă anticorpii corespunzători, vor aglutina. Reacţia poate fi efectuată
calitativ sau cantitativ.
Tehnica testului calitativ ( exemplu)
Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 4 godeuri.
Se utilizează obligatoriu un ser control pozitiv şi un ser control negativ.
1.Pentru fiecare ser se pipetează diluent: 25µl în godeurile 1,3 şi 4 şi
100µl în godeul 2.
2. Se adaugă 25µl ser în godeul 1, se amestecă şi se transferă 25µl în
godeul 2; se amestecă şi se transferă câte 25µl în godeurile 3 şi 4. Se amestecă
şi
se aruncă 25µl din godeurile
3 şi 4. Se realizează astfel diluţii de ser de 1:20
3. Se adaugă 75 µl suspensie hematii de control ( nesensibilizate ) în
godeul 3 şi 75 µl suspensie hematii sensibilizate ( hematii test) în godeul 4.
4. Se amestecă prin lovire uşoară sau prin folosire unui agitator mecanic
30 sec.
 5. Se acoperă placa şi se incubează la temperatura camerei timp de 1 h,
nemişcată.
6. Se citeşte reacţia.
Tehnica testului cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 8 godeuri.
Se realizează diluţii binare de ser, ultima fiind de 1:80
Citirea rezultatelor: ( Fig. 4 )

Fig.XV.5. TPHA – aspectul martorilor şi schema de interpretare a

rezultatelor
( după K.Tomae)

- : buton de hematii
+/- : buton de hematii cu centrul gol
 1+ : peliculă înconjurată de un inel gros de hematii
2+ : peliculă înconjurată de un inel subţire de hematii
3+ : peliculă omogenă ce acoperă parţial fundul godeului
4+ : peliculă omogenă de celule, ce acoperă tot fundul godeului

Interpretare:
Rezultatul pozitiv ( 1-4+) , indică prezenţa anticorpilor specifici
antitreponemici, semnificând o infecţie actuală sau în antecedente.
Rezultatul negativ indică absenţa anticorpilor , semnificaţia fiind, în
funcţie de rezultatul VDRL, fie absenţa infecţiei, fie o infecţie foarte recentă.
Rezultatele +/- sunt considerate fie ca negative, fie rezultate la limită,
corespunzătoare unui stadiu precoce sau ca anticorpi reziduali în sifilisul tratat .
Este indicat să se repete testarea .
Erorile pot fi date de : reactivi necorespunzători, seruri hemolizate,
rezultate necorespunzătoare la martorii pozitivi şi negativi, erori de tehnică.

LEPTOSPIRA
Genul Leptospira cuprinde bacilli subţiri (6 - 12 mm lungime şi 0,1
mm diametru), spiralaţi, cu una sau ambele extremităţi flectate în formă de cîrlig.
Nu se colorează în coloraţia Gram, ci doar prin metode speciale ( cu fluorocromi,
prin impregnare argentică), similar cu treponemele. Sunt bacterii aerobe.

A. B.
Fig.XV.6. Leptospira: A. Imagine de microscopie electronică, B. impregnare
argentică
(După Dr. P. PEROLAT Institut Pasteur – Paris)
Leptospira interrogans, cu serotipurile L.icterohemoragiae, L. canicola, L,pomona
şi L.autumnalis este patogenă pentru om şi animale, iar Leptospira biflexa este
specie saprofită.
Leptospiroza este o antropozoonoză, omul infectându-se fie direct prin contactul cu
animale bolnave (
rozătoare, cîini, bovine) sau
purtătoare, fie indirect prin intermediul apelor dulci sau solului contaminat cu urină
de la aceste animale.
La om, infecţia poate evolua sub mai multe forme clinice:
• Forma benignă, anicterică, pseudogripală, în 80% din cazuri
• Boala Weil, sau forma ictero-hemoragică, cu tablou septicemic iniţial urmat
de icter
• ( afectare hepatică), hemoragii difuze şi insufucienţă renală.
• Forma pulmonară
• Forma cardiacă
• Forma neurologică
Diagnosticul de laborator în leptospiroză pote fi făcut prin următoarele metode:
a. Identificarea leptospirelor în fluide biologice: urină, sânge, LCR. Urina
este cea mai recomandată leptospirele fiind prezente după prima săptămână pe toată
durata bolii. În sânge sunt prezebte doar în prima săptămână, iar în LCR în prima şi
a doua săptămână.
Examenul microscopic în câmp întunecat este puţin sensibil şi poate da rezultate
fals pozitive.
Flurescenţa directă este mai sensibilă şi mai specifică, dar nu reprezintă o metodă
de rutină pentru majoritatea laboratoarelor.
Cultura este metoda cea mai recomandată, leptospirele putând fi izolate in vitro pe
medii speciale: Tween 80 cu albumină, Fletcher, etc. Leptospirele sunt
microorganisme cu creştere lentă culturile fiind incubate la 28-30 0 C timp de 6
săptămâni.
b. diagnosticul serologic pune în evidenţă anticorpii anti-leptospira prin
reacţia de aglutinare MAT ( microscopic agglutination test) sau ELISA. Reacţiile
serologice se pozitivează după 8-12 zile . Un titru al anticorpilor de cel puţin 1:800
la prima determinare sau creşterea în dinamică de 4X a titrului în convalescenţă
faţă de prima determinare sunt sugestive pentru diagnostic.
c. Diagnosticul poate fi făcut şi prin metode de biologie moleculară - PCR dar de
asemenea nu reprezintă o metodă curentă pentru majoritatea laboratoarelor.
.

Capitolul XVI
 DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE CHLAMYDIA ŞI
MYCOPLASMA

Genul Chlamydia

Genul Chlamydia cuprinde bacterii Gram-negative cu parazitism intracelular

obligatoriu şi care au un ciclu de multiplicare unic între microorganisme.
Chlamydiile se multiplică în citoplasma celulelor gazdă, producând incluziuni
caracteristice , vizibile la microscopul optic.

Fig. XVI.1. Celule epiteliale cu incluziuni specifice C.trachomatis (după Atlas

Ronald M)

Speciile importante pentru om sunt: Chlamydia trachomatis şi Chlamydia

pneumoniae. Chlamydia psitacii este o specie patogenă pentru păsări şi animale.
C. trachomatis
Patogenitate
1. C. trachomatis, serotipurile A - C, determină trachoma,
keratoconjunctivită cronică, contagioasă endemică în Asia şi Africa Complicatia
redutabilă este pierderea totală a vederii.
2. C. trachomatis, serotipurile D - K, sunt responsabile de infecţii cu
transmitere pe cale sexuală, în special la tineri. În 20% - 40% din cazuri, infecţia
coexistă cu gonorea.
Chlamydia determină la femei cervicită, uretrită sau rectită iar la bărbaţi uretrită sau
rectită. Perioada de incubaţie este de 1-3 săptămâni. Infecţiile urogenitale sunt de
multe ori asimptomatice (50%dintre bărbaţi- 70% dintre femei).
La adulţii activi sexual, aceste serotipuri de C. Trachomatis pot determina
conjunctivita acută cu incluziuni ( secreţie mucopurulentă, keratită) , bacteria find
transmisă prin autoinoculare sau după contacte sexuale orale.
La gravidele cu infecţie genitală cu Chlamydia trachomatis, este
posibilă transmiterea verticală ( de la mamă la făt ) în timpul expulziei, în 50-70%
din cazuri. Nou născutul poate dezvolta conjunctivită, cel mai frecvent, cu secreţie
purulentă, la 5-12 zile după naştere. Ca urmare a colonizării faringelui, poate
dezvolta o pneumonie tardivă, în 10% din cazuri.
C. Trachomatis serotipurile L1, L2, şi L3, determină limfogranulomatoza
veneriană (LGV) sau boala Nicolas - Favre, boală sistemică cu punct de plecare
genital ce se întâlneşte în zonele tropicale din Africa, Asia, America se Sud.
Diagnosticul de laborator
Produsele patologice sunt recoltate de la nivelul mucoasei conjunctivale,
cervicale sau uretrale, cu tampoane sterile, prin raclare uşoară care să permită
antrenare de celule epiteliale (deoarece Chlamydia este un microorganism
intracelular, probele trebuie să fie bogate în celule epiteliale din zona infectată). Tot
în infecţiile genitale se mai pot recolta: urină, spermă, secreţii purulente. Pentru C.
Pneumoniae pot fi secreţii faringiană, nazală, spută , iar în suspiciunea de LGV:
aspirat ganglionar, puroi .
Examenul microscopic
Frotiurile efectuate din produsul patologic pot fi colorate prin metode
speciale: metoda cu lugol, coloraţia Machiavello, coloraţia Gimenez. Se urmăreşte
prezenţa leucocitelor, semn al inflamaţiei şi a celulelor epiteliale . Incluziunile se
evidenţiază ca aglomerări intracitoplasmatice de material , colorat diastinct de
restul celulei (roşu în coloraţiile Gimenez şi Machiavello, brun în coloraţia cu
lugol)
Imunofluorescenţa directă sau indirectă pune în evidenţă incluziunile
intracitoplasmatice şi corpusculii elementari. Sensibilitatea metodei este de până la
80%, iar specificitatea de 99%. Necesită reactivi relativi scumpi, microscop cu
lampă UV şi personal specializat în examinarea pentru IF. Este însă o metodă de
diagnostic de elecţie.
Cultivarea nu este o metodă de rutină. Chlamydiile cresc dificil, numai pe
medii celulare ( HeLa, McCoy, Hep-2). Metoda este scumpă, laborioasă, şi se obţin
multe rezultate fals negative ( sensibilitatea metodei este preciată la 50%-90% de
diferiţi autori)
Diagnosticul imunologic
Detectarea antigenelor de Chlamydia în produsele patologice se poate face
prin mai multe metode : teste rapide imunocromatografice, (fig.2), ELISA, PCR.
Produsele patologice sunt recoltate cu tampoane sterile, prin raclare uşoară care să
permită antrenare de celule epiteliale, apoi se introduc în tuburi cu medii speciale.
După descărcarea produsului şi eventual centrifugare, supernatantul este folosit
pentru detectarea antigenelor prin metodele amintite.
 Fig. Fig. XVI.2. Determinarea antigenelor de Chlamydia din produs patologic
(schemă)

Diagnosticul serologic
Evidenţierea anticorpilor IgG anti-Chlamydia trachomatis în serul
pacienţilor, prin diferite metode, dintre care cea mai utilizată în prezent este
ELISA. Sensibilitatea este de 60%, specificittatea de 99% . Esta o metodă
accesibilă ca preţ şi tehnică. Un titru de 1:64 este sugestiv pentru infecţie, iar
creşerea titrului în dinamică confirmă aceasta.
Sensibilitatea la antibiotice
Antibiograma nu se efectuează de regulă.
Antibioticele cele mai eficiente sunt cele cu o bună penetrabilitate
intracelulară: tetracicline, macrolide, fluorochinolone de generaţia a doua şi a treia
şi rifampicine.
Chlamydia posedă rezistenţă naturală la beta-lamine şi glicopepetide.

Chlamydia pneumoniae
Chlamydia pneumoniae determină infecţii respiratorii: faringite, bronşite,
pneumonie, sinuzite.
Diagnosticul serologic
Evidenţierea anticorpilor IgG anti-C. Pneumoniae în serul pacienţilor,
prin diferite metode, dintre care cea mai utilizată în este ELISA.
 Aproape 50% dintre adulţi au anticorpi anti- C. Pneumoniae.
Tratamentul se face cu Tetraciclină sau Eritromicină, 10-14 zile.

Genul Mycoplasma

Genul Mycoplasma face parte din clasa Mollicutes ( cu membrană moale).

Organisme procariote, de dimensiuni foarte mici: 150-250 nm, au un genom mic,
dar care conţine atât ADN cât şi ARN, o membrană celulară deformabilă ce conţine
steroli şi sunt complet lipsite de perete celular.

Fig. XVI.3. Mycoplasma – imagine de microscopie electronică ( K.Todar)

Speciile cele mai importante în patologia umană sunt:

Mycoplasma pneumoniae, care produce infecţii respiratorii
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium şi Ureaplasma
urealyticum, care determină infecţii genitale.
M. pneumoniae este aerobă, în timp ce celelalte specii sunt aerobe facultativ
anaerobe. Se colorează greu în coloraţia Gram ( Gram negative) .
Cresc in vitro pe medii de cultură acelulare, dar sunt bacterii pretenţioase.
Formează colonii caracteristice cu aspect de ouă ochiuri.
M. pneumoniae se transmite pe cale aerogenă, prin picături Pflugge,
infecţiile fiind mai frecvente toamna şi iarna. Majoritatea cazurilor sunt infecţii ale
căilor respiratorii superioare şi doar în 5-10% din cazuri infecţia progresează spre
traheobronşită sau pneumonie, de obicei autolimitate.
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium şi Ureaplasma
urealyticum se transmit pe cale sexuală.
Manifestările clinice în infecţiile genitale la femei sunt:
- secreţie veginală anormală
- simptome de boală inflamatorie pelvică
- stare febrilă post-partum sau post-abortum
La bărbaţi infecţia se manifestă ca uretrită non-gonococică:
- secreţie uretrală
 - disurie ( arsură, usturime la urinat)
- dureri la nivelul prostatei
- frisoane, febră

Diagnosticul de laborator
Examenul microscopic nu este sugestiv, deoarece mycoplasmele sunt foarte
mici şi se colorează greu sau nu se colorează în coloraţia Gram
Cultivarea este puţin utilizată în diagnosticul de rutină deoarece
Mycoplasmele sunt bacterii fastidioase şi cresc încet pe mediile de cultură.
Diagnosticul serologic este cel mai accesibil
- testul aglutininelor la rece; reacţia este nespecifică şi în plus, numai
50% dintre bolnavi dezvoltă hemaglutinine la rece
- reacţia de fixare a complementului pentru anticorpi anti M.
pneumoniae. Este mai specifică şi o creştere de 4X a titrului anticorpilor între
debutul bolii şi convalescenţă precizează diagnosticul
- ELISA pentru IgM şi IgG anti- M. Pneumoniae. Specificitatea şi
sensibilitatea sint de 98-99%. Este testul cel mai indicat în prezent.
Alte metode mai rar folosite sunt: Imunofluorescenţa directă, ELISA pentru
depistarea antigenelor în spută, RIA, şi recent PCR.

În infecţiile genitale, Mycoplasmele sunt depistate mai ales prin culturi ale
secreţiilor uretrală sau vaginală şi prin teste imunologice.
Cultivarea se face pe medii speciale: bulion cu extracte de cord bovin şi ser
de cal, urmată de trecere pe geloză îmbogăţită cu aceleaşi elemente. Ureaplasma
creşte de obicei în 2-3 zile, iar Mycoplasma hominis într-o săptămână. Mycoplasma
genitalium necesită pentru creştere 1-2 luni. Coloniile sunt foarte mici, cu centrul
dens şi marginile clare, aspect caracteristc de ouă ochiuri.

Diagnosticul imunologic este disponibil în prezent.

Tratament
În infecţiile tractului respirator superior tratamentul cu antibiotice nu este
necesar.
În pneumonie, deşi este autolimitată, se recomandă antibioterapia, în scopul
reducerii duratei bolii şi scăderii riscului pentru contacţii cu bolnavul.
- Antibioticele de elecţie sunt macrolidele, tetraciclinele, fluorochinolone
numai la adulţii cu pneumonie din comunităţi; sunt contraindicate la copii şi
gravide.
În infecţiile genitale Tetraciclina şi Doxiciclina sunt antibiotice de elecţie,
ele având o bună acţiune şi pe Chlamydia trachomatis. La gravide se recomandă
 Capitolul XVII
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR GENITALE

Flora normală a tractului genital feminine

Flora vulvară prezintă o floră asemănătoare cu a regiunii perineale.
Cantitativ şi calitativ este în strânsă legătură cu igiena locală a fiecărei persoane.
Flora vaginală este mai specifică şi influenţată de statusul hormonal şi de
activitatea sexuală.
- În copilărie, până la instalarea ciclului menstrual şi în post-menopauză , în vagin
sunt prezente numeroase specii de bacterii aerobe şi anaerobe.
- În perioada de activitate a funcţiei ovariene, sub influenţa estrogenilor, are loc o
modificare radicală a florei normale vaginale. Depozitele abundente de glicogen
din celulele epiteliale ale mucoasei vaginale favorizează dezvoltarea genului
Lactobacillus (fig. XVII.1), ce utilizează acest substrat nutritive şi produc acid
lactic, cu scăderea pH vaginal . PH de 3,8-4,5 este nefavorabil altor specii
bacteriene, saprofite sau patogene. Levurile (Candida) pot supravieţui, în număr
limitat în aceste condiţii.

Colul uterin, în zona exocolului are o floră asemănătoare florei vaginale, dar
în zona de tranziţie flora se reduce numeric. Mucusul cervical, prin substanţele
antimicrobiene pe care le conţine: lizozim, lactoferină şi imunoglobuline, are un rol
de barieră împotriva pătrunderii microorganismelor .
Uterul şi trompele uterine sunt sterile.

Infecţii ale regiunii vulvare se manifestă de obicei prin: prurit , senzatie de arsura
sau iritatie;
Infecţii specifice.
Sifilisul primar: leziunea specifică – şancrul dur : ulceraţie cu margini bine
delimitate, baza indurată, prezentând o serozitate clară. Leziunea este nedureroasă,
nepruriginoasă şi se însoţeşte de obicei de adenopatie inghinală . În sifilisul
secundar, pe mucoasa vulvară pot apare leziuni papuloase: condiloame.
Diagnosticul se face prin examen microscopic în câmp întunecat al unui preparat
proaspăt între lamă şi lamelă efectuat din serozitatea din şancru. Se indică şi testele
serologice ( VDRL, TPHA), care pot fi negative dacă boala se află la debut, dar se
recomandă repetarea acestora după 2 săpt., o lună.
Candidoza vulvară însoţeşte de obicei candidoza vaginală ( vulvovaginita
candidozică). Doagnosticul de laborator se bazează pe
- examenul microscopic al frotiurilor efectuate din secreţie şi
- culturi pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol
Infecţia cu Trichomonas vaginalis însoţeşte infecţia vaginală. Diagnosticul
se face prin
 - examen microscopic al unui preparat proaspăt între lamă şi lamelă
din secreţia vaginală şi
- examinarea frotiurilor colorate A.M. şi Gram din secreţie.

Vulvita herpetică determinată de Herpes simplex tip 2, caracterizată prin

prezenţa unor vezicule aglomerate pe o zonă eritematoasă, însoţite de durere, arsură
sau prurit, evoluează apoi spre ulceraţie şi crustificare.
Condilomatoza veneriană ( condiloma acuminata), determinată de HPV tip
6 şi 11, caracterizată prin leziuni maculo-papuloasede mărime şi formă variate.
Moluscum contagiosum determinat de Poxvirus se caracterizează prin
leziuni papuloase.

Infecţiile nespecifice pot avea diferite etiologii ( streptococie, stafilococice,

etc.), iar zona cutanată a vulvei poate fi sediul unor infecţii tip piodermite:
foliculite, furuncule.
Diagnosticul este bacteriologic şi se face prin cultivarea probelor recoltate de
la nivelul zonei afectate.

Bartolinitele – infecţii localizate la nivelul glandelor Bartholin- pot fi determinate

de Neisseria gonorhoeae, C. Trachomatis, Uraplasma urealyticum sau de floră
nespecifică aerobă sau şi anaerobă, în special abcesele glandelor Bartholin.
Diagnosticul bacteriologic se bazează pe culturi aerobe şi anaerobe efectuate din
puroiul eliminat spontan sau după incizie glandei abcedate, recoltat cu tampon
steril. Cu tampon separat se recoltează pentru frotiu.

Vaginita – inflamaţie acută sau cronică a mucoasei vaginale. Se însoţeşte de multe

ori de afectarea mucoasei vulvare ( vulvo-vaginită) Orice modificare a secretiei
vaginale normale poate sugera diagnosticul de vaginita. De obicei secretia devine
abundenta, isi modifica culoarea (poate fi galbena, verzuie, sau alba pastoasa),
consistenta (vascoasa, sau apoasa) si capătă un miros neplacut.
Se asociază dispareunia (durere la contactul sexual) si uneori disurie, polakiurie
Cele mai frecvente sunt: vaginitele nespecifice numite şi vaginoze
bacteriene, vaginitele cu Trichomonas vaginalis şi cu Candida Albicans
Vaginozele bacteriene reprezintă jumătate din totalul vaginitelor. Sunt
produse de diferite bacterii aerobe: Gardnerella vaginalis ( cocobacil Gram-
variabil); streptococi de grup A, B; Staphylococcus aureus; bacili Gram-negativi:
Escherichia coli, Klebsiella; anaerobe (Bacteroides, Prevotella, Mobiluncus,
Peptostreptococcus) şi Mycoplasma hominis.
Majoritatea femeilor cu vaginoze bacteriene sunt active sexual, raporturile
sexuale şi introducerea diferitelor obiecte în vagin reprezentând factori de risc în
apariţia VB. Condiţia majoră este reprezentată însă de modificarea florei normale
vaginale, dispariţia lactobalililor şi ruperea echilibrului florei endogene.
 Vaginozele bacteriene sunt frecvente la gravide şi tratarea acestora contribuie
la reducerea riscului unei naşteri premature.
În aproximativ 50% din cazuri vaginozele bacteriene sunt asimptomatice. În
celelalte cazuri, secreţia vaginală este abundentă, omogenă, gri-albicioasă sau
gălbuie, urât mirositoare , aderentă la mucoasa vaginală şi însoţită de prurit. Iritaţia
mucoasei vulvare este de obicei absentă.
Se pot complica cu boală inflamatorie pelvică.
Pentru diagnostic, se recoltează cu valva şi cu un tampon steril secreţie
vaginală pentru efectuarea de frotiuri. Pe frotiuri se observă leucocite în număr
moderat sau mare şi celule epiteliale vaginale cu conturul marcat de bacterii aderate
la suprafaţa lor – clue cells. ( peste 20% din celulele epiteliale prezente pe frotiu).
Cu alt tampon steril se recoltează secreţie pentru culturi aerobe şi anaerobe.
PH-ul vaginal este mai mare de 4,5.
Tratarea secreţiei cu soluţie KOH 10% determină degajarea unui miros
pronunţat de peşte.
Tratamentul antibiotic se face de obicei cu metronidazol şi clindamicină, pe
cale generală sau în preparate topice. Acestea din urmă pot avea însă efecte
decundare: iritaţie, senzaţie de arsură, stinging

Vaginita cu Trichomonas vaginalis este simptomatică în majoritatea

cazurilor.
Mucoasa vulvară şi vaginală apar roşii, edemaţiate. Secreţia vaginală este
abundentă, cu aspect omogen, galben-verzui sau gri, aerată, cu miros neplăcut. Se
pot observa puncte hemoragice şi ulceraţii la nivelul mucoasei vaginale şi
exocervicale.
Diagnosticul de laborator : pH vaginal este peste 5, iar din secreţia vaginală
recoltată cu valva sau cu tamponul se efectuează preparat proaspăt între lamă şi
lamelă, în ser fiziologic la 370 C şi frotiuri colorate A.M. şi Gram. Preparatul
proaspăt este deosebit de important deoarece se observă paraziţii vii, mobili. Pe
frotiuri se observă un număr mare de leucocite , parazitul T. vaginalis şi se
urmăreşte prezenţa eventuală a altor microorganisme cu transmitere sexuală. Deşi
localizarea cea mai frecventă a parazitului este mucoasa vaginală, el poate afecta şi
endocolul, uretra, glandele Bartholin şi Skene.

Vulvovaginita candidozică Speciile de candida: C albicans, C tropicalis,

and C glabrata, care populează în mod normal vaginul în număr mic, se multiplică
excesiv în anumite condiţii ( antibioterapie generală, diabet, sarcină,
imunospupresoare), dar infecţia candidozică poate fi transmisă şi pe cale sexuală.
Candidoza vaginală se manifestă prin prurit intens (simptomul cel mai
frecvent), arsură, chiar durere. Mucoasa este roşie, edemaţiată, şi se acoperă cu o
secreţie albibicioasă, păstoasă sau granuloasă. Pot fi prezente eroziuni sau papule.
Leucorea este uneori abundentă, alb-gălbuie, vâscoasă.
Diagnosticul de laborator: pH vaginal acid, din secreţia vaginală se
efectuează frotiuri colorate A.M. sau Gram .
Cu tamponul steril se recoltează secreţie pentru cultura pe mediul Sabouraud
cu cloramfenicol.

Cervicitele
La nivelul exocolului uterin, epiteliul pavimentos este asmănător celui
vaginal, iar infecţia cu Trichomonas vaginalis şi Candida poate evolua şi la acest
nivel. De asemenea, şancrul dur se poate localiza la nivelul exocolului. HPV
determină infecţii la acest nivel la 1% dintre femei.
La nivelul endocolului, unde epiteliul mucoasei este cilindric , se localizează
infecţii cu Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis serotipurile D-K, Herpex
simplex tip 2 .
Secreţia endocervicală normală este clară, uşor mucoidă, mai vîscoasă în
perioada progesteronică a ciclului luteal. În cervicite secreţia devine mai
abundentă, muco-purulentă. După îndepărtarea secreţiilor stagnante la nivelul
exocolului, se recoltează din endocol, prin introducerea pe o distanţă de 1-2 cm, a
două tampoane: unul pentru efectuarea de frotiuri şi unul pentru cultură. Pentru
testele imunologice (de ex. ELISA pt antigene C.trachomatis, HSV ) se recoltează
tampoane separate ce vor fi introduse în tuburi cu medii speciale.
Pe frotiurile colorate Gram şi Giemsa sau o coloraţie specială pentru
Chlamydia ( Gimenez) se urmăreşte prezenţa reacţiei inflamatorii şi a gonococilor ,
a levurilor sau a incluziunilor intraepiteliale specifice C.trachomatis.

Endometritele acute survin de obicei post-abortum sau post-partum şi se manifestă

prin febră, dureri hipogastrice, scurgeri vaginale purulente sau lohii cu aspect
purulent. Bacteriile ce determină endometrite sunt aerobe şi anaerobe, cel mai
frecvent izolate fiind de origine endogenă, vaginală: Streptococul de grup B, D, A
sau alte grupe, enterobacteriacee, Gardnerella vaginalis, anaerobi: Streptococi
anaerobi, Bacteroides fragillis, Clostridium perfringens, sau Mycoplasma hominis .
Culturile se fac întotdeauna aerobe şi anaerobe. În caz de satre febrilă
prelungită se recoltează şi hemoculturi, deoarece bacteriemia este o complicaţie
destul de frecventă a endometritelor .
Fig. XVII.1: Celulă epitelială vaginală superficială şi lactobacili
(www.medlineplus.gov)

Fig. XVII.2.Aspect de vaginoză bacteriană: clue-cells, leucocite, floră

polimorfă (www.medlineplus.gov)

Fig. XVII.3. Aspect de vaginită cu Trichomonas vaginalis ( indicat de

săgeată) (www.medlineplus.gov)
 Capitolul XVIII
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR PRODUSE DE LEVURI
(CANDIDA)

Ciupercile levuriforme sunt un grup heterogen de ciuperci, formate dintr-

o singură celulă ( celula levurică), eucariotă, de formă sferică, ovalară, sau, mai
rar , neregulată.
Ele se înmulţesc în general prin înmugurire ( formarea de blastoconidii sau
muguri), formă de reproducere asexuată şi se mai numesc fungi imperfecti.
Sporii asexuaţi ai levurilor sunt blastospori ( blastoconidii) celule sferice sau
ovalare izolate, formate prin înmugurirea levurilor şi care se separă de celula
mamă.
Unele levuri dezvoltă pseudo-filamente ( pseudohiphae): lanţuri de celule
levurice alungite, rezultate din formarea blastoconidiilor din unul în altul, în
linie, fără separarea completă a celulelor. Între celule nu există însă legături
stabile spre deosebire de fungii filamentoşi, ai căror micelii sunt ramificaţii ce
constituie o unitate fiziologică.
Alte levuri pot dezolta filamente adevărate ( hiphae) : fig.1 : Candida -
ciupercă dimorfică: celule levurice (C) şi forme filamentoase (D)

Fig. XVIII. 1 : Candida - ciupercă dimorfică: celule levurice (C) şi forme

filamentoase (D) ( www.mycologyadelaide.edu.au)

Genul Candida ( specia tip: C. Albicans)

Genul aparţine familiei Cryptococaceae, din Deuteromycete ( fungi imperfecti)
Gen heterogen, caracterizat prin celule globuloase, ovalare sau elongate sau
blastospori ( blastoconidii) care se reproduc prin înmugurire laterală.
Majoritatea speciilor formează pseudohiphae.
Deoarece Candida spp. poate fi prezentă în probele biologice ca rezultat al
contaminării din mediu, multiplicării din produsul respectiv ( dacă este păstrat
 prea mult timp) sau unei infecţii reale, recoltarea şi manipularea corectă a
probelor este esenţială în obţinerea unui diagnostic de laborator corect. De
exemplu, câteva celule de Candida prezente într-o spută lăsată la temperatura
camerei se pot înmulţi rapid, dând impresia unei infecţii candidozice.
Levurile se colorează în albastru închis, fiind foarte evidente în coloraţia A.M.,
şi în violet intens în coloraţia Gram. Candida prezintă celulele levurice de 3-4
µm, de obicei prezentând înmugurire unică. Pseudohifele au 5-10 µm, au
capetele subţiate şi rămîn ataşate. Hifele adevărate dacă sunt prezente au pereţi
paraleli şi sunt septate. Dacă pe frotiurile din produsele patologice se observă
sub formă de pseudohife sau cuiburi de blastoconidii, este o indicaţie a faptului
că modul lor de viaţă nu mai este saprofit ci parazit .

Fig XVIII 2: Candida: aspecte morfologice a = albicans, t=tropicalis, k=krusei,

l=lusitaniae, g=glabrata, p=parapsilosis; chl=chlamydospor
(dupa Campbell et al.)

Culturile pentru ciuperci se fac pe medii speciale, cum ar fi Sabouraud

(Sabouraud dextrose agar), pentru produsele normal sterile sau Sabouraud cu
cloramfenicol (Sabouraud cu cloramfenicol şi cicloheximidă) , Sabouraud cu
CCG şi NaCl (Sabouraud cu cloramfenicol, gentamicină şi cicloheximidă), sau
OGY- agar pentru produsele plurimicrobiene. Incubarea se face la 28-30O C
timp de 5-10 zile.
- Coloniile sunt albe, cremoase, mari şi se dezvoltă la 28-30O C după
48-72h ( maxim 5 zile). ( fig. 3 )
 Fig. XVIII .3 : Colonii de candida albicans pe mediul OGY-agar

În candidozele cutanate diagnosticul se pune pe

- examenul microscopic al scuamelor, prin efectuarea unui preparat
umed, în glicerină neutră sau în lichid de disociere KOH 30% (se observă celule
levurice, celule levurice înmugurite şi pseudofilamente)
- cultivarea pe mediu Sabouraud sau alte medii speciale pentru fungi.

Candidozele genitourinare

-Examenul microscopic al sedimentului urinar evidenţiază leucocite,

eventual hematii, celule levurice înmugurite, cuiburi de blastoconidii şi
pseudofilamente.

-Urocultura pe mediu Sabouraud.

- pH vaginal este acid; din secreţia vaginală se efectuează frotiuri colorate

albastru de metilen sau Gram. Pe frotiu se evidenţiază celule epiteliale vaginale,
leucocite, celule levurice, celule levurice înmugurite şi pseudofilamente
- Cu tamponul steril se recoltează secreţie vaginală pentru cultura pe mediul
Sabouraud .
 Candidoze ale tractului respirator

Examenul microscopic al sputei pe frotiurilor din colorate albastru de

metilen sau Gram pun în evidenţă leucocite, celule levurice, celule levurice
înmugurite şi pseudofilamente .

Culturile din spută pe medii speciale: Sabouraud, OGY-agar etc.

Endoscopia cu sau fără biopsie este utilă pentru a deosebi infecţia de
colonizare.

Identificarea de specie

a. Caractere morfologice: specii ale genului Candida pot fi identificate pe

baza caracterelor morfologice , testul de germinare: filamentele sunt produse din
celulele levurice după 2-3 h de la incubare. ( Figura 2)

b. Teste biochimice:

o CHROMagar Candida permite identificarea prezumptive a unor specii

de Candida folosind reacţii de culoare în medii specializate.
o API20C şi API 32C sunt galerii miniaturizate şi automatizate de reacţii
biochimice ( asimilarea unor substrate ) ce determină profile biochimice pe baza
cărora se pot identifica mai multe specii de levuri.

Antifungigrama

Testarea sensibilităţii la antifungice (antifungigrama) poate fi efectuată prin

• metoda difuziei,
• E-test sau
• metoda diluţiilor ( microdiluţiilor).

Metoda difuzimetrică, conform NCCLS, foloseşte ca mediu de cultură

geloza RPMI, inoculul standard de 0.5 Mc Farland şi discuri cu substanţe
antifungice ( Amfotericina B 10µg, Ketoconazol 15 µg , Itraconazol 8 µg,
Fluconazol 25 µg, Voriconazol 1.0 µg, 5-Fluorocitozină 1 şi 10 µg.
E-test foloseşte benzi impregnate cu substanţe antifungice în concentraţii
descrescătoare, putându-se determina şi CMI. Mediul de cultură indicat este geloza
RPMI cu glucoză. ( fig.4 )
Metoda diluţiilor este folosită pentru determinarea CMI, iar mediul folosit
este bulionul RPMI . Există truse comerciale pentru antifungigrame prin metoda
microdiluţiilor ( fig.5)
 Fig. XVII.4.Celule levurice înmugurite ( aspect indicat de săgeată)

Fig. XVIII 5 Determinarea sensibilitaţii la Fluconazol prin E-test şi prin metoda

difuziei

Fig. XVIII 6

Antifungigrama prin metoda microdiluţiilor (Fungitest)

 Capitolul XIX
DIAGNOSTICUL INFECŢIEI CU TRICHOMONAS VAGINALIS

Parazitul Trichomonas vaginalis este un protozoar urogenital, mobil, care

există numai sub forma vegetativă, neavând forme de rezistenţă.
T. vaginalis este piriform, cu lungimea de 18-26 µm, uneori putând ajunge la
30 µm. Nucleul este mare şi poziţionat anterior. Citoplasma este granulară. Posedă
patru flageli anteriori liberi şi un flagel recurent ce se găseşte pe marginea unei
membrane ondulante. În zona mediană prezintă un axostil puternic, ce menţine
forma celulei. ( fig. Fig.XIX.1.)

Fig.XIX.1. Schema structurii parazitului Trichomonas vaginalis

Transmiterea este directă, prin contact sexual în majoritatea cazurilor. Rar,

infecţia poate fi transmisă prin intermediul obiectelor de toaletă sau lenjeriei
murdare cu secreţii genitale infectate, sau de la mamă la nou-născut în timpul
travaliului.
La femei determină vaginită şi uretrită, infecţia fiind simptomatică în
majoritatea cazurilor. Pot fi afectate şi endocolul, uretra, glandele Bartholin şi
Skene.
La bărbaţi produce uretrită şi prostatită, în general asimptomatice .
La femei secreţia vaginală este abundentă, cu aspect omogen, galben-verzui
sau gri, aerată, cu miros neplăcut. Se pot observa puncte hemoragice şi ulceraţii la
nivelul mucoasei vaginale şi exocervicale.
Diagnosticul de laborator :
1. Metoda de diagnostic de elecţie este examenul microscopic al unui
preparat proaspăt între lamă şi lamelă, în ser fiziologic la 37 0 C din secreţia
vaginală recoltată cu valva în primele zile postmenstrual. Pe acest preparat se
observă paraziţii vii, care se recunosc uşor după formă, dimensiuni şi mişcările vii.
2. Tot din secreţia vaginală recoltată cu valva sau cu tamponul se efectuează
şi frotiuri colorate albastru de metilen, Gram sau Giemsa. Pe frotiuri se observă un
număr mare de leucocite , parazitul T. vaginalis şi se urmăreşte prezenţa eventuală
a altor microorganisme cu transmitere sexuală.

Fig.XIX.2. T.vaginalis. Coloraţie Geimsa ( www.geocites.com)

3. Când examenul microscopic direct sau frotiul nu au fost concludente, se

pot face culturi pe mediul Loeffler, turnat înclinat în tuburi . Incubaţia este de 24-
72h, după care cultura se verifică microscopic, între lamă şi lamelă. Dacă după 72h
parazitii mobili nu se evidenţiază microscopic, cultura este negativă.

Capitolul XX
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE

1. Microscopia optică: examenul citologic

Examenul citologic evidenţiază efectele citopatice caracteristice produse
de unele virusuri în celulele infectate: balonizarea celulei, formarea de sinciţii,
prezenţa de vacuole, incluziunile celulare. Incluziunile celulare: incluziuni
intranucleare Cowdry tip A, înconjurate de un halou clar şi marginaţia cromatinei,
datorate infecţiei cu HSV ( virusul Herpes simplex), corpii Babes-Negri ( virusul
rabic), incluziuni cu aspect de ochi de bufniţă ( virusul citomegalic).
2. Microscopia electronică nu este o metodă de rutină în diagnosticul de laborator,
dar este folosită în cercetare şi evidenţiază morfologia particulelor virale
3. Cultivarea virusurilor se poate face pe culturi celulare, ou de găină embrionat
şi animale de laborator.
Culturile celulare pot fi:
- culturi primare, obţinute din ţesuturi animale disociate cu tripsină
sau colagenază. Celulele sunt menţinute într-un mediu artificial cu
ser bovin şi factori de creştere, fie în mediu lichid ( limfocite), fie în
monostrat, adsorbite pe pereţii eprubetelor ( fibroblaşti, celule
epiteliale). Exemple: celule de rinichi de maimuţă.
- culturi secundare se obţin din culturile primare, disociate cu tripsină
şi transferate în alt mediu.
- culturi de celule diplode sunt culturi formate din celule capabile de
a se divide şi de a fi transferate de un număr mare dar finit de ori,
după care îmbătrânesc şi mor. Exemplu: celule diploide fetale umane
- linii celulare sunt formate din celule tumorale sau imortalizate prin
procedee chimice, şi care se divid de un număr infinit de ori, fără a
prezenta semne de îmbătrânire. Exemple: He-La, Hep-2.
Detectarea şi identificarea unor virusuri se face, după inocularea culturilor
celulare cu produsul patologic recoltat de la bolnav, prin apariţia efectelor
citopatice.
Cuantificarea virusurilor din produs poate fi făcută prin TCD50 titrul ce
produce efecte citopatice în 50% din celulele din cultură.
3. Detectarea proteinelor virale poate fi făcută prin electroforeză,
imunohistochimie, sau detectarea antigenelor virale în produsul patologic sau
sânge prin ELISA, imunofluorescenţă, Westtern-blot.
4. Detectarea acizilor nucleici virali poate fi făcută prin metode de biologie
moleculară ca: hibridizare in situ,imunoblotting, PCR. PCR este metoda
prin care ADN sau ARN viral este recunoscut cu ajutorul primerilor specifici
( secvenţe complementare) şi amplificat cu ajutorul enzimei polimeraza, astfel
încât produsul de amplificare este apoi uşor de identificat prin electroforeză în
gel sau ELISA.
5. Metode serologice. Identificarea anticorpilor antivirali în serul pacientului este
dovada răspunsului imun umoral faţă de infecţie. Apariţia anticorpilor în ser
poartă numele de seroconversie. Primii anticorpi care apar în răspunsul imun
primar sunt de clasă Ig M, detectarea acestora indicând astfel o infecţie recentă.
De asemenea, creşterea de 4X a titrului anticorpilor de clasă IgG semnifică o
infecţie curentă.
Cele mai utilizate metode folosite în prezent sunt:
- testele rapide imunohistochimice,
- ELISA ( metoda imunoenzimatică)
- reacţia de hemaglutinare (HA) şi hemaglutinoinhibare (HAI),
- latex-aglutinare
- imunofluorescenţa indirectă
- reacţia de seroneutralizare
- RIA ( radioimunoassay)

DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR CU HERPESVIRUSURI

Virusurile herpetice sunt foarte răspândite şi până în prezent, au fost

identificate opt specii de herpesvirusuri umane şi un număr de aproximativ 100 de
specii la animale. Au un caracter comun important: stabilesc infecţii latente după
prima pătrundere în organismul gazdei.
Virusurile herpetice umane sunt grupate în 3 subfamilii:

1. Alpha herpesvirinae
Genul Herpes simplex virus
- Virus herpetic uman tip 1 ( HSV-1)
- Virus herpetic uman tip 2 ( HSV-2)
Aceste virusuri produc : primoinfecţia herpetică şi herpesul recidivant.
Cea mai frecventă localizare a leziunilor este cea cutanată, dar mai pot fi:
gingivo-stomatite, faringite, keratoconjunctivite, encefalite.
Herpesul genital primar. Se caracterizează prin eziuni foarte dureroase de
vulvo-vaginită, care pot invada şi colul uterin. La bărbat infecţia este mai puţin
severă.
La nou născut poate determina o encefalită mortală. Este determinată în general de
HSV-2 transmis la naştere de la mama infectată.
Recurenţa ( recidiva) este favorizată de factori care produc depresia
tranzitorie a imunităţii celulare, fiind incriminaţi stressul, infecţiile, menstruaţia,
alimentaţia, unele medicamente.
 Reactivarea infecţiei latente determină apariţia erupţiei herpetice, cu acelaşi
aspect (papulă, veziculă, pustulă şi apoi vindecare până la restitutio ad integrum) şi
pe acelaşi teritoriu cutanat sau mucos ca şi localizarea primară.

Genul Varicellovirus, (sau Virus herpetic uman 3)

- virusul Varicella-Zoster (VZV)
Virusul Varicela-Zoster determină ca primă infecţie varicela ( vărsatul de
vânt). Infecţia latentă are loc în ganglionii nervoşi senzitiv. Reactivarea determină
zona zoster, manifestată durere şi erupţie în teritoriul dermatomului
( dermatoamelor) corespunzătoare.
După vindecarea varicelei, virusul se cantonează în ganglionii nervoşi
senzitivi, şi după perioade relativ lungi, se reactivează, determinând zona zoster.
Subfamilia alphaherpesvirinae se caracterizează prin: ciclu de replicare scurt,
producerea de infecţii latente în ganglionii senzitivi (spinali) şi producerea unor
efecte citopatice de tip litic în culturile celulare.

2. Beta herpes virinae

- Genul Citomegalovirus, specia Citomegalovirus uman
- Virus herpetic uman tip 6
- Virus herpetic uman tip 7
Subfamilia beta herpesvirinae se caracterizează prin ciclu de replicare lung,
efect de mărire a volumului celulelor infectateşi menţinerea latenţei în leucocitele
circulante, din rinichi, glandele exocrine şi alte ţesuturi.

3. Gamma herpesvirinae cu genurile:

- Lymphocryptovirus cu specia Virus Epstein-Barr
- Virus herpetic uman tip 8, cunoscut şi ca herpesvirus asociat
sarcomului Kaposi

Virusurile din subfamilia gamma herpesvirinae sunt specifice pentru limfocitele

B şi T şi dau infecţii latente în ţesutul limfoid.
Mononucleoza infecţioasă este o boală acută specific umană. Se transmite
prin contactul cu saliva unei persoane infectate ( se mai numeşte şi boala
sărutului).
Manifestările clinice cele mai importante sunt: adenopatii, splenomegalie şi
modificări hematologice.
 Metode de diagnostic de laborator în infecţiile cu virusurile herpetice

1. Microscopia electronică. Virusul poate fi vizualizat direct în lichidul din

vezicule , recoltat de la nivelul leziunilor ( HSV, VZV)

Fig. XX.1. Virusul Varicella-Zoster V.herpetic tip 3) – dupa F. Fenner

2. Examenul histopatologic evidenţiază celule multinucleate gigante, sinciţii,

incluziuni celulare Cowdry tip A.
3. Imunofluorescenţa. Preparate microscopice realizate din celulele infectate
( recoltate din leziuni sau culturi celulare) sunt tratate cu anticorpi
monoclonali cuplaţi cu fluorocromi. ( HSV, VZV, CMV)
4. Culturi celulare. Produsele patologice sunt lichidul din vezicule şi celule
obţinute prin raclaj de la baza leziunilor. Efectele citopatice apar după
intervale de timp diferite: 2 zile ( HSV) sau 1 săptămână ( VZV). Pentru
CMV efectele citopatice apar tardiv, după 3 săptămâni sau nu apar deloc.
5. Diagnosticul serologic.
În primoinfecţia herpetică anticorpii de clasă IgM arată infecţia recentă, iar cei
de clasă IgG expunere în antecedente. Este util în infecţia cu VZV, CMV, EBV şi
HHV-6. Pentru HSV este important ca testele folosite să detecteze anticorpii
specifici de tip: anti glicoproteina G a HSV1 ( gG1) sau a HSV2 ( gG2). Acesti
anticorpi sunt detectabili în ser după minim 2 săptămâni – maxim 3 luni de la
infecţie. Pentru EBV se identifică IgM şi IgG anti-VCA ( capsida virală ) şi anti-
EBNA ( nucleoproteine).
În infecţiile recurente serologia nu este foarte utilă. IgM de obicei sunt absenţi,
iar IgG trebuie să prezinte o creştere în dinamică a titrului pentru fi semnificativă.
6. Metode de biologie moleculară: PCR evidenţiază cu o specificitate şi
sensibilitate de peste 99% atât ADN viral cât şi ARN-m viral. Pot fi folosite
pentru HSV, VZV, CMV, HHV-8. Detectează genomul latent şi virionul
infecţios. Prezenţa ARN-m semnifică replicarea virală activă.
Diagnostic de laborator în mononucleoza infecţioasă
1. Diagnostic hematologic
Mononucleoza se caracterizează printr-o importantă reacţie leucocitară,
numărul de leucocite avriind între 8 000 şi 20 000/mm 3 , în care ponderea
monocitelor poate ajunge la 97%, caracteristice, mari, cu citoplasma şi
nucleul cu aspect vacuolizat. Se asociază scăderea valorilor hemoglobinei
şi a numărului de trombocite
2. Diagnostic serologic
Testele serologice reprezintă metoda de elecţie pentru diagnosticul
infecţiei primare. La pacienţii cu simptomatologie sugestivă pentru
mononucleoză şi testul Paul- Bunnell pozitiv nu mai face necesară nici o
testare suplimentară.
Truse pentru reacţia de hemaglutinare, RFC sau E.L.I.S.A. pun în
evidenţă anticorpii heterofili Paul-Bunnell.
 Capitolul XXI
DIAGNOSTICUL HEPATITELOR VIRALE

Virusurile hepatitice sunt virusuri cu structuri diferite care se caracterizează

prin tropism pentru celula hepatică, fiind denumite: Virusul hepatitei A, B, C, D,
E, F, G, etc.
Există şi alte virusuri care afectează în mod secundar ficatul ( virusuri
facultativ hepatotrope): enterovirusuri, herpesvirusuri, flavivirusuri, etc.
Virusurile hepatitei A, E şi F se transmit enteral

VIRUSUL HEPATITEI A ( HAV)

Clasificat ca Enterovirus tip 72, în prezent este considerat prototipul genului
heparnavirus, din familia Picornaviridae. Virus ARN, cu dimensiuni de 27-32
nm, formă sferică, simetrie eicosaedrică, neînvelit. Există un singur serotip.
Transmiterea este pe cale fecal-orală.

Diagnosticul etiologic se pune de obicei prin evidenţierea anticorpilor anti-

HAV de tip IgM, care atestă infecţia recentă. Anticorpii anti HAV de clasă igG
persistă în ser ani de zile, arătând o infecţie HAV în antecedente.
Virusul ca atare, sau Ag HAVpoate fi demonstrat în materiile fecale şi sânge
2 săptămâni înainte şi o săptămână după instalarea icterului.

Fig. XXI.1. Dinamica anticorpilor în infectia cu Virusul hepatitei A

 VIRUSUL HEPATITEI B ( HBV)
HBV face parte din genul hepadna virus, fiind un virus ADN, învelit. Se
prezintă la microscopul electronic sub trei forme morfologice:
- virusul complet sau particula Dane, cu formă sferică şi dimensiuni de 42nm,
cu o anvelopă glico-lipo-proteică ce prezintă la suprafaţă Ag HBs ( hepatitis
B surface antigen).
- Particule globulare cu diametru de 22 nm, şi
- Particule filamentoase cu grosimea de 22 nm, alcătuite exclusiv din Ag HBs.

Fig.XXI.2. Aspecte morfologice ale Virusului hepatitei B- imagine de microscopie

electronică ( Jawets, Melnick & Adelberg)

Nucleocapsida, după îndepărtarea anvelopei, prezintă Ag HBc ( antigenul

central, sau core antigen). Prin clivarea ( liza parţială) a Ag HBc, rezultă antigenul
Hbe.
Transmiterea se face pe cale parenterală, sexuală şi verticală, de la mamă la nou
născut.
Diagnosticul etiologic se pune prin evidenţierea markerilor serologici ( antigene şi
anticorpi), a căror succesiune indică şi faza evolutivă a bolii.
- Ag HBs apare încă din perioada de incubaţie şi ar trebui să dispară la 3 - 6
luni de la infecţie . Persistenţa Ag HBs peste 6 luni indică hepatita
cronică B
- Ag Hbe indică replicarea activă a virusului în hepatocit şi are un pronostic
defavorabil
- Ag HBs nu poate fi detectat în ser.
- Anticorpii anti HBc, sunt primii anticorpi care apar. IgM anti HBc indică o
infecţie recentă, activă. IgG anti HBc pot persista multă vreme după
vindecare, demonstrând trecerea prin boală.
- Anticorpii anti Hbe apar la sfârşitul perioadei acute a bolii, şi împreună cu
dispariţia Ag Hbe, arată evoluţia favorabilă, spre vindecare.
- Anticorpii anti Hbs apar tardiv, la 4-6 luni. Arată vindecarea ( simultan cu
dispariţia AgHBs), persistând toată viaţa.
 Fig.XXI.3. Dinamica anticorpilor în infecţia cu Virusul hepatitei B

Fig.XXI.4. Dinamica anticorpilor în hepatita cronică B

VIRUSUL HEPATITEI C

VIRUS ARN din familia Flaviviridae.

Se transmite predominent parenteral şi pe cale sexuală.
Diagnosticul de laborator se face pe baza evidenţierii în serul bolnavilor a
Ac anti HCV, cel mai utilizate fiind testele rapide imunocromatografice, metoda
ELISA şi chemiluminiscenţa. Anticorpii IgM anti-HCV semnifică infecţia recentă.

Fig.XXI.5. Test rapid imunocromatografic pentru Ac anti-HCV

Depistarea ARN-VHC şi cuantificarea prin măsurarea încărcării virale se

face prin biologie moleculară.: tehnica PCR
 Virusul hepatitei D ( delta)
Este un virus incomplet ( viroid), format dintr-o moleculă foarte mică de
ADN circular. Pentru a deveni infecţios are nevoie de învelirea în Ag HBs.( deci
prezenţa acestui antigen în serul bolnavului)
Transmiterea se face pe cale parenterală
Coinfecţia HBV+HDV determină o evoluţie gravă a hepatitei.
Infecţia D la un purtător de Ag HBs ( superinfecţia) creşte riscul cronicizării.
 Capitolul XXII
DIAGNOSTICUL INFECTIEI HIV

Posibilităţile actuale de diagnostic includ:

Detecţia directă şi indirectă a virusului HIV

- Izolarea şi cultivarea virusului
- PCR
- Hibridizarea in situ
- ELISA pentru antigenul p24
- Imunofluorescenţa indirecta

Detecţia anticorpilor anti HIV

- Teste rapide imunocromatografice
- ELISA pentru detecţia anticorpilor
- Imunofluorescenţa indirectă
- Immunoblotting ( Western-Blot)

Detecţia anticorpilor specifici se poate realiza doar după 6-8 săptămâni de la

contactul infectant, moment în care se produce seroconversia – apariţia în serul
pacientului a anticorpilor anti-HIV.
Viremia durează în majoritatea cazurilor până cu o săptămână înaintea
apariţiei anticorpilor.
In perioada de fereastră imunologică, virusul este prezent în sângele celui
infectat, acesta putând transmite infecţia pe căile enunţate mai sus, dar nu poate fi
diagnosticat prin metode serologice.

Testele standard pentru diagnosticul infecţiei HIV sunt testele serologice

pentru detecţia anticorpilor anti-HIV1 şi HIV2, teste care în prezent au o foarte
bună sensibilitatea şi specificitate: fie prin metoda ELISA (indirectă, competitivă,
sandwich), fie teste rapide imunocromatografice.
Testul standard de confirmare a infecţiei HIV este Western-Blot, folosit
pentru soluţionarea rezultatelor incerte obţinute prin metodele precedente.
Fig. XXII.1. Posibilitati de diagnostic serologic in HIV prin metoda ELISA

Fig.XXII: 2. Test rapid imunocromatografic pentru Ac anti HIV1 si HIV2

Fig.XXII:3. Teste ELISA de generaţia a IV-a

 Fig.XXII.4. Rezultatele unor teste Western-Blot

Testele pentru antigene şi detecţia virusului

Antigenele (antigenului p24) pot fi detectate în fazele timpurii ale infecţiei HIV,
înainte de apariţia anticorpilor, precum şi în fazele finale ale infecţiei. În faza latentă
nu pot fi detectate, datorită formării complexelor Ag-Ac
Prezenţa virusului în sânge poate fi demonstrată prin metoda PCR pentru ADN pro-
viral şi RT- PCR pentru ARN viral .
Izolarea virusului poate fi făcută în culturi de celule ( limfocitele pacientului
cultivate împreună cu celule din sânge periferic proaspăt de la donatori sănătoşi) sau
pe linii celulare de limfom T. Cultivarea virusului este o metodă scumpă, laborioasă,
folosită numai în cercetare.

Diagnosticul serologic al infecţiei HIV la nou-născuţii din mame

infectate HIV nu poate fi stabilit prin teste uzuale. Anticorpii se transmit
transplacentar de la mamă la făt şi persistă în sângele nou-născutului până la 18
luni. Determinarea AND sau ARN viral sau a anticorpilor Ig A anti-HIV, care nu
traversează placenta reprezintă metode de diagnostic utile pentru copiii până la 18
luni.
Testele cu valoare prognostică cele mai sugestive sunt
1. Prezenţa antigenelor HIV;
2. Numărarul de limfocite CD4 – oferă indicii despre stadiul bolii;
3. Neopterina
4. β2-microglobulina
5. încărcarea virală - testul cu cea mai mare valoare prognostică şi de
monitorizare a terapiei; se determină ARN viral prin metoda RT-PCR
cantitativ
Bibliografie selectivă

1. Ballows, A., Haissler W. J., Herrmann, K., Isenberg H.D., Shadomy H.G.,
Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, American Society of
Microbiology, Washington, D.C., 1992
2. Barousse MM, Van Der Pol BJ, Fortenberry D, et al: Vaginal yeast
colonisation, prevalence of vaginitis, and associated local immunity in
adolescents. Sex Transm Infect 2004 Feb; 80(1): 48-53
3. Barbeyrac B -Université Victor Ségalen, Bordeaux 2, Centre National de
Référence des Infections à Chlamydia- Chalmydia. Cours de bacteriologie
medicale, 2003
4. Buiuc, D. Microbiologie Medicalã , Ed. Didacticã şi Pedagogicã, Bucureşti
–1992
5. Buiuc D., Neguţ M., Tratat de Microbiologie Clinică, Ed. Medicală,
Bucureşti, 1999
6. Callahan DB, Weinberg M, Gunn RA: Bacterial vaginosis in pregnancy:
diagnosis and treatment practices of physicians in San Diego, California,
1999. Sex Transm Dis 2003 Aug; 30(8): 645-9
7. Cârstina D, Saşcă IC, Saşcă N, Laza-Stanca V, Tifrea D, Slavcovici A,
Saşcă F. E-test, diluţii în mediu solid şi tehnica difuzimetrică în aprecierea
rezistenţei stafilocilor la bata-lactami. Bacteriologia, Virusologia,
Parazitologia, Epidemiologia, 2001, vol.46 nr.4, 213-218.
8. Codiţă I., Israil A., Balotescu C., Popa M., Testarea rezistenţei la antibiotice:
standard NCCLS sau CA-FM ? Comunicare , Reuniunea anuală de
microbiologie, Timişoara, 2003.
9. Hammill HA: Normal vaginal flora in relation to vaginitis. Obstet Gynecol
Clin North Am 1989 Jun; 16(2): 329-36
10. Jawetz, Melnick , Adelberg – Medical microbiology, Lange Ed. 1991.
11. Lenette E., Ballows A., – Manual of Clinical microbiology, Am. Society of
Microbiology, Washington D.C., 1993.
12. Murray P.R., Kobayashi G.S., Pfaller, M.A., Rosenthal K., Medical
Microbiology, Second Edition, 1994, Mosby-Year Book Inc., Missouri
13. Popa C. E-Test – o nouă metodă pentru testarea rezistenţei la substanţe
antimicrobiene. Bacteriologia, virusologia, parazitologia, epidemiologia,
vol.44, nr.1-2, 1999, p.127-130.
14. Popa, M.I. Diagnosticul de laborator în microbiologie, Ed. INFOMEDICA,
Bucureşti, 2004
15. Sobel JD, Chaim W, Nagappan V, Leaman D: Treatment of vaginitis caused
by Candida glabrata: use of topical boric acid and flucytosine. Am J Obstet
Gynecol 2003 Nov; 189(5): 1297-300
16. Valenti W.M. – AIDS 25 zears later: monitorizing HIV testing. AIDS Read.
2006 Sept: 16 (9). 461-3.
17. Weber B, Orazi B, Rainieri A, Thorstensson R, Burgisser P Multicenter
evaluation of a new 4th generation HIV screening assaz Elecsys HIV combi.
Clin Lab. 2006: 52( 9-109: 463-73.