Universitatea Națională de Știință și Tehnologie
Politehnica București
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ
BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA
- CURS 3 -
Conf. Dr. ing. Adriana Lungu
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
D.A. Puleo and R. Bizios (eds.), Biological Interactions on Materials Surfaces, DOI
10.1007/978-0-387-98161-1_1, LLC 2009
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Adsorbţie ireversibilă
→ DENATURARE PROTEINE
!! Proteinele se “desfasoara”, isi pierd
structura cuaternara, tertiara sau secundara:
in consecinta proteinele isi pierd
functia normala (rolul biologic)
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Activitatea proteinelor difera in stare adsorbita vs. stare solvata
Functia proteinelor adsorbite:
1. este dependenta de concentratie:
Concentratie mare de proteine adsorbite la biomaterial
→ adeziune celulara crescuta
2. ca urmare a accesului la “secventele active” de aa →
se modifica reactivitatea proteinelor
↑ sau ↓ capacitatea de legare cu biomaterialul
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
ex1. Fibrinogenul:
Trombocitele adera la material atunci cand fibrinogenul este adsorbit la
biomaterial, nu si cand fibrinogenul este in solutie (!)
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
ex2. Fibronectina:
Functie de orientarea proteinei dupa adsorbtia la biomaterial, secventa de aa RGD este
sau nu disponibila pentru a-si exercita functia sa de adeziune celulara.
N. Matsui et al. / Materials Science and Engineering C 48 (2015) 378–383
Secventa RGD influenteaza semnificativ BIOCOMPATIBILITATEA.
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Factori care influenteaza interactiile proteine – suprafete:
1. proprietati ale proteinelor
2. proprietati ale suprafetei biomaterialului
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
1. Proprietati ale proteinelor:
Interactiile proteine – suprafata biomaterial se realizeaza prin:
✓ interactiuni hidrofobe: intre domenii nonpolare / polare
✓ legaturi ionice: intre molecule incarcate pozitiv si molecule incarcate negativ
Proprietatile proteinelor depind de:
- structura primara (compozitia in
aminoacizi)
- gruparile functionale disponibile
pentru formarea de interactiuni
cu dispozitivul
Biosensors 2019, 9, 15
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Prevalenta legaturilor proteine /biomaterial este semnificativ influentata
de proprietatile proteinelor:
hidrofilicitate / domeniile polare (hidrofile) ale proteinelor tind sa
hidrofobicitate adsoarba la suprafete polare; domeniile hidrofobe
tind sa adsoarba la suprafete hidrofobe
proteinele mai mici difuzeaza mai rapid si ajung la
dimensiune material mai repede; proteinele mari formeaza mai
multe “contact points” cu suprafata materialului
proteinele incarcate cu o anumita sarcina
sarcina electrica
electrica adsorb preferential pe suprafete
incarcate cu sarcina electrica opusa
stabilitate structurala / proteinele care sunt mai putin stabile structural
rigiditate au o tendinta mai mare de “unfolding”
(desfasurare), adsorb la suprafata materialului si Dee K. C., Puleo D. A.& Bizios
R.. 2002Tissue–biomaterial
formeaza mai multe “contact points” cu materialul interactions. New Jersey, NJ: John
Willey and Sons.
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
2. Proprietati ale suprafetelor: chimia materialului & topografie
Chimia materialului:
- compozitie chimica
& sarcina electrica
- hidrofilicitate
Topografie:
- aria suprafetei
- morfologie
- rugozitate
Progress in Materials Science 106 (2019) 100588
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
2.a) Compozitia chimica - tipuri de grupari functionale
Grupare functionala Proprietati Efect asupra proteinelor
-CH3 neutra; hidrofoba (nepolara) afinitate mare pentru fibrinogen;
realizeaza legaturi puternice cu IgG
-OH neutra; hidrofila afinitate scazuta pentru proteinele plasmatice
-NH2 pozitiva; hidrofila (polara) afinitate crescuta pentru fibronectina
-COOH negativa; hidrofila afinitate crescuta pentru fibronectina si albumina
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
2.b) Hidrofilicitate:
ENERGIA LIBERA DE SUPRAFATA (surface free energy (SFE)) guverneaza fortele de
interactie (hidrofobe / hidrofile si electrostatice) intre proteine si suprafete
SFE determina afinitatea suprafetei pentru
apa care este evaluata prin determinarea
unghiului de contact cu apa:
Suprafete hidrofobe > 90°
Suprafete hidrofile < 90°
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Hidrofilicitate:
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
- moleculele de apa de pe suprafetele hidrofile impiedica realizarea de interactii
puternice intre proteine si suprafete, permitand mentinerea proteinelor in
conformatia nativa → suprafetele foarte hidrofile sunt “respingatoare” pentru
proteine (NU permit adsorbtia proteinelor din solutii apoase)
- suprafetele hidrofobe permit adsorbtia
proteinelor si implicit denaturarea acestora
→ suprafetele foarte hidrofobe pot
denatura ireversibil proteinele, acestea
nu-si mai pot exercita functia biologica
M. Rabe et al. / Advances in Colloid and
Interface Science 162 (2011) 87–106
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
O suprafata optima pentru aderarea celulelor permite o adsorptie suficienta a proteinelor.
Hidrofilicitatea materialelor are cel mai important rol:
unghi de contact intre 70 and 80° (hidrofilicitate moderata) → proliferare optima fibroblaste
unghi de contact ~ 40° este ideal pentru celulele endoteliale (deci hemocompatibilitate)
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Topografia suprafetelor si Rugozitatea:
Rugozitatea suprafetelor creste aria suprafetei multiplicand “cantitatea” de grupari chimice
accesibile la contactul cu fluidul biologic, fapt ce conduce la cresterea hidrofobicitatii / sau
hidrofilicitatii pre-existente a materialului.
Water contact angle=WCA
Materialele polimerice vor deveni mai hidrofobe cu cat rugozitatea suprafetelor este mai mare
Progress in Materials Science 106 (2019) 100588
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Tipurile de interactiuni care determina biocompatibilitatea unui material difera
functie de scala de rugozitate:
- Rugozitatea micrometrica – imbunatateste adsorbtia proteinelor la material
- Rugozitatea submicronica – influenteaza activitatea celulara
- Rugozitatea nanometrica – influenteaza semnificativ interactiile proteinelor
Adsorbtia proteinelor la suprafata biomaterialelor - continuare
Raspunsul unui biomaterial plasat in mediu biologic - REZUMAT
3 componente:
1. Absorbtie molecule de apa la suprafata materialului (cateva nanosecunde)
2. Adsorbtia proteinelor la suprafata materialului – este general acceptat faptul ca proteinele mici vor fi
primele adsorbite mai rapid; in timp, acestea sunt inlocuite de proteine mai mari cu o afinitate mai mare
pentru suprafete
!!! Hidrofilicitatea influenteaza adsorbtia proteinelor: un biomaterial cu o hidrofilicitate moderata imbunateste
adeziunea celulara si creste biocompatibilitatea. Adeziunea celulara scade atunci cand materialul devine
foarte hidrofil.
!!! este importanta rugozitatea nanometrica
3. Adeziunea celulelor la suprafata biomaterialului –
aceasta etapa este influentata de stratul de proteine adsorbite
si respectiv de topografia / rugozitate suprafetei
!!! este importanta rugozitatea micrometrica
[Link]
Rezumat CURS 3
BIOMATERIAL MEDIU BIOLOGIC
Influenta biomaterialului asupra mediului biologic. Raspunsul gazdei
1. interactii sange / ECM si biomaterial - continuare
2. raspuns inflamator
3. infectii
4. tumorigeneza
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza
Metode de evaluare a adsorbtiei proteinelor la un biomaterial:
✓ monitorizeaza adsorbtia proteinelor la suprafata materialelor (tehnici directe)
✓ ofera informatii indirecte asupra adsorptiei proteinelor (tehnici indirecte)
ex. evaluarea umectabilitatii unui material (hidrofobicitate/hidrofilicitate)
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza
1. Tehnici de marcare
- izotopi radioactivi (125I) care reactioneaza cu resturi de aa specifici: ex. tirozina
- fluorescenta (ex. izotiocianat de fluoresceina) Se leaga covalent de grupari amino
- coloranti histologici uzuali (ex. sistem: hematoxilin-eozina)
hematoxilina – coloreaza nucleii in albastru
eozina – coloreaza citoplasma/colagen in roz
[Link]
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza
2. Microbalanta cu cristale de cuart (quartz crystal microbalance, QCM)
✓ metoda cu o inalta sensibilitate datorita intrucat detecteaza modificari in masa probei la nivel
de nano-grame
✓ este o tehnica acustica ce masoara modificari in
masa adsorbita pe suprafata unui cristal
piezoelectric de cuart
Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 8004 – 8032
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza - continuare
3. Cromatografia de excludere a masei moleculare
Principiul metodei: se bazeaza pe diferentele dintre masele moleculare ale proteinelor
Un amestec de proteine este aplicat in partea superioara a unei coloane ce contine particule poroase.
Proteinele cu masa moleculara mica pot fi adsorbite pe aceste particule iar moleculele mari nu.
amestec de proteine supus separarii
Coloana cromatografica !! proteinele mai mari trec mult mai rapid (sunt eluate primele)
a) b) prin coloana. Proteinele ramase sunt eluate in ordinea
descrescatoare a masei lor moleculare
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza - continuare
4. Determinari spectroscopice:
Spectroscopie în infraroşu (FT-IR)
- ofera informatii despre structura secundara a proteinelor
atat in solutie apoasa cat si in stare adsorbita pe baza benzilor de adsorbtie
caracteristice pentru benzile amida I si II (specifice pentru gruparile amida din
proteine) care apar intre 1500 - 1700 cm-1
- aceste benzi sunt cele mai sensibile moduri vibrationale pentru a
determina continutul de forme α si β (α helix si β sheet)
hemoglobina bovina adsorbita (curba albastra)
proteina in stare nativa (curba rosie);
diferenta intre cele doua spectre este extrasa si prezentata separat
(curba neagra); se pot observa modificari in structura secundara
Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 8004 – 8032
Evaluarea adsorbtiei proteinelor. Metode de analiza - continuare
4. Determinari spectroscopice:
✓spectroscopie de fotoelectroni cu raze X (XPS): se urmareste cresterea semnalului N1s
✓ elipsometrie spectroscopica: determina grosimea stratului proteic (uscat) adsorbit la
suprafata unui material (proteinele adsorbite modifica indicele de refractie al materialului)
✓ spectroscopie de dicroism circular (CD) – masoara si gradul de denaturare al proteinelor
✓ rezonanta plasmonilor de suprafata (SPR)
Analiza biocompatibilitatii trebuie realizata prin tehnici diferite,
complementare, deoarece au sensibilitate si specificitate diferita
MULTUMESC!
