Universitatea de Medicin i Farmacie Gr.T.

Popa Iai Facultatea de Medicin Disciplina de Biologie Celular i Molecular Disciplina Fiziopatologie

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

STUDIUL MODIFICRILOR CELULARE I MOLECULARE LA NIVELUL TEGUMENTULUI N DIABETUL EXPERIMENTAL

Conductori tiinifici: Prof. Univ. Dr. Carmen Elena COTRUTZ Prof. Univ. Dr. Magda BDESCU

Doctorand: Dr. ahian Luana Mihaela

-2012-IAI1

CUPRINS INTRODUCERE .............................................................................................. 5 STADIUL CUNOATERII CAPITOLUL I. DATE GENERALE PRIVIND STRUCTURA I FUNCIILE TEGUMENTULUI .... 8 I.1. Consideraii generale ..... 8 I.2.Aspecte celulare i moleculare ale tegumentului n diabet .... 27 CAPITOLUL II. ELEMENTE DE FIZIOPATOLOGIE A DIABETULUI I COMPLICAIILE ACESTUIA .. 30 II.1. Diabetul: definiii i prezentare . 30 II.2. Speciile reactive de oxigen .. 34 II.2.1. Tipuri de radicali liberi ai oxigenului 36 II.2.2. Surse de producere a radicalilor liberi de oxigen ..... 36 II.2.3. Metode de detecie i cuantificare a radicalilor liberi .. 37 II.2.4. Mecanisme de aciune a radicalilor liberi . 37 II.2.5. Peroxidarea lipidic a acizilor grai polinesaturai din membranele celulare ... 40 II.3. Principiile sistemelor antioxidante ........ 43 CAPITOLUL III. MANIFESTRI CUTANATE SPECIFICE DIABETULUI . 44 III.1. Date generale i manifestri cutanate specifice n diabet .. 44 III.1.1. Manifestri cutanate produse prin alterri vasculare 47 III.1.2. Manifestri cutanate, asociate diabetului, fr a fi strict legate cauzal de diabet, dar care recunosc ntre factorii favorizani o glicemie crescut . 51 III.1.3. Infecii cutanate .. 54 CONTRIBUII PERSONALE CAPITOLUL IV. METODOLOGIA CERCETRII ..... 57 IV.1. CONSIDERAII GENERALE ............................................................ 57 IV.2. MOTIVAIA ALEGERII TEMEI ...................................................... 58 IV.3. SCOPUL I OBIECTIVE .................................................................... 58 IV.3.1. Scopul studiului ...................................................................... 58 IV.3.2. Obiectivele cercetrii .............................................................. 58 IV.4. IPOTEZE DE STUDIU ........................................................................ 59 IV.5. MATERIAL I METOD ................................................................... 59 IV.5.1. Material ................................................................................... 59 IV.5.2. Metod ..................................................................................... 60 CAPITOLUL V. STUDIUL PARTICULARITILOR CELULARE I MOLECULARE LA NIVELUL TEGUMENTULUI N DIABETUL EXPERIMENTAL .......................................................................................... 87 V.1. INTRODUCERE ........................................................................ 87 V.2. SCOPUL STUDIULUI ............................................................... 87 2

V.3. OBIECTIVELE SPECIFICE ALE CERCETRII ................ 87 V.4. MATERIAL I METOD ......................................................... 87 V.5. REZULTATE .............................................................................. 88 V.5.1. Aspecte morfologice ale tegumentului n diabetul indus experimental 90 V.5.2. Aspecte evideniate folosind tehnici de imunohistochimie i imunofluorescen . 100 V.5.3. Elemente de ultrastructur evindeniate prin microscopie electronic de transmisie 105 V.6. DISCUII .................................................................................. 118 V.7. CONCLUZII ALE STUDIULUI MORFOLOGIC ... 122 CAPITOLUL VI. STUDIUL STRESULUI OXIDATIV N DIABETUL ZAHARAT EXPERIMENTAL ................................................................... 124 VI.1. INTRODUCERE ..................................................................... 124 VI.2. SCOPUL STUDIULUI ........................................................... 124 VI.3. OBIECTIVELE SPECIFICE ALE CERCETRII ............. 125 VI.4. MATERIAL I METOD ..................................................... 125 VI.5. REZULTATE ......................................................................... 127 VI.6. DISCUII ................................................................................. 140 VI.7. CONCLUZII FINALE ALE STUDIULUI BIOCHIMIC ... 149 CAPITOLUL VII. CONCLUZII FINALE ................................................ 151 ABREVIERI .................................................................................................. 154 BIBLIOGRAFIE ........................................................................................... 155 LISTA LUCRRILOR STIINIFICE PUBLICATE .............................. 170

Motivaia studiului Diabetul zaharat a devenit o problem de importan major pentru individ, medicin i societate. Aceasta pentru c este o boal frecvent, perfid, de lung durat i devastatoare dac nu este bine ngrijit. Impactul su este, deci, multiplu: epidemiologic, biologic, socio-familial, economic i politic. Diabetul exist la toate naiile, n toate nivelele societii, la sraci i la bogai, la negri i albi, la cei foarte educai i la cei needucai, la cei religioi i atei, la politicieni faimoi i la persoane necunoscute, fr adpost. Toi acetia, n ciuda imenselor diferene dintre ei, au nevoie de un minim de ngrijire a bolii, de educaie i suport (6). Se estimeaz c n anul 2006 n lume erau 264 milioane persoane cu diabet, imensa majoritate (peste 90%) fiind de tip 2. n 1995 prevalena diabetului era de 135 milioane, predicia pentru anul 2025 fiind de 380 milioane, ceea ce demonstreaz o dinamic impresionant a creterii (4). Creterea cea mai impresionant se nregistreaz n rile n curs de dezvoltare. Datele de prevalen a diabetului trebuie raportate la grupele de vrst ale populaiilor. Astfel, n rile dezvoltate, creterea frecvenei se noteaz la populaia vrstnic (>=65 ani), n timp ce n rile n curs de dezvoltare, creterea apare la grupa adult (45-64 ani), adic exact perioada de maxim productivitate. Pentru societate aceasta are consecine dintre cele mai nefavorabile. n 2007, prevalena diabetului zaharat tip 2 la adulii cu vrste ntre 20-79 ani era de 7.3%. n Romnia, nu exist date actuale referitoare la frecvena populaional a diabetului. Se tie c, n anul 2005, existau aproximativ 450.000 persoane nregistrate cu aceast boal i c, probabil, un numr similar, dac nu mai mare, erau nediagnosticate, ceea ce face ca numrul real s se apropie de un milion. ncepnd din vara anului 2007, prin iniierea i derularea Programului Naional de evaluare a Strii de Sntate a Populaiei, numrul persoanelor cu diabet zaharat tip 2 i cu glicemie bazal modificat a crescut de 2-3 ori comparativ cu aceeai perioad a anului precedent. Nu doar numrul mare de persoane cu diabet zaharat este ngrijortor, ci i prevalena crescut a glicemiei bazale modificate, care la nivel mondial este n jur de 8.2%, estimndu-se o cretere la 9.0% pn n 2025. Se poate, deci, considera c diabetul zaharat a devenit o boal epidemic, evolund n paralel cu epidemia de suprapondere/obezitate. Impactul biologic al diabetului este considerabil. El este evaluat prin reducerea speranei de via (creterea mortalitii), scderea speranei de sntate prin afectarea calitii vieii, datorit complicaiilor acute, dar mai ales a celor cronice. Mortalitatea specific diabetului este subevaluat datorit incorectitudinii completrii certificatelor de deces. Prima estimare global a mortalitii datorate diabetului a fost publicat n anul 2005 i a demonstrat c diabetul reprezint a 5-a cauz de mortalitate la nivel mondial, fiind responsabil pentru 5.2% din totalul deceselor. Rezultatele sunt cu att mai alarmante cu ct pn la 275 dintre decesele nregistrate la adulii cu vrste cuprinse ntre 35-64 ani au fost atribuite diabetului zaharat. Prevalena complicaiilor cronice i a condiiilor asociate n diabet este impresionant. Aproape o treime dintre pacienii diabetici au un anumit tip de manifestare cutanat, iar cu timpul, pielea tuturor pacienilor diabetici este afectat ntro form sau alta. n general, manifestrile cutanate ale diabetului apar dup dezvoltarea bolii, dar pot reprezenta i primele semne sau chiar pot preceda cu civa ani manifestrile afeciunii primare. Prevalena afectrilor cutanate nu pare s difere ntre pacienii cu diabet zaharat de tip 1 i 2. Cu toate acestea, s-a constatat faptul c 4

pacienii cu diabet zaharat de tip 2 dezvolt mai frecvent leziuni ale pielii asociate cu infeciile, pe cnd pacienii cu diabet zaharat de tip 1 prezint adesea leziuni cutanate de tip autoimun. Constatnd o cretere a prevalenei diabetului zaharat la nivel mondial, fapt ce i confer acestuia, la ora actual, un caracter epidemic, ce solicit peste tot n lume cheltuieli imense din partea sistemelor de sntate, scopul acestei teze de doctorat este acela de a sublinia importana cunoaterii ndeaproape a diabetului zaharat i a implicaiilor acestuia, cu referire mai ales la modificrile celulare i moleculare aprute la nivelul tegumentului diabeticului. Ca urmare a impactului multiplu al diabetului zaharat: epidemiologic, biologic, socio-familial, economic i politic, am decis efectuarea acestui studiu experimental, n ncercarea de a contura noi concluzii cu privire la complicaiile tegumentare ale acestei afeciuni. TEZA DE DOCTORAT cuprinde un numr de 170 pagini (56 pagini STADIUL CUNOATERII i 114 pagini CONTRIBUII PERSONALE) i include un numr de 19 tabele i 64 figuri. BIBLIOGRAFIA conine un numr de 315 referine din literatura de specialitate.

EXPERIMENTELE AU RESPECTAT LEGISLAIA N VIGOARE I REGULAMENTUL COMISIEI DE ETIC A UNIVERSITII Toate procedeele experimentale, pe animale, folosite n acest studiu au fost n strict concordan cu reglementrile etice internaionale. La terminarea studiului, animalele au fost eutanasiate dup anestezie i.p. cu ketamin 40 mg/kg corp i pentobarbital 20 mg/kg corp. S-a provocat o moarte rapid, lipsit de suferin prin exanginare dup puncie intracardiac. La constatarea absenei semnelor vitale (micri respiratorii, btile cordului, reflexe) animalele au fost disecate pentru recoltarea fragmentelor de tegument (Andrews E.J., Protocolul AVMA de Eutanasiere, 1993).

METODE DE PRELUCRARE I INTERPRETARE STATISTIC A REZULTATELOR Datele rezultate din studiu au fost prelucrate cu ajutorul programelor de statistic medical SPSS (versiunea 13.0), EPIINFO - versiunea 6 i Excel XP. Prelucrarea primar, respectiv sistematizarea datelor prin centralizare i grupare, au condus la obinerea indicatorilor primari, care se prezint sub form de mrimi absolute. Pe baza indicatorilor primari, prin diferite procedee statistice de comparare, abstractizare i generalizare s-au obinut indicatorii derivai. Indicatorii derivai au rolul de a evidenia aspectele calitative ale unui ansamblu, viznd relaia dintre diferite pri ale unui grup de pacieni sau diferite caracteristici, legturi de interdependen dintre variabile. S-au folosit urmtorii indicatori derivai: - indicatori ai valorii medii: media aritmetic simpl, media ponderat, mediana, modulul; - indicatori ai dispersiei: deviaia standard, variaia. 5

n calculul diferenei semnificative dintre dou medii, testul ine cont de msurarea variabilitii i ponderea observaiilor. Testul t-Student calculeaz un t pe baza mediei i abaterii standard pentru fiecare lot n parte, n funcie de numrul gradelor de libertate (GL). Plecnd de la ipoteza nul, care presupune c ntre grupurile studiate nu exist nici o diferen, calculnd valoarea lui t i comparndu-l cu t tabelar, dac valoarea calculat este mai mare dect cea tabelar atunci ipoteza nul este respins, iar diferena este declarat semnificativ statistic. Prelucrarea statistic a datelor se va efectua folosind media aritmetic, abaterea standard (DS), coeficientul de variabilitate (%). Pentru prelucrarea statistic a datelor s-a utilizat testul t-Student folosind programul de calcul Microsoft Excel 1997. Pragul de semnificaie unanim acceptat este de 95% adic p=0,05. Cu ct valoarea lui p este mai mic dect aceast valoare cu att semnificaia este mai puternic. I nterpretarea statistic a datelor a considerat diferenele corespunztoare pentru un prag de semnificaie: - p>0,05 statistic nesemnificative; - p<0,05 semnificative statistic; - p<0,01 puternic semnificative statistic; - p<0,001 foarte puternic semnificative statistic. Testul 2 Pentru aprecierea diferenelor statistice dintre loturi i/sau parametri analizai sa folosit testul 2. Testul 2 este un test neparametric care compar 2 sau mai multe repartiii de frecvene provenite din aceeai populaie, se aplic cnd evenimentele ateptate se exclud. Uneori cnd o frecven din formula de calcul este mic, se aplic Yates pentru corecia formulei, pentru a obine o estimare mai mare a diferenei. Dac p obinut este mai mic dect cel tabelar la pragul de semnificaie de 95%, evenimentele nu se exclud - n acest caz se pune problema dac sunt dependente. Coeficient de corelaie Pearson (r) are valori cuprinse ntre -1 i 1. Cu ct valoarea lui r este mai apropiat de 1 (corelaie direct) sau de -1 (corelaie indirect) parametri sunt dependeni unul de altul. Studiul corelaiei dintre diferite fenomene s-a realizat cu ajutorul coeficientului de corelaie r (Pearson). Acesta red att intensitatea legturilor statistice ct i sensul acestora. Valorile coeficientului de corelaie sunt cuprinse ntre (-1, +1): - dac coeficientul de corelaie tinde spre +1, exist o dependen liniar foarte mare a fenomenelor, corelaie direct; - dac coeficientul de corelaie tinde ctre 1, exist de asemenea o dependen foarte mare a fenomenelor, corelaie invers; cu ct coeficientul de corelaie se apropie mai mult de 0, cu att intensitatea legturii este mai mic. Coeficientul de variaie (CV%) evideniaz abaterea procentual dintre dou medii, oferind rezultate asupra omogenitii seriei de valori. Testul F ntoarce probabilitatea uni-alternativ c varianele din seria1 i seria2 nu sunt semnificativ diferite. Se utilizeaz aceast funcie pentru a determina omogenitatea celor dou eantioane.

Modelul experimental de diabet streptozotocinic Pentru obinerea datelor redate n aceast tez, am folosit modelul experimental de diabet streptozotocinic, perfecionat i utilizat de ctre disciplina de fiziopatologie a Universitii de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa, Iai, sub ndrumarea doamnei Prof. Univ. Dr. Magda Bdescu. Cercetarea s-a efectuat pe obolani albi Wistar, aduli de ambele sexe cu greutatea medie de 200 g, care au fost grupai cte 12 n 4 loturi. Experimentul a durat 12 sptmni. Cele 4 loturi au fost alctuite dup cum urmeaz: Lot M-m lot martori masculi, animale normale; Lot M-f lot martor, animale femele normale; Lot DZ-m obolani masculi cu diabet realizat prin injectarea de streptozotocin (STZ) 60mg/Kg corp , dizolvat n ser fiziologic, n doz unic, intraperitoneal; Lot DZ-f obolani femele cu diabet realizat prin injectarea de STZ 60mg/Kg corp , dizolvat n ser fiziologic, n doz unic, intraperitoneal; Diabetul a fost obinut prin administrarea de STZ (2-deoxi-2(3-metil-nitrozoureido)-p-glucopiranoz) n doz unic de 60mg/Kg corp, soluie 1% n ser fiziologic, pe cale intraperitoneal (i.p.), rapid, dup un post de 18 ore. Prin administrarea streptozotocinului (antibiotic citotoxic sintetizat de Streptomyces achromonogenes) se declaneaz diabet zaharat (DZ) insulinopriv prin pancreatectomie endocrino-chimic selectiv, distrugndu-se exclusiv celulele insulelor beta-Langerhans ale pancreasului. Metoda are avantajul, fa de pancreatectomia chirurgical, de a respecta pancresul exocrin i, n consecin, de a nu influena procesele digestive. Hiperglicemia permanent diabetic se instaleaz dup 24-48 de ore de la injecia diabetogen i poate fi: definitiv sau poate regresa spontan n cteva zile. obolanii, care au prezentat o stare general alterat, au fost sacrificai n timpul experimentului, iar ceilali la 12 sptmni de la administrarea streptozotocinului. Urmrirea glicemiei obolanilor diabetici s-a fcut n dinamic, utiliznd un glucometru. Toi obolanii au dezvoltat foarte repede diabet zaharat dup administrarea injeciei cu streptozotocin (Tabel nr. I). Concentraiile plasmatice ale glucozei la trei sptmni dup efectuarea streptozotocinului au fost crescute de 3.2 ori fa de cele ale oarecilor martor. O cretere semnificativ a glicemiei a fost observat ncepnd cu a doua zi de la efectuarea injeciei, iar creterea a continuat pn n sptmna a treia. Dup patru sptmni, activitatea transaminazelor la obolanii cu diabet a fost similar lotului de control. Nu a existat nici o cretere n greutate a acestora pe perioada celor 3 sptmni ce au urmat administrrii de streptozotocin.

Tabelul nr 1: Efectele diabetului indus experimental asupra glicemiei i activitii transaminazelor Ziua dup Lotul de control injecie Glicemie TGO 2 zile 2 sptmni 3 sptmni 4 sptmni 2133.5 2143.9 2114.1 2218.7 N N N 221.0 N N N 9.40.6 Lotul la care s-a administrat streptozotocin Glicemie TGO TGP 33722.5 567544.4 68231.2 70933.4 N N N 242.3 N N N 111.2

TGP

Graficul nr 1: Evolutia glicemiei la lotul cu diabet indus experimental comparativ cu lotul martor

Efectele diabetului indus experimental asupra glicemiei i activitii transaminazelor

800 600 400 200 0 Lotul de control

2 zile

2 sptmni

3 sptmni

Lotul de control 4 sptmni

Lotul la care s-a administrat streptozotocin

Sobolanii tratai cu streptozotocin au artat o reducere a conductanei de nalt frecven la nivelul stratului cornos, comparativ cu grupul de control. n contrast, nu exist nici o diferen n ceea ce privete TEWL grupului de control i al grupului la care s-a administrat streptozotocin (n primele 3 sptmni). La trei sptmni dup injecie, conductana de nalt frecven a stratului cornos al animalelor diabetice a reprezentat jumtate din cea a lotului de control. Coninutul n ap al stratului cornos a fost redus semnificativ n acest tip de diabet, ntruct pierderea apei transepidermic rmne neschimbat. Pentru a examina mecanismul care st la baza diminurii hidratrii stratului cornos la obolanii cu diabet indus de streptozotocin, noi am cuantificat aminoacizii de la acest nivel. n grupul diabetic, coninutul n aminoacizi, de fapt, a prezentat o uoar cretere, la 3 sptmni dup administrarea injeciei. Coninutul n aminoacizi, mpreun cu profilagrina epidermic normal procesat a fost fie normal sau crescut n stratul cornos al obolanilor tratai cu streptozotocin. Am analizat, de asemenea, coninutul stratului cornos n lipide n lotul diabetic. ntruct lipidele totale din stratul cornos au fost mai crescute n grupul diabetic dect n 8

cel de control, la 3 sptmni dup administrarea injeciei, coninutul n trigliceride al stratului cornos a fost semnificativ redus dup inducerea diabetului. n contrast, cu coninutul n trigliceride al stratului cornos, nivelurile ceramidelor, colesterolului i acizilor grai au fost mai crescute la grupul diabetic dect n cel de control. Aceast modificare sugereaz faptul c trigliceridele sunt metabolizate anormal la nivelul glandelor sebacee ale oarecilor cu diabet indus experimental. Cu toate acestea, coloraia histochimic a pielii cu ulei rou O nu a artat nici o modificare a numrului glandelor sebacee la oarecii cu diabet indus. Dup 3 sptmni de la inducia diabetului, epidermul lotului diabetic a fost mai subire dect cel al grupului de control. S-a raportat faptul c suprafaa corneocitelor crete n xeroza senil, reflectnd rata turnover-ului epidermic. Suprafaa corneocitelor n grupul diabetic a tins s creasc peste nivelul de control, cu creterea numrului de straturi de corneocite la nivelul stratului cornos. Aceste rezultate au sugerat faptul c turnover-ul celulelor epidermice al oarecilor cu diabet indus a avut o tendin de ncetinire. Aspecte morfologice ale tegumentului n diabetul indus experimental La nivelul tegumentului aparent fr modificri macroscopice, analiza n microscopia fotonic a preparatelor microscopice colorate cu hematoxilin-eozin evideniaz un epiderm cu o grosime medie, creste epiteliale i papile dermice prezente, ct i modificri de tip hipercheratoz, acantoz i fibroza dermului. (Figura 20) Stratul cornos a prezentat o grosime diferit la animalele din lotul experimental, dei fragmentele au fost recoltate din aproximativ aceeai regiune. Astfel, n lotul nostru au fost cazuri n care epidermul a prezentat un strat cornos relativ subire (n curs de descuamare) i cazuri n care acesta avea o grosime evident (Figura 20, Figura21a, Figura 21b, Figura 21c). La nivelul stratului spinos am gsit aspecte evidente de acantoz, cu diferite forme histopatologice: n unele cazuri stratul spinos prezenta o ngroare moderat i creste epiteliale de adncimi diferite (Figura 21b, Figura 22a, Figure 22b, Figura 22c). Am identificat i cazuri cu reducerea evident a keratinizrii, subierea progresiv a epidermului i reducerea numeric a crestelor papilare i a profunzimii acestora la nivelul dermului. n cteva cazuri s-au pstrat numai creste epiteliale izolate printre structurile dermului papilar. La nivelul dermului, n special la nivelul dermului profund am remarcat un important proces de fibroz i hialinizare a colagenului (Figura 21a).

Figura 20: Fragment cutanat (Lot diabetic): hiperkeratoz, hipergranuloz, reducerea crestelor interpapilare, col HE, x100

10

Figura 21a: Fragment cutanat (Lot diabetic): cu celule dispuse pe mai multe straturi i o zon redus la un singur strat, col HE, x100

11

Figura 221b: Fragment cutanat (Lot diabetic): aspect de hiperkeratoz a epidermului, col HE, x100

12

Figura 231c: Fragment cutanat (Lot diabetic): ngroarea stratului cornos, col HE, x100

13

Figura 242a: Fragment cutanat (Lot diabetic): epiderm inegal ngroat, col HE, x100

14

Figura 252b: Fragment cutanat (Lot diabetic): epiderm inegal ngroat, col HE, x100

15

Figura 262c: Fragment cutanat (Lot diabetic): epiderm inegal ngroat, col HE, x100

Aspecte evideniate folosind tehnici de imunohistochimie i imunofluorescen. Am analizat expresia integrinei v6 prin imunohistochimie tehnica PAP, pentru a observa dac expresia acesteia este asociat cu lezarea epidermului prin arsur sau fibroz. La 3 zile dup producerea leziunii, epiteliul a exprimat integrina 6, mai abundent la nivelul celulelor epiteliale bazale. A existat, de asemenea, i o reacie imun pozitiv redus la nivelul membranelor celulare ale celulelor suprabazale. La 7 zile, cnd celulele epiteliale migratorii tocmai s-au unit pentru a acoperi leziunea, celulele epiteliale bazale nc exprim integrina 6. n ziua a 14-a, expresia integrinei 6 a fost puternic redus, i nici o expresie a ei nu a fost observat la nivelul epiteliului lezional la 28 sau 44 de zile.

16

Pentru a atinge obiectivele acestui studiu am realizat un model de arsur chimic pe tegument de obolan Wistar. Am urmrit producerea unei leziuni standardizate, reproductibile i cuantificabile, care s presupun distrugerea n totalitate a epidermului i a dermului pn cel puin n n treimea extern. Pentru aceast leziune am utilizat o tehnic perfecionat la disciplina de Fiziopatologie cu ocazia altui doctorat. nainte de tunderea i raderea prului, de pregatirea tegumentului i realizarea arsurilor, animalele de laborator au fost anesteziate pe cale general cu un amstec de Ketamina (50 mg/kg corp) i Xilazina (10 mg/kg corp)[179]. Am obinut o anestezie profund, care a persistat ntre 1 i 3 ore, timp n care am avut linite muscular i neam putut efectua lucrul. Trezirea complet din anesteziei a avut loc dup 3-5 ore de la inducerea acesteia la majoritatea animalelor. La trezire nu au existat evenimente majore, doar civa obolani s-au trezit mai greu (dup 8-10 ore) sau au prezentat o hipersecreie bronic. Toi obolanii astfel anesteziai au supravieuit i au putut fi folosii la experimente. TEHNICA REALIZRII LEZIUNILOR DE ARSUR Am efectuat arsuri circulare, simetrice, n numr de 6 sau 8, de o parte i de alta a liniei mediane din regiunea dorsal i lombar, prin instilarea unei soluii acide de concetraie determinat, n recipientul de plastic cu apertura inferioar de 5mm ce venea n contact cu tegumentul (fig. ). S-a folosit o soluie de acid i nu de baz, pentru a evita necroza de lichefiere i efectul de penetran ntarziat caracteristic acestora din urm. Se tie c acizii produc arsuri autolimitate ca urmare a necrozei de coagulare. n astfel de cazuri esutul devitalizat i coagulat formeaz o barier fizico-chimic ce scade puterea de penetrare a acidului n profunzime. Am folosit pentru arsuri amestecul sulfocromic (50 g bicromat de potasiu, se adaug 50 ml ap, apoi se adaug treptat prin agitare 1 litru acid sulfuric cu concentraia 98,9%). Prin tehnica diluiilor succesive am stabilit c soluia sulfocromic n diluie realiza ntr-un timp de 20 secunde contact cu pielea, arsurile cu profunzimea dorit. Dup scurgerea timpului de expunere la acid, cuva nc aplicat a fost splat din abunden cu ap distilat, apoi tegmentul ars a fost ters uor cu o compres de tifon nmuiat n ser fiziologic. Au rezultat arsuri de gradul II care au interesat ntreg epidermul, dermul papilar i dermul reticular cel puin pn n treimea extern (partial thickness burn n literatura de specialitate). Imediat dup realizarea arsurii, tegumentul a avut o coloraie normal. n 5-10 minute tegumentul ars a devenit maroniu datorit necrozei straturilor de la suprafa i acumulrii de snge prin deschiderea capilarelor dermice. n unele cazuri s-a constatat c esutul necrozat s-a detaat cu uurin rmnnd dermul denudat care sngera difuz. Arsurile realizate corect au avut forma de disc, cu diametrul de 5 mm, cu contur net i coloraie maronie uniform (fig.25). Pentru studiul comparativ al epitelizrii spontane au fost folosite doar animalele la care arsurile au ndeplinit criteriile menionate.

17

Fig.25. Realizarea leziunilor de arsur, aspectul macroscopic i microscopic al acestora

18

Figura 26: Localizarea imunohistochimic a 6-integrinei n vindecarea unor leziuni cutanate la 3 (A si B), 7 (C si D), 14 (E si F), 28 (G si H), i 44 (I si J) zile dup producerea lor. E epiteliu, FC cheag de fibrina, CT esut conjunctiv, GT esut de granulaie, WCT esut conjunctiv cicatricial.

19

Figura 27: Imunolocalizarea LM5 la nivelul keratinocitelor bazale la 2 zile dup producerea leziunii (A), la 4 zile (B D) n citoplasma keratinocitelor i la 9 zile (E). n vecintatea epidermului regenerat se observ o reacie mai intens i keratinocite alungite (D). (F) Identificarea LM5 n esut normal

Pe parcursul reepitelizrii, tehnica imunohistochimic a relevat i prezena lamininei 5 (LM-5) n special la nivelul keratinocitelor de la nivelul marginii evideniate a leziunii.

20

Figura 28: Identificarea prin IF a lamininei-5 n keratinocitele bazale ce vor migra (la 3 zile dupa producerea leziunii).

Elemente de ultrastructur evindeniate prin microscopie electronic de transmisie Examinarea probelor n microscopia electronic de transmisie a evideniat modificri morfologice att la nivelul epidermului, confirmnd observaiile din microscopia fotonic, ct i la nivelul componentelor esutului conjunctiv. Astfel,s-au observat zone n care epidermul prezenta un strat cornos relativ subire, alternnd cu zone cu grosime medie i uneori evident (Figura 30, Figura 31, Figura 35, 21

Figura 39) n care se puteau observa unele celule cu doi nucleoli, bine reprezentai, cu heterocromatina strns asociat i uneori o hipertrofie a organitelor celulare implicate n procesele de sintez i secreie celular - reticol endoplasmic rugos i complex Golgi. Am remarcat totodat modificri la nivelul capilarelor: ngroarea pereilor i lumenul ngustat semnificativ (Figura 37). n cazul zonelor de cuplaj celular, structurile joncionale tip desmozomi prezentau aspecte morfologice normale (Figura 36) dar n unele zone s-a remarcat pierderea fibrelor de ancorare de la nivelul membranei bazale. Un alt aspect remarcat este lipsa microtubilor din citoplasma acestor fibroblaste. Analiza imaginilor de microscopie electronic evideniaz dezorganizarea distribuiei normale a fibrelor de colagen i prezena fibrelor de elastin rupte i separate prin zone microfibrilare dense ce sunt situate n jurul extremitilor acestora.

22

Figura 27: Tegument - diabet zaharat experimental microscopie electronic de transmisie: diferite grade de ngroare a epidermului

23

Figura 28: Tegument - diabet zaharat experimental microscopie electronic de transmisie: prezena structurilor veziculare-vacuolare n citoplasm; diferite grade de ngroare a epidermului

24

Figura 29: Tegument - diabet zaharat experimental microscopie electronic de transmisie: desmozomi

25

Figura 30: Tegument - diabet zaharat experimental microscopie electronic de transmisie: modificri morfologice la nivelul capilarelor

CONCLUZII ALE STUDIULUI MORFOLOGIC 1. Evidenierea electronomicroscopic a fibroblastelor cu volum celular mrit, ce indic un fenotip hipertrofic, ct i diminuarea indicelui de proliferare sugerat de existena unui numr redus de celule n fazele G2/M,reprezint elemente care sunt ntlnite deobicei n cazul organismelor, senescente. Acest aspect este n acord cu unele date din literatur (313) conform crora diabetul induce prematur modificri degenerative ce sunt de obicei asociate mbtrnirii. 2. Prezena unui grad de hipertrofie a organitelor celulare implicate n sinteza celular, n special a reticolului endoplasmic rugos sugereaz o sintez crescut de proteine n timp ce dezorganizarea structurii mitocondriale observate frecvent indic o energetic celular deficient. 26

3. Studiul electronomicroscopic a evideniat lipsa microtubilor din citoplasma fibroblastelor sau prezena sporadic i dezorganizat a acestor structuri nc din stadiile timpurii ale instalrii diabetului experimental. Aceste aspecte sunt n acord cu rezultatele comunicate de Rousset i colab. (312) care au identificat la unii pacieni cu diabet un procent semnificativ de anticorpi antitubulin. De asemenea, conform datelor din literatur, se consider c nivelele crescute ale glucozei sanguine pot inhiba ansamblarea microtubilor (311). Microtubii regleaz att forma celulelor ct i dinamica proliferrii celulare i ar putea fi una din componentele mecanismului responsabil de diminuarea ratei de proliferare constatate. 4. Prezena a numeroi corpi veziculari uneori cu structur multilamelar, n citoplasma fibroblastelor sugereaz un turnover accentuat al structurilor intracelulare.Aspectele degenerative ale fibrelor de colagen indic acumularea produilor de glicare i n cazul prezentului studiu au fost identificate nc din stadiile timpurii ale instalrii diabetului,contrar unor date din literatur care le consider rezultatul evoluiei bolii. STRESUL OXIDATIV N DIABETUL ZAHARAT EXPERIMENTAL Dei oxigenul molecular este indispensabil pentru via, n acelai timp el are un efect negativ, cunoscut ca toxicitatea oxigenului, determinat de formarea unor specii reactive. Stresul oxidativ definete situaia n care se produce un dezechilibru ntre producia de radicali liberi i mecanismele de aprare prin factori antioxidani. n aceast situaie, excesul de radicali liberi scpai de sub control poate genera reacii biochimice n lan care duc la leziuni tisulare. Modificrile biochimice din diabetul zaharat sunt responsabile de complicaiile sistemice ce apar n evoluia bolii. Acestea au o foarte mare variabilitate, n funcie de vechimea diabetului, de severitatea modificrilor i de particularitile organului implicat. La majoritatea pacienilor, dup 10-15 ani de la debut, modificrile morfologice se produc la nivelul membranei bazale a micilor vase (microangiopatie), arterelor (ateroscleroz), rinichi (nefropatie diabetic), retin (retinopatie), nervi (neuropatie) i la nivelul altor organe i esuturi. Creterea stresului oxidativ, care este asociat cu hiperglicemia cronic din diabetul zaharat, are un rol cheie n geneza disfunciei endoteliale. Nu se tie n ce msur hiperglicemia i autooxidarea exagerat a glucozei sau, dimpotriv, scderea capacitii antioxidante nregistrat la diabetici sunt responsabile de exagerarea proceselor oxidative. Insulinorezistena, hipertensiunea arterial, dislipidemiile i obezitatea reprezint factori care accentueaz sinteza de radicali liberi i instalarea unui stres oxidativ care agraveaz perturbrile deja existente. Deoarece zincul este un factor necesar pentru o serie de enzime antioxidante, n special pentru superoxid dismutaza, catalaza i peroxidaza, alterri n metabolismul acestuia, cum ar fi c zincul adecvat nu este disponibil pentru aceste enzime, ar putea s contribuie la producerea injuriilor tisulare observate n diabet. n ultimii ani, s-a nregistrat un interes crescnd fa de rolul potenial protector antiaterosclerotic al vitaminelor antioxidante E, A i C, att la diabetici ct i la nediabetici. Dei studiile efectuate nu permit concluzii certe, corectarea unor deficiene n aportul vitaminic sau al altor compui antioxidani (glutation, antociani, carotenoizi), trebuie avut n vedere, prefernd ntotdeauna o abordare nutriional i nu farmacologic a corectrii deficitelor existente.

27

Concluzii ale studiului biochimic din snge Investigaiile biochimice din snge s-au adresat cuantificrii: concentraiei malon-dialdehidei (MDA) sau a compuilor tiobarbiturici reactivi (TBARS); concentratiei glutationului redus (GSH); activitii glutation peroxidazei (G-Px); activitii superoxid-dismutazei (SOD). Analiza acestor parametri permit urmtoarele concluzii: o Ca urmare a intensificrii stresului oxidativ i peroxidarii lipidice, la obolanii diabetici (DZ), MDA are valori semnificativ crescute fa de obolanii din M. o Ca urmare a intensificrii stresului oxidativ i dup mai multe sptmni de boal, la obolanii diabetici (DZ), activitatea seric a G-Px, GSH (glutationul redus) i SOD au valori semnificativ sczute fa de obolanii din M. o Scderea dramatic a GSH, care este substrat pentru enzima glutationperoxidaz explic i scderea activitii acestei enzime cu potenial antioxidant. o Se poate concluziona c stresul oxidativ augmentat din diabetul zaharat diminu capacitatea de aprare antiradicalar prin depirea capacitii de sintez a glutationului i a glutation peroxidazei eritrocitare. La acest fenomen ar putea contribui i gradul mare de glicare a proteinelor eritrocitare la diabetici.

Determinri biochimice n tegument

Un alt obiectiv al cercetrii a fost recoltarea de probe de tegument n vederea determinrii aprrii antiradicalare la nivel de epiderm i derm n condiii de hiperglicemie/normoglicemie. Deoarece manifestarrile cutanate depind nu numai de vechimea diabetului ci i de vrsta pacientului, am utilizat: 2 loturi de obolani diabetici o Un lot de obolani diabetici tineri (vrsta de 8 luni) i o Un lot de obolani diabetici vtstnici (vrsta de 30 luni). 2 loturi de martori masculi o Un lot de obolani martori tineri (vrsta de 8 luni) i o Un lot de obolani martori vrstnici (vrsta de 30 luni) Voi relata n continuare rezultatele acestui studiu asupra modificrilor enzimelor majore antioxidante superoxid dismutaza (SOD), catalaza, glutation peroxidaza (GPx) i glutationul reductaza (GR) n timpul proceselor diabetice la obolanii tineri i btrni la nivelul epidermului i dermului. S-au recoltat mostre de tegument (diametrul de 6-10 mm), dup o prealabil epilare local. Probele de tegument au fost congelate imediat n nitrogen lichid i depozitate la 700C. Separarea dermului de epiderm s-a efectuat prin decongelarea probei dispuse cu dermul n jos ntr-o cutie Petri i apoi nclzite la 550C timp de 2 minute, dup care s-a realizat separarea cu ajutorul unui bisturiu special. Aceste modificri termice nu produc alterri ale enzimelor antioxidante (125, 222).

28

Figura 56: Recoltarea fragmentelor de tegument Specimenele de epiderm i derm au fost suspendate i omogenate separat ntr-o soluie baz A compus din clorur de sodiu 130 mM, glucoz 5 mM, EDTA mM i fosfat de sodiu 10 mM, cu pH 7,0. Suspensia s-a mojarat la 40 timp de 10 minute i ulterior centrifugat la 14 000 ture timp de 10 minute. S-au determinat apoi activitile catalazei, SOD, GPx, GR ale fiecrei probe de epiderm i, respectiv derm. De asemeni s-au determinat valorile proteinelor din esut, la care s-au raportat valorile enzimatice.

Figura 57: Separarea epidermului de derm

Rezultate i discuii
Am urmrit modificrile a patru enzime antioxidante: SOD, catalaz, GPx i GR la nivel de tegument. Activitile sunt exprimate ca uniti/mg. protein. Pentru a investiga efectul hiperglicemiei asupra activitilor enzimelor antioxidante, valorile activitilor enzimelor antioxidante ale mostrelor de tegument de la obolani martori tineri/vrstnici au fost comparate cu cele determinate la diabetici. Aceste valori nu au artat diferene semnificative ntre pielea normal i cea diabetic cu excepia catalazei, crescute att n epidermul ct i n dermul pielii obolanilor diabetici.

29

Tabel nr.XVI : Valorile enzimelor antioxidante n tegument (derm i epiderm) la loturile de obolani masculi tineri Enzim SOD Catalas e GPx GR Diabetici Epiderm Derm 108,8 6,2 86,2 6,1 64,8 3,0 0,04 0,0 0,05 0,0 32,8 3,3 0,05 0,0 0,01 0,0 Martori Epiderm Derm 107,3 3,5 82,6 6,4 84,4 1,8 0,03 0,0 0,0 0,0 45,9 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0

La masculi, valorile medii ale SOD i ale catalazei nregistreaz puternice diferene semnificative din punct de vedere statistic, att la martori ct i la diabetici.
120 100 80 U/Ht 60 40 20 0 Epiderm Diabetici tineri Derm Epiderm Derm Martori tineri

Figura 58: Valorile medii ale SOD la loturile de obolanii tineri

120 100
U/mg protein

80 60 40 20 0
Epiderm Derm Diabetici Epiderm Martori Derm

Figura 59: Valorile medii ale catalazei la loturile de obolani tineri 30

Tabel XVII:Diferene statistice ntre enzimele antioxidante n tegumente la loturile de obolani tinerii (GL = 38) Enzim SO D Ca talaz 32,09 p < 0,001 54,55 p < 0,001 Diabetici t-Student p 11,62 p < 0,001 Martori t-Student p 15,14 p < 0,001

Pentru valorile medii ale enzimelor antioxidante GPx i GR, n tegumente (derm i epiderm) la obolanii tineri nu se pot calcula diferenele statistice deoarece abaterile standard sunt 0.
0,1

0,05
0,05

0,05 0,03 0,01 0 0

Derm Epiderm Epiderm

0,04

0
Derm

0
Derm Epiderm Epiderm Derm

Diabetici tineri GPx

Martori tineri

Diabetici tineri

Martori tineri GR

Figura 60: Valorii medii ale GPx i GR la loturile de obolani tineri

Tabel nr XVIII.: Valorile enzimelor antioxidante n tegument (derm i epiderm) la loturile de obolani vrstnici Enzim Diabetici Epiderm Derm Martori Epiderm Derm

31

SOD Catalaz a GPx GR

113,8 5,2 109,8 4,2

89,8 6,8 26,6 3,3

118,3 1,6 99,8 3,8

84,6 3,4 26,9 2,8

0,04 0,0 0,0 0,0

0,04 0,0 0,03 0,0

0,0 0,0 0,04 0,0

0,0 0,0 0,01 0,0

La obolanii vrstnici, valorile medii ale SOD i ale catalazei nregistreaz, de asemenea, puternice diferene semnificative din punct de vedere statistic, att la diabetici ct i la martori.
120 100 80 U/Ht 60 40 20 0 Epiderm Diabetici Derm Epiderm Derm Martori

Figura 61: Valorile medii ale SOD la loturile de obolani vrstnici

120 100
U/mg protein

80 60 40 20 0
Epiderm Diabetici Derm Epiderm Derm Martori

Figura 62: Valorile medii ale catalazei la loturile de obolani vrstnici Tabel nr.XIX: Diferene statistice ntre enzimele antioxidante n tegumente 32

la loturile de obolani vrstnici (GL = 38) Enzim 12,54 Diabetici t-Student SO D Ca talaz Pentru valorile medii ale enzimelor antioxidante GPx i GR, n tegumente (derm i epiderm) la loturile de obolani vrstnici nu se pot calcula diferenele statistice deoarece abaterile standard sunt 0.
0,1

Martori p t-Student 40,11 p p < 0,001

p < 0,001

69,66

p < 0,001

67,91

p < 0,001

0,05

0,04 0,04 0,03

0,04

0,01 0
0
Derm Derm Derm Epiderm Epiderm Epiderm Epiderm Derm

Diabetici GPx

Martori

Diabetici

Martori

GR

Figura 63: Valorii medii ale GPx i GR la loturile de obolani vrstnici ncercnd s vedem ce se ntmpl cu valorile enzimelor antioxidante, din punct de vedere statistic, ntre loturile de obolani tineri i vrstnici se remarc: SOD: la diabetici: corelaia n epiderm este la pragul de semnificaie de 99% ntre tineri i vrstnici (p < 0,01); pentru derm nu exist semnificaie statistic; la martori: corelaia n epiderm este puternic semnificativ statistic (p < 0,001); pentru derm nu exist semnificaie statistic;

33

catalaza: att la diabetici ct i la martori exist puternice diferene din punct de vedere statistic ntre persoanele tinere i cele vrstnice ale valorilor enzimelor antioxidante; valorile testului t-Student pentru catalaz depesc valorile testului t-Student pentru SOD, corelaiile fiind mai puternice.
Diabetici 40 38,99

SOD Catalaz

30

20

10 2,76 Martori 22,64 1,23 0 5,94 1,76 Diabetici

12,78 16,03

Martori

Figura 64: Corelaia valorilor medii ale enzimelor antioxidante n tegumente, ntre loturile de persoane tinere i vrstnice Activitatile SOD, catalazei i GR au fost semnificativ mai mari n epiderm dect n derm cu o medie de 128% (p<0,05), 190% (p<0,001) i 236% (p<0,001) n tegumentul tnr i cu 134% (p<0,001), 436% (p<0,001) i 238% (p<0,001) n pielea mbtrnit. Activitatea GRx din epiderm este mai sczut n epiderm dect n derm i reprezint 74% din valoarea de la nivelul dermului n pielea tnr i 80% din nivelul dermului n pielea mbtrnit. De remarcat faptul c, indiferent de vrst, diabetul cronic a determinat o intensificare a proceselor de aprare antiradicalar puternic semnificativ comparativ cu obolanii martori, la nivelul epidermului. Catalaza a prezentat creteri semnificative ale activitii n epidermul pielii senescente (la diabetici i la martori) n comparaie cu cele din tegumentul tnr de 184% i respectiv 126%. n derm, catalaza a suferit o scdere semnificativ a activitii att n pielea diabeticilor ct i n cea a martorilor senesceni de 65% i 52% fa de nivelele din tegumentul tnr. Activitatea GR din epidermul pielii mbtrnite natural este semnificativ sczut, cu 126% n comparaie cu cea din pielea tnr. n acest studiu am demonstrat c activitile SOD i GPx nu s-au modificat n timpul evoluiei diabetului la obolanii senesceni. Activitatea catalazei este semnificativ crescut n epiderm, n timp ce la nivelul dermului este sczut la pielea diabetic i senescent n comparaie cu pielea tnr. Activitatea GR este crescut n epidermul mbtrnit . 34

Deoarece epidermul este expus n mod direct variatelor stresuri oxidative din mediu, se presupune c are o capacitate de aprare antioxidant mai mare dect dermul, pentru a mentine echilibrul redox al pielii. Aa cum era de asteptat, am observat c activitile SOD, catalazei i GR sunt mai mari n epidermul dect n dermul pielii tinere i a celei mbtrnite. Rezultatele noastre sunt similare cu cele obtinute de Shindo n 1999 n ceea ce privete nivelele concentraiilor antioxidantilor enzimatici, mai crescute n epiderm dect n derm. Rezultatele noastre demonstreaz c enzima antioxidant catalaza este reglat diferit n epiderm i derm n timpul evoluiei. Activitatea catalazei a crescut semnificativ n epidermul diabetic i mbtrnit, i a crescut mai mult n epidermul diabetic comparativ cu cel martor mbtrnit. Acest nivel crescut al catalazei din epiderm, din timpul procesului mbtrnire este foarte important pentru c se tie c, catalaza este distrus de lumina din spectrul vizibil. S-a rapartat c valorile catalazei din epidermul i dermul murinelor sufer o scdere marcat a activitii dup iradiere acut cu UV. Inducerea catalazei n epiderm poate s fie un rspuns de aprare la stresul oxidativ din mediu. Pe de alt parte, stresul oxidativ cronic din timpul vieii poate stimula celulele pielii s produc variate citokine care s regleze expresia catalazei. n contrast cu epidermul, activitatea catalazei scade semnificativ n dermul pielii diabetice la obolanii senesceni. Cuantificrile noastre ale catalazei din derm sunt comparabile cu cele ale lui Shindo (1999), care a comparat fibroblatii din piele derivai de la oameni n vrst cu fibroblatii de la oamenii tineri. Rezultatele noastre indic faptul c activitatea catalazei poate fi reglat diferit n epiderm fa derm n timpul evoluiei diabetului i mbtrnirii intrinseci, i c, catalaza pare a fi enzima cheie care ndeplinete un rol important n protecia pielii fa de daunele oxidative. Rezultatele acestui studiu sugereaz c, componentele sistemului de aprare antioxidant, din tegument sunt probabil reglate ntr-o manier complex n evoluia diabetului. Conform teoriei radicalilor liberi a senescenei, valorile ROS cresc odat cu mbtrnirea datorit activitii sczute a enzimelor de aprare antioxidant. Rezultatele noastre sunt compatibile cu aceast teorie a radicalilor liberi a mbtrnirii. Astfel, scderea activitii catalazei din derm i nivelele reduse ale antioxidanilor nonenzimatici din epidermul i dermul pielii diabetice i mbtrnite in vivo, par s determine o cretere asociat cu vrsta a stresului oxidativ (ROS) n pielea mbtrnit. n consecin, ROS precum peroxidul de hidrogen din pielea mbtrnit poate crete i se poate acumula odat cu vrsta. Aceste ROS vor afecta cile de semnalizare i vor induce n final modificri morfologice i funcionalel n pielea diabetic. CONCLUZII FINALE ALE STUDIULUI BIOCHIMIC Investigaiile biochimice din snge s-au adresat cuantificrii: concentraiei malon-dialdehidei (MDA) sau a compuilor tiobarbiturici reactivi (TBARS); concentratiei glutationului redus (GSH); activitii glutation peroxidazei (G-Px); activitii superoxid-dismutazei (SOD). Analiza acestor parametri permit urmtoarele concluzii: o Ca urmare a intensificrii stresului oxidativ i peroxidarii lipidice, la obolanii diabetici (DZ), MDA are valori semnificativ crescute fa de obolanii din M. o Ca urmare a intensificrii stresului oxidativ i dup mai multe sptmni de boal, la obolanii diabetici (DZ), activitatea seric a G-Px, GSH (glutationul redus) i SOD au valori semnificativ sczute fa de obolanii din M. 35

o Scderea dramatic a GSH, care este substrat pentru enzima glutationperoxidaz explic i scderea activitii acestei enzime cu potenial antioxidant. o Se poate concluziona c stresul oxidativ augmentat din diabetul zaharat diminu capacitatea de aprare antiradicalar prin depirea capacitii de sintez a glutationului i a glutation peroxidazei eritrocitare. La acest fenomen ar putea contribui i gradul mare de glicare a proteinelor eritrocitare la diabetici. Investigaiile biochimice din tegument (epiderm i derm) s-au adresat cuantificrii: SOD, catalazei GPx i GR (glutation reductazei) Analiza acestor parametri permit urmtoarele concluzii: o SOD scade la nivel de epiderm la obolanii diabetici comparativ cu martorii n timp ce la nivelul dermului se constat o cretere nesemnificativ. Vascularizaia puternic la nivelul dermului ar putea explica sinteza crescut de SOD local i astfel o relativ protecie fa de agresiunea ROS n timp ce la nivel de epiderm aprarea este depit (mai ales n tegumentul obolanilor vrstnici). o Catalaza prezint valori mai sczute n tegumentul obolanilor diabetici (derm i epiderm) comparativ cu martorii. n contrast cu epidermul, activitatea catalazei scade semnificativ n dermul pielii diabetice la obolanii senesceni. o Glutation peroxidaza (GPx) n tegumentul diabetic are valori foarte crescute (puternic semnificativ) comparativ cu martorii att la nivel de derm ct i de epiderm. o Glutation reductaza crescut n epidermul obolanilor martor (senesceni), este absent la nivel de epiderm diabetic n timp ce la nivelul dermului activitatea GR este mai crescut la diabetici. o Scderea activitii catalazei din derm i nivelele reduse ale antioxidanilor non-enzimatici din epidermul i dermul pielii diabetice i mbtrnite in vivo, par s determine o cretere asociat cu vrsta a stresului oxidativ (ROS) la diabetici. n consecin, ROS precum peroxidul de hidrogen din pielea diabetic i mbtrnit poate crete i se poate acumula odat cu vrsta. Aceste ROS vor afecta cile de semnalizare i vor induce n final modificri morfologice i funcionale n pielea diabetic. CONCLUZII GENERALE 1. Acest studiu s-a realizat pe model experimental animal, utiliznd obolanii albi Wistar (loturi de masculi i femele), la care a fost indus diabet zaharat prin administrare de streptozotocin. Acest model experimental animal de diabet este asemntor cu diabetul zaharat tip 1 uman. 2. Dup administrarea de streptozotocin, toi obolanii au dezvoltat foarte repede diabet zaharat, fapt constatat ca urmare a creterii concentraiilor plasmatice ale glucozei de 3.2 ori la cei injectai comparativ cu martorii. O cretere semnificativ a glicemiei a fost observat ncepnd cu a doua zi de la efectuarea injeciei, iar creterea a continuat pn 36

n sptmna a treia. Dup patru sptmni, activitatea transaminazelor la obolanilor cu diabet a fost similar lotului de control. 3. Coninutul n ap al stratului cornos a fost redus semnificativ n acest tip de diabet, ntruct pierderea apei transepidermic rmne neschimbat. Acest fapt s-a putut demonstra prin cuantificarea aminoacizilor de la acest nivel. n grupul diabetic, coninutul n aminoacizi, de fapt, a prezentat o uoar cretere, la 3 sptmni dup administrarea injeciei. 4. n acest studiu, au fost efectuate, de asemenea, determinri biochimice de confirmare a mecanismelor fiziopatologice de generare a complicaiilor diabetului zaharat de tip I. S-au determinat glicemia (n dinamic) i glucozuria. Dup 24 48 ore de la injectarea STZ s-au instalat: poliuria, glucozuria i hiperglicemia la toate animalele din loturile cu diabet zaharat indus experimental. Controlul glicemiei la obolanii cu DZ a relevat creterea extrem de mare a glucozei sanguine, i anume, cu peste 400% fa de lotul martor, ceea ce demonstreaz lezarea celulelor beta din insulele Langerhans. 5. Diabetul zaharat reprezint o stare patologic n care stresul oxidativ este major. Acest fenomen a putut fi evideniat i n studiul nostru experimental prin concentraiile serice semnificativ crescute ale malonildialdehidei (MDA) la obolanii diabetici fa de martori. De asemenea, s-a relevat i o activitate seric a glutation peroxidazei (G-Px) semnificativ sczut fa de obolanii martori. Prin urmare, stresul oxidativ augmentat din diabetul zaharat diminu capacitatea de aprare antiradicalar prin depirea capacitii de sintez a glutation peroxidazei eritrocitare. 6. Creterea stresului oxidativ, care este asociat cu hiperglicemia cronic din diabetul zaharat, are un rol cheie n geneza disfunciei endoteliale. 7. Modificrile biochimice din diabetul zaharat sunt responsabile de complicaiile sistemice ce apar n evoluia bolii. Acestea au o foarte mare variabilitate, n funcie de vechimea diabetului, de severitatea modificrilor i de particularitile organului implicat. La majoritatea pacienilor, dup 10-15 ani de la debut, modificrile morfologice se produc la nivelul membranei bazale a micilor vase (microangiopatie), arterelor (ateroscleroz), rinichi (nefropatie diabetic), retin (retinopatie), nervi (neuropatie) i la nivelul altor organe i esuturi. 8. Analiza expresiei integrinei v6 n biopsiile umane prin imunohistochimie a relevat faptul c aceasta este supraexprimat n leziunile epidermice prezente la lotul cu diabet experimental. Probele recoltate de la lotul martor (fr diabet) indic prezena acestui tip de integrin n proporii diferite, dar fr o influen direct asupra timpului de vindecare. Consider c acest tip de integrin are un rol important numai n cazurile n care vindecarea este ntrziat de prezena unei infecii sau a terenului diabetic. Exprimarea de ctre keratinocite a v6 integrinei va conduce la activarea TGF-1, cu rol important n reglarea procesului de reepitelizare prin inducerea diferenierii fibroblastelor n miofibroblaste. 9. Rezultatele obinute evideniaz c prezena lamininei 5 este mai important pe msura evoluiei statusului diabetic i esenial n procesele de reepitelizare i regenerare. Aceasta este utilizat ca legatur ntre integrina v6 i matricea extracelular nou sintetizat. n stadiile finale ale proceselor de vindecare lezional, laminina 5 reprezint un prim element de ancorare ce inhib migrarea celular i favorizeaz realizarea contactelor cu componentele membranei bazale prin asamblarea hemidesmozomilor. 10. Rezultatele studiului morfologic indic ngroarea, alternnd cu subierea progresiv a epidermului nc din stadiile incipiente ale diabetului. 11. Sunt evidente modificrile volumului celular i/ sau nuclear ct i cele ale procesului de proliferare i difereniere celular care afecteaz funciile tegumentului. Totodat ngroarea stratului cornos n zone supuse unor presiuni mecanice reprezint un factor de risc pentru apariia ulceraiilor. 37

12. Pe baza rezultatelor studiului morfologic efectuat ct i a stadializrii diabetului, consider c modificrile celulare i moleculare de la nivelul tegumentului pot fi primele semne ale unei perturbri a metabolismului glucidic, iar n cazul diabetului instalat pot reflecta evoluia acestuia i eficacitatea terapiei. 13. Lipsa total sau prezena sporadic a structurilor citoscheletului tip microtubi n cazul tegumentului recoltat de la lotul cu diabet experimental indic perturbarea traficului vezicular intracelular i implicit perturbarea unor procese fiziologice celulare importante cum ar fi endocitoza mediat de receptori, livrarea unor molecule sintetizate n reticolul endoplasmic rugos ctre alte structuri celulare ct i afectarea proceselor de proliferare i/ sau difereniere celular. 14. Contrar studiilor din literatur care postuleaz c manifestrile de la nivelul tegumentului apar n funcie de durata evoluiei diabetului i sunt asociate cu apariia complicaiilor microvasculare, prezentul studiu conduce la ipoteza c modificrile morfologice ultrastructurale sunt prezente nc din stadiile incipiente ale instalrii statusului diabetic. Identificarea lor precoce poate constitui un semnal de alarm privind necesitatea modulrii terapiei i a posibilitii predispoziiei ctre un anumit tip de complicaie. 15. Rezultatele prezentului studiu pot contribui la elaborarea unui set de investigaii care s permita identificarea precoce a unui status hiperglicemic, ct i la adaptarea monitorizrii diabeticului la predispoziia ctre un anumit tip de complicaii indicat de aceste modificri precoce.

38

LUCRRI PUBLICATE N EXTENSO N CADRUL TEZEI DE DOCTORAT N PUBLICAII COTATE B+

1. Luana ahian, Carmen Elena Cotrutz, Magda Bdescu: Ways of minimizing skin damage in diabetes mellitus/ Cai de reducere a afectarii pielii in diabetul zaharat, The Revue of Aeronautical Medicine and Psychology/ Revista de Medicina si Psihologie Aeronautica, No. 3 (56), Anul 2011, Nr. 3 (56), 9-14/ 55-60. 2. Luana ahian, Carmen Elena Cotrutz, Magda Bdescu: Changes of keratinocytes occurring during the reepithelialization process in diabetic patients/ Modificrile keratinocitelor aprute n cursul procesului de reepitelizare la pacienii diabetici, The Revue of Aeronautical Medicine and Psychology/ Revista de Medicina si Psihologie Aeronautica, No. 4 (57), Anul 2011, Nr. 4 (57), 19-22/ 45-48.

39

Bibliografie selectiv
1. Abdollahi A, Daneshpazhooh M, et al. Dermopathy and retinopathy in diabetes: is there an association?. Dermatology. 2007; 214 (2):133-6 2. Abu Abeeleh M, Ismail ZB, et al. Induction of diabetes mellitus in rats using intraperitoneal streptozotocin: a comparison between 2 strains of rats. European Journal of Scientific Research. 2009; 32 (3):398-402 3. Adamis AP, Shima DT, Tolentino MJ et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor prevents retinal ischemia-associated iris neovascularisation in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol. 1996; 114:66-7 4. Akpan A, Morgan R. Oral candidiasis. Postgrad Med J. 2002; 78:455-459 5. Alecu M. Patologia molecular a pielii. Editura Medical, Bucureti, 2006 6. Al-Mutairi N. Skin diseases seen in diabetes mellitus. Bulletin of the Kuwait for medical specialization. 2006; 5:30-39 7. Amos AF, McCarty DJ, Zimmet P. The rising global burden of diabetes and its complications: estimates and projection to the year 2010. Diabetes. 1997; Med. 14, S1S85 8. Antezana MA, Sullivan SR, Usui ML, Gibran NS, Spenny ML, Larsen JA, Ansel JC, Bunnett NW and Olerud JE. Neutral Endopeptidase Activity is Increased in the Skin of Subjects with Diabetic Ulcers. Journal of Investigative Dermatology . 2002; 119:14001404 9. Ashcroft FM, Rorsman P. Molecular defects in insulin secretion in type-2 diabetes. Endocrine and Metabolic Disorders. 2004; 5:135-142 10. Baynes J. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes. 1991; 40:405-412 11. Bdulescu O, Bdescu C, Alexa I, Ciocoiu M, Luca V, Bdescu M. The study of endothelial dysfunction and of the proinflamatory status in patients with type 2 diabetes mellitus and cardiovascular disease. Annals of RSCB. 2010; 15(1):193-201 12. Bernardo ML. Diabetes: Part III Diabetes mellitus and skin. Writephd s blog. 2009 13. Bhat Y, Gupta V, Kudyar RP. Cutaneous manifestations of diabetes mellitus. Int J Diab Dev Ctries. 2006; 26(4) 14. Bickers DR, Athar M. Oxidative stress in skin disease. Journal of Investigative Dermatology. 2006; 126 15. Bierhaus A, Chevion S, Chevion M, Hofmann M, Quehenberger P, Illmer T, et al. Advanced glycosilation end products-induced activation of NF-KappaB is suppressed by alpha-lipoic acid in cultured endothelial cells. Diabetes. 1997; 46:148190 16. Briganti S, Picardo M. Antioxidant activity, lipid peroxidation and skin disease. Whats new. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2003; 17:663-9 17. Brownlee M, Advanced glycosylation in diabetes and aging. Annu Rev Med. 1995; 46:223-234 18. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature. 2001; 414:813-820 19. Burton J.L., Burnis D.A., Breathnacy S.M. Comparative dermatology. In : Rook, Wikinson, Ebling, Text Book of Dermatology, Campion R.H., 6th ed., 2, 1-37, Blackwell Science, 1998 40

20. Caimi G, Carollo C, Lo Presti R, Diabetes mellitus: oxidative stress and wine, Curr Med Res Opin. 2003; 19(7) 21. Chan NN, Vallance P, Colhoun HM. Nitric oxide and vascular responses in tzpe I diabetes. Diabetologia. 2000; 43:137-47 22. Chantelau E, Kohner EM. Why some case of retinopathy worsen when diabetic control improves. Br Med J. 1997; 315:1105-1106 23. Chausmer AB. Zinc, insulin and diabetes. Journal of the American College of Nutrition. 1998; 17 (2):109-115 24. Chea D.M. New insights into experimental diabetes. Ed. Academiei Romne. 2002; 1(8):174 251, Bucureti 25. Chibber R, Ben-Mahmud BM, Coppini D, Christ E, Kohner EM. Proteinkinase C2 dependent phosphorilation of core 2GlcNAc-T promotes leucocites-endothelial adhesion: a mechanism underlying capillary occlusion in diabetic retinopathy diabetes. 2003; 52:1518-1527 26. Chiriac A. Manifestri cutanate n diabetul zaharat. Editura Pim. 2007; Iai 27. Chishiki M, Ohnishi Y, Kawada A, Tajima S, Ishibashi A. Diabetic pigmented spots on the extrapretibial region: immunohistochemical study of type IV collagen in dermal vessel wall. European Journal of Dermatology. 1998; 8(8):560-2 28. Compton CC, Butler CE, Yannas IV, Warland G, Orgill DP. Organized Skin Structure is Regenerated In Vivo from Collagen-GAG Matrices Seeded with Autologous Keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 1998; 110(6):908-916 29. Diabetes Atlas, 3rd edition. International Diabetes Federation. 2006 30. DiBenedetto A, et al. Skin lesions in diabetes mellitus: prevalence and clinical correlations. Diabetes Research and Clinical Practice. 1998; 39:101-106 31. Dimitrescu A. Dermatologie. Editura Medical Naional, Grupul Editorial Naional, 2002; Bucureti 32. Dismoulire A, Chaponnier C, Gabbiani O. Tissue repair contraction and myofibroblast. Wound Rep Reg. 2005; 13:4-12 33. Elder D, et col. Atlas and Synopsis of Levers Histopathology of the Skin. 2nd Edition, Lippincott Williams & Wilkins. 2007 34. Epstein JR. Human molecular biology. Cambridge University Press. 2003; 14:344-345 35. Etu-Seppala L. Long Way but real Hope. Diabetes voice. 2001; 46:5 36. Fadini GP, Albiero M, Menegazzo L, et al. The Redox Enzyme p66Shc Contributes to Diabetes and Ischemia-Induced Delay in Cutaneous Wound Healing. Diabetes. 2010; 59(9):2306-2314 37. Faure P, Ben HP, Perard A, Halimi S, Roussel A. Lipid peroxidation in insulin dependent diabetic patients with early retinal degenerative lesions: effects of an oral Zn supplementation. Eur J Clin Nutr. 1995; 49:282-288 38. Flagothier C, Quatresooz P, Bouruignon R, Pirard-Franchimont C, Pirard GE. Cutaneous stigmata of diabetes mellitus. Revue mdicale de Lige. 2005; 60(5-6):553-9 39. Foss NT, Polon DP, Takada MH, Foss-Freitas MC, Foss MC. Skin lesions in diabetic patients. Rev Saude Publica. 2005; 39(4) 40. Gartner LP, Hiatt JL, Strum JM. Cell Biology and Histology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2002 41. Genuth S, Sun W, Cleary P, Sell DR, Dahms W, Malone J, Sivitz W, Monnier VM. Glycation and carboxymethyllysine levels in skin collagen predict the risk of future 10 year progression of diabetic retinopathy and nephropathy in the diabetes control and complications trial and epidemiology of diabetes interventions and complications participants with type 1 diabetes. Diabetes. 2005; 54:3103-3111

41

42. Gerrits EG, Lutgers HL, Kleefstra N, Graaff R, et al. Skin autofluorescence. Diabetes Care. 2008; 31:517-521 43. Ghibu SM. Studiu experimental privind potenialul efect al acidului alfa lipoic n evoluia sindromului metabolic i a stresului oxidativ asociat , la obolani. 2010 44. Giugliano D, et al. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care. 1996; 19:257-267 45. Gorbach SL, et al. Infectious Diseases. 2nd ed. Philadelphia. WB Sanders. 1998 46. Goyal A, Raina S, Kaushal S, Mahajan V, Sharma N. Pattern of cutaneous manifestations in diabetes mellitus. Indian Journal of Dermatology. 2010; 55:39 47. Graur Mariana. Diabetologie clinic. Litografia UMF. 1999; Iai 48. Greenhalgh DG. Wound healing and diabetes mellitus. Clinics in Plastic Surgery. 2003; 30(1):37-45 49. Grimaldi A. Diabte de type 2. Encyclopdie Mdico-Chirurgicale, Elsevier Paris. 2004; 477-485 50. Hadi H, Suwaidi J. Endothelial dysfunctional in diabetes mellitus. Vascular Health and Risk Management. 2007; 3(6):853-876 51. Hafner J, Ramelet AA, Schmeller W, Brunner UV. Management of leg ulcers. Current problems in dermatology. Basel, Karger, 1999; 27:271-276 52. Hall SE. The skin in diabetes mellitus, in Pickup JC, Williams G (eds). Chronic complications of diabetes. Oxford, Blackwell Scientific Publications. 1994; 250-259 53. Hangaishi M, TaguchiJ, Ikari Y, Umezu M, Watanabe T, Miyata T, Kurokawa K, Kimura T, Ohno M. Advances glycation end products enhanced the aggregation oh human platelets in vitro. Circulation. 1997; 96 (I): I-665 54. Hayat AS, Shaikh TZ, Khan AH, Shaikn N. Frequency and pattern of cutaneous manifestations in type 2 diabetes mellitus at Northern Institue of Medical Sciences Abbottabad. World Applied Sciences Journal. 2010; 9 (5):467-473 55. Heald AH, OHalloran DJ, Richards K, et al. Fungal infection of the diabetic foot: two distinct syndromes. Diabet Med. 2001; 18(7):567-572 56. Hermanns-Le T, Scheen A, Pierard GE. Acanthosis nigricans associated with insulin resistance: pathophysiology and management. Am J Clin Dermatol. 2004; 5:199-203 57. Hink U, Li H, Mollnau H, Oelze M, Matheis E, Hartmann M, Skatchkov M, Thaiss F, Stahl RA, Warnholtz A, Meinertz T, Griendling K, Harrison DG, Forstermann U, Munzel T. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 2001; 88:E14-E22 58. Hourigan R. Cellular energy metabolism and oxidative stress. Textbook of aging skin. 2010 59. Hui YY, McAmis WC, Baynes JW, Schaeffer RC, Wolf MB. Effect of advanced glycation end products on oxidative stress in endothelial cells in culture: a warning on the use of cells studied in serum-free media. Diabetologia. 2001; 44:13101317 60. Huntley AC. Cutaneous manifesttations of diabetes mellitus. Dermatologic clinics. 1989; 7(3):531-46 61. Huzaira M, Rius F, Rajadhyaksha M, Anderson RR, Gonzalez S. Topographic variations in normal skin, as viewed by in vivo reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol. 2001; 116:846-852 62. Jacques SL, Ramella-Roman JC, Lee K. Imaging skin pathology with polarized light. Journal of Biomedical Optics. 2002; 7:329-340 63. James W, Berger T, Elston D. Andrews diseases of the skin: Clinical dermatology. 2006; Edition 10th, Elsevier. 64. Jeffcoate WJ, Harding KG. Diabetic foot ulcers. The Lancet. 2003; 361(9368):1545-1551 42

65. Jelinek JD. Skin disorders associated with diabetes mellitus, In Rifkin H, Pourte D, (eds): Ellenberg and Rifkins Diabetes Mellitus: Theory and Practice, New York, Elsevier. 1990; 838-849 66. Jones W, Li X, Qu ZC, Perriott L, Whitesell RR, May JM. Uptake, recycling and antioxidant of -lipoic acid in endithlial cells. Free Radic Biol Med. 2002; 33:8393 67. Joussen AM, Huang S, Poulaki V, et al. In vivo retinal gene expression in early diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42:304757 68. Joussen AM, Murata T, Tsujikawa A, et al. Endothelial cell injury and death in the diabetic retina. Am J Pathol. 2000;140:130142 69. Joussen A.M ,Murata T, Tsujikama A,Kirchof B Leukocite mediated endothelial cell injury and death in the diabetic retina. Am J Pathol. 2001; 158:147-152 70. Joussen AM, Poulaki V, Mitsiades N, et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs prevent early diabetic retinopathy via TNF-alpha suppression. FASEB J. 2002 71. Katon K, Kano Y, Amono M. RHO-kinase-mediate contraction of isolated stress fibres. J Cell Biol. 2001; 153:569-584 72. Keaney JF, Loscalzo J. Diabetes, Oxidative Stress and Platelet Activation. Circulation. 1999; 99:189-191. 73. Kim NN, Stankovic M, Cushman T, Goldstein I, Munarriz R, Traish AM. Streptozotocin-induced diabetes in the rat is associated with changes in vaginal hemodynamics, morphology and biochemical markers. BMC Physiology. 2006; 6:4 74. Kishiyama CM, Chase HP, Barker JM. Prevention strategies for type 1 diabetes. Rev Endocr Metab Disord. 2006; 7:215-224

43