Lp 11: Diagnosticul de laborator al virozelor respiratorii acute.

Obiective:
1. Prezentarea diagnosticului de laborator n grip;
2. Prezentarea diagnosticul serologic n pneumonii atipice primare.
Diagnosticul de laborator n grip
O mica introducere: importanta diagnosticului direct (variabilitatea antigenica,
cunoasterea tulpinilor circulante, stabilirea formulei vaccinale la nivel mondial)
Diagnostic direct:
Produs
patologic: tampon faringian,
nasal
sau
spltur
nasal.
Sensibilitatea diagnosticului crete dac recoltarea este ct mai precoce
(primele 3 4 zile de boal) i dac probele sunt examinate imediat, sau
conservate la 4 C.
Metode rapide (permit diferenierea tipurilor):

Detecie antigenelor prin ELISA sau IF;

Detecia ARN viral prin PCR.

Metode clasice (permit caracterizarea subtipurilor i

a tulpinilor circulante, n scop epidemiologic sau al preparrii de vaccinuri):

izolarea pe ou embrionate;

culturi de celule.
RH (reacia de hemaglutinare):
- evideniaz prezena virusului n produsul patologic, graie capacitii
virusului de a aglutina hematii;
- titreaz cantitatea de virus hemaglutinant.
Necesar:
- suspensie hematii de coco;
- antigen gripal:
o pentru stabilirea apariiei i multiplicrii virusului se va folosi lichid
amniotic i alantoidian din ou embrionate;
o pentru titrarea antigenelor hemaglutinante se folosesc antigene
standard, preparate pe oul embrionat.
Tehnic de lucru:
- se folosesc plcue cu godeuri;
- se repartizeaz cte 0.25 ml soluie tampon in ficare godeu;
- se adaug cte 0.25 ml antigen n primele dou godeuri; dup agitare, din al
doilea godeu se trec 0.25 ml in al treilea godeu i aa mai departe, pn
ajungem la penultimul godeu; din acesta se scoate 0.25 ml care se arunc. Sau realizat astfel diluii succesive de antigen (1/1, 1/2, 1/4, . ,1/128);
- se adaug n fiecare godeu cte 0.25 ml suspensie hematii;
- se agit placa i se las apoi n repaus la temperatura camerei, timp de 90
minute.

Interpretarea reaciei:
- reacie negativ = hematiile sedimenteaz sub forma unui disc rou cu
margini perfect regulate;
- reacie pozitiv = depozit granulos / depunere a hematiilor sub form de
umbrel cu margini neregulate; supernatantul este incolor.
Introducere: limitele diagnosticului direct prin metode clasice (avantajele lui pentru
tulpini complet noi) si de aici necesitatea diagnsoticului indirect.
Diagnostic serologic:

ELISA (Ac specifici de tip)

RIH (reacia
de
inhibare
a
hemaglutinrii) - reacia Hirst.
Principiu RIH: unele virusuri posed capacitatea de a aglutina hematii (RH).
Reacia este mpiedicat de prezena Ac prezeni n serul de testat (post-infecie sau
post-vaccinare), n prezena antigenului omolog.
RIH:
- ofer posibilitatea identificrii unui virus hemaglutinant (diagnostic direct);
- permite stabilirea diagnosticului unei viroze, prin evidenierea anticorpilor
specifici inhibitori ai hemaglutinrii n serurile testate (seruri perechi: acut si
de convalescent); dezavantajul legat de timp (scop epidemiologic si mai
putinpentru pacienti)
- permite aprecierea eficientei vaccinarii si studierea Ac-lor anamnestici, dupa
trecerea prin infectie, pentru populatii largi (serograme) seroarheologie
(istoria circulatiei virusurilor gripale, de-a lungul timpul, prin determinarea Aclor in seruri obtinute de la varstnici)
Necesar:
- seruri pacient (serul I i serul II, recoltate la 10-14 zile interval);
- antigene hemaglutinante;
- hematii.
Tehnic de lucru (pentru titrarea antigenelor prin RH):
- se realizeaza diluii duble succesive din serul imun specific, cu titru cunoscut,
n soluie tampon (0.25 ml);
- se adaug virusul la titrul cunoscut (intentionam sa reproducem titrul) (0.25
ml); nr de untitati hemaglutinante cu care se va lucra: se imparte titrul obtinut
la 8 (se lucreaza cu 8U antigenice)
- se adaug suspensia de hematii (cte 0.25 ml).
RIH:
- dilutii duble succesive de ser (dupa tratarea serului pentru indepartarea
inhibitorilor nespecifici, dilutia serului devine 1/7 un volum ser, 3 volume
periodat de potasiu, 3 volume glicerol = 1/7)
- un volum antigen (la titru cunoscut)
- un volum hematii
Martori RIH:

martor hematii;
martor antigen (titrat anterior reaciei prin RH);
2

martori seruri de referin.

Interpretare: - reacie pozitiv (sedimentarea hematiilor -buton);

- reacie negativ (hemaglutinare).
1/7

1/14

1/28

1/56

1/112 1/224 1/448

A/Beijing/262/95 (A/H1N1) 2000

Ser I +
Ser II
A/Sydney / 15 / 97 (A/H3N2) (1999)
Ser I
Ser II
B/Shandong
Ser I
Ser II

+
+

Diagnostic: infectie cu virusul gripal A/H1N1 (dinamica semnificativa)

Diagnosticul serologic n pneumonii atipice primare
Pneumonie atipic primar / pneumonie interstiial:
- pneumonie care evolueaz cu leziuni inflamatorii n interstiiul
pulmonar;
- este atipic deoarece nu induce semnele stetacustice i
radiologice descrise clasic (tipic) n pneumonia lobar;
- este primar pentru c este determinat de microorganisme
primar patogene.
Ageni etiologici: virusuri (gripal A, B; VRS, adenovirusuri, virusuri paragripale,
etc), rickettsii, chlamydii.
RFC (reacia de fixare a complementului)
Principiu: 2 complexe Ag Ac i disput aceeai cantitate de complement (C):
o Primul complex = Ag de referin i Ac prezeni n ser;
o Al doilea complex = Cuplul hemolitic sau sistemul indicator al reaciei
(hematii de oaie i ser anti-hematii de oaie).
Complexul Ag Ac format n prima reacie, fixeaz C, astfel nct a doua
reacie nu mai are loc iar hematiile rmn intacte (buton). Dac prima
reacie nu are loc (Ac specifici abseni), complementul rmne la dispoziia
cuplului hemolitic i determin hemoliz.
Reacie pozitiv = lipsa hemolizei (sedimentarea hematiilor - buton).
Reacie negativ = hemoliz.
3

Pacient A. G., 14 ani, prezint la internare frisoane, cefalee, tuse uscat. Ulterior apar
dureri musculare generalizate, stare de ru, anorexie, astenie. Rezultatele
diagnosticului serologic sunt:
Agent etiologic
Virus gripal A
Virus gripal B
Virus Paragripal 3
Adenovirus
Virus respirator sincitial
Mycoplasma
Chlamydia
Coxiella

Titru Ac ser I

Titru Ac ser II

< 1/8
< 1/8
< 1/8
1/16
< 1/8
< 1/8
< 1/8
< 1/8

1/32
< 1/8
< 1/8
1/16
< 1/8
< 1/8
< 1/8
< 1/8

Diagnostic etiologic: infectie cu virus gripal A (seroconversie);

pentru adenovirus Ac anamnestici
Pacient R. S., sugar de 4 luni, prezint dispnee, febr, cianoz, secreii nazale care
sunt antrenate spre cile respiratorii inferioare. Ipotez diagnostic clinic: broniolit.
Serodiagnosticul este urmtorul:
Agent etiologic
Virus gripal A
Virus gripal B
Virus Paragripal 3
Adenovirus
Virus respirator sincitial
Mycoplasma
Chlamydia
Coxiella

Titru Ac ser I
< 1/8
1/16
< 1/8
< 1/8
1/16
< 1/8
< 1/8
< 1/8

Titru Ac ser II
< 1/8
1/128
< 1/8
< 1/8
1/16
< 1/8
< 1/8
< 1/8

Diagnostic etiologic: infectie cu virus gripal B (dinamica semnificativa)

Pentru VRS Ac anamnestici (pot fi si de la mama; intervalul de timp dintre 2 prelevari,
prea mic, nu a permis o scadere semnificativa)