Sunteți pe pagina 1din 52

MINISTERUL EDUCAIEI, CERCETRII I INOVRII UNIVERSITATEA DUNREA DE JOS GALAI FACULTATEA TIINA SI INGINERIA ALIMENTELOR DOMENIUL INGINERIE INDUSTRIAL

REZUMAT TEZ DE DOCTORAT BIOTEHNOLOGII DE MBUNTIRE A RANDAMENTULUI N ACID ACETIC LA FERMENTAREA DIFERITELOR MEDII DE CULTUR

Conductor tiinific: Prof.dr.ing. BANU Constantin Autor: TARHON Maria Cristiana

GALAI 2009

STRUCTURA TEZEI DE DOCTORAT


Teza de doctorat conine 187 de pagini, din care partea documentar reprezint 40 de pagini, iar partea exprimental este prezentat n 144 de pagini. Lucrarea conine 41 de figuri i 81 de tabele. Adiional, sunt redate 12 imagini foto, prezentate n anexe. Pentru elaborarea tezei s-au utilizat 63 de referine bibliografice.

Mesaj de mulumire
Prin acest mesaj vreau s mulumesc tuturor celor care m-au susinut moral sau profesional pe tot parcursul desfurrii tezei de doctorat. Mulumesc d-lui profesor Banu Constantin c a fost de acord s m nscriu la dumnealui la doctorat. Mulumesc domnilor profesori de la Facultatea SIA din Galai c m-au primit cu mult drag n familia lor. Mulumesc d-nei profesor Oancea Ioana c m-a ndrumat n arta de a vedea ceea ce nu se vede cu ochiul liber microbiologia, n izolarea, identificarea i botezarea bacteriile acetice. Mulumesc domnului Lupu Cicerone, directorul Fabricii de oet - Trgu Bujor, care mia permis accesul n fabric i realizarea experimentului industrial pe unul din acetatoarele fabricii. Mulumesc prinilor mei c m-au neles i au acceptat plecarea mea de acas pentru a m mplini profesional. Mulumesc soului meu care m-a susinut i ajutat de cte ori am avut nevoie de el. Mulumesc celor care m-au ajutat i vreau s tie c atunci cnd vor avea nevoie de mine voi fi acolo mereu...

Ing. Garnai (Tarhon) Maria Cristiana

CUPRINS
1. INTRODUCERE .......................................................................................................................................... 1 2. IMPORTANA CERCETRII ....................................................................................................................... 1 3. SCOPUL I OBIECTIVELE LUCRRII ....................................................................................................... 1 PARTEA I - STUDIU DOCUMENTAR 1. STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND OBINEREA OETULUI 1.1. Materii prime folosite n industria oetului............................................................................................... 2 1.2. Nutrimente folosite la fabricarea oetului ................................................................................................ 2 1.3. Bacterii acetice caractere morfofiziologice ....................................................................................... 3 1.4. Biochimismul fermentaiei acetice ........................................................................................................ 4 1.5. Factorii care influeneaz fermentaia acetic ........................ .............................................................. 5 1.6. Procedee de obinere a oetului .............................................................................................................. 6 1.7. Factorii care influeneaz calitatea oetului ........................................................................................... 7 1.8. Tipuri de oet de fermentaie i caracteristici compoziionale ............................................................ 7 PARTEA a II-a - REZULTATELE CERCETRII EXPERIMENTALE 2. MATERIALE, METODE I APARATUR UTILIZATE N CERCETRILE EXPERIMENTALE EFECTUATE N CONDIII DE LABORATOR ......................................................................................................................... 8 2.1. Materiale ................................................................................................................................................. 8 2.2. Metode de analiz .................................................................................................................................. 8 2.3. Aparatur utilizat n experimentri .................................................................................................... 9 3. ANALIZA FIZICO-CHIMIC A MATERIILOR PRIME UTILIZATE N PREPARAREA MEDIILOR DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE.......................................................................................................... 9 3.1. Materii prime i auxiliare ...................................................................................................................... 9 3.2. Metode de analiz ................................................................................................................................ 10 4. OBINEREA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE ............................................................................. 10 4.1. Izolarea i obinerea n culturi pure a bacteriilor acetice din vin i cidru ..................................... 10 4.2. Verificarea puritii culturilor pe baza observaiilor macro i microscopice................................ 10 4.3. Teste biochimice de identificare a bacteriilor acetice i stabilirea apartenenei n clasificare .. 11 4.4. Concluzii............................................................................................................................................... 11 5. ACTIVITATEA FERMENTATIV I EFICIENA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE SUB INFLUENA PRINCIPALILOR FACTORI (materii prime, concentraia alcoolic, aciditatea, temperatura, SO2, pH-ul) i a materiilor auxiliare (extract de drojdie, extract de porumb i diferite amestecuri de sruri) .............................................................................................................................................................. 12 5.1. Cercetri privind utilizarea ca materie prim a alcoolului de fermentaie n tehnologia de obinere a oetului ........................................................................................................................................... 12 5.2. Cercetri asupra utilizrii vinului ca materie prim n tehnologia oetului - n mod singular i n asociere cu alcool de fermentaie.................................................................................................................. 19 5.3. Experimente privind studiul fermentaiei acetice n vin roze i rou - cu diferite tulpini de bacterii acetice................................................................................................................................................. 22 5.4. Influena unor sruri de amoniu folosite singular sau mixt n diferite medii de cultivare a bacteriilor acetice ............................................................................................................................................ 24 6. EXPERIMENT INDUSTRIAL N SISTEM CU ACETATOR FRINGS ......................................................... 27 6.1. Pregtirea inoculului de bacterii acetice ......................................................................................... 27 6.2. Rezultatele cercetrii industriale...................................................................................................... 29 7. PROIECTAREA I STABILIREA PARAMETRILOR DE FUNCIONARE A UNEI INSTALAII DE PRODUCERE A OETULUI N SISTEM SUBMERS....................................................................................... 33 7.1. Prezentarea instalaiei de laborator cu funcionare n sistem submers ...................................... 33 7.2. Funcionarea instalaiei de laborator............................................................................................... 33 7.3. Rezultate experimentale .................................................................................................................... 33 8. CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI............................................................................................ 36 BIBLIOGRAFIE................................................................................................................................................. 40 ANEXE .............................................................................................................................................................. 42

INTRODUCERE
Oetul este un produs al fermentaiei acetice cunoscut nc din antichitate. Din cele mai vechi timpuri grecii, indienii, babilonienii, perii obineau oet din vin, bere, struguri, curmale i alte fructe. Cu toate acestea, natura procesului de obinere a oetului ncepe a fi cunoscut abia n anul 1837 de ctre Kutzing, care emite ipoteza transformrii alcoolului n acid acetic prin intermediul microorganismelor. Mai trziu (1864 - 1868) Pasteur, este cel care confirm aceast ipotez i totodat descrie agentul de fermentare sub termenul de Micoderma aceti. [35]

IMPORTANA CERCETRII
S-a realizat o cercetare tiinific n ceea ce privete stabilirea unor variante tehnologice de obinere a oetului pe cale fermentativ, n mod ct mai eficient sub raportul randamentului, utiliznd alcoolul etilic dublu rafinat i vinul, materii prime de care se dispune n ara noastr. n Romnia oetul se obine din vin sau din vin n amestec cu alcool etilic dublu rafinat (din cereale) i ap. Lund n considerare faptul c ara noastr nu duce lips de alcool de fermentaie (spirt) i, n plus, gradul alcoolic al spirtului este mai ieftin dect al vinului, am considerat c intereseaz i studiul obinerii oetului din alcool rafinat - folosit ca materie prim n mediu de fermentare mbogit cu substane nutritive.

SCOPUL I OBIECTIVELE LUCRRII


Scopul lucrrii de doctorat Biotehnologii de mbuntire a randamentului n acid acetic prin fermentarea diferitelor medii de cultur este acela de a izola cele mai performante tulpini de bacterii acetice i de a optimiza condiiile de lucru n vederea obinerii unui produs de calitate superioar, care s corespund normelor europene. Pentru atingerea scopului menionat ne-am propus realizarea urmtoarelor obiective: 9 Analiza materiilor prime utilizate: - analiza vinului; - analiza spirtului; - analiza apei potabile folosite la diluarea spirtului (alcool etilic rafinat); 9 Izolarea i pstrarea n cultur pur a tulpinilor de bacterii acetice selecionate; 9 Identificarea tulpinilor de bacterii acetice selecionare; 9 Determinarea potenialului fermentativ al tulpinilor de Acetobacter izolate; 9 Utilizarea tulpinilor de bacterii acetice selecionate pentru obinerea oetului n sistem static i dinamic; 9 Analiza oetului ca produs finit.

PARTEA I STUDIU DOCUMENTAR CAPITOLUL I. STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND OBINEREA OETULUI 1.1. Materii prime folosite n industria oetului
Oetul de fermentaie, dup felul materiei prime folosite la fabricarea lui, poate fi oet din: - vin, vin pichet, cidru de mere; - alcool etilic diluat (cu 1012% alcool) obinut din melas, cereale, cartofi etc.; - diverse soluii alcoolice obinute prin fermentaia alcoolic a unor: sucuri de fructe (pere, smochine, piersici, caise, curmale, ananas) sau materii prime amidonoase; - miere (hidromel); - must de mal. Fiecare ar folosete n fabricarea oetului materia prim de care dispune. Totui, se poate sublinia, c vinul, cidrul, spirtul (la care se adaug nutrimente) i berea sunt considerate materiile prime de baz pentru industria oetului, deoarece conin toate substanele necesare dezvoltrii i multiplicrii bacteriilor acetice ntr-o form uor asimilabil. n Frana, Italia, Spania vinul reprezint principala materie prim n fabricarea oetului, aa cum cidrul este materia prim pe care se bazeaz producia de oet din S.U.A., sau aa cum malul i berea reprezint materia prim n Anglia. Materia prim folosit n industria oetului trebuie s nu conin inhibitori i, prin compoziia sa, s furnizeze bacteriilor acetice elementele plastice i catalitice indispensabile nmulirii i realizrii biochimismului fermentaiei acetice. [37] Condiia esenial a obinerii oetului este ca materia prim s conin alcool etilic. Aceste materii prime se pot folosi individual sau n amestec, cu sau fr adaos de ap. Concentraia de alcool etilic din soluia hidroalcoolic se regleaz ntre 3,5 17%, n funcie de tria acetic ce urmeaz s fie obinut i randamentul de conversie corespunztor tehnologiei folosite, corelat i cu capacitatea fermentativ a culturii de bacterii acetice utilizate.[11]

1.2. Nutrimente folosite la fabricarea oetului


Pentru desfurarea fermentaiei acetice n bune condiii, bacteriile acetice au nevoie, pe lng alcool etilic i oxigen, de nutrimente secundare i de factori de cretere. n cazul n care oetul se obine din vin, prezint mai puin importan suplimentarea plmezii cu factori nutritivi, deoarece vinul asigur necesarul n azot, fosfor, substane nutritive. n condiiile n care oetul se obine din spirt diluat n amestec cu vin, sau numai din spirt diluat, devine o necesitate a se mbogii mediul alcoolic cu substane nutritive (sruri, vitamine), care s permit o bun dezvoltare a bacteriilor acetice, asigurndu-se astfel o vitez de fermentare convenabil i un randament sporit n acid acetic. n scopul suplimentrii plmezilor cu substane nutritive se pot folosi diverse sruri (i anume fosfai i sulfai) ca: (NH4)2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, (NH4)2SO4, care se pot folosi separat sau asociate, n proporie de 0,2 0,5 g/l. De asemenea, plmezile pot fi optimizate n ceea ce privete coninutul n substane nutritive i prin adaos de autolizat de drojdie, extract de mal sau extract de porumb. Ca surs de azot bacteriile acetice pot s foloseasc srurile de amoniu, aminoacizii (valin, alanin, izoleucin, cistein, histidin, prolin) i peptonele, iar ca nutrieni, care se

pot ntlni mai mult sau mai puin i n unele surse organice, se utilizeaz extractul de drojdie sau de porumb. Extractul de porumb este subprodus al fabricrii amidonului, care rezult prin concentrarea apei de nmuiere a boabelor de porumb nainte de mcinare. Se folosete i in industria antibioticelor. [24] Nevoia fa de factori de cretere variaz de la o tulpin la alta, astfel bacteriile acetice sunt auxotrofe fa de vitaminele: acid para-aminobenzoic, niacin (B3), tiamin (B1), acid pantotenic (B5) (vitamine ale grupului B).[37]

1.3. Bacterii acetice caractere morfofiziologice


Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe, nesporulate, Gram negative, grupate n perechi sau lanuri, cu dimensiuni variabile (0,5 0,8) (0,9 4,2) m. Pot fi mobile sau imobile, cu cili polari sau peritrichi. Acetobacter suboxydans prezint cili dispui lofotrichi, cu lungimea de 4,5 m, ca i Acetobacter melanogenum. De asemenea, specia Acetobacter aceti prezint cili monotrichi, cu lungimea de 11,7 m. n mediu acid, n timp, pot s apar forme de involuie, ramificate, care i pierd capacitatea de reproducere. Majoritatea au form de bastonae drepte sau curbate. Cele din vin prezint o uoar gtuire. Unele specii au posibilitatea de a forma zooglee (Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides). n medii lichide (n cultur staionar) se dezvolt sub forma unui voal fragil, care pe msura creterii n dimensiuni se ridic pe pereii vasului (Acetobacter ascendens, Acetobacter aceti). S-a observat c puterea de acidifiere a bacteriilor este cu att mai mic, cu ct voalul este mai gros i mai afundat n lichid. Alte specii, cum sunt Acetobacter xylinum i Acetobacter xylinoides, formeaz un strat gelatinos de natur - glucanic (n vinul oeit sau n oet), care blocheaz circuitul normal al aerului n cazul fermentatoarelor cu tala cu consecine nedorite. [25] Pe medii de cultur solide, bacteriile acetice formeaz (n funcie de natura lor) colonii cu aspect diferit, netede sau cutate, umede sau uscate, de culoare alb, alb-roz, brune. Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optim de dezvoltare este de 22-33oC, n funcie de specie) i produc fermentaia acetic ntr-un domeniu larg de temperatur (1040oC). Temperatura minim de dezvoltare pentru majoritatea bacteriilor acetice este de 10oC, ns sunt i specii care se pot dezvolta la 6-7oC. Temperatura maxim de dezvoltare pentru cele mai multe bacterii acetice este n jur de 40oC, cu meniunea c sunt i cazuri de excepie. Spre exemplu, Acetobacter xylinum se dezvolt i la 50oC, iar Acetobacter industrium se dezvolt numai pn la temperatura de 28oC. Bacteriile acetice au o termorezisten sczut n mediu lichid, cu pH acid, inactivarea lor avnd loc ntr-un minut la 60oC ; n timp ce bacteriile reinute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100oC). [6] Bacteriile acetice sunt tolerante la acid i concentraii de pn la 2o acetice activeaz creterea celular. Rezistena la acid acetic se poate explica prin aceea c membrana acestor bacterii are un coninut ridicat n acizi grai saturai, motiv pentru care este relativ impermeabil la acidul acetic, care se gsete sub form nedisociat n mediile fermentate industrial. Valoarea optim de pH pentru creterea bacteriilor acetice este de 5,5; iar pH-ul limit se situeaz la nivel de 2,5. Bacteriile acetice au un echipament enzimatic complex, n care sunt prezente dehidrogenaze foarte active, localizate n sistemele membranare cuplate cu lanul citocromic, enzime ale ciclului Krebs, care le permite oxidarea a circa 80 de produi (alcooli, glucide, acizi organici), printre care i acidul acetic. La oxidarea acidului acetic particip unele specii de bacterii din genul Acetobacter, productoare de acid acetic (Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter

pasteurianum, Acetobacter hansenii). Aceste bacterii posed toate enzimele care particip la ciclul acizilor tricarboxilici. Acidul acetic inhib oxidarea sa de ctre bacteriile acetice la concentraii mai mari de 8o acid acetic i la pH = 3,0. Dintre sursele de carbon utilizate preferenial, alcoolul etilic este oxidat la acid acetic, iar glucoza la acid gluconic i acid 5-cetogluconic. Bacteriile din genul Gluconobacter utilizeaz ca principale surse de carbon: glucoza i etanolul. Bacteriile din genul Acetobacter folosesc ca surse de carbon: etanolul, lactatul, hexozele i glicerolul. Bacteriile din genul Acetobacter pot s oxideze i acetalii la CO2 i H2O, cnd alcoolul etilic a fost consumat din mediu, pentru c alcoolul etilic inhib activitatea enzimelor de oxidare a acetalului. Ca surs de azot bacteriile acetice pot s foloseasc srurile de amoniu, aminoacizii (valin, alanin, izoleucin, cistein, histidin, prolin), peptonele i alte surse de azot organic, cum sunt extractul de drojdie, de carne sau de porumb. [28] Nevoia fa de factori de cretere variaz de la o tulpin la alta, astfel bacteriile acetice sunt auxotrofe fa de vitaminele: acid para-aminobenzoic, niacin, tiamin, acid pantotenic i fa de alte vitamine din grupului B. Bacteriile sunt rspndite, n natur, pe produsele vegetale (fructe, frunze, flori) si transportul lor este favorizat de insecte (musculia de oet: Drosophilla) i nematode (Anquillula aceti). [12]

1.4. Biochimismul fermentaiei acetice


Reacia general a fermentaiei acetice este urmtoarea:
CH3 - CH2 - OH + O2 CH3 - COOH + H2O + ATP 46 32 60 18

(1)

Din ecuaia general rezult c, sub aciunea bacteriilor acetice, alcoolul este oxidat n acid acetic, fr a trece prin faza intermediar de aldehid acetic. n realitate, n urma cercetrilor ntreprinse de Dupny P. i Maugen J. (1962), s-a demonstrat experimental c la fermentaia acetic se formeaz ca produs intermediar acetaldehida, fapt dovedit prin adaos n mediu de fermentare a sulfitului sau bisulfitului de calciu, care blocheaz transformarea acetaldehidei n acid acetic:
OH CH3 C O + Ca (HSO3)2 H CH3 C H SO3 Ca++
-

(2) Produsul format nu este oxidat de bacteriile acetice i se acumuleaz n mediu, fermentaia acetic blocndu-se. [32] Mecanismul fermentaiei acetice implic participarea unor dehidrogenaze care au drept cofactor NADP. Hidrogenul format este transferat de enzimele catenei respiratorii celulare pe oxigenul molecular provenit din aerul folosit pentru oxigenarea substratului. n acest fel, n mediu se acumuleaz acid acetic, viteza de conversie a alcoolului etilic n acid acetic depinznd de specia de bacterie acetic, natura substratului, nivelul de aprovizionare cu oxigen i de temperatura la care are loc fermentarea. Viteza de conversie scade odat cu acumularea acidului acetic n mediul de fermentaie. [29] n figura 1. se prezint mecanismul biochimic al fermentaiei acetice. Dup Riberau Gayon i colaboratorii (1975) alcool - dehidrogenaza are pH optim la ~ 5, iar aldehid - dehidrogenaza are pH optim la ~ 6. Se consider c exist i o cale colateral de transformare a acetaldehidei printr-o reacie de disproporionare:
CH3 C O H + CH3 C O H + H2O CH3 C O OH + CH3 CH2 OH

(3)

Etanolul format n cazul prezentat n relaia (3) se poate oxida din nou conform schemei din figura 1 (anexa 1). Proporia de acid acetic care se formeaz pe aceast cale colateral n raport cu calea principal nu este cunoscut pn n prezent.
C H
3

C H 2 a lc o o l e tilic

O H
N A D P
+

a lc o o l d e h id ro g e n a z a N A D P H + H
+

C H

O H
h id ra ta z a

a ld e h id a a c e tic a

2 H

O C H
3

H O H O H

a ld e h id a a c e tic a h id r a ta ta N A D P
+

a ld e h id d e h id ro g e n a z a
+

N A D P H + H

C H

C O O 3 a c id a c e t ic

N A D P

2 N A D P H 2 F A D H 2 F A D
+

O H

O H

4 H

4 F e

+ +

- c ito c r o m

4 F e

+ + +

- c ito c r o m

2 O

Fig. 1. Biochimismul fermentaiei acetice

1.5. Factorii care influeneaz fermentaia acetic


Factorii mai importani care influeneaz fermentaia acetic se refer la: compoziia chimic a substratului, temperatura de fermentare, aciditatea iniial a substratului alcoolic, concentraia n alcool a substratului fermentativ, numrul de bacterii acetice inoculate n substrat, aerarea substratului, concentraia n acid acetic acumulat n substratul ce fermenteaz, prezena agenilor duntori. [3]

1.6. Procedee de obinere a oetului


Tehnologia de fabricare a oetului nu difer esenial n funcie de substratul alcoolic folosit (vin sau soluie hidro-alcoolic preparat din spirt). n figura 1.a. este prezentat schema tehnologic general de fabricare a oetului de fermentaie din materii prime amidonoase i zaharoase. Operaiile importante care implic aspecte biotehnologice se refer la prepararea substratului pentru fermentaia alcoolica, fermentaia acetica a substratului hidroalcoolic si maturarea, n special, n cazul oetului de vin i de fructe. [6], [42] n figurile 1.b. i n 1.c. sunt prezentate schemele tehnologice de fabricare a oetului din vin i respectiv , din spirt.
Materii prime amidonoase: orz, orez, porumb, cartofi, etc. Zaharificare (enzime din mal sau mucegai) Materii prime zaharoase: mere, banane, ananas, etc. Extracie, presare struguri,

Glucide fermentescibile (zaharoza, maltoza, glucoza, fructoza) Fermentaie alcoolica Saccharomyces cerevisiae C6H12O6 Condiii anaerobe Alcool etilic C2H5OH + O2 Acetificare bacterii acetice Oet Fig. 1.a. Schema tehnologic general de obinere a oetului de fermentaie din materii prime amidonoase i zaharoase Vin alb Aerare puternic pentru desulfitare
(n cazul vinului sulfitat)

2 C2H5OH + 2 CO2

CH3 COOH + H2O

Introducerea vinului n acetatorul umplut cu tala i mbibat cu oet fin Acetificare la 28...32oC pn la un coninut rezidual de 0,2% alcool etilic Oet brut Filtrare Pasteurizare / rcire Maturare (nvechire) Filtrare mbuteliere Depozitare Fig. 1.b. Schema tehnologic de obinere a oetului din vin n acetatoare cu tala

Glucoz

Ap

Oet de 7o

Alcool etilic (96o) Acidifiere soluie

Nutrimente

Inocul dintr-o arj anterioar 20%

Diluare cu ap pn la 12 % alcool etilic Pregtirea substratului hidroalcoolic Fermentare la 30oC pn la un nivel rezidual de 0,2 % alcool etilic n acetator pregtit n prealabil Maturarea oetului 7 zile Clarificare prin filtrare mbuteliere Depozitare Fig. 1.c. Schema tehnologic de obinere a oetului din spirt

Procedeele de realizare a fermentaiei acetice difer ntre ele n funcie de viteza de formare a acidului acetic i implicit n funcie de modul de aerare, i pot fi clasificate n dou categorii: procedee lente; procedee rapide. Procedeele lente pot fi: de tip clasic i de tip Orleans. Procedeele rapide pot fi: a) procedee la care contactul soluiei alcoolice cu aerul se face prin distribuirea soluiei respective pe o coloan de umplutur inert; b) procedee submerse. [1], [3], [6].

1.7. Factorii care influeneaz calitatea oetului


Factorii care influeneaz calitatea oetului sunt urmtorii: - maturarea; - clarificarea; - pasteurizarea. [ 62]

1.8. Tipuri de oet de fermentaie i caracteristici compoziionale


Influena procesului tehnologic asupra calitii oetului de fermentaie nu este neglijabil i n anumite cazuri (oetul balsamic) este extrem de important. Cu toate acestea, cel mai important factor este materia prim. n funcie de natura materiei prime, exist cteva tipuri distincte de oet, enumerate n continuare: oetul din vin[50], oetul din fructe[27], oetul din orez, oetul din must de bere, oetul din spirt, oetul din zer, oetul balsamic [16], [17], oetul de Filipine, oetul Thai. [35], [6] Indicii compoziionali ai oetului variaz foarte mult n funcie de materiile prime folosite i tehnologia adoptat (tabelul 1) Anexa 1.

PARTEA a II-a REZULTATELE CERCETRII CAPITOLUL II. MATERIALE, METODE I APARATUR UTILIZATE N CERCETRILE EXPERIMENTALE EFECTUATE N CONDIII DE LABORATOR 2.1. Materiale
Studiul s-a efectuat pe urmtoarele materii prime: - vin alb de la Societatea "Vinificaie i Buturi" S.A. Galai. ; - vin roze de la Societatea "Vinificaie i Buturi" S.A. Galai; - vin rou de la Societatea "Vinificaie i Buturi" S.A. Galai; - alcool etilic concentrat care a fost diluat cu ap distilat pn la obinerea diferitelor concentraii . Materiile auxiliare folosite au fost: - apa potabil i apa potabil sterilizat; - nutrimeni: extractul de drojdie, extractul de porumb, diferite sruri (fosfai sau sulfai).

2.2. Metode de analiz


Pentru atingerea obiectivelor stabilite i rezolvarea tematicii tezei de doctorat, s-a impus utilizarea unor metode de analiz microbiologice, senzoriale, fizico-chimice i biochimice. Pentru realizarea analizelor materiilor prime am utilizat STAS - urile din domeniu, astfel:
- SR 184 ALCOOL ETILIC I BUTURI ALCOOLICE, Analiza senzorial; - STAS 184/287 ALCOOL ETILIC I BUTURI ALCOOLICE, Determinarea concentraiei alcoolice; - STAS 184/2/A1 ALCOOL ETILIC I BUTURI ALCOOLICE, Determinarea concentraiei alcoolice; - STAS 6182/1-79 VIN, Determinarea aciditii totale; - STAS 6182/2-86 VIN, Determinarea aciditii volatile; - STAS 6182/6-70 VIN, Determinarea concentraiei alcoolice; - STAS 6182/8-71 VIN, Determinarea densitii; - STAS 6182/9-80 VIN, Determinarea extractului sec total; - STAS 6182/10-71 VIN, Determinarea fierului; - STAS 3001-91 AP POTABIL, - STAS 6322-61 AP POTABIL, Determinarea culorii; - STAS 6324-61 AP POTABIL, Determinarea temperaturii, mirosului i gustului; - STAS 157-86 OET ALIMENTAR; - SR EN 13188 OET.PRODUS FABRICAT DIN LICHIDE DE ORIGINE AGRICOL. DEFINIII, PRESCRIPII, MARCARE.

Metode de studiu a microorganismelor n stare colorat n aceast direcie s-au avut n vedere urmtoarele: a) obinerea i studiul preparatelor umede; b) tehnici de evaluare a numrului de microorganisme; c) tehnici de studiu i identificare a microorganismelor.[23], [24], [29] Teste de difereniere a speciilor de bacterii acetice Diferenierea diferitelor specii de bacterii acetice s-a fcut pe baza unor teste fiziologice i biochimice, i anume: reacia catalazei, producia de acid acetic, proprietatea de a metaboliza acidul lactic, puterea cetogen, formarea de acid gluconic, asimilarea NH3 n prezena alcoolului etilic, oxidarea 2,3 butandiolului n acetoin, producerea de celuloz (mucilagii) [8], [2]

2.3. Aparatur utilizat n experimentri


Aparatura utilizat n experimentri a fost urmtoarea: microscop de laborator tip ML-4M; microscop cu aparat foto-color ncorporat; set Multi 350i dotat cu pH-metru i oxi-metru; alcoolmetrul Dujardin-Salleron; spectofotometruDR/2010; pomp de aerResun-AC 9601; pomp de recirculare a lichidului AquaEL-tip FAN-mini; etuv electronic Stericell cu nregistrator (utilizat pentru sterilizarea ustensilelor de laborator); autoclav tip Autoclave AE 75 DRY cu nregistrator; balan analitic. Pentru desfurarea n bune condiii a activitii de cercetare a mai fost nevoie de sticlrie i ustensile de laborator, de asemenea i de trusa de colorare Gram.

CAPITOLUL III. ANALIZA FIZICO-CHIMIC A MATERIILOR PRIME UTILIZATE LA PREPARAREA MEDIILOR DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE 3.1. Materii prime i auxiliare
n experimentele de laborator efectuate, ca i n cele industriale, am folosit ca materii prime vinul alb, roze i vinul rou (tabelul 3.1.), alcoolul rafinat (spirt) (tabelul 3.2.) n amestec cu apa i cu adaos de nutrimeni (tabelul 3.3). [19] Tabelul 3.1. Caracteristicile fizico-chimice ale vinului-materie prim
Materia prim Vin alb Vin rou Vin rose Caracteristicile materiei prime Aciditate g ac. acetic / 100 ml 0.6 2 0,7 Alcool, % vol 8 9 6,0 pH 4,05 4,27 4,30 SO2 total, mg/l 33,6 liber, mg/l 19,2 Antociani mg/100 ml 81,75 20,00

Tabelul 3.2 Caracteristicile fizico-chimice ale alcoolului etilic


Proprietile fizico-chimice Coninut alcool etilic Metanol Alcool izo-propilic Compui carbonilici Aciditate n acid acetic Alcalinitate Valorile % vol. min. 94 % vol. max. 0,1 % vol. max. 0,003 % max. 0,05 % max. 0,005 % max. 0,0003

Tabelul 3.3 Caracteristicile fizico-chimice ale extractului de porumb (Ep)


Proprietile fizico-chimice Substana uscat Cenua Azot proteic Azot aminic Acid lactic Dioxid de sulf Fier Cupru Valorile 48% > 20% (fa de S.U.) Min. 42% Min. 2,5% 6,46% 0,2% 0,05% 0.012%

Principalele caracteristici ale extractului de drojdie (Ed) folosit ca supliment nutritiv n fermentaia acetic sunt prezentate n continuare: preparat pulbere, foarte higroscopic, care trebuie pstrat bine nchis i la temperaturi mai mici de 30oC; se dizolv n alcool sau n ap deionizat (3 10 g/l) i rezult o soluie clar cu pH = 6,6 0,2; surs natural de vitamina B complex. Firme productoare: Difco LaboratoriesDetroit Michigan SUA; Merck Darmstadt, .a. [22]

10

3.2. Metode de analiz


Analizele efectuate pentru: stabilirea principalelor caracteristici ale materiilor prime, n scopul izolrii i seleciei de material biologic (bacterii acetice), pentru urmrirea dinamicii fermentaiei acetice realizat cu diferite tulpini de bacterii acetice i pentru caracterizarea produsului finit a oetului, sunt de natur microbiologic, biochimic, senzorial i fizicochimic. Pentru analiza materiilor prime care se refer la densitate, concentraie n alcool, aciditate, extract, coninutul n SO2, n fier, am consultat i aplicat STAS - urile din domeniul Alcool etilic buturi alcoolice. Determinrile menionate au fost efectuate n laboratoarele de chimie, microbiologie i biochimie din cadrul Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor. [15], [19], [20]

CAPITOLUL IV. OBINEREA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE 4.1. Izolarea i obinerea culturilor pure de bacterii acetice din vin i cidru
Pentru a dispune de materialul biologic, respectiv de bacteriile acetice necesare n scopul realizrii temei de doctorat, am cutat i izolat bacterii acetice din diferite probe de vin i cidru, cu aciditate volatil crescut, provenite din judeele Galai, Buzu i Dmbovia. n scopul izolrii de culturi pure de bacterii acetice am practicat tehnica cunoscut de izolare prin metoda de rspndire, folosit pe scar larg prin diluarea n medii lichide i prin diseminarea mecanic a celulelor pe suprafaa mediilor solide (mustul de mal agarizat (cu 6% extract refractometric, 4% alcool i 0,2% acid acetic). n cercetarea de laborator am folosit n special metoda scarificat. Culturile pure obinute au fost studiat macro - i microscopic, examinnd preparate microscopice umede i uscate, colorate simplu i Gram. [8] Culturile formate din bastonae mai mici sau mai mari, din celule izolate sau dispuse n perechi ori lanuri, care n urma colorrii difereniate Gram s-au comportat ca bacterii Gramnegative (caracteristic pentru bacteriile acetice), au rmas n continuare n atenia noastr. [16] Odat cu examinarea acestor culturi s-a avut n vedere i eventualul caracter de ascensiune pe pereii vasului. Pe lng examenul direct microscopic al culturilor, presupuse ca bacterii acetice, s-a urmrit i creterea aciditii ca efect al activitii acestor bacterii, n comparaie cu aciditatea probei de mediu nutritiv martor, nensmnat. Din culturile cu bacterii Gram-negative i cu aciditate crescut, s-au efectuat rensmnri, pentru a dispune de aceste bacterii n culturi pure. [15]

4.2. Verificarea puritii culturilor pe baza observaiilor macro - i microscopice


Dup izolarea bacteriilor acetice cu ajutorul mediilor lichide alcoolice, am verificat puritatea culturilor obinute, prin nsmnri pe medii de cultur solide (formate din must de mal cu 4% alcool, 0,2% acid acetic i 1,5-2% geloz). Alcoolul a fost adugat odat cu repartizarea n cutii Petri sterile a mediului de cultur fluidificat i rcit la 35 40oC. nsmnarea din culturile izolate, pe mediul alcoolic solid, s-a realizat utiliznd metoda de nsmnare scarificat. Cu firul metalic steril al ansei, ncrcat cu celule, s-au trasat striuri astfel nct pe mediile din cutiile Petri s se nsmneze ct mai puine celule, care s rmn ataate de mediu i ct mai izolate (figura 4.1).

11

Figura 4.1 Dup termostatarea cutiilor Petri cu medii de cultur nsmnate, timp de 4 5 zile, la temperatura de 25 30oC (practic dup dezvoltarea coloniilor), s-au fcut repicri n medii nutritive din coloniile cele mai izolate. Asupra coloniilor s-au fcut constatri privind aspectul, culoarea, consistena, i anume dac aspectul este neted, lucios sau mat, umed sau uscat i zbrcit, de consisten cremoas, mucilaginoas, de culoare alb, crem, roz sau neagr.

4.3. Teste biochimice de identificare a bacteriilor acetice i stabilirea apartenenei filogenetice


Lund n considerare datele rezultate din aceste teste i interpretnd rezultatele obinute dup indicaiile nscrise n tabelul 4.1 (anexa 1) am realizat identificarea bacteriilor acetice izolate. Concluzii 9 Testul lactatului indic faptul c cele 14 culturi de bacterii acetice aparin genului Acetobacter. 9 Testul glicerolului i al catalazei i observaiile macro - i microscopice au artat c cele 14 culturi pure de bacterii acetice aparin speciei Acetobacter aceti. 9 Tulpinile de Acetobacter aceti, care nu s-au dezvoltat pe mediul de cultur Hoyer Frateur, i anume Ai, A10 i T10, aparin subspeciei Acetobacter aceti orleansis. 9 Tulpina A14, care produce celuloz i care formeaz o membran groas mucilaginoas, s-a identificat ca fiind subspecia Acetobacter aceti xylinum. 9 Celelalte 10 tulpini de Acetobacter aceti care se dezvolt pe mediul Hoyer - Frateur, care nu produc celulaz i nici pigment, i anume tulpinile C2, C3, 2Gl, 3Gl, S, Bz, 3Gi, T5, T6, T8 aparin subspeciei Acetobacter aceti subspec. aceti. 9 Coloniile dezvoltate pe mediu solid au fost studiate macroscopic din punct de vedere al testului de oxidare a glicerolului, gradului de dezvoltare, formei, profilului, felului marginii coloniei, aspectului acesteia i culorii. Din punct de vedere al dezvoltrii foarte bine s-au comportat tulpinile Ai, A10, 2Gl, 3Gl, T10, T5, T6 i T8, aa cum se observ n tabelele 4.3 4.5 (prezentate n anexa 2).

CAPITOLUL V. ACTIVITATEA FERMENTATIV I EFICIENA CULTURILOR DE BACTERII ACETICE SUB INFLUENA PRINCIPALILOR FACTORI
(MATERII PRIME, CONCENTRAIA ALCOOLIC, ACIDITATEA, TEMPERATURA, pH-ul) I A MATERIILOR AUXILIARE (EP, Ed, sruri) 5.1. CERCETRI PRIVIND UTILIZAREA CA MATERIE PRIM A ALCOOLULUI DE FERMENTAIE N TEHNOLOGIA DE OBINERE A OETULUI n acest studiu sunt prezentate rezultatele cercetrilor asupra fermentaiei acetice, n diferite variante ale mediului de cultivare, cu diferite tulpini de Acetobacter izolate n prealabil. Experimentele efectuate n condiii de laborator au fost orientate n dou direcii principale: 5.1.1. o direcie, n care variabila n mediul de cultivare o reprezint att aciditatea, ct i alcoolul;

12

5.1.2. o alt direcie, n care variabila o reprezint numai alcoolul, n timp ce aciditatea iniial a mediului de cultivare, n toate variantele, este aceeai. Ca nutriment, n mediile de cultur, s-a folosit extractul de porumb indigen, subprodus al Fabricii de Amidon i Glucoz Trgul Secuiesc, produs apreciat n literatura de specialitate, n special, ca surs ieftin de azot. 5.1.1. Cercetrile efectuate cu 13 tulpini de Acetobacter, n 5 variante ale mediului de cultivare, scot n eviden sensibilitatea i rezistena fiecrei tulpini la aciditatea iniial a mediului de cultivare. Pentru fiecare tulpin de bacterii acetice experimentat se pot observa aspectele cele mai importante referitoare la variantele optime ale mediului de cultivare din punct de vedere al eficienei activitii fermentative. n stabilirea acestor condiii trebuie, ns, s se in seama de proprietile i comportarea fiecrei tulpini de Acetobacter folosit ca agent de fermentare. n sistem static, n recipieni de sticl i la temperatura de 25oC n probe de 200 ml n condiii identice, au fost cultivate cele 10 tulpini de Acetobacter, una industrial i 9 tulpini izolate din vinuri i cidru din 3 judee: Dmbovia, Galai i Buzu. Cele 5 medii de cultivare au n comun nutrimentul folosit (1 % extract de porumb). Coninutul n acid acetic al mediului de fermentaie a variat ntre 2 i 6 % iar alcoolul ntre 9 i 5 %. nsmnarea mediilor cu bacterii acetice s-a efectuat la toate probele n condiii identice, cu aceeai cantitate de inocul. Periodic s-a urmrit aciditatea titrabil exprimat n acid acetic i, n final, pH-ul i alcoolul rezidual. Datele analitice sunt cuprinse n tabelele 1 10, n urma crora se pot face recomandri utile n cazul valorificrii acestui material biologic n figurile 5.1-5.5 este prezentat dinamica procesului de fermentaie acetic a tulpinilor de bacterii acetice studiate.
A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 zile 14 zile 21 zile 28 zile 35 zile 42 zile 49 zile Durata fermentatiei zile Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3Gi
A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l

10

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 zile 14 zile 21 zile 28 zile 35 zile 42 zile 49 zile Durata fermentatiei, zile

Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3Gi

Figura 5.1. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziia mediului: alcool etilic 9%, acid acetic 2%, extract de porumb 1%)
A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 zile 14 zile 21 zile 28 zile 35 zile 42 zile 49 zile Durata fermentatiei, zile Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3Gi

Figura 5.2. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziia mediului: alcool etilic 8%, acid acetic 3%, extract de porumb 1%)
A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
7 zile 14 zile 21 zile 28 zile 35 zile 42 zile 49 zile Durata fermentatiei, zile

Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3Gi

Figura 5.3. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziia mediului: alcool etilic 7%, acid acetic 4%, extract de porumb 1%)

Figura 5.4. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziia mediului: alcool etilic 6%, acid acetic 5%, extract de porumb 1%)

13
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 zile 14 zile 21 zile 28 zile 35 zile 42 zile 49 zile Durata fermentatiei, zile

A c id it a t e a t it r a b ila g a c id a c e t ic / 1 0 0 m l

Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3Gi

Figura 5.5. Dinamica procesului de acetificare cu diferite tulpini de bacterii acetice (compoziia mediului: alcool etilic 5%, acid acetic 6%, extract de porumb 1%)

Tulpinile de bacterii acetice T5, T6, T8 s-au dezvoltat foarte slab n aceste condiii de mediu. n tabelele 5.15.6 este prezentat clasamentul tulpinilor n funcie de compoziia mediului de cultur. Tabelul 5.1
Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice n funcie de eficiena lor (varianta de mediului de cultur V1)
Compoziia mediului de cultur Clasarea tulpinilor dup rezultatele obinute T10 2 Gl A10, 3 Gl S C3, Ai Bz 3 Gi C2 Locul n clasament 1 2 3 4 5 6 7 8 Tulpina de Acetobacter folosit ca inocul [5%] Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi Aciditatea final a oetului g acid acetic / 100 ml 8,33 8,75 7,64 8,33 8,89 8,75 8,57 8,95 7,89 7,75
Randamentul practic [%]

2% acid acetic 9% alcool din spirt 1% extract de porumb

70,3 75,0 62,7 70,3 76,6 75,0 73,0 77,2 65,4 63,9

14

Tabelul 5.2 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice n funcie de eficiena lor (varianta de mediului de cultur V2)
Randamentul practic [%] Locul n clasament Compoziia mediului de cultur Tulpina de Aciditatea final a oetului Acetobacter folosit ca inocul g acid acetic / 100 ml [5%] Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi 8,08 8,52 8,67 8,70 8,64 8,64 8,02 9,18 7,10 4,80 Clasarea tulpinilor dup rezultatele obinute T 10 C3 C2 2 Gl, 3 Gl A10 Ai S Bz 3 Gi

Tabelul 5.4 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice n funcie de eficiena lor (varianta de mediului de cultur V4)
Locul n clasament 1 2 3 4 5 6 7 Locul n clasament 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tulpina de Aciditatea final a oetului Compoziia mediului Acetobacter folosit ca inocul g acid acetic / de cultur 100 ml [5%] Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi 8,70 9,00 8,76 8,76 8,57 8,57 8,57 9,27 6,90 6,08 Randamentul practic [%] 61,7 66,7 62,7 62,7 59,5 59,5 59,5 71,2 31,7 18,0 Randamentul practic [%] 56,6 49,2 26,4 58,0 48,0 56,6 52,8 41,6 16,0 12,6 Clasarea tulpinilor dup rezultatele obinute T10 A10 C2, C3 Ai 2 Gl, 3 Gl, S Bz 3 Gi

3% acid acetic 8% alcool din spirt 1% extract de porumb

63,5 69,0 70,9 71,3 70,5 70,5 62,8 77,3 51,3 23,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5% acid acetic 6% alcool din spirt 1% extract de porumb

Tabelul 5.3 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice n funcie de eficiena lor (varianta de mediului de cultur V3)
Randamentul practic [%] Locul n clasament Tulpina de Aciditatea final a Compoziia oetului Acetobacter folosit mediului de cultur g acid acetic / ca inocul 100 ml [5%] Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi 8,35 8,70 9,02 8,57 8,64 8,21 8,21 9,39 6,32 4,50 Clasarea tulpinilor dup rezultatele obinute T10 C2 A10 2 Gl C3 Ai S, 3 Gl Bz 3 Gi

Tabelul 5.5 Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice n funcie de eficiena lor (varianta de mediului de cultur V5)
Tulpina de Aciditatea final a Compoziia mediului oetului Acetobacter de cultur folosit ca inocul g acid acetic / 100 ml [5%] Ai A10 C2 C3 2 Gl 3 Gl S T10 Bz 3 Gi 8,83 8,46 7,32 8,90 8,40 8,83 8,64 8,08 6,80 6,63 Clasarea tulpinilor dup rezultatele obinute C3 3 Gl, Ai S A10 2 Gl T10 C2 Bz 3 Gi

4% acid acetic 7% alcool din spirt 1% extract de porumb

62,1 67,1 71,7 65,3 66,3 60,1 60,1 77,0 33,1 7,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

6% acid acetic 5% alcool din spirt 1% extract de porumb

15

Clasamentul tulpinilor de bacterii acetice este prezentat n tabelul 5.6.

Tabelul 5.6
2% acid acetic 3% acid acetic 4% acid acetic 5% acid acetic 6% acid acetic +6% alcool+ +5% alcool+ +9% alcool+ +8% alcool+ +7% alcool+ 1%Ep 1%Ep 1%Ep 1%Ep 1%Ep T10 T10 T10 T10 C3 2 Gl C3 C2 A10 3 Gl, Ai A10, 3 Gl C2 A10 C2, C3 S

Locul I Locul II Locul III

Din tabelul 5.1 rezult c cea mai bun activitate n ceea ce privete producia de acid acetic este cea dat de tulpina Ai, n varianta de mediu V5, n care caz s-a produs dup 49 de zile o aciditate de 8,83 g acid acetic/100 ml, ns ca o deficien, alcoolul rezidual a fost cel mai ridicat (2,05% vol.). Dei tulpina Ai a produs relativ mai puin acid acetic (8,33 g acid acetic/100 ml dup 42 de zile de fermentare), alcoolul rezidual a fost numai 0,55% volume, ceea ce reprezint un randament de transformare a alcoolului n acid acetic de 70,3%. Din aceste date se constat c folosirea soluiei de alcool etilic cu 9% alcool i 2% acid acetic pentru acidifiere d rezultate bune la fermentarea acetic timp de 49 de zile. Pe de alt parte se constat c dei cantitile de acid acetic acumulate sunt diferite, pH-ul soluiilor acetice rmne aproape constante, fapt explicat prin constanta de disociere a acidului acetic, ce nu pare a fi influenat de alcoolul rezidual. Rezultate similare se obin i cu tulpinile C2, C3, 2Gl, 3Gl, respectiv cu tulpinile S i T10. Pentru fiecare tulpin utilizat se constat o acumulare continu de acid acetic n funcie de timp, durata de 42-49 de zile considerndu-se satisfctoare pentru obinerea unui oet de calitate (a se vedea graficele 5.1 5.5). Din tabelele 5.15.4 se constat c cel mai bine se comport tulpina T10, n condiiile n care alcoolul din soluie a sczut de la 9 la 6%, iar coninutul de acid acetic din soluie a crescut de la 2 la 5%. Avnd n vedere att alcoolo-tolerana ct i aceto - tolerana, tulpina T10 identificat a fi Acetobacter aceti subspecia orleansis se comport cel mai bine n procesul de fermentaie acetic, att ca randament de transformare a alcoolului n acid acetic, dar i din punct de vedere al toleranei la alcool, ceea ce presupune c aceast specie se adapteaz foarte bine la stresul produs de aciditate i de concentraie n alcool. Cele menionate rezult i din analiza datelor cuprinse n tabelul 5.6. Concluzii Calitile fermentative ale tulpinii de Acetobacter T10, o recomand ca agent de fermentare n tehnologia obinerii oetului din alcool de fermentaie, utiliznd ca nutrient extractul de porumb, un subprodus al industriei alimentare. 5.1.2. Prin studiul efectuat s-a urmrit activitatea fermentativ a bacteriilor acetice luate n experiment i eficiena acesteia n mediul de cultivare, n care variabila o reprezint coninutul n alcool (obinut din spirt rafinat concentrat - 96% vol.), aciditatea iniial a mediului de fermentare, nutrientul utilizat i temperatura de fermentare fiind aceleai pentru toate tulpinile de Acetobacter testat. Acest experiment permite un studiu comparativ privind randamentul n acid acetic al fermentaiei realizat de fiecare dintre tulpinile de bacterii acetice luate n studiu, n scop selectiv. Studiul menionat urmrete randamentul practic al fermentaiei acetice cu 10 tulpini de bacterii acetice, una industrial (Ai ) i alte nou tulpini izolate din vinuri i cidru, avnd drept scop o selecie a tulpinilor sub acest aspect. Cele zece tulpini de Acetobacter au fost testate n cadrul experimentrilor noastre pe medii de cultur cu coninuturi diferite de alcool etilic (6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12% alcool), cu 2% acid acetic i adaos de 1% extract de porumb, ca nutrient pentru bacteriile acetice. Alcoolul a fost luat din spirtul rafinat de concentraie 96%. La prepararea mediului de cultur, pentru cele 7 variante experimentale cu concentraii diferite de alcool etilic, s-a folosit pentru diluarea spirtului ap potabil steril. Clasificarea celor 10 tulpini de Acetobacter i prezentarea celor aflate pe primele trei locuri dup randamentele cu care se realizeaz bioconversia etanolului n acid acetic este prezentat n tabelul 5.14.

16

Tabelul 5.7 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de randamentul practic de bioconversie


Caracteristici ale mediului de cultur Tulpina de Randamentul Acetobacter practic, p [%] Ai 89,8 A10 95,0 C2 89,8 C3 94,0 Alcool 6 % Acid acetic 2 % 2 Gl 96,0 Extract de porumb 3 Gl 96,0 (EP) 1% S 95,0 T10 89,8 Bz 89,8 3 Gi 94,0 2Gl, 3Gl>S i A10>C3 i 3Gi>Ai, C2, T10 i Bz p = 89,8 96,0%

Tabelul 5.11 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de randamentul practic de bioconversie


Caracteristici ale mediului de cultur

2 Gl 76.6 3 Gl 72,3 S 71,8 T10 76,6 Bz 74.4 3 Gi 63,3 T10>A10>3Gl>S>Ai i C3>2Gl>3Gi>C2>Bz p = 52,2 76,6

Tulpina de Randamentul Acetobacter practic, p [%] Ai 67,6 A10 65,1 C2 51,3 C3 65,7 Alcool 10 % Acid acetic 2 % 2 Gl 70,2 Tabelul 5.8 3 Gl 67,0 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de Extract de porumb (Ep) 1% S 61,4 randamentul practic de bioconversie T10 70,8 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul Bz 69,5 mediului de cultur Acetobacter practic, p [%] 3 Gi 56,0 Ai 91,4 T10>2Gl>Bz>Ai>3Gl>C3>A10>S>3Gi>C2 A10 93,8 p = 51,3 70,8% C2 87,7 Tabelul 5.12 C3 88,7 Alcool 7 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de Acid acetic 2 % 2 Gl 85,0 Extract de porumb randamentul practic de bioconversie 3 Gl 86,0 (EP) 1% Caracteristici ale Tulpina de Randamentul S 90,4 mediului de cultur Acetobacter practic, p T10 87,7 [%] Bz 88,7 Ai 58,7 3 Gi 80,0 A10 55,3 A10>Ai>S>C3 i Bz >C2 i T10>3Gl>2Gl>3Gi C2 46,2 p = 80,0 93,7% C3 55,8 Alcool 11 % Tabelul 5.9 2 Gl 57,5 Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de Acid acetic 2 % Extract de porumb 3 Gl 58,2 randamentul practic de bioconversie (Ep) 1% S 55,8 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul T10 61,5 mediului de cultur Acetobacter practic, p [%] Bz 60,0 Ai 82,1 3 Gi 46,6 A10 84,5 T10>Bz>Ai>3Gl>2Gl>C3 i S>A10>3Gi>C2 C2 83,8 p = 46,2 61,5% C3 76,0 Alcool 8 % Tabelul 5.13 2 Gl 75,3 Acid acetic 2 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de Extract de porumb 3 Gl 83,8 (EP) 1% randamentul practic de bioconversie S 85,4 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul T10 81,4 mediului de cultur practic, p Acetobacter Bz 72,9 [%] 3 Gi 76,0 Ai 45,9 S>A10>C2 i 3Gl>Ai>T10>C3 i 3Gi >2Gl>Bz A10 48,0 p = 72,9 85,4% C2 51,2 Tabelul 5.10 C3 46,4 Alcool 12 % Clasificarea tulpinilor de Acetobacter n funcie de Acid acetic 2 % 2 Gl 48,6 randamentul practic de bioconversie Extract de porumb 3 Gl 49,1 Caracteristici ale Tulpina de Randamentul (Ep) 1% S 34,4 mediului de cultur Acetobacter practic, p [%] T10 52,3 Alcool 9 % Ai 71,1 Bz 48,6 Acid acetic 2 % A10 74,4 3 Gi 38,2 Extract de porumb C2 58,4 T10>C2>3Gl>2Gl i Bz>A10>C3>Ai>3Gi>S (Ep) 1% C3 71,1 p = 38,2 52,3%

17

Tabelul 5.14 Clasamentul bacteriilor acetice n funcie de toleranta la concentraia de alcool


6% alcool +2%acid acetic +1%Ep 2 Gl i 3 Gl A10 i S C3 i 3 Gi 7% alcool +2%acid acetic +1%Ep A10 Ai S 8% alcool +2%acid acetic +1%Ep S A10 C2 i 3 Gl 9% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 A10 3 Gl 10% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 2 Gl Bz 11% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 Bz Ai 12% alcool +2%acid acetic +1%Ep T10 C2 3 Gl

Locul I Locul II Locul III

Analiza datelor prezentate mai sus a condus la concluzia c se obin randamente practice mai mari de acid acetic cu tulpina T10, care suport concentraii de pn la 12% alcool n mediul de fermentare, iar randamentul practic n acid acetic este destul de ridicat, n cele mai multe cazuri superior celorlalte tulpini de bacterii acetice (Acetobacter aceti subsp. orleansis), ceea ce este n concordan att cu datele gsite n literatura de specialitate, ct i cu cele obinute n practica industrial. Astfel Banu (2000) arat c Acetobacter orleansis produce 9,3% acid acetic (% m/v) la temperatura de 30oC, fiind depit doar de Acetobacter schtzenbachii, care produce 11% acid acetic(% mlv) la temperatura de 28oC. De remarcat c, de regul n producia curent, nu se lucreaz efectiv cu o singur tulpin de Acetobacter, ci cu tulpini diverse care intr n competiie, n funcie de alcool-rezisten i de acido-toleran, n aceleai condiii de mediu de fermentare. La folosirea culturilor mixte de bacterii acetice trebuie s avem n vedere temperaturile optime de fermentare, care sunt diferite pentru diferitele specii de Acetobacter (36oC pentru Acetobacter aceti, 33oC pentru Acetobacter acetigenus, 31oC pentru Acetobacter ascendens, 30oC pentru Acetobacter kutzingianus, Acetobacter orleansis i 28oC pentru Acetobacter pasteurianus i Acetobacter schtzenbachii). De regul, temperatura optim de fermentare nu se coreleaz cu tolerana la alcool i la acid acetic. Concluzii n urma analizei datelor prezentate mai sus putem face urmtoarele concluzii: 1. Toate cele zece tulpini de Acetobacter luate n experiment se pot dezvolta mai bine sau mai slab, cu eficien diferit privind producerea de acid acetic n medii de cultur cu 6 12% alcool, cu 2% acid acetic i 1% extract de porumb. 2. Bioconversia alcoolului n acid acetic se realizeaz cu randamente diferite n funcie de concentraia n alcool a mediului de cultur i de tulpina de Acetobacter folosit ca agent de fermentare. Pe msur ce crete concentraia n alcool a mediului de cultur, randamentul scade. n mediul de cultur cu 6% alcool, toate tulpinile de Acetobacter fermenteaz integral alcoolul cu randamente cuprinse ntre 89,8 96,0%. Randamentul maxim n aceste condiii de mediu este obinut de tulpinile de bacterii acetice notate cu 2 Gl i 3 Gl. 3. n mediul de cultur cu 7 % alcool, n funcie de tulpina de Acetobacter folosit n fermentare, randamentul practic n acid acetic variaz ntre 80,0 93,7%. n acest mediu de cultur se ajunge la aciditatea de 8,57% cu un randament maxim de 93,7% realizat de tulpina A10, creia i sunt optime aceste condiii de mediu. 4. n mediul de cultivare al bacteriilor acetice, cu 8% alcool funcie de agentul de fermentare, randamentul n acid acetic variaz ntre 72,9 85,4%. Se remarc tulpina S, cu care se obine o aciditate de 8,83 % exprimat n acid acetic cu randamentul maxim de 85,4 %. 5. n urma cultivrii celor 10 tulpini de bacterii acetice n mediu cu 9% alcool, se ajunge la aciditatea de 8,89% realizat cu randamentul maxim de 76,6% de ctre tulpina de Acetobacter T10. n aceste condiii de mediu randamentul minim de 52,2% este realizat de tulpina Bz. 6. Bioconversia alcoolului n mediul de cultur cu 10% alcool are loc cu randamente n acid acetic cuprinse ntre 51,3 70,8%. Aciditatea maxim de 9,08% se obine cu randamentul maxim, realizat de tulpina T10, care se dovedete mai rezistent la concentraia n alcool.

18

7. n mediul de cultur cu 11% alcool randamentele n acid acetic obinute cu bacteriile acetice studiate variaz ntre 46,2 61,5%. Randamentul maxim se obine tot cu tulpina T10, urmat de tulpinile Bz i Ai. 8. n mediul cu 12% alcool dezvoltarea i activitatea fermentativ a celor 10 tulpini de Acetobacter este mai slab. Alcoolul rmas n mediu este de 4,1 7,05% i doar 2 tulpini de Acetobacter ( T10 i C2) realizeaz randamente n acid acetic peste 50%. 9. Pentru mediile de cultur cu 6, 7 i 8% alcool se recomand tulpinile 2 Gl, 3 Gl, S i A10. Pentru mediile cu 9 i 10% alcool se recomand tulpina T10, bacterie acetic cu nsuiri fermentative superioare, cu rezisten la alcool mai mare. 10. n mediul de cultur cu 6% alcool, cultura industrial Ai este depit ca randament n acid acetic de ctre 6 tulpini din cele 10 studiate. n mediile cu 8 i 9% alcool, Ai este depit ca potenial fermentativ de ctre 4 tulpini dintre cele experimentate. n mediile de cultur cu 10 i 11% alcool, cultura industrial este depit ca randament de ctre tulpinile T10, 2 Gl i Bz. n mediul de cultur cu 12% alcool, cultura industrial se dezvolt slab, cu un randament n acid acetic sub 50 %. n cele mai multe variante de mediu, cultura industrial (Ai) a prezentat activitate fermentativ inferioar culturilor selecionate de noi i luate n studiu. 11. pH-ul final al tuturor probelor experimentale s-a ncadrat ntre 3,19 3,44.

5.2. CERCETRI ASUPRA UTILIZRII VINULUI CA MATERIE PRIM N TEHNOLOGIA OETULUI N MOD SINGULAR I N ASOCIERE CU ALCOOL DE FERMENTAIE
5.2.1. Folosirea vinului alb ca materie prim n cinci variante de mediu de fermentare, cu i fr adaos de alcool rafinat i urmrirea dinamici i eficienei fermentaiei. n acest studiu am utilizat pentru experimentri 3 tulpini de bacterii acetice (T10, Ai i 2 Gl), care au fost cultivate pe medii de cultur pe baz de vin alb cu 6% alcool i 0,68% g acid acetic/100 ml i de vin suplimentat cu pn la 10% alcool (prin adaos de spirt rafinat cu concentraia de 95%). Probele cu mediu pasteurizat, n 6 variante de cte 200 ml, au fost inoculate cu cte 5% cultur de Acetobacter din fiecare tulpin de bacterii acetice dintre cele menionate. Dup omogenizare, prin agitare, probele repartizate n vase de sticl de aceleai dimensiuni cu dopuri de vat, au fost termostatate n condiii identice la temperatura de 25oC timp de 49 de zile, perioad n care s-a urmrit sptmnal aciditatea titrabil (exprimat n acid acetic) i, n final, n plus s-a determinat pH-ul i alcoolul rezidual (figura 5.6).
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 T10 2 Gl Ai Tulpina urmarita Randamentul practic, % 6% 7% 8% 9% 10%

Figura 5.6. Variaia randamentului n funcie de tulpina bacterian folosit i de concentraia de alcool

19

Concluzii n urma analizei datelor prezentate anterior putem face urmtoarele observaii: 1. n vin cu 6% alcool i cu o aciditate titrabil exprimat n acid acetic de 0,68 g/100 ml, toate cele 3 tulpini de bacterii acetice testate n acest experiment (T10, 2Gl, Ai), realizeaz fermentaia acetic cu randamente n acid acetic cuprinse ntre 98,6 i 98,8%. n acest mediu alcoolic bacteriile acetice aproape c metabolizeaz integral alcoolul din mediul de cultivare. 2. n varianta de mediu, n care vinul cu caracteristicile menionate, este suplimentat cu 1% alcool din spirt, tulpinile de bacterii acetice T10 i 2Gl, se comport similar, finaliznd fermentaia acetic cu un randament practic de 94,7%. n acelai mediu de cultivare, tulpina industrial Ai, realizeaz fermentaia cu un randament practic (p) de 89,3%. 3. n mediul de cultivare, n care vinul cu 6% alcool suplimentat cu 2% alcool din spirt, bacteriile acetice luate n studiu, realizeaz fermentaia acetic cu un randament de 80,1 83,8%. Randamentul maxim fiind obinut de tulpina 2Gl. Aciditatea oetului n final, funcie de agentul de fermentare, variaz ntre 7,09 i 7,38, iar alcoolul n final variaz ntre 0,25 i 0,5%. 4. n vin cu 6% alcool suplimentat cu 3% alcool (din spirt), tulpinile de Acetobacter 2Gl i T10 manifest acelai potenial fermentativ realiznd fermentaia cu un randament de 75,1%, n timp ce tulpina industrial transform alcoolul n acid acetic cu un randament de 67,3%. n acest din urm caz, alcoolul rmas n mediu nefermentat a fost cu 1,4%, procent mai mare dect n cazul tulpinilor T10 i 2Gl, pentru care alcoolul rezidual a fost de 0,6% i respectiv de 0,65%. 5. n ultima variant de mediu cu 10% alcool, n care vinul (cu 6% alcool) a fost suplimentat cu 4% alcool din spirt, fermentaia se desfoar mai slab, rmne mai mult alcool nefermentat ntre 1,7 i 2,4%. Aciditatea maxim fiind obinut cu tulpina 2Gl cu un randament de bioconversie de 64,4%. 6. n medii alcoolice obinute din vin cu 6% alcool sau din vin suplimentat cu 1 i 2% alcool din spirt toate cele 3 tulpini de Acetobacter dau rezultate foarte bune sub raportul eficienei, fiind obinut oet cu un randament n acid acetic cuprins ntre 80,5 i 98,8%. Variaia randamentului ntre aceste limite se datoreaz att alcoolului din mediu, ct i agentului de fermentare. Aciditatea oetului, pH-ul i alcoolul rmas n mediu se ncadreaz n limitele indicate de normale UE (aciditatea oetului obinut din vin s fie de minimum 6% acid acetic i maximum 1,4% alcool). Pe de alt parte pH-ul de 3,7 se ncadreaz n limitele perceperii gustului acru al acidului acetic. 5.2.2. Studiul fermentaiei n care coninutul n alcool al mediului de fermentare provine n pri egale din vin alb i alcool rafinat, cu i fr adaos de extract de porumb, i acid acetic. Pentru acest studiu am preparat un mediu cu 8% alcool provenit n pri egale din vin i alcool rafinat (considerat mediu de baz), cu i fr adaos de extract de porumb i acid acetic. Probele n studiu (de cte 200 ml) au fost repartizate n recipieni de sticl i inoculate n condiii identice n toate cele 6 variante de mediu(V1 -V6), cu fiecare dintre cele 3 tulpini de bacterii acetice luate n experiment. Toate probele termostatate la 25oC au fost analizate sptmnal i urmrite timp de 49 de zile. n experienele efectuate pe medii de fermentaie coninnd pri egale de alcool din vin i spirt, cu sau fr adaos de extract de porumb i cu folosirea tulpinilor T10, Ai i 2Gl, s-a demonstrat c prin creterea coninutului n alcool din mediul de fermentare, a nivelului de acid acetic (1% sau 2%), dar mai ales prin folosirea extractului de porumb se mbuntete coninutul de acid acetic dup 49 de zile de fermentaie. De asemenea, s-a evideniat faptul c tulpinile T10, Ai i 2Gl s-au comportat cel mai bine, indiferent de compoziia mediului de fermentare i c numai vinul ca atare satisface cerinele nutriionale ale bacteriilor acetice.

20

Materialul grafic ilustreaz dinamica acumulrii de acid acetic n cazul utilizrii fiecrui agent de fermentare i de asemenea scoate n eviden condiiile n care se obin cele mai bune randamente n acid acetic (figurile 5.7-5.13).
g acid acetic/100 m g acid acetic/100 m 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 7 14 21 28 35 42 49 zile

Evoluia vitezei de fermentare


T10 Ai 2Gl

8 7 6 5 4 3 2 1 0

Dinamica acumulrii de acid acetic n varianta de mediu V3


T10 Ai 2Gl

14

21

28

35

42

49 zile

Figura 5.7
Dinamica fermentaiei acetice pentru varianta V1 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)
Curbele de fermentaie reprezentate funcie de acumularea n timp a acidului acetic rezultat din fermentaie
T10 Ai 2Gl

Figura 5.10
Dinamica fermentaiei acetice pentru varianta V3 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)
Dinamica acumulrii de acid acetic n varianta de mediu V4
T10 Ai 2Gl

g acid acetic/100 m

7 6 5 4 3 2 1 0

g acid acetic/100 m

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

14

21

28

35

42

49 zile

14

21

28

35

42

49 zile

Figura 5.8
Curbele de fermentaie realizate pe baza acumulrii n timp a acidului acetic rezultat din fermentaie
8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 14 21 28 35 42 49 zile

Figura 5.11
Dinamica fermentaiei acetice pentru varianta V4 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 14 21 28 35 42 49 zile

g acid acetic/100 m

g acid acetic/100 m

Dinamica acumulrii de acid acetic n varianta de mediu V2


T10 Ai 2Gl

Dinamica acumulrii de acid acetic n varianta de mediu V5


T10 Ai 2Gl

Figura 5.9
Dinamica fermentaiei acetice pentru varianta V2 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)

Figura 5.12
Dinamica fermentaiei acetice pentru varianta V5 de mediu (tulpinile de Acetobacter T10, Ai, 2Gl)
Influena adaosului de 0,3% Ep asupra randamentului n acid acetic obinut cu tulpinile de Acetobacter (T10, Ai, 2Gl)
a b

Randamentul practic,%

100 80 60 40 20 0

T10 Ai 2Gl Tulpinile de Acetobacter n cele 2 variante de mediu a: 8%alcool provenit din 1/2 din vin i 1/2 din spirt;b: cu 8% alcool provenit din 1/2 din vin i 1/2 din spirt i cu 0,3% Ep

Figura 5.13

20

Concluzii 1. n vin cu 6% alcool i cu o aciditate titrabil exprimat n acid acetic de 0,68 g/100 ml, (varianta V1), toate cele 3 tulpini de bacterii acetice utilizate n acest experiment, fermenteaz acest mediu alcoolic cu randamente n acid acetic cuprinse ntre 94,5 i 98,33%. Randamentul maxim este obinut cu tulpina T10, urmat fiind de tulpinile 2Gl i Ai. Pentru acest coninut alcoolic, vinul satisface cerinele nutritive ale bacteriilor acetice cu randamente maxime n procesul de fermentaie acetic. 2. n mediul de fermentare V2, n care coninutul alcoolic de 8% este obinut n pri egale din alcool rafinat i din vin (cu 6% alcool i cu 0,68% aciditate), bioconversia alcoolului n acest mediu mai srac n elemente nutritive, se realizeaz cu randamente cuprinse ntre 68,8 i 81,5%. Randamentul cel mai mare n acest caz este obinut de tulpina de Acetobacter T10, urmnd tulpinile Ai i 2Gl. 3. n mediul de cultur V3 (cu aceeai compoziie ca i mediul V2, n plus suplimentat cu 0,3% extract de porumb) randamentele practice, ca urmare a plusului de elemente nutritive, sunt mbuntite la toate cele 3 tulpini de Acetobacter folosite. Suplimentul nutritiv ajut cel mai mult tulpina 2Gl, creia i mbuntete randamentul cu 19,1% n varianta V3 fa de V2. 4. n varianta de mediu V4, care fa de varianta V3, are un adaos de 1% acid acetic, bioconversia alcoolului se realizeaz cu randamente cuprinse ntre 80,9 i 84,9%. Randamentul maxim este obinut cu tulpina T10, urmat de tulpinile 2Gl i Ai. n aceste condiii de fermentaie se constat o uoar scdere a randamentului n cazul tulpinilor T10 i 2Gl fa de varianta de mediu V3. 5. n mediul de fermentare V5 cu 8% alcool provenit, de asemenea, n pri egale din vin i din alcool rafinat, i cu 0,3% extract de porumb i cu 2% acid acetic, se obin randamente n acid acetic fa de V4 mai sczute, cuprinse ntre 62,9 i 72,4%. Randamentul maxim este obinut de tulpina T10, urmnd tulpinile 2Gl i Ai. Aciditatea iniial mai crescut influeneaz uor defavorabil multiplicarea bacteriilor acetice i procesul fermentativ. 6. n ultima variant a mediului de fermentare V6 n care alcoolul 8% este obinut n condiii identice variantei V5, cu acelai adaos de acid acetic de 2%, dar fr extract de porumb, se constat c fermentarea se desfoar cu randamente mai sczute, cuprinse ntre 58,9 i 67,6% . Randamentul maxim este obinut de ctre tulpina T10, urmat de tulpinile 2Gl i Ai. 7. Tulpina T10, n toate variantele de mediu prezint potenial superior fa de 2Gl i Ai, n cadrul acestui set de experiene. 8. pH-ul final al probelor se ncadreaz ntre 3,58 i 3,76. 5.3. EXPERIMENTE PRIVIND STUDIUL FERMENTAIEI ACETICE N VIN ROZE I ROU CU DIFERITE TULPINI DE BACTERII ACETICE n tehnologia de obinere a oetului vinurile roii sunt mai puin preferate, deoarece un coninut ridicat n polifenoli (antociani, flavone, tanin) ar putea influena defavorabil creterea i activitatea bacteriilor acetice prin perturbarea schimburilor osmotice dintre celule i mediu. n idea c un rol important l poate avea i natura bacteriilor acetice, am iniiat acest studiu, folosind ca mediu de fermentare un vin roze, cu 6% alcool i 0,7% aciditate exprimat n acid acetic. Agentul de fermentare l-a constituit fiecare dintre tulpinile de Acetobacter Ai, T10, 2Gl. Rezultatele acestui studiu sunt cuprinse n tabelul 5.43. Temperatura la care s-a desfurat experimentul a fost de 28oC.

21

ntr-un alt experiment efectuat am folosit ca mediu de fermentare un vin rou cu 9% alcool, cu 2% acid acetic i cu 81,75 mg/100 ml antociani. La fermentarea vinului roze cu 6% alcool i 0,7% aciditate, dup 21 de zile de fermentare s-au obinut ntre 6,61 6-68 g/100 ml acid acetic, n funcie de tulpin, cu randamente practice bune (mai mari de 94%), aa cum se vede n tabelul 5.43. La folosirea vinului rou cu 9% alcool, cu adaos de 2% acid acetic i circa 82 mg/l antociani s-au obinut rezultate bune numai cu anumite tulpini de bacterii acetice, care prezint rezisten mare la polifenoli (taninuri) i antociani. Tulpinile T5 i T6 (respectiv Acetobacter aceti subsp. aceti I i II) au avut cea mai bun comportare, att n ceea ce privete cantitatea de acid acetic format, ct i randamentul practic realizat. n acest vin a fost testat activitatea fermentativ a unui numr de 13 tulpini de Acetobacter, din care numai 6 au desfurat activitate oxidativ satisfctoare, dar i aceasta diferit n funcie de tulpina de bacterie acetic. Rezultatele obinute au fost nscrise n tabelele 5.43 5.44 i n figurile 5.14 5.17. Urmrind comportarea a treisprezece tulpini de Acetobacter aceti n vin rou cu 9% alcool, 2% acid acetic, cu un coninut mare de antociani 81,75 mg/l , s-a constatat c numai ase dintre tulpini (T5, T6, T8, ai, 3Gi, A10) au desfurat activitate fermentativ. Cu patru dintre tulpini, i anume cu T5, T6, T8 i Ai, s-a obinut oet cu 9 9,65% acid acetic, cu un randament cuprins ntre 77,8 85%. Cea mai eficient activitate fermentativ a dovedit tulpina T5, urmnd n ordine descresctoare tulpinile de Acetobacter T6, T8, Ai, 3Gi i A10. Celelalte apte tulpini 2Gl, 3Gl, C2, C3, S, Bz i T10, mai sensibile la coninutul mare n antociani ai vinului, care pe lng tanin poate s influeneze schimburile osmotice de la nivelul membranelor celulare, nu au prezentat activitate fermentativ. n vinul roze, cu un coninut mai mic de antociani (200 mg/l), tulpinile T10 i 2Gl au avut activitate fermentativ foarte bun, realiznd oxidarea alcoolului cu un randament practic de 95 96,5%. Aceste dou tulpini, dup cum s-a observat, nu s-au putut dezvolta n vin rou. Este de remarcat c tulpina de Acetobacter aceti orleansis (Ai) este mai tolerant la polifenoli, prezentnd activitate fermentativ bun, att n vin roze, ct i n vin rou.
Dinamica fermentatiei acetice in vin roze
Aciditatea, g acid acetic/100ml 7 6 5 4
Aciditatea g acid acetic&100 ml

Ai T10 2Gl

Randamentul practic al fermentaiei acetice n vin roze

3 2 1 0 initial 7 zile 14 zile 21 zile Durata fermentatiei, zile

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 initial 7 zile 14 zile 21 zile Durata fermentatiei , zile

Ai A10 3Gi T5 T6 T8

Figura 5.14.
Dinamica acumulrii de acid acetic la fermentarea vinului roze (cu 81,75 mg/l antociani)
Randam entul practic al ferm entatiei acetice in vinului roze Randament practic, % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ai T10 2Gl Tulpinile de Acetobacter aceti

Figura 5.16.
Dinamica acumulrii de acid acetic la fermentarea vinului rou

Figura 5.15.

Figura 5.17.
Randamentul practic, % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ai A10 3Gi T5 T6 T8 Tulpina de Acetobacter

24

Randamentul practic al fermentaiei acetice n vin rou

Concluzii n urma analizei datelor prezentate mai sus desprindem urmtoarele concluzii: 1. n cazul folosirii tulpinilor de Acetobacter Ai, T10, 2Gl, inoculate n proporie de 5% n vin roze pasteurizat cu 6% alcool, 0,7% aciditate, exprimat n acid acetic i 20 mg/l antociani, fermentaia acetic s-a desfurat n condiii similare, remarcndu-se numai uoare diferene ntre tulpinile de bacterii acetice testate. 2. Tulpina de Acetobacter T10 a condus la obinerea unui oet cu un coninut de acid acetic de 6,7% i un randament practic de bioconversie, de 95,0%. 3. n aceleai condiii de fermentare, prin folosirea tulpinii de Acetobacter 2Gl s-a obinut un oet cu 6,68% acid acetic i un randament de transformare de 96,5%. 4. Tulpina de Acetobacter Ai inoculat n acelai mediu de fermentare a condus la obinerea unui oet cu 6,61% acid acetic i la un randament practic de 94,33%. 5. Tulpinile de Acetobacter Ai, A10, 3Gi, T5, T6, i T8 au manifestat o mai mare rezisten la polifenoli, atunci cnd au fost inoculate n vin rou. 6. Coninutul de 81,75 mg/100 ml antociani al vinului rou nu a exercita influen de inhibare a celor ase tulpini de bacterii acetice care au desfurat activitate fermentativ n acest vin. 7. Cu patru din cele ase tulpini de Acetobacter dezvoltate n vin rou, se obine oet cu aciditi de 9 9,65% acid acetic. 8. Tulpinile de Acetobacter T5 i T6 sunt cele mai indicate n fermentarea vinului rou. 9. Tulpina de Acetobacter T5 a condus la obinerea unui oet cu 9,65% acid acetic i a unui randament practic de 85%, atunci cnd mediul de cultur a fost reprezentat de vinul rou (cu caracteristicile menionate).

5.4. INFLUENA UNOR SRURI DE AMONIU FOLOSITE SINGULAR SAU MIXT N DIFERITE MEDII DE CULTIVARE A BACTERIILOR ACETICE
5.4.1. Influena fosfatului de amoniu folosit n mod singular sau n asociere cu extractul de porumb n mediu cu 7% alcool rafinat i 2% acid acetic, fermentat cu fiecare dintre tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz, 3Gi i S (n condiii puin modificate). n acest set de experiene, n mediul cu 7% alcool (din alcool rafinat) i 2% acid acetic, s-a urmrit activitatea fermentativ a tulpinilor de Acetobacter (T5, T6, T8, Bz, 3Gi) la diferite niveluri de adaos de fosfat de amoniu (F.a.) i de fosfat de amoniu n asociere cu extractul de porumb (E.p.). Tulpina S, fiind considerat cu un potenial fermentativ superior din experimentele anterioare, a fost experimentat i sub acest aspect, al adaosului de nutrieni n mediul cu 8% alcool i 3% acid acetic. Toate probele de mediu de cultur, repartizate cte 200 ml n recipieni de sticl de aceleai dimensiuni, au fost inoculate cu 5% cultur de bacterii acetice i termostatate la 25oC. n aceste condiii s-a urmrit activitatea bacteriilor acetice prin evoluia aciditii ca rezultat al oxidrii alcoolului, n toate variantele de mediu, iar , n final, s-a determinat alcoolul rezidual i pH-ul oetului obinut. Concluzii

24

Doza de 0,2% fosfat de amoniu, n mediul de cultivare cu 7% alcool i 2% acid acetic, permite o slab dezvoltare a bacteriilor acetice luate n studiu (T5, T6, T8, Bz, 3Gi), care realizeaz n mediul de fermentare, n funcie de tulpin, 0,5 2% acid acetic. Acest nutrient mineral este mai bine metabolizat de tulpina de Acetobacter T8 i cel mai slab tolerat de tulpina T5. Adaosul de 0,3% fosfat de amoniu, n acelai mediu de baz, conduce la rezultate mai slabe comparativ cu adaosul de 0,2% fosfat de amoniu. n aceste condiii se realizeaz prin bioconversia alcoolului 0,3 - 1,9% acid acetic, cu valoarea maxim obinut tot de tulpina de Acetobacter T8. Suplimentul de 0,2% fosfat de amoniu mpreun cu 0,3% extract de porumb prezint influen pozitiv asupra activitii fermentative a tulpinilor de Acetobacter T6 i T8, cu o cretere a aciditii de 0,28 0,8% acid acetic, n timp ce tulpinile de Acetobacter T5 i 3Gi sunt influenate defavorabil, caz n care scade aciditatea cu 0,5 0,7% fa de cea realizat numai cu 0,3% extract de porumb. Extractul de porumb folosit ca nutrient n concentraie de 0,5% satisface mai bine necesitile nutritive ale bacteriilor acetice, n comparaie cu adaosul de 0,3%, fa de care se constat o cretere a aciditii cu pn la 0,8% acid acetic. Adaosul de 0,5% extract de porumb n mediul de fermentare asigur obinerea unui oet cu 6 6,2% acid acetic de ctre tulpinile de Acetobacter T5, Bz, 3Gi. n variantele de mediu n care suplimentul nutritiv este de 0,2% fosfat de amoniu i 0,5% extract de porumb, funcie de tulpina folosit ca agent de fermentare, aciditatea obinut n final variind ntre 5,8 6,2 g acid acetic / 100 ml. Dac aceste aciditi sunt comparate cu cele obinute numai cu adaos de extract de porumb, se observ c fosfatul de amoniu 0,2% nu influeneaz activitatea fermentativ a tulpinilor de Acetobacter T5, T8 i Bz, aduce un plus de 0,8% acid acetic n cazul tulpinii de Acetobacter T6 i o uoar influen negativ asupra tulpinii de Acetobacter 3Gi. Adaosul de 0,3% fosfat de amoniu mpreun cu 0,3% extract de porumb sau cu 0,5% extract de porumb influeneaz negativ activitatea bacteriilor acetice, caz n care se obin aciditi finale sub nivelul aciditilor realizate numai de extractul de porumb. n mediul de fermentare cu 7% alcool i 2% acid acetic, cu adaos de nutrient n 8 variante, numai n varianta cu 0,5% extract de porumb se poate obine oet cu 6 6,2% acid acetic, astfel tulpinile de Acetobacter T5 i T8 realizeaz un oet de 6% acid acetic, tulpinile de Acetobacter Bz i 3Gi un oet de 6,2% acid acetic. Oetul obinut cu tulpina T6, n toate variantele de mediu, are aciditate sub 6% acid acetic. Tulpina de Acetobacter S asimileaz mai eficient fosfatul de amoniu comparativ cu celelalte tulpini studiate. n mediul de cultivare cu 8% alcool, 3% acid acetic i 0,2% fosfat de amoniu, se poate obine oet cu 6,1% acid acetic, dar cu un randament sczut. n varianta cu 0,2% fosfat de amoniu adaosul de 0,3 sau 0,5% extract de porumb aduce o uoar influen pozitiv. n cazul tulpinii S se remarc varianta cu 1% extract de porumb, cu care se obine oet cu 9,8% acid acetic, cu un randament convenabil de peste 70%. n toate variantele adaosului de nutrieni n mediul de baz cu 7% alcool i 2% acid acetic, fermentat cu fiecare dintre tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz, 3Gi, rmne alcool neoxidat, n cantitatea cea mai mic n varianta cu 0,5% extracte de porumb i n cantitatea cea mai mare n varianta cu 0,3% fosfat de amoniu. pH-ul probelor de oet n toate variantele cu adaos de nutrient, pentru toate cele cinci tulpini de Acetobacter studiate variaz n limitele 3 4,12, cu valorile cel mai sczute la probele cu 0,5% extract de porumb i cu valorile cele mai mari la probele cu 0,3% fosfat de amoniu. n acest set de experiene cu mediul de baz format din 7% alcool i 0,2% acid acetic, fermentat cu tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz i 3Gi, dup adaosul de nutrimente, se obin variante n care se produce oet cu 6 6,2% acid acetic, ns randamentul practic nu depete 60%.

25

5.4.2. Studiul influenei fosfatului de amoniu, sulfatului de amoniu, extractului de drojdie, nutrimenilor utilizai separat sau n amestec n mediul de baz cu 5% alcool i 3% acid acetic, ca i n mediul de baz cu 6% alcool i 2% aciditate, asupra activitii fermentative a tulpinilor de Acetobacter T5, T6, T8, i T10 n acest set de experiene s-a folosit mediul de baz cu 5% alcool (din spirt rafinat) i 3% acid acetic, care a fost suplimentat cu fiecare dintre urmtorii nutrimeni 0,5% extract de drojdie, 0,2% fosfat de amoniu, 0,1% % fosfat de amoniu + 0,1% sulfat de amoniu i 0,2% sulfat de amoniu. Mediul mbogit cu nutrimenii menionai a fost repartizat n recipieni de sticl de aceleai dimensiuni cte 200 ml n fiecare recipient. Dup inocularea cu 5% bacterii acetice, n mod separat din fiecare tulpin de acetobacter T5, T6, T8 i T10, toate probele au fost termostatate la 25oC i urmrit sptmnal dinamica aciditii titrabile. n final s-a determinat alcoolul rezidual i pH-ul oetului. Tot n cadrul acestui set de experiene a fost folosit i mediul cu 6% alcool i 2% acid acetic, suplimentat, n mod separat, cu 0,1% fosfat de amoniu + 0,1% sulfat de amoniu, cu 0,5% extract de drojdie i cu 1% extract de drojdie. Experimentele au fost efectuate folosind ca agent de fermentare tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, i T10. Dup inocularea mediilor cu 5% bacterii acetice, probele, repartizate (cte 200 ml) n recipieni de sticl de aceleai dimensiuni, au fost termostatate la 25oC i urmrit evoluia aciditii ca rezultat al oxidrii alcoolului. n final s-a determinat alcoolul rezidual i pH-ul oetului. Concluzii n mediul cu 5% alcool i 3% acid acetic, suplimentat cu 0,5% extract de drojdie, dintre cele patru tulpini de Acetobacter T5, T6, T8, i T10 folosite ca ageni de fermentare, numai dou dintre tulpini (T6 i T10) au produs oet cu 6 i peste 6% acid acetic. Cu tulpina T10 inoculat n mediul cu 5% alcool, 3% acid acetic i 0,5% extract de drojdie s-a obinut oet cu 7,4% acid acetic, cu un randament practic de 88%. n mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic i 0,2% fosfat de amoniu cu trei din cele patru tulpini (i anume cu T6, T10 i T8) se obine oet cu 6 6,2% acid acetic, cu un randament practic cuprins ntre 60 64%. n mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic, suplimentat cu 0,1% fosfat de amoniu i 0,1% sulfat de amoniu, numai n cazul tulpinilor T10 i T8 se obine oet cu peste 6% acid acetic. Cu tulpina T10 se obine oet cu 6,9% acid acetic, cu un randament practic de 78%. n mediul de fermentare cu 5% alcool, 3% acid acetic, cu adaos de 0,2% sulfat de amoniu, dintre cele patru tulpini de Acetobacter testate, numai cu T10 s-a obinut oet cu peste limita impus de 6% acid acetic, i anume 6,2% acid acetic realizat cu un randament practic de 64%. n mediul de fermentare cu 6% alcool, 2% acid acetic suplimentat cu 0,1% fosfat de amoniu i 0,1% sulfat de amoniu cultura de Acetobacter T5 prezint o slab activitate fermentativ. n acelai mediu de cultivare, tulpinile T6 i T8 se dezvolt mai bine, realiznd o aciditate de 5,2 5,7% acid acetic, dar nu suficient. Cultura de Acetobacter T10, tot n acest mediu de dezvoltare, este mai activ, mai eficient, realiznd o aciditate de 6,8% acid acetic, cu un randament practic de 80%. n mediul de fermentare cu 6% alcool, 2% acid acetic, mbogit cu 0,5% extract de drojdie, n funcie de tulpina de Acetobacter folosit se obine oet cu 5,6 6,74% acid acetic. Cu tulpina T5 se obine oet cu 6% acid acetic, cu randamentul practic de 66,7%. n acelai mediu de fermentare tulpina T10 produce oet cu 6,74% acid acetic, cu un randament practic de 79%. n mediul cu 6% alcool, 2% acid acetic, cu un adaos de 1% extract de drojdie, tulpinile de Acetobacter T5, T6 i T10 sunt cele mai eficiente, realiznd aciditi cuprinse ntre 6,2 7% acid acetic, cu un randament practic de 70 83,3%.

26

Tulpina T10 realizeaz aciditatea de 7% acid acetic i un randament practic de 83,3%.

CAPITOLUL VI. EXPERIMENT INDUSTRIAL N SISTEM CU ACETATOR FRINGS


Cu orientarea dobndit n urma rezultatelor obinute din numeroasele experimente de laborator efectuate cu tulpini diferite de Acetobacter, n medii de cultivare diferite, obinute din alcool de fermentaie rafinat, din vin plus alcool rafinat sau numai din vin alb sau vin rou, am realizat un experiment industrial la Fabrica de oet Trgu Bujor, judeul Galai. Cu acordul i bunvoina conducerii ntreprinderii am efectuat cercetarea pe un acetator cu tala, de capacitate 8 000 litri, utiliznd materia prim de care a dispus fabrica, vin alb pichet cu 8,6% alcool, 0,7 g/l aciditate total (exprimat n acid acetic) i pH 4,5. Pentru aceast materie prim am decis s folosesc ca agent de fermentare tulpina de Acetobacter T10, care a manifestat potenial fermentativ bun n condiii apropiate de materia prim destinat experimentului industrial. Dac ns, materia prim ar fi fost vin rou, mai indicat, ca agent de fermentare, ar fi fost tulpina de bacterii acetice T5.

6.1. Pregtirea inoculului de bacterii acetice


n studiul efectuat am folosit medii preparate din vin alb, vin alb i spirt i numai din spirt, cu i fr adaos de nutrimeni (extract de drojdie sau extract de porumb) utilizai n diferite proporii, menionate n tabelul 6.1, iar inoculul folosit pentru nsmnarea mediilor a fost de 10 i 30%. n scopul producerii de biomas (pentru a servi ca inocul) s-a experimentat cultivarea tulpinii Acetobacter aceti orleansis (T10), n instalaia cu aerare n sistem submers, n varianta mediului de cultivare n lichid hidroalcoolic cu 6% alcool, provenit din spirt rafinat, cu adaos de nutriment n variante cu 0,1 i 0,5% extract de porumb i cu 0,5% extract de drojdie. Adaosul de 0,5% extract de drojdie ca nutriment n lichidul hidroalcoolic, crete biomasa de bacterii acetice (stabilit numeric) cu 3,8% fa de biomasa realizat cu 0,1% extract de porumb. Adaosul de 0,5% extract de porumb n lichidul hidroalcoolic, evident stimuleaz mai mult procesul de multiplicare al bacteriilor acetice i, ca urmare, n aceste condiii biomasa obinut crete cu 33,3% fa de cea realizat cu 0,1% extract de porumb i cu 28,4% n comparaie cu biomasa obinut n varianta adaosului de 0,5% extract de drojdie. n concluzie, extractul de porumb (0,5%) este mai convenabil n producerea de biomas deoarece, prin compoziia sa, favorizeaz metabolismul plastic al celulelor de bacterii acetice cu eficien n procesul de multiplicare i, n plus, este convenabil i sub aspect economic, fiind mai ieftin.

27

Tabelul 6.1. Evoluia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice pe diferite medii de cultivare i cantiti diferite de inocul
Caracteristicile mediului de cultivare Mediu cu 6% alcool i 2% aciditate (250 ml vin alb i 250 ml spirt rafinat) Variantele de mediu Inocul de bacterii acetice

Evoluia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice (prin stabilirea numrului de celule/ml)


iniial la 12 ore dup 24 oredup 48ore dup 72ore dup 96ore dup 120 ore dup 144 ore dup 168 ore

V1: cu nutriment 10% inocul 19x106 21x106 0,1% extract de drojdie din cultura V2: cu nutriment Acetobacter 19x106 32x106 0,3% extract de drojdie aceti V3: cu nutriment 0,5% extract de drojdie
orleansis 19x106 44x106 (T10) de

56x106 84x106 96x106

58x106 96x106

59x106 98x106

65x106

75x106

96x106 1,3x108 1,50x108 1,35x108 1,55x108 1,85x108 1,81x108 2,05x108 2,48x108 1,72x108 1,82x108 2,70x108

1,57x108 1,84x108 2,12x108 1,36x108 1,62x108 1,98x108 1,93x108 2,30x108 2,60x108 2,18x108 2,10x108 2,75x108

1,02x108 1,07x108

1,01x108 1,12x108 1,20x108 1,30x108

Mediu cu 6% alcool i 2% aciditate (spirt rafinat)

V1 94x106 98x106 V2: cu nutriment 94x106 1,0x108 0,1% extract de porumb 30% inocul din cultura V3: cu nutriment 94x106 98x106 de 0,3% extract de porumb Acetobacter V4: cu nutriment 94x106 98x106 aceti 0,1% extract de drojdie orleansis V5: cu nutriment (T10) 94x106 98x106 0,3% extract de drojdie V6: cu nutriment 94x106 99x106 0,5% extract de drojdie V1: cu nutriment 30% inocul 94x106 98x106 0,5% extract de drojdie din cultura
de V2: cu nutriment 6 Acetobacter 94x10 0,1% extract de porumb aceti orleansis V3: cu nutriment 94x106 (T10 0,5% extract de porumb

1,10x108 1,28x108 1,30x108 1,33x108 1,34x108 1,25x108 1,38x108 1,43x108 1,47x108 1,50x108 1,31x108 1,53x108 1,60x108 1,63x108 1,75x108 1,11x108 1,36x108 1,40x108 1,54x108 1,65x108 1,20x108 1,58x108 1,70x108 1,83x108 1,95x108 1,28x108 1,78x108 1,90x108 2,13x108 2,35x108 1,22x108 1,30x108 1,33x108 1,35x108 1,60x108

Mediu cu 6% alcool i 2% aciditate (vin alb)

99x106 1,21x108 1,29x108 1,34x108 1,40x108 1,54x108 99x106 1,40x108 1,52x108 1,70x108 2,00x108 2,22x108

28

6.2. Rezultatele cercetrii industriale


n cadrul cercetrii industriale am urmrit 5 arje de fabricaie a oetului cu interes, privind evoluia procesului fermentativ asupra duratei ciclului de fermentare i a randamentului n acid acetic. n toate ciclurile de fermentare am folosit ca materie prim acelai vin alb pichet. n prima arj, peste 2 000 litri oet cu 8,1% acid acetic s-a adugat 5 600 litri vin alb pichet cu 8,6% alcool i 50 litri cultur selecionat de Acetobacter cultivat i nmulit n prealabil n acelai vin. n ciclurile urmtoare, s-au meninut aceleai proporii ntre oet i vin, variind puin aciditatea iniial a oetului rmas n acetator, care s asigure aciditatea iniial a mediului de fermentare la fiecare arj. Astfel c, dup omogenizarea mediului alcoolic din acetator, aciditatea iniial a variat ntre 2,24 i 2,31% acid acetic (g/100 ml), n timp ce alcoolul mediului de fermentare a fost acelai pentru toate ciclurile de fermentare i anume 6,3%vol. Aerarea s-a fcut n condiiile practicate n ntreprindere, stabilit ca optim prin deschiderea i obturarea orificiilor laterale ale acetatorului. Vinul a fost introdus n acetator fr o nclzire prealabil. Temperatura de fermentare s-a controlat zi i noapte la cele 3 nivele ale acetatorului i s-a ncadrat n limitele 24 340C. Durata ciclului de fermentare pn la nceperea experimentului la acetatorul cu care am efectuat cercetarea a fost de 8 zile, iar aciditatea oetului rmas ca zestre n acetator a fost de 8,1g acid acetic / 100 ml. n sistemul dinamic al experimentului, s-au efectuat analize de aciditate, alcool i pH. Dinamica aciditii fiecrui ciclu de fermentare se poate urmri n tabelul 6.2. n tabelul 6.3. sunt nscrise gradele acetice obinute n cadrul celor 5 cicluri de fermentare, randamentul practic i durata fiecrui ciclu de obinere a oetului. n medie, ciclul de fermentaie realizat n cadrul experimentului industrial este de 125 ore. Din datele prezentate se poate constata c ciclul de fermentare (C4) n care ponderea culturii selecionate, viteza i temperatura de fermentare au crescut, are ca efect reducerea duratei de fermentare la numai 4 zile, dar cu unele pierderi de alcool prin evaporare, care scad randamentul practic de la 76,30 la 72,56%. Tabelul 6.2 Evoluia n timp a aciditii n acetatorul cu capacitatea util de 7 700 litri (EXPERIMENT INDUSTRIAL)
Ciclul de fermentare Caracteristici vin mediu de fermentare iniial 2,24 2,31 2,29 2,26 2,24 Dup 1 zi 5,1 5,2 5,2 5,15 5,1 Aciditatea titrabil g acid acetic/100 ml 2 6,85 6,27 7,19 8,06 6,72 3 7,54 6,85 7,42 8,35 7,56 4 8,23 7,48 7,54 8,50 7,77 5 8,80 8,17 8,64 8,55 6 0,1 3,25 Alcool pH rezidual % oet

C1 C2 C3 C4 C5

Alcool 8,6% Alcool 6,3% vol. vol. Aciditate 0,7 g Aciditate 2,24acid acetic/100 2,31 g acid ml acetic/100 ml pH 4,5 pH 4,5

8,70 8,70

29

Tabelul 6.3 Caracteristicile oetului i randamentele de bioconversie pe cicluri de fabricaie n acetatorul industrial
Randamentul de fermentaie, % 99,2 96,76 94,33 95,34 Ciclul experimental Caracteristici oet finit
o

ac

alc.

C1

C2

C3

C4

C5

5 600 l vin cu 8,6% alcool i 2 000 l oet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool i 2 000 l oet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool i 2 000 l oet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool i 2 000 l oet cu 8,5oacetice 5 600 l vin cu 8,6% alcool i 2 000 l oet cu 8,5oacetice

(5 zile)

6,34

2,24

8,80

0,1

(6 zile) 125 de ore (sunt incluse i operaiile de ncrcaredescrcare ale acetatorului)

6,34

2,31

8,70

0,1

48 564

49 856

Grade acetice realizate / ciclu de fermentare

Caracteristici mediu de Compoziia Durata Durata medie fermentare plmezii de ciclului de a unui ciclu fermentare o fermentare de fermentare oalc. ac din acetator

Reducerea ciclului de fermentare prin aportul culturii selecionate

(5 zile)

6,34

2,29

8,74

0,1

Ciclul de fermentare de la 8 zile (192 97,50 de ore) se reduce la 125 de ore

(4 zile)

6,34

2,26

8,50

0,1

(5 zile)

6,34

2,24

8,55

0,1

Calcularea randamentelor de fabricaie


Randamentul teoretic este dat de cantitatea teoretic de acid acetic rezult din reacia stoichiometric de conversie a alcoolului etilic n acid acetic:
CH3CH2OH + O2 = CH3COOH + H2O 46 g 32 g 60 g 18 g

Prin urmare din 46 Kg alcool i 32 Kg oxigen se obin 60 Kg acid acetic i 18 Kg ap. mprind totul la 46 (greutatea molecular a alcoolului etilic), vom avea: 1Kg alcool+0,696 Kg oxigen=1,304 Kg acid acetic+0,392 Kg ap 60 n mod teoretic 1 g de alcool etilic conduce la = 1,3 g acid acetic. 46 Calcularea randamentului teoretic este urmtoarea: din 100 g alcool etilic se obin, teoretic, 130 g acid acetic. Dintr-un litru de alcool, care cntrete 0,794 Kg, rezult 1,036 Kg acid acetic, iar dintrun Kg alcool absolut, ar trebui s rezulte teoretic 1,304 Kg acid acetic. 1l alcool (0,794 Kg)+0,553 Kg oxigen =1,035 Kg acid acetic+0,311Kg ap

47 956

47 424

49 020

30

n practic randamentul este cu 1520% mai mic dect cel teoretic, datorit pierderilor de alcool etilic, aldehid acetic i acid acetic prin volatilizarea acestora sau prin participarea lor la reacii secundare (de esterificare). Randamentul practic (p) al acetatoarelor Frings este situat ntre 75% (dac acetatorul nu este prevzut cu condensator, iar condiiile de funcionare ale aparatului sunt defectuoase) i 90% din randamentul teoretic (dac acetatorul este prevzut cu condensator, iar condiiile de funcionare sunt corespunztoare). Randamentul practic n cazul acetatoarelor fr umplutur (care funcioneaz prin fermentaie submers) este de 98% din randamentul teoretic. Calcularea randamentului practic Se va lua ca exemplu arja (C1) n care oetul fabricat a avut tria acetic de 8,8% aciditate, deci i oetul mbibat n tala a avut aceeai concentraie. S-a introdus vin cu trie alcoolic de 8,6% alcool, n cantitate de 5 600 l i 2 000 l oet cu 8,5o aciditate. S-au obinut grade alcoolice/ciclu de fermentare astfel: % alcoolic iniial x cantitatea de lichid alcoolic o 8,6 x 7 600 = 65 360 grade alcoolice/ciclu de fermentare La sfritul fermentaiei s-au obinut grade acetice/ciclu de fermentare calculate astfel: (aciditatea final aciditatea iniial) x cantitatea de lichid alcoolic din acetator (8,8-2,24) x 7 600 = 49 856 grade acetice/ciclu de fermentare mprind gradele acetice ale oetului rezultat la gradele alcoolice cuprinse n materia prim i nmulind cu 100, se obine randamentul practic de : 49 856 p= 100 = 76,3% 65 360 Randamentul de obinere a acidului acetic, ( f) n faza de fermentaie, se calculeaz cu relaia: Cp f = 100 Ct n care: C p = cantitatea de acid acetic obinut practic, [g]; C t = cantitatea teoretic de acid acetic, [g]. Randamentul de fermentaie calculat pentru primul ciclu de fermentaie este urmtorul: 76.3 130 = 99,2% f = 100 Rezultatele randamentelor practic, teoretic i de fermentaie obinute pe fiecare ciclu de fermentaie sunt prezentate n tabelul 6.4: Tabelul 6.4. Randamentele obinute Ciclul de fermentare Randamentul Randamentul Randamentul de practic, ( p), % teoretic, ( t), % fermentare, ( f), % C1 76,30 130 99,20 C2 74,43 130 96,76 C3 75,00 130 97,50 C4 72,56 130 94,33 C5 73,34 130 95,34 Randamentele medii 74,33 130 96,63 pe cele 5 cicluri de fermentare Dup cum se poate observa din tabelul prezentat anterior, randamentele obinute n fermentatorul cu tala (Frings) se ncadreaz n valorile prezentate n literatura de specialitate.

31

n figura 6.1 se poate urmri evoluia procesului de fermentaie n funcie de ponderea n cretere a culturii selecionate, prin dinamica vitezei de fermentaie.
Aciditatea, g acid acetic/100 ml 9 C1 8 C2 C3 7 C4 C5

2 1 2 3 4 5 6 7 Durata ciclului de fermentare, zile

Figura 6.1. Dinamica fermentaiei acetice pentru cele cinci cicluri ale experimentului industrial Se subliniaz faptul c, la fiecare dintre cele 5 cicluri de fermentaie, s-a adugat cantitatea menionat de 50 litri cultur selecionat de bacterii acetice (tulpina T10). Concluzii Oetul obinut n cadrul experimentului industrial, are culoare plcut, a fost limpede i nu a necesitat cleire cu bentonit. Aciditatea oetului de 8,5 8,8% acid acetic cu un pH de 3,2 3,25 corespunde normelor europene de calitate. Randamentul practic cu care se obine oetul cu participarea culturii selecionate, de 99 103% a fost foarte bun i a evideniat o cultur de bacterii acetice activ i o tehnologie corect aplicat. Ca urmare a utilizrii culturii selecionate de Acetobacter la fiecare ciclu de fermentare durata arjei se reduce n medie de la 192 la 125 de ore (fiind incluse i operaiile de ncrcare-descrcare), desigur cu consecine asupra creterii productivitii. Cultura de Acetobacter izolat, selecionat, studiat i utilizat n experimentul industrial, fr ndoial a demonstrat caliti fermentative superioare n biotehnologia obinerii oetului.

32

CAPITOLUL VII. PROIECTAREA I STABILIREA PARAMETRILOR DE FUNCIONARE A UNEI INSTALAII DE PRODUCERE A OETULUI N SISTEM SUBMERS 7.1 Prezentarea instalaiei de laborator cu funcionare n sistem submers
Instalaia sub form cilindro-conic a fost confecionat din oel inoxidabil, fiind prevzut cu un agitator cu rotaie variabil, ntre 10-60 rot/min. Axul i paleta agitatorului au fost realizate din sticl ca, de altfel i barbotorul de aer. Axul agitatorului se cupleaz la exterior la un motora electric al unui agitator cu un cablu flexibil. Schimbtorul de cldur montat n fermentator s-a confecionat din eav de oel inox cu diametrul = 6 mm, ramura de intrare i ieire fiind legate la un termostat cu termometru de contact, cu posibilitate de meninere constant a apei din termostat la 25100oC. Legtura dintre intrare i ieire a schimbtorului de cldur din fermentator i termostat s-a fcut prin tuburi de plastic flexibile. ntr-un orificiu situat pe capacul fermentatorului s-a montat un refrigerent rcit cu ap de la robinet, cu scopul de a condensa vaporii de acid acetic n vederea recuperrii acestora. Capacul fermentatorului s-a fixat etan de capac cu ajutorul unor uruburi, iar etaneitatea a fost asigurat de o garnitur de material plastic acido-rezistent. Aerarea agitatorului s-a realizat cu ajutorul unei pompe de aer folosit n mod curent pentru acvarii. Verificarea temperaturii lichidului n fermentare s-a fcut cu ajutorul unui termometru cu mercur, cu limitele de msurare cuprinse ntre 0 i 50 oC. Schia de principiu i vederea general a instalaiei de laborator este artat n figurile 7.1 i 7.2 (anexa 3).

7.2. Funcionarea instalaiei de laborator


Iniial se pregtete soluia hidroalcoolic (format din vin i/sau soluie hidroalcoolic, care se aciduleaz cu acid acetic pn la aciditatea de 2 g%). Soluia se inoculeaz cu cultur de bacterii acetice n proporie de 10%. Amestecul realizat se introduce n fermentator (pentru aerare) printr-un orificiu prevzut cu capac, cu ajutorul unei plnii de sticl, orificiu care se nchide apoi cu un dop de material plastic. Instalaia este pus n funciune prin conectarea agitatorului pompei de aer i a termostatului la reeaua electric de 220 V / 50 Hz. nainte de nceperea fermentaiei acetice temperatura se regleaz i se menine la o 25 C, iar dup declanarea fermentaiei acetice, care este un proces exotermic (se degaj 490 kJ/mol alcool etilic absolut), temperatura se menine n limitele 27-30oC prin intermediul schimbtorului de cldur cuplat la termostat. La terminarea fermentaiei se extrage 90 sau 80% din oetul obinut, iar restul de 10, respectiv 20% constituie cultura de producie pentru o nou arj. Fermentaia acetic se desfoar n prezena oxigenului din aer.

7.3. Rezultate obinute prin cultivarea bacteriilor acetice cu aerare, n sistem submers, n instalaia proprie
Pentru a dispune de bacteriile acetice, necesare pentru inocularea mediilor de cultur, n vederea realizrii obiectivelor tezei de doctorat, am folosit instalaia proprie de fermentare n sistem submers cu aerare (caracteristicile prezentate n capitolele 7.1 i 7.2). Obinerea culturii pure de bacterii acetice n instalaia respectiv s-a realizat ntr-un timp mai scurt, dect n sistem static (pn s-a ajuns la concentraia n celule de 108 / ml).

33

n sistemul discontinuu de cultivare a microorganismelor, creterea i multiplicarea lor au depins de mai muli factori, i anume: de compoziia mediului care se modific treptat datorit consumului de substane nutritive i a acumulrii produilor de metabolism, de pHul mediului, de condiiile de aerare, de temperatur i de cantitatea de inocul. n instalaia amintit am urmrit, n timp, creterea populaiei bacteriene folosind diferite medii nutritive i, totodat, aciditatea, oxigenul din interiorul mediului, pH-ul, temperatura mediului de cultivare, alcoolului i modificrile de culoare. n studiul efectuat am folosit medii preparate din vin alb, vin alb i spirt i numai din spirt, cu i fr adaos de nutrimeni (extract de drojdie sau extract de porumb) utilizai n diferite proporii, iar inoculul folosit pentru nsmnarea mediilor a fost de 10 sau 20% (figura 7.1.).
celulex1000000 / ml 300 V1 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,1%Ed+10%inocul T10 V2 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,3%Ed+10%inocul T10 V3 mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din 1/2 vin si 1/2 spirt)+0,5%Ed+10%inocul T10 V1' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+30%inocul T10 V2' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,1% Ep + 30%inocul T10 150 V3' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,3% Ep + 30%inocul T10 V4' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,1% Ed + 30%inocul T10 100 V5' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,3% Ed + 30%inocul T10 V6' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din vin)+ 0,5% Ed + 30%inocul T10 50 V1'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,5% Ed + 30%inocul T10 V2'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,1% Ep + 30%inocul T10 0 initial 12 ore 24 ore 48 ore 72 ore 96 ore 120 ore 144 ore 168 ore Durata fermentatiei acetice, ore V3'' mediu cu 6% alcool si 2% aciditate (din spirt)+ 0,5% Ep + 30%inocul T10

250

200

Figura 7.1. Evoluia populaiei bacteriene n diferite variante de mediu, cu sau fr adaos de nutrieni Concluzii 1. Numrul de celule pe unitatea de volum crete odat cu creterea dozei de nutriment (0,1; 0,3 i 0,5% extract de drojdie (Ed) sau extract de porumb (Ep)). 2. Adaosul de 0,5% extract de drojdie sau extract de porumb asigur o mai bun nutriie a bacteriilor acetice, n favoarea procesului de multiplicare i randamente mai bune n acid acetic. 3. Variantele de cultivare a bacteriilor acetice n vin alb pasteurizat sau n mediu hidroalcoolic cu 6% alcool, cu sau fr nutrimente, inoculat cu 30% cultur de bacterii acetice sunt mai puin convenabile, deoarece cantitatea prea mare de inocul scade mult pH-ul iniial al mediului (la 3,4), ceea ce are influen defavorabil asupra procesului de multiplicare al celulelor, a cror cretere nu depete 2% fa de numrul iniial de celule. 4. n mediile cu 0,1; 0,3 i 0,5% extract de drojdie i, respectiv extract de porumb, chiar dac numrul de celule crete mai puin sau mai mult n 24 de ore, aciditatea mediilor nu crete, deoarece au loc procese de biosintez n cadrul metabolismului plastic. 5. Ca urmare a oxidrii alcoolului, aciditatea ncepe s creasc dup 24 de ore, n toate variantele adaosului de extract de drojdie sau extract de porumb n mediile de cultivare.

34

6. Randamentul practic n acid acetic la fermentarea submers a mediilor hidroalcoolice analizate variaz ntre 62% (cnd mediul este obinut numai din vin fr adaos de nutriment) i 94% (cnd mediul este obinut din vin alb suplimentat cu 0,5% extract de drojdie). 7. Pe msur ce fermentaia acetic avanseaz, consumul de oxigen n mediul de cultivare este mai mare i ca urmare scade oxigenul prezent n mediu. 8. n acelai timp temperatura crete uor (variind ntre 18 i 22 oC). 9. Nu exist o corelaie ntre concentraia oetului n acid acetic i pH, dar odat cu creterea concentraiei de acid acetic, pH-ul scade puin, rmnnd n limitele valorilor 3,23 3,86, n comparaie cu soluiile de acid acetic pur de concentraii diferite. Astfel pentru concentraiile de acid acetic pur de 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10% , pH-ul soluiilor respective prezint urmtoarele valori 2,86; 2,83; 2,77; 2,73; 2,70; 2,65; 2,60; 2,55; 2,50. n cazul oetului, aa cum am menionat, odat cu creterea concentraiei n acid acetic pH-ul scade puin, dar rmne superior valorii de 3, ceea ce demonstreaz faptul c oetul (din vin sau din soluie alcoolic cu adaos de nutrimente) are o anumit capacitate tampon. n acest context trebuie avut n vedere c acidul acetic este un acid slab, gradul de disociere fiind cu att mai redus cu ct pH-ul din mediu este mai sczut. 10. Cu privire la modificarea culorii n condiiile utilizrii unui filtru cu lungimea de und ( = 420 nm) extinciile citite variaz att n funcie de culoarea iniial a mediului de cultivare, ct i n funcie de stadiul procesului fermentativ. 11. n concluzie, din experimentul efectuat cu extractul de drojdie se obin rezultate mai bune n ceea ce privete multiplicarea tulpinilor de bacterii acetice i al randamentului n acid acetic, dar extractul de porumb (n varianta cu 0,5% Ep) este mai convenabil n producerea de biomas (deoarece prin compoziia sa favorizeaz metabolismul plastic al celulelor de bacterii acetice) cu eficien n procesul de multiplicare i cu randamente mai bune i, n plus, este convenabil i sub aspect economic, fiind mai ieftin.

Ca urmare a experimentelor efectuate n prima etap a cercetrii impus de obiectivele tezei de doctorat, am izolat i selecionat materialul biologic necesar. Au fost izolate 14 tulpini ce aparin genului de bacterii acetice Acetobacter, care dup testele de identificare aparin speciei Acetobacter aceti. n cadrul acestei specii au fost identificate trei culturi de Acetobacter aceti orleansis, zece culturi de Acetobacter aceti aceti i o cultur de Acetobacter aceti xylinum. alcool a culturilor de Acetobacter izolate i obinute n culturi pure; n cazul utilizrii ca materie prim a alcoolului de fermentaie (spirt rafinat) i a folosirii ca nutrient extractul de porumb. Acest studiu a permis stabilirea rapoartelor optime dintre alcool i acid acetic, din mediul de fermentare pentru obinerea unor rezultate bune pentru potenialul fermentativ i randamentul practic pentru fiecare tulpin de Acetobacter, luat n studiu. n mediul de cultivare cu 2, 3, 4, 5 i 6% acid acetic, completat (pn la 11%) cu 9, 8, 7, 6 i 5% alcool i cu 1% nutrient (extract de porumb) s-a constatat la majoritatea tulpinilor de Acetobacter aceti, folosite ca ageni de fermentare, o scdere a eficienei fermentaiei pe msur ce a crescut aciditatea iniial a mediului. Tulpina de Acetobacter aceti orleansis (T10) s-a dovedit a fi mai puin sensibil la aciditatea iniial a mediului de fermentare, scderea eficienei constatndu-se numai n mediul de cultivare cu 5% acid acetic i 6% alcool.

CAPITOLUL VIII. CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI

9 Etapa urmtoare a cercetrii experimentale a urmrit sensibilitatea la aciditate i

35

Tulpin de Acetobacter aceti orleansis (T10) n mediul cu 4% acid acetic i 7% alcool a condus la obinerea unui oet cu 9,4% acid acetic i la un randament practic de 77%; n mediul cu 5% acid acetic i 6% alcool s-a obinut oet cu 9,3% acid acetic, cu un randament practic de 71,2%. n mediul cu 6% acid acetic i 5% alcool activitatea culturii a fost slab, realizndu-se un randament practic sub 50%. Prin utilizarea tulpinii de Acetobacter T10 s-a obinut oet cu peste 9% acid acetic, cu un randament practic n jur de 77%, n mediile de cultur cu 2%, 3% sau 4% acid acetic i n completare cu 9%, 8%, 7% alcool, suplimentate cu extract de porumb (1%). Tulpinile C3, 2Gl, Ai i S au manifestat acidorezisten mai mare, dect tulpina T10, ele conducnd la randamente de fermentare de 52 58%, atunci cnd mediul de cultur a fost reprezentat de o soluie alcoolic cu concentraia de 5% alcool etilic, acidulat cu 6% acid acetic . n mediile de cultur n care variabila a fost reprezentat de coninutul de alcool (concentraii testate: 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% i 12% alcool n asociaie cu 2% acid acetic i 1% extract de porumb notat cu Ep), s-a constatat c pe msur ce a crescut concentraia de alcool din mediul, randamentul practic a sczut, difereniat n funcie de tulpina de Acetobacter aceti, folosit ca agent de fermentare. n mediul de cultur cu 6% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep toate tulpinile de Acetobacter aceti au oxidat alcoolul etilic cu randamente bune, cuprinse ntre 89,8 96%. n mediul de cultur cu 7% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep, randamentele practice de fermentaie pentru cele 10 tulpini de bacterii acetice s-au ncadrat ntre 80 93,7%. Randamente mai mari de 90% au fost obinute numai n cazul tulpinilor de Acetobacter A10 i S. n mediul de cultur cu 8% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep, randamentele de fermentaie obinute cu tulpinile luate n studiu au fost cuprinse ntre 72 85,4%, evideniindu-se tot tulpinile de Acetobacter A10 i S. n mediul de cultur cu 9% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep, randamentele de bioconversie a alcoolului n acid acetic au sczut semnificativ, fiind cuprinse ntre 52 76,6%. n mediul de cultur cu 10% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep, randamentele de transformare a alcoolului n acid acetic de ctre cele zece tulpini de Acetobacter aceti s-au ncadrat ntre 51,3 70,2%, iar cele mai bune rezultate au fost obinute cu tulpinile de Acetobacter aceti orleansis T10 i Acetobacter aceti aceti 2Gl. n mediul de cultur cu 11% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep, eficiena fermentaiei a sczut semnificativ, randamentele de bioconversie a alcoolului n acid acetic la cele zece tulpini de Acetobacter fiind cuprinse ntre 46,6 61,5%; rezultatele cele mai bune au fost obinute cu tulpinile de Acetobacter aceti orleansis T10 i Acetobacter aceti aceti 3Gl. n mediul de cultur cu 12% alcool, 2% acid acetic i 1% Ep activitatea fermentativ a celor zece tulpini de Acetobacter a fost slab, cu randamente practice cuprinse ntre 38,2 52,3%. n aceste condiii numai tulpinile de Acetobacter T10 i C2 au transformat alcoolul n acid acetic cu un randament practic de 50 52,3%. n cazul folosirii vinului alb cu 6% alcool i 0,65% acid acetic (ca prob martor) i a vinului alb suplimentat cu 1%, 2%, 3% i 4% alcool (diferite variante de mediu de cultur), a rezultat, n cazul tulpinilor de Acetobacter T10, Ai i 2Gl, folosite separat ca ageni de fermentare, c pe msur ce gradul alcoolic al mediului a crescut, randamentul practic de bioconversie a sczut. Variantele de mediu optime au fost cele cu un coninut de alcool de 6 8%, pentru care s-au obinut randamente practice cuprins ntre 80 98%. n cazul utilizrii mediului de fermentare cu 8% alcool, provenit n pri egale din vin i alcool rafinat, s-au obinut un randamente de bioconversie cuprinse ntre 79,9 81,5%. Diluarea vinului cu soluie alcoolic din spirt a condus la srcirea mediului n

36

substane nutritive i la privarea tulpinilor de bacterii acetice (T10, Ai i 2Gl) de nutrienii necesari. Suplimentarea mediului nutritiv cu 0,3% Ep a condus la creterea eficienei fermentaiei i a randamentelor practice de conversie (80,9 89,4%), n cazul utilizrii tulpinilor de bacterii acetice T10, Ai i 2Gl. Acest supliment nutritiv a stimulat, n special, activitatea tulpinii 2Gl, ceea ce a determinat mrirea randamentului practic cu 19,1%. n toate variantele de mediu de cultur pe baz de vin alb sau vin alb n combinaie cu alcool rafinat, mbogite sau nu cu extract de porumb, cu sau fr adaos de acid aceti (1% sau 2%), tulpina de Acetobacter aceti orleansis T10 s-a dovedit a fi cea mai eficient. Experimentrile pe mediul de cultur pe baz de vin rou cu 9% alcool, 2% acid acetic i 81,75 mg/100 ml antociani au artat c dintre cele treisprezece tulpini de Acetobacter aceti, luate n studiu, numai T5, T6, T8, Ai, 3Gi i A10, au manifestat rezisten la polifenoli, ele desfurnd activitate oxidativ remarcabil. Tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8 i Ai n vin rou au condus la obinerea unui oet cu 9 9,65% acid acetic i la randamente practice de 77,8 85%, pe cnd cu tulpinile de Acetobacter A10 i 3Gi s-a obinut oet cu 6 7% acid acetic i un randament practic cu puin peste 70%. Tulpinile de Acetobacter T10 i 2Gl, care nu s-au putut dezvolta n vinul rou, (81,75 mg/100 ml antociani) s-au dezvoltat n vinul roze (cu 20 mg/100 ml antociani) unde au realizat o activitate fermentativ eficient i un randamente practice de 95 96,5%, iar tulpina de Acetobacter Ai s-a dezvoltat bine, att n vin alb, ct i n vin rou. Pentru fermentarea acetic a vinului rou, cu un coninut mai ridicat n polifenoli, recomandm tulpinile de Acetobacter aceti T5 i T6. Fosfatul de amoniu (Fa) nu a influenat semnificativ dezvoltarea i activitatea bacteriilor acetice folosite. Tulpinile de Acetobacter T5, T6, T8, Bz i 3Gi n mediul de cultur cu 7% alcool, 2% acid acetic i tulpina S, n mediul de cultur cu 8% alcool, 2% acid acetic, au fost mai sensibile la adaosul de fosfatul de amoniu (0,2-0,3%), nregistrndu-se urmtoarea ordine descresctoare privind eficiena fermentaiei acetice n prezena fosfatului de amoniu: S> T> Bz> 3Gi. Tulpinile T5 i T6 au prezentat activitate fermentativ extrem de redus. n prezena fosfatului de amoniu producia de acid acetic a fost de 3,1% pentru tulpina S (0,2% Fa); 1,9% n cazul tulpinilor T8 i Bz (0,3% Fa) i de 0,8% (0,2% Fa) pentru tulpina 3Gi. Extractul de porumb folosit ca nutrient asigur o nutriie i o activitate fermentativ mai bune pentru culturile de bacterii acetice, dar nu satisface complet cerinele nutriionale, dect n cazul tulpinii de Acetobacter S. Adaosul de extract de porumb, n proporie de 0,3-0,5% a stimulat difereniat activitatea bacteriilor acetice, nregistrndu-se urmtoarea ordine descresctoare de eficien a stimulrii dezvoltrii tulpini de bacterii acetice de nutrientul respectiv: T8 > Bz > 3Gi > T5 > T6 (n cazul mediului de cultur cu 7% alcool, 2% acid acetic, extractul de porumb). Tulpina de Acetobacter T5 a fost mai eficient la un adaos de 0,5% Ep n mediul de fermentare, fa de adaosul de 0,3% Ep. Tulpina de Acetobacter S a produs 4,4% acid acetic la un adaos de 0,3% Ep n mediu; 4,9% acid acetic la un adaos de 0,5% Ep i la 6 g acid acetic / 100 ml la un adaos de 1% Ep (randamentul practic realizat 75%), n mediul de cultur cu 8% alcool i 2% acid acetic. Eficiena adaosului de Fa (0,2-0,3%) n asociaie cu extractul de porumb a fost nesemnificativ. Adaosul diferiilor nutrieni la mediul de cultur cu 6% alcool i 2% acid acetic, n cazul acetificrii cu tulpinii Acetobacter aceti orleansis a condus la urmtoarele rezultate:

9 9

37

- la un adaos de 0,1% fosfat de amoniu (Fa) i 0,1% sulfat de amoniu (Sa), bacteria Acetobacter aceti orleansis a generat 6,8% acid acetic, la un randament practic de 80%; - prin adaos de 0,5% extract de drojdie (Ed) oetul obinut cu Acetobacter aceti orleansis a avut o aciditate de 6,7% acid acetic, randament practic fiind de 79%; - adaosul de 1% extract de drojdie a determinat creterea activitii fermentative a acestei tulpinii respective, care a produs oet cu 7% acid acetic, cu un randament practic de 83,3%.
n cazul utilizrii mediului de cultur cu 5% alcool i 3% acid acetic, suplimentat cu diferii nutrieni, tulpina de Acetobacter T10, folosit ca agent de fermentare a condus la obinerea rezultatelor: - prin adaos de 0,1% fosfat de amoniu (Fa) i 0,1% sulfat de amoniu (Sa) tulpina Acetobacter T10 a produs un oet cu 6,9% acid acetic, la un randament practic de 78%; - prin suplimentarea mediului de cultur cu 0,5% extract de drojdie aciditatea oetului s-a situat la nivel 7,4% acid acetic, iar randamentul practic la nivel de 88%. Cercetrile realizate la nivel de laborator au permis stabilirea variantelor optime de medii de cultur i selecionarea tulpinii de Acetobacter cu potenialul oxidativ cel mai ridicat (Acetobacter aceti orleansis T10). Aceste rezultate au constituit punctul de plecare pentru obinerea culturilor de producie n acetatorul experimental proiectat i realizat de noi, care au fost testate la nivel industrial ntr-un acetator Frings de mare capacitate (8000 l) Experimentrile, conduse la nivel industrial n cele cinci cicluri de fermentaie, au confirmat eficiena tulpinii Acetobacter aceti orleansis T10, n ceea ce privete viteza de multiplicare i potenialul de bioconversie a alcoolului etilic n acid acetic. Durata ciclului de fermentare a fost mai scurt n raport cu varianta tehnologic aplicat n producia curent a fabricii i randamentul practic a fost superior celui realizat n producie. Caracteristicile fizic-chimie ale oetului obinut de noi la nivel industrial au fost uor mbuntite n raport cu oetul produs de unitate, unde au fost efectuate testrile. n experimentele realizate n sistem submers s-a urmrit evoluia procesului de multiplicare a bacteriilor acetice i caracteristicile fizico-chimice ale diferitelor variante de mediu de cultivare, astfel: - multiplicarea tulpinii de Acetobacter aceti orleansis (T10) prin citirea numrului de celule / ml soluie cu ajutorul camerei Thoma; - cantitatea de oxigen din mediu (mg / l) cu ajutorul oxi-metrului Multi 350i; - pH-ul cu ajutorul pH metrului; - temperatura mediului de fermentare (oC) cu ajutorul unui termometru cu mercur; - aciditatea (g acid acetic / 100 ml mediu) titrimetric; - culoarea (la lungimea de und de 420 nm). Toate acestea sunt rezultatul unei activiti ndelungate de laborator, n cadrul tezei de doctorat i al sprijinului acordat de profesorul ndrumtor. Acetatorul experimental va intra n dotarea laboratorului de biotehnologii industriale, iar culturile starter realizate vor fi donate coleciei de microorganisme a facultii de tiina i Ingineria Alimentelor.

9 9

38

BIBLIOGRAFIE [1] Ana Alexandru, Tehnologia vinului i subproduselor, Galai, 1980. [2] Ana Hulea, Ghid pentru laboratoarele de microbiologie i bacteriologie. [3] Annencov M. G. Fabricarea oetului, Picepromizdat, Moscova, 1951. [4] Bahrim G., Microbiologie tehnic, Editura Evrika, Brila, 1999. [5] Banu C. Manualul inginerului de industrie alimentar, vol. I, Bucureti, 2002. [6] Banu C. Biotehnologii n industria alimentar, Ed. Tehnic, Bucureti, 2000. [7] Banu C., Voiculescu L., Stabilizarea i dezacidifierea vinurilor, Editura de Pres Universitar, Bucureti, 2000. [8] Banu C., coord. , Calitatea i analiza senzorial a produselor alimentare, Editura AGIR, Bucureti, 2007. [9] Brzoi, D. Microbiologia produselor alimentare, Editura Ceres, Bucureti, 1985. [10] Bohatier P. a, Modeling the kinetics of growth of acetic acid bacteria to increase vinegar production: analogy with mechanical modeling, Laboratoire de Genie Biologique et Sciences des Aloments, Universite Montpellier. [11] Bourgeois C.M., Larpent J. P., Microbiologie alimentaire les fermentation alimentaires, vol. II, Cap. 6 Le vinaigre (Divies C.), Technique et documentation Lavoisier, Paris, 1989. [12] Carpov S. Tehnologia general a industriei alimentare, I.E.P. tiina, Ed. Tehnic, Bucureti, 1997. [13] Cotea V. Tratat de oenologie Vinificaia i biochimia vinului, vol. I, Ed. Ceres, Bucureti, 1985. [14] Cotea V. Tratat de oenologie Limpezirea, stabilizarea i mbutelierea vinului, vol. II, Ed. Ceres, Bucureti, 1988. [15] Clark P.J., Fermentation-New Products from an Old Process, vol 58, no. 10, oct. 2004 [16] Dan Valentina, Oancea Ioana, Zara Margareta ndrumar de lucrri practice la microbiologie, Galai, 1985. [17] Dan Valentina, Oancea Ioana, Zara Margareta Controlul microbiologic al produselor alimentare, Galai, 1991. [18] Dan Valentina Microbiologia alimentelor, Ed. Alma, Galai, 2001. [19] Divies C., Contribution a letude de la production dacide acetique et du metabolisme de lethanol par les bacteries acetiques. Paris.1973. [20] Ebner H., Acetic acid. Biotehnology, vol 3, pp.387-407, 1983. [21] Ghimicescu G., Chimia i analiza alimentelor, buturilor i condimentelor, Editura Funimea, Iai, 1977. [22] Ionescu Aurelia, Zara Margareta Biotehnologia aditivilor alimentar, Ed. Evrika, Brila, 2001. [23] Mencinicopschi .a., Biotehnologii n prelucrarea produselor agroalimentare, Editura Ceres Bucureti, 1987. [24] Moraru C., Rpeanu R., Tehnologia industrializrii porumbului, Editura Tehnic, Bucureti, 1972. [25] Oancea Ioana, Renescu I. Cercetri privind fermentaia acetic, n lucrrile celui de-al II-lea Simpozion de Microbiologie Industrial, Iai, 1980. [26] Oancea Ioana O nou tulpin de Acetobacter n experiment industria, n Lucrrile Congresului ARA - Trgovite, 1997. [27] Oancea Ioana Posibiliti de combinare a materiilor prime folosite n fabricarea oetului, n Analele Universitii Valahia Trgovite, 2000. [28] Oancea Ioana Microbiologia produselor alimentare. [29] OIV, 2005 Recueil des methodes internationales danalyse des vins et des mouts, volume 1, Paris. [30] Pogany I., Metode fizice n chimia organic - Spectrofotometria, Editura tiinific, Bucureti, 1972. [31] Pomohaci N., Nmoloanu I. Producerea vinurilor i a altor buturi din struguri i vin, Ed. Tehnic, Bucureti. [32] Popa A.I., Teodorescu C. Microbiologia vinului, Ed. Ceres, Bucureti, 1990. [33] Ribereau Gayon, J. .a. Sciences et techniques du vin. Dunod, Paris, vol.I, 1972, vol. II, 1975, vol.III, 1976, vol.IV, 1976. [34] Ronald A., Principles of Microbiology, St. Louis, Missouri, 1995. [35] Rugin V. Din secretele proceselor fermentative (de la vin la antibiotice), Ed. Tehnic, Bucureti, 1992.

39

[36] Salle A.J., Fundamental principles of bacteriology, Mc. Graw-Hill Book Company, Ing. 1954. [37] Satinover N., Marinescu I., Conservarea industrial a alimentelor, Editura Tehnic, Bucureti, 1962. [38] Segal Rodica, Biochimia produselor alimentare, vol. II, Ed. Alma, 1999. [39] Segal Rodica, Metode rapide de analiz n industria alimentar, Editura Tehnic, Bucureti, 1966. [40] Thonges Henrich , Sucuri de fructe, vinuri, oet i lichior- traducere din limba german de Popescu Cornelia, Ed. M.A.S.T. Bucureti, 1999. [41] Tofan Clemansa, Bahrim Gabriela, Nicolau Anca, Zara Margareta, Microbiologia produselor alimentare, Ed. AGIR, Bucuresti, 2002. [42] Vasilescu I. Tehnologia i aplicaiile industriale ale enzimelor, Ed. Tehnica, Bucureti, 1963. [43] Vandamme, E. Fermented foods en Fermentation. n Revue des fermentations et des industries alimentaires, 7, 1982, p.158. [44] Trdea C., Ghe. Srbu i A. Trdea, Tratat de vinificaie, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iai, 2000. [45] rdea C., Chimia i analiza vinului, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iai, 2007. [46] *** Curs pentru profesorii candidai la gradul didactic I. Probleme ale calitii produselor alimentare, Galai, 1997. [47] *** Tehnologia produselor fermentative, Ed. Tehnic, Bucureti, 1950. [48] http://129.93.84.115/Chemistry/MicroScale/Titration of vinegar [49] http://linus.chem.ukans.edu/Hewlett/Chemistry184/Determination of AceticAcid in Vinegar [50] http://www.cipriani.com/cipriani/Aceto/chemicae1.htm/Vinegarchemistry [51] http://www.fermierul.ro/modules/bolile vinului, march 2002. [52] A Text book for student, Investigator and Manufacturer, Commercial Fruit and Vegetable Product, W. V. Cruess, Mc. Graw, Hill Book, Company, 1958 [53] Food sciens Foods and enzymes product by microorganisms, cap. 21. [54] *** Food & Drinks Globus, aprilie 2001, anul 3, nr. 20. [55] *** Food & Drinks Globus, ianuarie 2002, anul 4, nr. 29. [56] *** Food & Drinks Globus, februarie 2002, anul 4, nr. 30. [57] *** Food & Drinks Globus, Stroia I., Obinerea oetului de calitate superioar, anul 9, nr. 97, septembrie 2007. [58] http://www.Wikipedia/acid acetic/proprietati [59] STAS 184/287 alcool etilic i buturi alcoolice. [60] STAS 6182/1-79 vin. [61] STAS 3001-91 ap potabil. [62] STAS 157-86 oet alimentar. [63] SR EN 13188 oet.produs fabricat din lichide de origine agricol. definiii, prescripii, marcare.

40

Anexa 1. Tabelul 1
Caracteristicile unor tipuri comerciale de oet
Tipul de oet Indicatorul Densitatea, [Kg/m3] Extract, [g / l] Cenu, [g / l] Aciditate total, [% acidacetic] Aciditate volatil, [%acid acetic] Acizi nevolatili, [%acid acetic] Alcool etilic, [%] Azot total, [%] Glucide, [g / l] Aldehid acetic, [mg/l] Acetat de etil, [mg/l] Acid citric, [g / l] Acid malic, [g / l]
*

Oet din vin

Oet de mere

Oet de mal

Oet din spirt*

Oet de orez Oet balsamic

Oet sintetic**

1013-1020 1013 - 1024 1011-1022 1015-1020 8,71-24,88 1,47-3,10 5,94-9,2 5,55-7,95 0,02-0,55 0-0,81 1,15-1,86 0-6,2 19,9-114,4 206-590 0,26-0,39 0,47-0,8 19-35 2-4,5 3,9-9 0,1-0,55 1,5-7 0,47-0,8 3-28 0,6-7,6 4,3-5,9 0,2-0,4 0,4-1,4 0-6,2 18,9-114,4 206-590 0,26-0,39 0,47-0,8 1,5-6 0,2-0,5 11,5-12,2 0,05-0,15 0,03-0,3 -

0,5-7,6 4-5,24 3,79-5,16 0,05-0,66 0,05-0,68 0,8-1,29 0-91 -

336,7-873,9 4-18,8 6,25-14,88 3,9-13,6 1,58-2,27 0,04-0,08 1,02-2,16 351-689,7 84,9-374,7 1,66-3,47 8-37,4

1007-1022 1-4,5 0,2-0,5 4,1-5,3 -

De regul oetul din spirt se coloreaz cu caramel.

** Nu este admis pentru consum alimentar conform legislaiei n vigoare.

Tabelul 4.1 Caracteristici difereniale n cadrul genului Acetobacter


CARACTERE MACROSCOPICE SPECII SUBSPECII Oxidarea lactatului Oxidarea glicerolului Producerea Creterea Producerea Producerea de catalaz pe mediu de celuloz de pigmeni HoyerTESTE BIOCHIMICE CARE POT FI FOLOSITE N SCOP TAXONOMIC PENTU BACTERII ACETICE Acetobacter Frateur Acetobacter aceti A.a.-aceti A.a.-orleansis A.a.-xylinum A.a.liquefaciens A.p.A.p.-lovaniensis A.p.-estunensis A.p.-ascendens A.p.-paradoxus Acetobacter peroxidans + + + + + + ----------+ + + + --+ --+ ---------pasteurianus pasteurianus + + + + + + + + + + -+ + --+ --+ ---+ +

41

Tabelul 4.2. Caracterizarea macroscopic a tulpinilor de bacterii acetice studiate


REZULTATUL TESTELOR BIOCHIMICE AL BACTERIILOR ACETICE Tulpina de bacterii acetice testat Ai A10 C2 C3 2Gl 3Gl S T10 Bz 3Gi T5 T6 T8 T14 +++ + +++ + +++ +++ + +++ + + +++ + + +++ +++ +++ ++ +++ +++ + +++ + + +++ +++ +++ + ++ ++ + + + + + ++ + + + ++ + + --+ + + + + -+ + +++ + ++ -------------+ --------------A.a.-orleansis A.a.-orleansis A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-orleansis A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-aceti A.a.-xylinum Oxidarea lactatului Oxidarea glicerolului Producerea Creterea pe Producerea de Producerea de celuloz pigmeni Frateur Introducere n clasificare de catalaz mediu Hoyer-

42

Anexa 2. Tabelul 4.3.


Cultura Testul de oxidare a glicerolului dezvoltarea Ai +++

OBSERVAII MACROSCOPICE Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid


forma circular, cu margini ridicate profilul convex marginea aspectul culoarea crem

uniform aspru, mat

A10 +++ filamentoas plat erodat aspru, mat crem

C2 +++

circular, cu margini ngroate

plat

uniform neted, mat

crem

C3 ++ neregulat crescut ondulat lucios crem

2 Gl +++ neregulat crescut lobat neted, cremos crem

3 Gl +++

circular, cu margini ngroate

crescut

uniform

neted, lucios

crem, nchis

S + neregulat plat lobat neted, lucios crem

43

T10 +++ rizoidal crescut lobat neted, cremos crem

Bz + circular plat

uniform cu margini cretate

neted, mat

alb

3 Gi + circular plat

uniform cu margini cretate

neted, mat

alb

T5 +++ circular plat uor ondulat neted, mat crem

T6 +++ circular convex uor lobat rugos, cremos crem

T8 +++ circular convex lobat rugos, cremos alb crem

Tabelul 4.4.
Cultura Testul de oxidare Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid a lactatului dezvoltarea forma profilul marginea aspectul Ai +++ circular, plat ondulat aspru, punctiform lucios culoarea crem

A10 + circular, punctiform plat uniform neted, lucios crem

44

C2 +++ circular convex uniform neted, cremos crem

C3 + circular plat ondulat aspru, cremos crem

2 Gl +++ circular neregulat crescut lobat rugos, cremos crem

3 Gl +++ circular, rizoidal plat filamentoas aspru, lucios crem, maroniu

S + circular plat uniform aspru,cr emos crem

T10 +++ filamentoas crescut ondulat rugos, cremos crem

Bz + circular plat uniform cu margini cretate neted, mat alb

3 Gi + circular plat uniform cu margini cretate neted, mat alb

Bz +++

circular, cu margini ngroate

convex

uniform

neted, cremos

crem

45

3 Gi ++ neregulat, punctiform plat ondulat aspru, cremos crem

T5 +++

circular, cu margini ngroate

convex

uniform

neted, cremos

crem

T6 +++ circular, neregulat convex neregulat rugos, cremos crem nchis

T8 + punctiform plat ondulat aspru, lucios crem

Tabelul 4.5.
Cultura Testul de Caracterizarea coloniei dezvoltate pe mediu solid cretere pe dezvoltarea forma profilul marginea aspectul mediul Hoyer Frateur Nu s-a dezvoltat Nu s-a dezvoltat + filamentoas plat filamentoas neted, mat culoarea

Ai A10 C2

alb

C3 + filamentoas plat filamentoas aspru, lucios alb

2 Gl + circular, filamentoas plat erodat neted, mat crem

46

3 Gl + circular, filamentoas plat erodat neted, lucios crem

S + circular plat uniform neted, mat alb

T10 Bz

Nu s-a dezvoltat + circular, punctiform plat uniform cu margini cretate neted, mat alb

3 Gi + circular, filamentoas plat

uniform cu margini cretate

neted, mat

alb

T5 +++ circular, cu margini ngroate crescut uor erodat aspru, mat alb cretat

T6 + circular, punctiform plat uor erodat aspru, lucios crem

T8 ++ circular, punctiform crescut uor erodat aspru, lucios crem

Legend:
+++ ++ + dezvoltare foarte bun dezvoltare bun dezvoltare slab

47

Anexa 3
5 7 7 8 11 2 3 10 1 6

4
Variai

Fig. 7.1. Acetatorul submers pilot


1 - corpul acetatorului; 2 - capacul acetatorului; 3 - sistemul de nchidere al capacului; 4 - robinet de evacuare a oetului; 5 - electromotor; 6 - ax cu o palet; 7 - intrarea apei de nclzire n schimbtorul de cldur; 7 - ieirea apei de nclzire din schimbtorul de cldur spre termostat; 8 - barbotor; 9 teac; 10 - termometru; 11 - condensator.

Fig. 7.2. Vederea general a instalaiei cu funcionare submers pilot

48

LUCRRI PUBLICATE DIN DOMENIUL TEZEI DE DOCTORAT

Lucrari publicate in reviste de specialitate: Buletinul Agir, anul VIII, nr.3, iulie septembrie 2003, ISSN 1224-7928, tiina i Ingineria Alimentelor, Studii i cercetri, Instalaie pilot pentru fermentaia acetic submers. Lucrari prezentate la conferinte de specialitate: 1. A comparative study on the efficiency in acetic acid obtained in acetic fermentation with 10 Acetobacter colonies, Banu Constantin, Garnai Maria Cristiana, Annals of the Suceava University Food engineering, year VI, no.2, p 84, Ed. Universitii Suceava, ISSN 1842-4597, 2007. 2. The acetic bacteria isolation and selection for the vinegar industry, Oancea Ioana, Garnai Maria Cristiana, Annals of the Suceava University Food engineering, year VI, no.2, p 92, Ed. Universitii Suceava, ISSN 1842-4597, 2007. 3. Studiu asupra capacitii fermentative a unor tulpini de Acetobacter aceti n vin rou i roze , Garnai Maria Cristiana Actes du cinquime Colloque franco roumain de chimie applique COFrRoCA 2008, Bacau, Roumanie, no.5, p 172 , Ed. Alma Mater - Bacu, ISBN 978-973-1833-77-4 , 25-29 iunie 2008. Cri: Tehnologia fabricrii oetului, Editura Fundaiei Universitare, Galai, 2006.