SUBIECTE EXAMEN PRACTIC MICROBIOLOGIE

SEMESTRUL II, BALS 2017

Recapitulare medii de cultura (semestrul I):

! Medii de cultura pentru izolare bacteriana:

uzuale, nediferentiale,

diferentiale, care diferentiaza pe baza unui singur caracter, grupe taxonomice (geloza sange, CLED,
AABTL, MacConkey cu sorbitol, Chapman etc)

medii selective: inhiba dezvoltarea bacteriilor asociate cu germenul a carui izolare se urmareste,

Efectul selectiv este obtinut prin urmatoarele metode:

- cresterea presiunii osmotice (concentratii de saruri crescute),

- actioneaza prin valori diverse de pH (apa alcalina peptonata, pH= 8),

- actiunea bacteriostatica sau bactericida a unor substante,

- adaugarea de coloranti (cristal violet, eozina, albastru de metilen, verde briliant), diverse substante
organice (acizi biliari, saruri biliare).

* medii slab selective (Levine, MacConkey),

* medii moderat selective (ADCL, Hektoen, SS),

* medii inalt selective (Wilson Blair)

---

medii de imbogatire:

Def: asigura dezvoltarea unei specii in detrimentul altora

- mediul Selenit acid de sodiu- favorizeaza dezvoltarea tulpinilor din genul Salmonella, dintr-un prelevat
pluribacterian, cum sunt materiile fecale,

- mediul Chapman lichid (imbogatire pentru Staphylococcus aureus- insamantarea alimentelor nr mic
de bacterii, necesita multiplicare),

- apa peptonata alcalina (pH-8): imbogatire Vibrio cholerae

medii de conservare si transport:

- sunt, in general, sarace in substante nutritive,

- au capacitatea si rolul de a mentine viabilitatea limita a microorganismelor, timp de 24- 48 ore.

- mediu Stuart, Amies, Cary Blair, apa peptonata alcalina etc.

! pe medii diferentiale (AABTL), selectiv diferentiale (MacConkey cu lactoza, MacConkey cu sorbitol,
ADCL, Chapman) :

- colonii lac(+): galbene pe AABTL, roz opace pe MacConkey, ADCL,

- lac (-): translucide, de culoarea mediului,
- sorbitol (+): rosii,
- sorbitol (-): roz translucide, culoarea mediului,
- colonii manita(+): galbene, cu virarea mediului in galben (Staphylococcus aureus),
- colonii manita(-): roz, culoarea mediului, care ramane nevirat (Staphylococcus spp)

Recapitulare coloratii (semestrul I):

GRAM
Reactivi necesari:
1. solutie de violet de gentiana 1%,
2. solutie Lugol (fixator/ mordant),
3. solutie alcool acetona (sol. decoloranta),
4. solutie fucsina bazica 1%, in dilutie 1/ 10 (dilutia se face pe lama, in momentul utilizarii)
* Tehnica de lucru:
- pe frotiul uscat si fixat se depune solutie violet de gentiana (sa acopere frotiul), proaspat
filtrata, fara precipitate, timp de 1- 2 min,
- dupa 2 min se varsa colorantul si se acopera frotiul cu solutie Lugol, 2- 3min,
- se indeparteaza sol Lugol si se decoloreaza cu sol alcool- acetona, pana cand decolorantul se
indeparteaza incolor de pe frotiu,
- operatia de decolorare se poate repeta de mai multe ori, fiind timpul cel mai important al
coloratiei Gram: permite diferentierea germenilor Gram + de cei Gram -,
- se spala cu apa de robinet (opreste decolorarea),
- recolorare cu solutie fucsina bazica 1%, dilutie 1/ 10, timp de 1-2 min,
- frotiul se spala apoi cu apa de robinet si se usuca la temperatura camerei,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
* Mecanismul coloratiei Gram are la baza compozitia biochimica diferita a peretelui celular la
bacteriile Gram (+) fata de cele Gram (-):
- in structura peretelui celular la bacteriile Gram (-), continutul crescut de lipide (care,
solubilizandu- se in alcool acetona, creste permeabilitatea peretelui celular) permite
pierderea violetului de gentiana si recolorarea ulterior cu fuxina.
- la bacteriile Gram (+), peretele celular are alta compozitie: predomina acidul muramic. In
timpul tratarii cu alcool acetona se deshidrateaza, permeabilitatea se reduce si violetul de
gentiana nu mai poate fi extras din celule.
* Tipuri de coci Gram (+):
- genul Staphylococcus spp.,
- genul Streptococcus spp., Enterococcus spp.,
* Tipuri de bacili Gram (+):
- Listeria spp.,
- Bacillus spp., (B. anthracis)
- Clostridium spp., (Cl. tetani)
* Tipuri de coci Gram (-):
- Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoese,
- Moraxella, Branhamella etc
* Tipuri de bacili Gram (-):
- E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus, (Enterobacteriaceae),
- Haemophilus spp,
- Pseudomonas spp
* Bacterii Gram (+) la limita:
- Corynebacterium diphteriae (prin decolorare prelungita pierde violetul de gentiana apare
colorat in rosu, iar la o colorare obisnuita apare violet).

ZIEHL NEELSEN
- evidentierea germenilor acido- alcoolo-rezistenti care apartin genului Mycobacterium:
tuberculosis, avium, bovis, leprae
* Reactivi:
- fucsina fenicata Ziehl 1%,
- decolorant decombinat alcool acid
(alcool etilic 96%/ 97 mL + acid clorhidric 37%/ 3 mL),
- albastru metilen 1%.
* Tehnica de lucru:
- frotiul uscat si fixat la caldura se acopera cu fucsina fenicata Ziehl 1%,
- se incalzeste dosul lamei cu flacara becului Bunsen sau cu un tampon inmuiat in alcool si
aprins, pana la emisia de vapori (nu se fierbe!!!),
- se raceste la temperatura camerei,
- se repeta de inca 2 ori incalzirea, completand cu fucsina daca este cazul, daca aceasta scade
prin evaporare (10 min in total)
- dupa racire se spala cu apa de robinet,
- decolorare cu amestec alcool acid, 2-3 min,
- recolorare prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de 1 min,
- se spala cu apa de robinet,
- se usuca,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
* Bacilii acido- alcoolo- rezistenti (BAAR) apar rosii pe fondul albastru.
* Ceilalti germeni si elementele tisulere (celule epiteliale, PMN, limfocite, fibrina) apar colorate
in albastru.
* Principiul coloratiei: se bazeaza pe rezistenta Mycobacteriilor la decolorarea cu acizi minerali
diluati si alcool, dupa colorare cu fucsina fenicata Ziehl;.
- Colorabilitatea depinde de varsta culturii, mediul de izolare, prezenta in produsul patologic a
medicamentelor tuberculostatice.
- Si alte bacterii sunt acido- alcoolo rezistente : Nocardia, Actinomyces.
* Mecanismul colorabilitatii: patrunderea fucsinei fenicate Ziehl in interiorul bacteriei si
legarea colorantului de acidul micolic (din invelisul peptidoglicolic) al peretelui celular, prin
legaturi stabile, legaturi care confera suprafetei celulei caractere hidrofobe.
- Se pare ca micobacteriile patogene sunt mai bogate in acid micolic (mai rezistente la
decolorare, mentin culoarea rosie pe frotiu) decat cele nepatogene- saprofite (contin putin acid
micolic in perete, nu rezista la decolorare, apar albastri pe frotiu/ Mycobacterium smegmatis).
 1. Antibiograma difuzimetrica principiu, interpretari
DEFINITIE : metoda de testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice si substante
chimioterapice, a unei tulpini bacteriene izolate si identificate, dintr-un prelevat patologic.

Tehnica difuzimetrica Kirby Bauer:

* Materiale necesare:
- germenul de studiat (inocul),
- geloza Mueller Hinton (valoarea nutritiva permite dezvoltarea majoritatii germenilor, nu
contine inhibitori ai actiunii substantelor antimicrobiene)
- substante antimicrobiene: antibiotice si chimioterapice (microcomprimate de 6 mm,
impregnate cu anumite cantitati, diferite, de substanta antibacteriana activa

* Principiul metodei : consecutiv depunerii de microcomprimate impregnate cu antibiotic pe

suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc urmatoarele procese fizico
chimice :
- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei antimicrobiene
active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce conditioneaza
difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constanta a gradientului de
concentratie, de la marginea discului spre periferie. Sensibilitatea bacteriei la un anumit
antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii, din jurul
microcomprimatului impregnat cu antibioticul de testat.
Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si constanta.

* Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru :

Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta diametrul
zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.

1. Mediul de cultura : geloza Mueller - Hinton

- asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida

- nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni
- contine concentratii adecvate de Ca si Mg
- este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii (testarea sensibilitatii streptococilor
beta hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, geloza Mueller- Hinton se suplimenteaza cu sange berbec 5-
10%)
- pentru testarea sensibilitatii hemofililor, se utilizeaza pentru antibiograma un mediu special, care contine
factori de crestere, X, V
- compozitie definita
- asigura reproductibilitate de la lot la lot
- compozitie standard si consistenta corespunzatoare
- pH : 7,2 7,4
- grosimea stratului de geloza : 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90 mm)

2. Germenul de testat :

- agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura

- contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta
- efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e o constanta dinainte
previzibila
- se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea care au tendinta de a
castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic
- antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile si contaminate cu un
singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina)
- antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul ; stocarea indelungata duce la aparitia
determinantilor de rezistenta.

* Inoculul : - sa fie reprezentativ, preparat din 4 6 colonii identice,

- marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (turbiditate standard : 0,5 unitati MacFarland)
- insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii
- cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii diferite, pana la acoperirea
uniforma a suprafetei mediului
- placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului inainte de depunerea
microcomprimatelor
- daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura bacteriana uniform confluenta.

3. Substante antimicrobiene

- sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul respectiv (simbolul denumirii
antibioticului: A, TE, CIP, NOR etc, eventual incarcatura de antibiotic pe microcomprimat : 1g, 5g30 g)
- conservarea microcomprimatelor : la adapost de lumina, caldura, umiditate
- inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare termica
- interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit
selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma :
- 2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite :
- unul pentru germeni Gram pozitivi,
- unul pentru germeni Gram negativi,
- unul pentru infectii urinare,
- set de microcomprimate pentru bacili Gram (-) izolati din infectii digestive,
- asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni
- depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand usor fiecare
microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu cultura sau cu ajutorul unui dispozitiv
numit dispencer ,
- se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre marginile comprimatelor sau
30 mm distanta intre centrele lor,
- pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.

Placile de antibiograma se incubeaza la 37C, timp de 18- 20 ore, in aerobioza, dupa care
se efectueaza citirea.
Placile cu mediu Mueller Hinton cu 5- 10 % sange de berbec, folosite pentru testarea
sensibilitatii streptococilor, pneumocilor, meningococului etc, se incubeaza in atmosfera
aeroba, suplimentata cu 5% CO2 (exicator cu lumanare sau plicuri generatoare de CO2).
In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, ale
caror antibiotice sunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizarea
infectiei.

* Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor :

- se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al puritatii si
densitatii
- citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in mm, de 2-
3 ori, in diferite directii, cu o rigla
- pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in lumina
reflectata
 - daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata, in
lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.
- exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI, prin incadrarea marimii
diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/S, intermediar/I, rezistent/R.
- se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei germenilor la
antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului CLSI 2008.

2. Exudatul faringian mod de recoltare, insamantare, interpretare

Infectia faringiana presupune: febra, frison, otinofagie, disfagie.

1. NORME DE RECOLTARE:
- recoltare cat mai aproape de debutul bolii
- inaintea administarii de antibiotice
- ex faringian se recolteaza dimineata, inainte de ca pacientul sa manance, inainte de a
se spala pe dinti sau de a face gargarisme cu substante antiseptice
- respectarea conditiilor de asepsie si antisepsie in recoltarea produsului patologic
- folosirea echipamentului de protectie pentru prevenirea contaminarii personalului de
laborator
- se recolteaza cu tampoane sterile, din peretele posterior al faringelui, pilierii anteriori si
de pe suprafata amigdalelor

2. TRANSPORT: rapid (max 1 2 ore) si utilizarea mediilor de conservare si transport:

Stuart, Amies, Pike (mediu de imbogatire si selectiv, numai pentru izolarea Str. Beta
hemolitic grup A/ Str. pyogenes in perioada de triaj epidemiologic al anginelor
streptococice in colectivitati: bulion glucozat 0,2%, hematii de berbec, azida de sodiu
si cristal violet, care inhiba stafilococul si bacilii Gram negativi)

3. EXAMEN MACROSCOPIC AL PRODUSULUI PATOLOGIC:

aspectul purulent, culoare, miros, consistenta etc.
4. EXAMEN MICROSCOPIC:
- examinarea unui frotiu colorat Gram din secretie faringiana (de ex.) pune in evidenta
prezenta cocilor Gram pozitivi alungiti, in diplo, lanturi scurte, dar nu ofera nicio relatie
despre caracterele de patognitate; pot fi streptococi viridans, saprofiti. Singurul diagnostic
bacteriologic care se pune pe frotiu colorat Gram este prezenta asocierii fuzo- spirilare (bacili
fuziformi + bacili spiralati Gram negativi, anaerobi) care determina angina ulcero-necrotica
Plaut- Vincent.

5. DETECTIA DIRECTA in produs patologic a antigenului de grup A, ce apartine Str. beta

hemolitic grup A/ Str. pyogenes. Exista kituri comerciale pentru aceasta detectie.
Alte metode: ELISA, latex- aglutinare, co- aglutinare. Aceste teste au doar valoare
orientativa, diagnosticul bacteriologic se impune in toate infectiile streptococice.
6. INSAMANTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE. IZOLARE BACTERIANA.
 - medii de cultura: streptococii necesita pentru dezvoltare medii cu sange (le lipseste
catalaza). Se utilizeaza medii imbogatite cu glucoza (le stimuleaza inmultirea), si cu lichide
organice (sange iepure, cal, berbec, lichid de ascita, care asigura aportul de aminoacizi si
vitamine).
* medii de cultura solide pentru izolarea streptococilor:
- geloza/ sange berbec 5-10%,
- mediul SSP (mediu selectiv pentru streptococ si pneumococ, care contine geloza, acid
nalidixic, cristal violet, glucoza, sange defibrinat de berbec)
* medii de cultura lichide pentru izolare streptococi:
- bulion glucozat 0,2%
- bulion Todd- Hewitt.
Exudatele faringiene recoltate se pot insamanta in prima zi in mediul Pike (imbogatire
streptococi beta hemolitici), si se incubeaza 4 ore pana la 24 ore, la 37 C. Apoi se descarca
pe placi de geloza sange, cu incubare 18- 20 ore la 37C, in atmosfera imbogatita cu 5-10%
CO2.
7. IDENTIFICARE BACTERIANA:
* pe baza caracterelor culturale:
- Caractere culturale: pe mediu geloza- sange berbec, streptococul se dezvolta sub forma de
colonii mici, transparente sau translucide, bombate, cu marimea de la un varf de ac la 0,5- 1
mm, cu zona larga de hemoliza completa, , in jur (hemoliza depaseste de 2-4 ori diametrul
coloniei).
- Coloniile pot avea mai multe aspecte: colonii mucoase M (rotunde, convexe, mucoase,
cu tendinta la confluare), colonii matt (plate, cu suprafata mamelonata, translucide,
confluente), colonii glossy (mici, rotunde, lucioase, cu centrul ridicat, consistenta apoasa),
colonii R (rugoase, plate, margini neregulate).
- Primele 2 tipuri de colonii sunt caracteristice streptococilor virulenti, iar ultimele apartin
streptococilor lipsiti de antigen M (necapsulati, nevirulenti). Aceste aspecte culturale
variaza in functie de mediul utilizat si atmosfera de incubare.
- In cursul insamantarii, pe laturile poligonului obtinut in urma dispersiei, trebuie intepat
mediul de cultura cu ansa, in profunzime, astfel incat, actiunea hemolizinei O sa fie
stimulata, in atmosfera anaeroba (streptolizina inactivata de prezenta oxigenului).
- Caractere culturale in mediu de cultura lichid (bulion glucozat 0,2%), dupa incubare 18-20 ore
la 37C, streptococii se dezvolta sub forma de depozit grunjos, pe fundul tubului si pe peretii
acestuia, lasand mediul clar deasupra.
* pe baza caracterelor biochimice:
- Testul sensibilitaii la bacitracina: metoda simpla, care diferentiaza streptococii piogeni/
grup A (bacitracina- sensibili) de celelalte grupe de streptococi beta hemolitici, grup non-
A (bacitracina- rezistenti). Procent subunitar de tulpini de Streptococi beta hemolitici grup
A sunt rezistenti la bacitracina si exista tulpini de streptococi beta hemolitici grup non- A
sensibili la bacitracina (exceptii).
Tehnica: pe o placa cu mediu geloza- sange se efectueaza cu ansa bacteriologica sectoare
de cultura pura, prin insamantare striu langa striu, dens (dintr-o singura colonie
caracteristica de streptococ beta hemolitic se obtine un sector). In mijlocul sectorului se
aplica un disc de bacitracina si se incubeaza placa la 37C, pana a doua zi. Daca tulpina de
cercetat apartine grupului A, cresterea culturii va fi inhibata in jurul discului de bacitracina
pe o suprafata cu diametrul de cel putin 10 mm. Daca cresterea bacteriana se produce
pana in marginea discului de bacitracina (tulpina este rezistenta), aceasta nu apartine
grupului A, ci altui grup serologic.
- Testul PYR pozitiv (streptococul beta hemolitic grup A/ Streptococcus pyogenes este
producator de pirolidonil- amidaza).
- Rezistenta la trimethoprim- sulfamethoxazol: diferentierea intre streptococii beta
hemolitici grupurile A si B (rezistenti) de streptococii beta hemolitici ce apartin grupurilor
serologice C si G (sensibili).
- Testul CAMP: test de identificare a tulpinilor de Streptococ grup B (Streptococcus
agalactiae). Str grup B prezinta pe mediu geloza- sange berbec, o hemoliza incompleta,
tip ', care, in prezenta hemolizinei B stafilococice (determina hemoliza incompleta, tip
, cald-rece, la stafilococ) are loc insumarea efectelor celor doua hemolizine (care,
separat determina hemoliza incompleta) ducand la aparitia hemolizei complete tip . Se
efectueaza un sector de cultura pura de Str. Grup B in centrul caruia se plaseaza un disc
de hartie de filtru imbibata cu hemolizina B stafilococica: in jurul discului, dupa 18-20 ore
de termostatare, apare un halou de hemoliza completa, .
- Producerea de pigment: Streptococii de grup B, au capacitatea de a produce un pigment
portocaliu, carotenoid, in geloza Columbia.
- Diagnostic diferential intre Str. beta hemolitici gr. B Str. beta hemolitici gr. D:
- insamantarea pe mediu cu bila/ esculina:

Str. grup B- cresc pe mediu cu bila, dar nu hidrolizeaza esculina.

Str. grup D- cresc pe mediu cu bila si hidrolizeaza si esculina.

- Diagnostic diferential Str. Grup D- Enterococi:

Enterococii:
- cresc pe medii hiperclorurate/ 6,5% NaCl;
- rezista 30 min la 60C;
 - sunt rezistenti la oxacilina,
- se dezvolta la 45C.

Str grup D: cresc pe mediu cu bila, hidrolizeaza esculina, dar nu cresc pe mediu
hiperclorurat/ 6,5% NaCl.
* pe baza caracterelor antigenice:
Determinarea grupului serologic, se face prin reactii de aglutinare (latex- aglutinare, co-
aglutinare) sau reactii de precipitare. Aceste reactii antigen- anticorp impun contactul direct
dintre antigenul de grup (polizaharidul C) si anticorpul omolog (ser anti- grup A, B, C, F, G etc).
Deoarece antigenul de grup se gaseste in profunzimea peretelui celular al streptococilor, trebuie
extras fie chimic (extractie cu HCl la cald), fie enzimatic.

- Reactia de precipitare: metoda Lancefield este o reactie de precipitare in inel, in care, se pune
in contact Ag de grup (polizaharidul C, extras cu HCl la cald) cu seruri anti- streptococice specifice
de grup. Este o metoda rar utilizata, pentru ca exista tehnici mai simple si mai precise.

- Reactii de aglutinare: dupa testul sensibilitatii la bacitracina, sunt cele mai frecvent utilizate
teste.

a) reactia de latex- aglutinare: reactie de aglutinare pe lama, in care, Ac specifici de grup au ca

suport, particule inerte de latex- polistiren. Antigenul de grup extras enzimatic, in contact cu Ac
specific de grup vor produce in cateva secunde, pana intr-un minut, o reactie de aglutinare vizibila
cu ochiul liber pe lama.

b) metoda co- aglutinarii (testul STREPTIC): este tot o reactie de aglutinare pe lama, in care,
serurile anti- streptococice specifice de grup (Ac) sunt reprezentate de imunglobuline IgG, cuplate
cu suspensie de Staphylococcus aureus. Pe fragmentul Fc al IgG, exista receptorul pentru proteina
A stafilococica. La nivelul fragmentului Fab se cupleaza specific polizaharidul C, antigenul specific
de grup streptococic (Ag). Reactia are loc pe lama, intre cele doua componente, Ag/Ac, si devine
vizibila in mai putin de 1 min.

Vizualizarea reactiei se imbunatateste prin contributia suspensiei de stafilococ sau prezenta

particulelor de latex.

- Streptococcus pyogenes se imparte in serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 80) prin
reactia de precipitare in tuburi capilare si pe baza antigenelor proteice T (28 serotipuri), prin reactii
de aglutinare pe lama. Aceste incadrari in serotipuri se fac doar in centre nationale de referinta,
in scop epidemiologic (se determina fluctuatia serotipurilor intr- o anumita perioada de timp si
intr-o anumita zona geografica, precum si filiatia cazurilor intr-un focar).

- Teste imunologice: teste rapide de identificare a Ag streptococice direct in produs patologic, in

mai putin de 10 min. Desi sunt specifice si sensibile, nu pot inlocui metoda clasica a diagnosticului
bacteriologic direct.

8. ANTIBIOGRAMA: streptococii piogeni isi mentin sensibilitatea cunoscuta la penicilina, dar s-

au descris tulpini cu toleranta la penicilina G (inhibate dar nu distruse de penicilina G, necesita
dze mai mari de antibiotic). Pentru pacientii cu alergie dovedita la penicilina, se recomanda
tratamentul cu macrolide (eritromicina, claritromicina, azitromicina). Se descriu azi, tulpini de
Streptococcus pyogenes rezistente la eritromicina. Asadar, este din ce in ce mai utila
 antibiograma, datorita necesitatii alegerii clasei de antibiotic si evitarea unui tratament la care
tulpina incriminata poate fi rezistenta sau toleranta.

In general, antibiograma se face in scop epidemiologic, de incadrare a unei tulpini in

antibiotip.

3. Urocultura mod de lucru, insamantare, interpretare

UROCULTURA:
- 90% ITU cu E. coli,
- E. coli din flora bacteriana intestinala proprie,
- calea de infectie: ascendenta,
- aderenta la celulele uroepiteliale: fimbrii,
- pilii pap: pyelonephritis associated pil
* UROCULTURA CANTITATIVA

* INTERPRETARE IN CONTEXT:

CLINIC,

PARACLINIC (IMAGISTIC, SUMAR DE URINA)

1. RECOLTARE
- inainte de administrarea substantelor antibiotice sau antiseptice
- prima urina de dimineata
- din jet mijlociu
- asigurarea conditiilor se asepsie, antisepsie (toaleta locala riguroasa)
- recoltor steril
- tehnici de recoltare invazive
2. TRANSPORT
TRANSPORT IMEDIAT, MAX 30 MIN LA LABORATOR
- Insamantare imediata sau pastrare la frigider (+4C)
3. EXAMEN MACROSCOPIC URINA
culoare
grade diferite ale aspectului tulbure, pana la piurie
miros
prezenta sedimentului la fundul recoltorului
grade diferite de hematurie macroscopica
4. EXAMEN MICROSCOPIC
* Centrifugare (3-5 min la 2000- 2500 turatii/min) =
Screening microscopic:
- Sediment urinar:
- preparat proaspat intre lama si lamela
- examinare cu obiectiv 40X:
- leucocite, hematii, cristale, flora bacteriana, levuri etc
- Sediment urinar -Frotiuri Gram/ AM
- PMN neutrofile, bacterii, celule epiteliale
5. CULTIVAREA URINEI
* METODA DILUTIILOR,
* METODA ANSEI CALIBRATE
* URICULT/ URILINE
METODA DILUTIILOR:

- dilutii 1/ 10 si 1/ 100
- Insamantare pe medii de cultura:
* Geloza sange berbec 5-7%,
* Mediu de cultura slab selectiv MacConkey,
- Inoculare 1 ml de urina diluata 1/ 10 sau 1/ 100 prin inundare
- Incubare 18- 20 ore la 37C
- Citire, dupa formula de calcul:
* Nr. UFC = nr colonii X factor de dilutie X factor de volum
METODA ANSEI CALIBRATE:

- anse calibrate, de unica utilizare, de 0,01 si 0,001 ml,

- insamantare pe medii de cultura:
geloza sange,
MacConkey,
pe placa Petri de 90mm diametru,
1 striu diametral si 10 striuri perpendiculare
Incubare: 18- 20 ore, 37C
METODA URICULT:
 - geloza- sange,
- CLED sau MacConkey
6. CITIRE. INTERPRETARE
a) ASPECT CULTURAL: E. coli
Geloza sange:
- colonii alb- gri, lucioase, bombate, tipS,
- hemolitice sau nehemolitice,
MacConkey, CLED:
- colonii lactozo (+)/ lactozo (-),

b) Caractere microscopice.: bacili scurti Gram (-)

c) Caractere biochimice:
TSI: G+; L, Z +/- ; H2S -, gaz +/ -
MIU: mob +/ -; I +; U
MILF: mob +/ -; I +; Liz +/-, FenAla-
Citrat Simmons
ONPG +

UROCULTURA INTERPRETARE REZULTATE

UROCULTURA CANTITATIVA:
* > 100 000 UFC/ ml
- infectie urinara,
* 10 000 100 000 UFC/ ml
- bacteriurie cu suspiciune de infectie urinara;
- se recomanda repetarea,
- bacteriurie semnificativa in context clinic
* 1 000 10 000 UFC/ ml
- bacteriurie fiziologica, clinic nesemnificativa
*< 1 000 UFC/ ml
- negativa
Criterii in interpretare a rezultatului:
 - sex (fetite, baieti),
- varsta (n.n., sugar, batrani),
- tratament antibiotic,
- situatii fiziologice (sarcina, ciclul menstrual, alaptare etc),
- situatii patologice:
* imunodepresie: HIV, TBC, hepatita B, C, hemopatii maligne, cancer, chimioterapie
imunosupresiva etc,
* ruptura perineu, sonda uretrala permanenta, constipatie cronica etc.

4. Coprocultura mod de lucru, insamantare, interpretare

A. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC DIRECT SI INDIRECT COPROCULTURA SALMONELLA

1. RECOLTARE si TRANSPORT:
* Tipuri de prelevate:
- materii fecale,
- lichid de varsatura,
- aliment,
* mediu de conservare si transport: Carry Blaire
2. EXAMEN MACROSCOPIC (scaune frecvente, moi, apoase, cu mucus, culoare si miros
caracteristic)
3. EXAMEN MICROSCOPIC (preparat proaspat, frotiuri AM, Gram)
4. CULTIVARE in vederea IZOLARII (colonii izolate, dispersie corecta)
4.1. Imbogatire: selenit acid de sodium, mediu Rappaport
- timp de incubare in etapa de imbogatire: 18- 20 ore,
- raport 1/10 intre volumul de materii fecale si volumul de mediu de imbogatire
(1 ml scaun + 9 ml mediu lichid/selenit),
4.2. Medii de cultura
- diferentiale : geloza lactozata (AABTL), CLED (geloza lactozata cu thiosulfat de sodium/ pentru
inhibarea migrarii proteusului),
- medii de cultura solide selectiv diferentiale:
*slab selective: MacConkey,
*moderat selective: ADCL, Hektoen, SS,
*inalt selective: Wilson Blair (izolare Salmonella typhi)
5 CONDITII DE INCUBARE: 24- 48 ore, 37C,
6. IDENTIFICARE
* caractere microscopice: bacilli Gram (-), nesporulati, necapsulati,
* caractere culturale:
- pe mediul ADCL, Salmonella spp, se dezvolta sub forma de colonii lactozo (-), necolorate sau
de culoarea mediului, transparente sau usor opace, rotunde, cu suprafata bombata, lucioasa,
tip S, cu sau fara H2S,
- pe mediul Wilson Blair, Salmonella typhi realizeaza colonii negre, rugoase, cu luciu metalic si
halou negru, brun, colonii tip R.
Identificare biochimica pe baza proprietatilor exoenzimatice ale
genului Salmonella

MEDIUL SUBSTRATUL MODUL DE OBSERVATII

COMPORTARE
GLUCOZA ACID (galben-
(partea dreapta) fermentarea -
TSI glucozei))
LACTOZA- ALCALIN
ZAHAROZA (culoarea mediului,
(partea inclinata) roz rosu, -
nefermentarea
lacozei si/ sau
zaharozei)
GAZ din + Salmonella typhi
fermentareaglucozei cu rare exceptii nu produce gaz
+ S. typhi poate fi
H2S cu rare exceptii neproducatoare de
H2S
MOBILITATE +
MIU INDOL -
UREE -
LIZIN + (-)
MILF DECARBOXILAZA La S. paratyphi A
FEN-ALA -

- fermenteaza glucoza cu producere de gaz,

- produc lizin- decarboxilaza,
- produc H2S (cu unele exceptii),
 - folosesc citratul ca unica sursa de carbon (cresc pe mediu Simmons cu citrat),
- NU produc: indol, ureaza, fenilalanindeaminaza.
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC INDIRECT, IMUNOLOGIC
1. Reactia Widal inlocuita cu Reactia Serica Calitativa/ ASC,
2. Seroreactia Vi.
1. a. Reactia Widal:
- evidentiaza prezenta Ac anti- O si anti- H,
- utilizeaza suspensie de Salmonella vie,
* 3 mari inconveniente:
- nu diferentiaza titrul aglutininelor anti- H de aglutininele anti- O,
- risc mare de contaminare (Ag vii),
- nu poate fi standardizata.
1.b. Reactia ASC:
- reactie calitativa si, in acelasi timp, cantitativa,
- evidentiaza separat titrul aglutininelor anti-O si anti- H,
- se efectueaza cu antigene separate Ag O si Ag H, standardizate si inactivate.
* TEHNICA:
- dilutii ser de bolnav 1/ 10 si 1/ 100, peste care se adauga Ag O,
- serie separata de dilutii de ser, la care se adauga Ag H,
- la prima citire (2 ore la 52C si 30 min la temperatura camerei) se apreciaza nivelul de
anticorpi anti- H,
- dupa 24 ore incubare la 52C si 30 min la temp camerei, se face citirea finala: se apreciaza
anticorpii anti- O,
* REACTI ASC- INTERPRETARE:
- Reactia ASC pune in evidenta anticorpii in dinamica, in serul bolnavilor cu febra tifoida si
paratifoida.
- Anticorpii incep sa apara din a 2-a saptamana si cresc in timp.
* la persoane nevaccinate, care nu au facut boala :
- titrul Ac anti- O = 1/ 40,
* persoane vaccinate:
- Ac O: 1/80,
- Ac H: 1/ 250,
* bolnavi (variabil, in raport cu saptamana de boala ): peste 3 saptamani de boala:
- Ac O: 1/500,
- Ac H: 1/ 1000.
2. In seroreactia Vi apar titruri mari de anticorpi anti- Vi, la purtatorii de Salmonella
typhi,
- Titrul de diagnostic: 1/ 40.

B. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC IN HOLERA COPROCULTURA VIBRION CHOLERAE

Enteritele de tip holeriform
asociarea a 2 factori de patogenitate ai microorganismelor:
- factorul de colonizare: atasare de receptori de la nivelul celulelor mucoasei,
colonizarea mucoasei intestinale
- adera de microvili (marginea in perie a enterocitelor);
- se ataseaza pe un receptor gangliozidic de pe celulele intestinale si se multiplica.
- producerea de enterotoxina
Enterotoxina- enterocite
stimuleaza adenilat ciclaza sau guanilat cyclaza, enzime care cresc nivelul nucleotidelor
ciclice (cAMP sau cGMP) din enterocite.
Nivelul crescut de cAMP activeaza o pompa de ioni care determina secretia clorului si a
bicarbonatilor in intestinal subtire si inhiba absorbtia sodiului (Na) si K
Rezulta secretia activa a apei si electrolitilor in lumenul intestinal
se manifesta prin:
-varsaturi,
-scaune diareice apoase
nu sunt prezente in materiile fecale resturi celulare si PMN-uri (polimorfonucleare).
COPROCULTURA Vibrio cholerae
1. Produse patologice:
- materii fecale (la bolnavii cu forma acuta de boala, se izoleaza germenii in cultura
pura),
- produs de voma,
 - bila,
- lambouri de rufe murdarite cu materii fecale,
- continut intestinal de la cadavre (intestin subtire),
- materii fecale, bila de la contacti, convalescenti, pacienti cu forme inaparente de
boala.

2. Conditii de recolta:
- materiile fecale se recolteaza inainte de administrarea unui chimioterapic,
- de la bolnavii cu tulburari acute, se recolteaza materii fecale din scaun emis spontan,
- daca bolnavul nu are tulburari gastro intestinale (contacti, convalescenti, forme
inaparente de boala, purtatori cronici): se administreaza purgativ salin,
NU se recolteaza cu sonda.

3. Aprecierea aspectului macroscopic:

- materii fecale de consistenta redusa, apoase, aspect riziform (apa de orez),

4. Transport: mediu Cary Blair transportat si stocat la temperatura camerei (V. cholerae
rezista si 1 saptamana in Cary Blair, la temperatura camerei),

5. Examen microscopic:
- preparat proaspat intre lama si lamela: flora bacteriana cu aspect morfologic
caracteristic: bacterii incurbate in forma de virgula, cu mobilitate f. mare determinata
de cilul polar, mai lung decat corpul bacterian,
- frotiuri Gram si albastru metilen: absente sau extrem de rare PMN (1-3 PMN/ camp) si
bacili incurbati Gram (-) cu flagel polar

6. Imbogatire: apa peptonata alcalina pH 9,0 9,2

incubare la 37C timp de 4- 6- max 8 ore (daca se depasesc 8 ore, flora de asociatie din
materiile fecale, determina acidifierea mediului si vibrionii sunt distrusi),
multiplicarea vibrionilor holerici determina formarea la suprafata mediului de
imbogatire/ apa peptonata, un val (sunt aerobi, se dezvolta la suprafata mediului),

7. Cultivare:
insamantare din suprafata mediului de imbogatire sau din valul format, pe medii
selective, solide:
* moderat selectiv: BSA (Bile Salts, Agar),
* inalt selective: TCBS (Thiosulphate, Citrate, Bile Salts, Sucrose)
* Agar 5% sange berbec,
* Agar MacConkey

8. Incubare:
18- 20 ore la 37C,
 9. Identificare Vibrio cholerae pe baza caracterelor culturale
- mediul BSA: colonii plate sau usor convexe, netede, umede, extrem de transparente
(se vad doar dupa deschiderea placii),
- mediul TCBS: colonii galbene,
- geloza- sange: V. cholerae non: O1 produc beta- hemoliza,
- MacConkey: V. cholerae cresc sub forma de colonii lactozo- negative (L-).
- medii cromogene

Identificare pe baza caracterelor microscopice: bacili Gram (-) incurbati, in forma de

virgula, cu flagel polar, mai lung decat corpul bacterian.
Identificare pe baza caracterelor biochimice: V. cholerae clasic si ElTor:
- R. catalazei: (+),
- R. oxidazei (+),
- fermenteaza glucoza fara producere de gaz (G+, g-)
- V. cholerae clasic: lactozo (+) tardiv (L+),
- fermenteaza manita (M+),
- zaharoza Z (+/-),
- lizindecarboxilaza (+),
- ornitindecarboxilaza (+),

Identificare pe baza caracterelor antigenice:

- aglutinare pe lama cu ser antiholeric grup O:1,
- aglutinare pe lama cu ser anti O: 139 (mutanta O a biovarului ElTor).
- test de imobilizare: suspensie de materii fecale + 1 picatura de ser antiholeric O:1: se
observa la microscop imobilizarea bacililor.
- Imunofluorescenta: nespecifica.
- Lizotipia:
- Metode de biologie moleculara

5. Hemocultura mod de lucru, insamantare, interpretare

Arborele circulator este n mod normal steril.
Bacteriemia / fungemia reprezint prezena tranzitorie i de regul intermitent a bacteriilor
/fungilor n torentul circulator. O bacteriemie / fungemie se poate nsoi de creterea
temperaturii i /sau frison precum i de alte semne sau simptoame. Dintre situaiile care pot
conduce la apariia unei bacteriemii putem aminti:
- realizarea unei extracii dentare
- periajul mai energic al dinilor folosind o periu neadecvat (prea dur)
- multe acte medicale sau medicochirurgicale invazive realizate la diferite niveluri
anatomice (cateterisme etc).

Bacteriemia / fungemia nsoesc infeciile generalizate cu bacterii / fungi. Exist o mare

varietate de microorganisme capabile s produc infecii generalizate (bacterii aerobe i
anaerobe,fungi, virusuri, parazii). Trebuie ns menionat c, destul de frecvent, o hemocultur
pozitiv nu indic de fapt agentul etiologic al infeciei ci o contaminare survenit pe parcursul
diagnosticului microbiologic. Dintre agenii contaminani ntlnii mai frecvent putem aminti:
- Staphylococcus epidermidis
- S. hominis
- Micrococcus luteus
- Corynebacterium spp.
- Brevibacterium epidermidis
- Propionebacterium acnes
- Acinetobacter calcoaceticus
- streptococii nonhemolitici etc.

Este important utilizarea noiunilor de microbiologie clinic care trebuie foarte bine
cunoscute de ctre medicul microbiolog n colaborare cu restul membrilor echipei complexe,
pentru stabilirea n mod corespunztor a etiologiei infecioase i atitudinii de urmat.
Avnd n vedere cele menionate mai sus, dorim s subliniem i alte dou dintre aspectele
importante de care trebuie s se in seama n realizarea unei hemoculturi:
momentul recoltrii sngelui
volumul de snge recoltat.

Cu privire la primul aspect este de reinut c ntotdeauna se recomand recoltarea a minim 2

probe de snge, ns cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de snge, n momente diferite, pe
parcursul a 24 de ore. n anumite cazuri (de ex. n endocardita bacterian subacut),
bacteriemia fiind continu, sunt suficiente 2 hemoculturi / 24 ore. Pe de alt parte, n cazul n
care presupunem c agentul etiologic poate face parte din flora normal vom recolta minim 3
probe pentru hemocultur. n cele ce urmeaz o s listm cteva din exemplele posibile, n ceea
ce privete momentul recoltrii sngelui i numrul de hemoculturi recomandate:
endocardit acut recoltm 3 hemoculturi din 3 sedii diferite, pe parcursul a 12
ore
endocardit subacut recoltm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi i mai
sus) la un interval mai mare de 15 minute
sepsis recoltm 3 hemoculturi din sedii diferite, pe parcursul a 10 minute (ideal ar fi,
pentru toate cazurile menionate, s recoltm sngele cu circa 30 minute nainte de
vrful febril, acest moment ar coincide cu cea mai mare concentraie de
microorganisme n torentul circulator,dar acest moment este dificil de precizat)
febr de origine necunoscut recoltm 23 hemoculturi, din sedii diferite, la un
interval de timp de 45-60 minute etc.

n ceea ce privete al doilea aspect, avnd n vedere faptul c de regul n cursul bacteriemiilor
/fungemiilor numrul de uniti formatoare de colonii / ml de snge este destul de redus,
trebuie s recoltm un volum de snge adecvat (pentru fiecare hemocultur n parte). Astfel,
vom recolta circa 20 ml de snge n cazul adulilor i 15 ml de snge n cazul nounscuilor,
sugarilor i copiilor mici (deoarece numrul de UFC / ml poate fi de circa 3 ori mai mare la
aceste grupe de vrst).

Atunci cnd este necesar realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui set de hemoculturi)
este necesar s ne gndim i la urmtoarele aspecte:
 cel mai adesea hemoculturile trebuie realizate n urgen

sngele, fiind un produs biologic n mod normal steril, vom izola cel mai adesea un
singur agent infecios (dar exist i posibilitatea unor asocieri)

dintre agenii etiologici cu semnificaie clinic izolai mai frecvent prin hemocultur, n
ordine descrescnd a frecvenei putem aminti: Staphylococcus aureus, diferite
enterobacterii, Pseudomonas aeruginosa, streptococi hemolitici (inclusiv pneumococul),
enterococi, Haemophilus influenzae (tip b), Neisseria meningitidis, germeni anaerobi
(Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringens etc),
stafilococi coagulazonegativi, Listeria monocytogenes, Leptospira spp., Brucella spp., Candida
spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. etc

exist anumite particulariti n ceea ce privete etiologia infeciilor generalizate n funcie de

vrsta pacienilor, poarta de intrare posibil, focarul infecios principal, starea din punctul de
vedere al aprrii (specifice i nespecifice) a gazdei respective etc

n snge exist o serie de factori antimicrobieni a cror aciune trebuie pe ct posibil

diminuat (aceasta se realizeaz pe de o parte prin diluarea 1 / 10 a sngelui cultivat n raport
cu volumul mediului de cultur dar exist i o serie de substane chimice care pot fi utilizate n
acelai scop, spre ex. polianetol sulfonatul de sodiu are att efect anticoagulant ct i de
neutralizare a unor factori antimicrobieni)

mediile de cultur i condiiile de incubare trebuie ales n aa fel nct s permit dezvoltarea
agenilor etiologici probabili

asigurarea calitii mediilor de cultur va include att controlul sterilitii fiecrui lot ct i
controlul eficienei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referin, de colecie).

Pentru recoltarea sngelui trebuie respectate condiiile impuse recoltrii oricrui tip de p.p.
Subliniem ns importana respectrii cu strictee a regulilor de prelevare aseptic i respectiv a
recoltrii sngelui nainte de administrarea oricrui tratament antimicrobian. Orict de urgent
ar fi considerat c trebuie nceput terapia se poate temporiza pn se realizeaz recoltarea
sngelui pentru hemocultur, ceea ce n astfel de situaii ar necesita un interval de timp de
numai 10-15 minute.

Este recomandat ca recoltarea s fie urmat de nsmnarea direct pe mediul de cultur, la

patul bolnavului, spre exemplu ntr-un sistem nchis de recoltare i nsmnare aa cum a fost
realizat de Prof. Dr. Matei Bal. Utilizarea sistemelor cu vacuum este relativ recent n ara
noastr n SUA a fost utilizat nc nainte de 1974. Altfel spus, recoltarea ar trebui s fie
urmat imediat de nsmnare, fr a mai exista o etap de transport. Dac aceast
recomandare nu poate fi urmat am putea folosi un tub care conine 1 ml dintr-o
soluie 0,25-0,50% de polianetol sulfonat de sodiu n care realizm recoltarea sngelui i pe care
l transmitem imediat ctre laborator pentru nsmnarea pe medii de cultur.
Mediile de cultur sunt medii lichide, mbogite (ex. bulion infuzie de cordcreier
pentru aerobi BHI i respectiv bulion Columbia cu cistein pentru anaerobi) condiionate n
flacoane corespunztoare cantitii de snge pe care trebuie s o recoltm. Pentru bacteriile cu
multiplicare lent este recomandat utilizarea mediului bifazic (mediu solidificat n pant, de
ex. Geloz chocolat plus mediul lichid bulion tripticaz din soia). n finalul prezentrii vom
discuta i despre sistemele automate pentru hemocultur.

n cazul n care recoltarea a fost realizat simultan n dou flacoane pentru hemocultur, unul
va fi incubat n aerobioz iar cellalt n anaerobioz. Pentru unele microorganisme (ex. Brucella
spp.) este necesar incubarea n atmosfer de 5-10% CO2. Temperatura de incubare este cel
mai frecvent 35-37 C.

Examinarea flacoanelor de hemocultur se realizeaz de 2 ori / zi n primele 3 zile, apoi zilnic

pentru minim 7 zile (n anumite situaii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe
sptmni).

Examinarea o facem macroscopic urmrind o serie de aspecte care ar putea s semnifice

dezvoltarea microbian (tulburarea mediului mai mult sau mai puin uniform, apariia unei
pelicule la suprafaa mediului lichid, apariia unui depozit pe stratul de hematii din zona decliv
a flaconului,apariia unor bule de gaz, apariia unor colonii pe mediul solid n cazul n care am
utilizat mediul bifazic etc). Din punct de vedere microscopic, manipulnd aseptic flacoanele de
hemocultur putem realiza frotiuri pe care le colorm Gram.
n cazul apariiei unor modificri precum cele descrise mai sus dar i atunci cnd acestea nu
apar (treceri oarbe) vom realiza subcultivri pe medii de cultur solide (de ex. geloz
chocolat).

Prin utilizarea mediului bifazic subcultivarea se realizeaz uor i fr riscul contaminrii, prin
simpla nclinarea a flaconului i scldarea pantei cu mediul de cultur solid).
Dup obinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic i stabilirea
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a acestuia.

n vederea testrii sensibilitii la antibiotice putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultur,

dar rezultatele obinute vor fi confirmate prin antibiograma difuzimetric standardizat pornind
de la coloniile izolate (cultura pur).
n momentul de fa exist numeroase sisteme automate utilizate pentru hemocultur (BacT /
Alert, Isolator, BACTEC, SeptiChek, Vital etc).
Spre exemplu, sistemul BacT / ALERT reprezint un instrument automat pentru detectarea
multiplicrii microbiene, capabil s incubeze, s agite i s monitorizeze continuu (pe baz de
reflectometrie) aerob i anaerob prelevate de la pacieni suspeci de bacteriemie / fungemie.

Instrumentul prezint:
- un modul de control care include un ecran ce permite operatorului s intervin (prin
atingerea cu degetul) n alegerea opiunilor de ncrcare i descrcare a flacoanelor
introduse,
- un modul de incubare ce poate prelucra 120 pn la 240 flacoane nsmnate,
posibilitatea realizrii automate a controlului de calitate al celulelor n care sunt introduse
flacoanele (nefiind necesar intervenia operatorului).
Intervalul optim de funcionare al instrumentului este situat ntre +5o i 45oC. Flacoanele
introduse n instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui cititor de cod de bare
(codul se afl pe partea lateral a flaconului). Flacoanele i instrumentul sunt produse n
conformitate cu standardele internaionale de calitate n vigoare (ISO 9001, FDA i Quality
System Regulations).

Flacoanele de cultur conin mediu de cultur lichid (bulion), care permit multiplicarea
majoritii speciilor bacteriene precum i a fungilor. Fiecare flacon conine un senzor LES
(senzor emulsie lichid), ce detecteaz producerea de CO2, ca indicator al multiplicrii
microbiene.

Exist mai multe tipuri de flacoane, pentru incubare n aerobioz, anaerobioz, pentru aduli
sau copii, pentru pacieni la care nu s-au administrat medicamente antimicrobiene anterior
recoltrii (varianta strict recomandat) sau chiar i pentru pacieni aflai sub tratament
antibiotic.

Citirea se efectueaz automat la fiecare 10 minute, rezultnd o medie de 144 citiri / zi, prin
reflectometrie cu afiaj pe monitor, semnal luminos sau sonor. n cazul unui rezultat pozitiv,
flaconul respectiv este analizat prin metode ale microbiologiei clasice sau moderne n vederea
identificrii speciei microbiene i stabilirii sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.

Interpretarea rezultatelor hemoculturii

Avnd n vedere pe de o parte posibilitatea contaminrii unei hemoculturi iar pe de alt parte
creterea incidenei hemoculturilor pozitive cu semnificaie clinic n care sunt implicate
microorganisme condiionat patogene, care fac parte din flora microbian normal, rezultatele
trebuie interpretate cu responsabilitate i n echip.
Exist argumente bacteriologice (de ex. izolarea aceluiai microorganism din mai multe
flacoane de hemocultur) i clinice care permit medicilor infecioniti n colaborare cu medicii
microbiologi s stabileasc etiologia microbian (uneori polimicrobian) a unei infecii
generalizate.
Fiind vorba de infecii cu pronostic adesea rezervat, laboratorul are datoria s comunice
rezultatele pe msur ce acestea sunt obinute (de ex. aspectul microscopic pe frotiul colorat
Gram dup tulburarea bulionului de cultur, aspecte microscopice i culturale observate dup
dezvoltarea unor colonii, rezultatele antibiogramei nestandardizate etc, sau faptul c dup o
sptmn de observaie nu se poate evidenia multiplicarea microbian) pentru ca s poat fi
luate cele mai adecvate msuri, n favoarea vindecrii pacientului respectiv.

6. Diagnosticul de laborator in infectiile produse de Staphylococcus

aureus

Staphylococcus aureus implicatii in patologia infectioasa

1. Infectii localizate:
- foliculite superficiale,

- furuncule antracoide,

- acnee pustuloasa,

- panaritiu,

- microabcese,

- orjelet,

- hidrosadenite,

- mastite,

- Infectii ale plagilor,

- Infectii ale mucoaselor:

- infectii urinare ascendente,

- infectii genitale,

2. Infectii generalizate:
- bacteriemii,

- septicemii

* Mecanisme:
- diseminare din aproape in aproape,

- evacuari traumatice,

- generalizare pe cale:

- limfatica,

- sanguina

3. Infectii secundare, metastazice:

- abcese secundare in organe,

- osteomielita,

- infectii urinare descendente,

- endocardite,

- meningite,

- infectii la nivelul seroaselor (pleurale, articulare etc.),

- pneumonii

Alte manifestari clinice determinate de Staphylococcus aureus si toxinele lui

4. Sindroame dermatologice exfoliative (Sindrom de piele oparita),

5. Sindrom de soc toxic,

 6. Toxiinfectii alimentare,

7. Enterite stafilococice post- antibiotico terapie,

8. Sensibilizari la alergene stafilococice (dermatite urticariene, stafilococii cutanate recidivante

etc.).

Diagnosticul de laborator :

1. RECOLTAREA, TRANSPORTUL
Tipuri de prelevate patologice
Prelevate intens contaminate:
- materii fecale,

- alimente,

- lichide de voma,

Prelevate moderat contaminate:

- sputa,

- secretii (exudate) plagi superficiale,

- colectii inchise (puroi flegmon, abces),

Prelevate necontaminate (normal sterile):

- sange,

- LCR, alte lichide de punctie (pleural, peritoneal, articular),

- cateter,

- urina,

- aspirat bronsic

- Recoltarea prelevatelor:
* recipiente sterile, unica utilizare,

* conditii de asepsie,

* inainte de administrarea antibioticelor,

* inainte de aplicarea antisepticelor,

- Transport:
* max 1 ora,

* medii de transport (Stuart, Amies)

 2. EXAMEN MICROSCOPIC DIRECT

Frotiu direct din prelevat (coloratia Gram):

- coci Gram pozitivi sau Gram variabili, izolati, in perechi, lanturi scurte sau in gramezi, intra si
extraleucocitari.

- apreciere semicantitativa a tipurilor de celule (PMN),

- aprecierea semicantitativa a microorganismelor,

- relatia bacteriilor cu celulele inflamatorii,

- variabilitate morfologica sau tinctoriala (conditii de stress metabolic),

Prelevate normal sterile:

* Centrifugare si frotiu din sediment

3. INSAMANTARE PE MEDII DE CULTURA

* Medii de cultura lichide (imbogatire):
- bulion thioglicolat,

- bulion BHI, Mueller Hinton,

- Chapmann lichid,

* Medii de cultura solide (izolare):

- Neinhibitorii, diferentiale:
agar Columbia cu adaos 5-10% sange berbec la S. aureus apare o zona mica de hemoliza completa in jur

- Medii diferentiale si selective:

agar trehaloza- manitol,

Chapman solid S. aureus fermenteaza manitolul din mediu, iar coloniile apar galbene,

Baird Parker,

agar Columbia cu colistin si acid nalidixic

4. IZOLARE, IDENTIFICARE
S. Aureus

a) Izolare:
- termostatare: 37C, 24 ore, aerobioza,

(5%CO2)

b) Identificare:
- Frotiu Gram din colonie izolata (caractere morfotinctoriale)
 * coci rotunzi, Gram (+), dispusi izolat, in perechi, lanturi scurte, gramezi neregulate (dispozitie
caracteristica in ciorchine de strugure),

* cu dimensiuni de 0,5 1,5 m,

- Caractere culturale

- colonii S, G, R,

- Prezenta si tipul hemolizei:

- hemoliza ,

- hemoliza (tip cald- rece),

- Prezenta si tipul pigmentului:

- carotenoid, portocaliu, galben citrin

- Aspectul coloniilor pe mediul solid hiperclorurat:

- manito (+) (cultura galbena)

Identificare preliminara
Teste enzimatice caractere biochimice si de patogenitate
* diferentierea de familia Streptococacceae:

testul catalazei,

* diferentierea de genul Micrococcus:

testul producerii de acid din glucoza in anaerobioza,

testul sensibilitatii la furazolidon,

* diferentierea S. aureus de SCN:

- coagulaza libera (testul in tub),

- coagulaza legata/ clumping factor (pe lama),

- termonucleaza (DNA - aza termo rezistenta),

* diferentierea in cadrul grupului SCN:

- testul sensibilitatii la novobiocina,

- acidifiere trehaloza - manitol (aerob)

 Schema minimala de diferentiere a principalelor specii de stafilococi

Caractere S. aureus S. epider- S. sapro-

midis phyticus

Coag.libera + - -

fosfataza + + -

rez la novobiocina - - +

zaharoza/aer + + +

trehaloza/ aerob + - +

Manitol/ aerob + - d

Caractere S. S. lugdu- S. schleiferi

aureus nensis

Coag. legata + + +

Coag. libera + - -

Manitol anaerob + - -

Termonucleaza + - +
DNA- aza t- rez

Teste accesorii de patogenitate pentru Staphylococcus aureus

fibrinolizina,

fosfataza,

lipaza,

hidrolaza.
 Detectia toxinogenezei la
Staphylococcus aureus
* Enterotoxine:

- latex aglutinare,

- ELISA,

* Leucocidina:

- ELISA

Tiparea pe baza sensibilitatii la bacteriofagi Staphylococcus aureus (lizotipie)

Centrul National de Referinta:

- identificarea clonala a S. aureus,

- identificare curenta in infectii de focar (infectii nosocomiale, TIA),

- setul international de bacteriofagi (grup litic: I, II, III, V)

Sisteme comerciale de diagnostic caractere de antigenicitate

Sisteme de aglutinare indirecta:

(fibrinogen, IgG, Ac specifici de grup),

API STAPH,

ID Rapid Staph,

VITEK 2 Compact,

Vidas,

Metode moleculare
1. PCR , PCR multiplex, Real Time PCR, PFGE, PCR- RFLP

- identificarea tulpinilor de stafilococi,

- detectarea rapida a stafilococilor din prelevat,

(focare Infectii nosocomiale, TIA),

- detectarea genelor care codifica factori de patogenitate (enterotoxine, leucocidina),

- secventierea genei spa (codifica proteina A),

- identificarea genei mecA (MRSA, MRSCN), alte gene de rezistenta,

- tipari in scop epidemiologic (markeri epidemiologici),

 5. ANTIBIOGRAMA
Metoda difuzimetrica

CMI (E test, Vitek 2C) - stripuri

Depistarea S. aureus si SCN meticilino rezistenti (MRSA, MRSCN)

Metode moleculare (gene de rezistenta/ mec),

Asocierea fenotipurilor de rezistenta dobandita

Stafilococi meticilino-rezistenti MRSA (rezistenti la toate penicilinele)

administrare de beta-lactami: cefalosporine toate generatiile, carbapeneme

7. Diagnosticul de laborator in faringita streptococica

Criterii de clasificare a streptococilor:

1. Tipul de hemoliza:
- Streptococi beta hemolitici: produc hemoliza completa, clara, tip beta (), caracteristica
speciilor cu potential patogen,
- Streptococi alfa prim hemolitici: produc hemoliza (') incompleta, cu aspect voalat,
caracteristica Streptococului de grup B/ Streptococcus agalactiae,
- Streptococi alfa hemolitici: produc hemoliza partiala, incompleta, cu tenta verzuie, (hemoliza
viridans (specifica streptococilor viridans si pneumococului),
- Streptococi nehemolitici.
2. Structura antigenica/ clasificare Lancefield, bazata pe natura antigenului
polizaharidic din peretele celular (antigen specific de grup):
- cel mai important criteriu din punct de vedere clinic si epidemiologic,
- streptococii se impart in grupe serologice, notate: A-H, K-V,
- Grupul serologic A este cel mai important din punct de vedere al patogenitatii. Se imparte la
randul sau in peste 80 serotipuri, pe baza antigenelor specifice de tip (proteinele M si T),
- Grupurile serologice C, G, B, D, F sunt prezentate in ordinea frecventei,
- Streptococii lipsiti de antigen de grup, numiti streptococi negrupabili (nu sunt inclusi in
clasificarea Lancefield): streptococii viridans si Streptococcus pneumoniae (pneumococul),

In diagnosticul de rutina in laborator, clasificarea streptococilor se realizeaza printr-o combinatie

de criterii: tipul hemolizei, structura antigenica, caracterele culturale si biochimice.

Streptococii sunt implicati intr-o multitudine de boli, patogenitatea lor fiind complexa: capacitatea
de multiplicare, proprietati invazive, producerea de enzime si toxine, producerea de autoanticorpi si
boli autoimune, complicatii imunologice cu efect intarziat/ efecte tardive.

Infectiile streptococice pot fi grupate astfel:

- infectii localizate la poarta de intrare:

* infectii cu poarta de intrare respiratorie: angina streptococica, scarlatina, infectii in sfera ORL (otita,
otomastoidita), meningita, pneumonii, bronhopneumonii,
 * infectii cu poarta de intrare cutanata: streptodermii (focare familiale- cu caracter epidemic),
erizipel, impetigo, intertrigo, pemfigus, cu complicatii supurative: celulite, flegmoane, abcese, fasceita
necrozanta,

* infectii cu poarta de intrare genitala: post abortum, post- partum, febra puerperala,

- infectii generalizate: septicemii,

- infectii produse de streptococi lizogenizati (tulpini de streptococ producatoare de eritrotoxina,

toxina A/ cytotoxina, in urma transferului de gene (tox+) ce codifica sinteza acestor toxine, prin
intermediul bacteriofagilor): scarlatina, sindromul de soc toxic streptococic,

- complicatii tardive nesupurative: sindrom post- streptococic minor, reumatism acut articular,
cardita reumatismala, glomerulonefrita acuta post-streptococica .

Tipuri de prelevate patologice, in functie de tipul si localizarea procesului infectios:

- exudat faringian, nazal, sputa, secretii conjunctivale, otice, puroi, secretii vaginale, urina, sange,
LCR, lichide de punctie sinusala, peritoneala, articulara, pleurala etc.

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC DIRECT: - vezi subiectul 2 Exudatul faringian

DIAGNOSTIC SEROLOGIC: datorita faptului ca in evolutia complicatiilor post- streptococice tardive,

germenii nu se mai izoleaza in cultura, se urmareste determinarea anticorpilor antistreptococici, prin
teste serologice. Se pun in evidenta anticorpii prezenti in ser atat fata de componentele endocelulare,
cat si fata de produsii extracelulari, streptococici.

REACTIA ASLO:
Reactia de seroneutralizare este utilizata in Diagnosticul microbiologic indirect.

Reactia ASLO se practica pentru:

- diagnosticul serologic al infectiilor streptococice si post- streptococice,

- diagnosticul complicatiilor tardive post- streptococice,
- urmarirea evolutiei unei infectii streptococice,
- urmarirea eficientei tratamentului.
-
* O reactie ASLO (-) nu infirma diagnosticul de infectie streptococica.

* In 80% din cazurile de infectii streptococice reactia ASLO este pozitiva,

* In 20% dintre infectiile streptococice reactia ASLO este negativa - cauze:

- infectii cu tulpini de Streptococcus pyogenes slab productive sau neproductive de streptolizina O,

- infectii in organisme imunodeprimate,
- in cazul in care tratamentul antibiotic este instituit foarte precoce,
- in sangele bolnavului exista mucine care blocheaza anticorpii antistreptolizina O, determinand
reactii ASLO fals negative.

* Reactii ASLO fals pozitive cauze:

- prezenta in serul bolnavilor a unor inhibitori nespecifici ai streptolizinei O, si - lipoproteine,

in boli asociate ca: hepatite, nefroze, boli autoimune (lupus eritematos diseminat, poliartrita
reumatoida), tuberculoza etc.
 Pentru a indeparta inhibitorii nespecifici, care determina reactii fals pozitive, o etapa
obligatorie a reactiei ASLO este tratarea serului de bolnav cu solutie 0,4% Rivanol, care precipita
si - lipoproteinele. Aceste precipitate se inlatura prin centrifugare.

- alta sursa de reactii fals pozitive, o constituie suprainfectarea serurilor de bolnav cu

Pseudomonas sau Bacillus, care elaboreaza enzime ce oxideaza streptolizina O si o inactiveaza.
Streptolizina O este oxigen labila; in forma inactivata nu actioneaza asupra hematiilor si reactia
se interpreteaza ca fals pozitiva.

PRINCIPIU: dozarea anticorpilor antistreptolizina O se bazeaza pe efectul neutralizant al acestora asupra

streptolizinei O (hemolizina O). Seroneutralizarea streptolizinei O (SLO) prin existenta in ser a
antistreptolizinei O, este vizualizata prin absenta hemolizei unor eritrocite test, care constituie
substratul celular indicator.

In absenta anticorpilor antistreptolizina O, streptolizina O isi exercita efectul litic pe hematii, efect
tradus prin prezenta hemolizei.

MATERIALE SI REACTIVI NECESARI:

- ser de cercetat (sau seruri- pereche, recoltate la interval de 2 saptamani),

- SLO liofilizata (standardizata de catre producator),
- Sange defibrinat de iepure/ berbec,
- Solutie salina izotona, solutie de Rivanol 0,4%,
- Eprubete, pipete gradate,
- Baie apa, centrifuga.

TEHNICA DE LUCRU:

* prima etapa a reactiei ASLO:

- serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56C si se trateaza cu Rivanol 0,4%,
pentru indepartarea inhibitorilor nespecifici,

- se efectueaza dilutia 1/ 10 a serului si se mentine 30 min la 56C,

- se realizeaza dilutii succesive, binare, de ser si se pun in contact cu SLO (cantitate constanta, cate 0,5
mL/ tub);

- se agita tuburile si se mentin 15 min la 37C (REACTIA DE NEUTRALIZARE),

* a II-a etapa a reactiei:

- se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub,

- se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37C plus peste noapte la 4C,

- citire finala a doua zi.

 Schema reactiei ASLO:

Dil. ser 1/100 1/ 500

Ser dil 1 0,8 0,6 0,4 0,3 1 0,8 0,6 0,4 0,2
bolnav

NaCl 0,9% - 0,2 0,4 0,6 0,7 - 0,2 0,4 0,6 0,8

SLO 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

15 min la la baie de apa, 37C (reactia de neutralizare)

Hematii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Iepure 5%

45 min la baie de apa 37C

Unitati 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500
ASLO/mL

TITRUL

Titrul este dat de tubul cu dilutia cea mai mare de ser de testat in care lipseste hemoliza, ceea ce
exprima prezenta unei cantitati suficiente de anticorpi ASLO, capabili sa neutralizeze intrteaga cantitatte
de SLO din amestec.

INTERPRETARE:

- daca infectia streptococica (cu streptococ beta hemolitic grup A) a fost corect tratata se ajunge la
sterilizarea bacteriologica a bolnavului si la scaderea in timp a titrului anticorpilor ASLO, pana la valori
normale (0- 200 UI/mL),
- titruri crescute de anticorpi, persistente, urmarite in dinamica, corelate si cu alte teste imunobiologice,
precum si cu aspectul clinic, atrag atentia asupra unor complicatii post streptococice, ca Sindrom
poststreptococic (reumatism articular acut, cardita reumatismala, glomerulonefrita acuta).

Control de calitate: Martor pentru hematii, tub martor pentru SLO.

8. Diagnosticul de laborator in pneumonia pneumococica

Streptococcus pneumoniae: este un streptococ negrupabil, comensal al cailor respiratorii superioare, cel
mai frecvent intalnit in stare de portaj. Devine virulent cand este incapsulat, determinand infectii
respiratorii de tract superior (angine) si inferior (pneumonia franca- lobara, bronhopneumonii, la varstele
extreme sau pe fond de imunodepresie). Diagnosticul este bacteriologic.
 1. Recoltarea: in functie de localizarea infectiei, se recolteaza: exudat faringian, nazal,
sputa, sange, LCR.
2. Examen direct macroscopic: sputa din pneumonia franca- lobara, are un aspect ruginiu,
caracteristic.
3. Examen microscopic al frotiului colorat Gram din sputa: screening al calitatii frotiului:
peste 25 PMN/ camp si prezenta cocilor alungiti, lanceolati, in flacara de lumanare,
unii incapsulati, dispusi in diplo, lanturi scurte, intra- si extraleucocitari.
4. Izolarea: pe geloza sange berbec/ 5-10%, in atmosfera imbogatita cu 5-10% CO2, la 37C,
timp de 24 ore.
5. Identificarea:
caractere culturale: pe mediu geloza- sange, coloniile sunt rotunde, usor bombate, mucoase sau
plate, netede, cu zona de hemoliza / verzuie in jur. Pe masura ce cultura se invecheste, coloniile
devin escavate, concave, datorita inceperii procesului de autoliza.
Testul sensibilitatii la optochin: se repica in sectoare, cultura pura de pneumococ, pe care se
aplica un disc de optochin. Se incubeaza 24 ore, la 37C. Testul este pozitiv (germenii sunt sensibili
la optochin) daca in jurul discului de optochin cultura este inhibata pe o arie de minim de 20 mm.
Este un test specific, care diferentiaza pneumococul de streptococul viridans.
Biloliza, autoliza: solubilizarea pneumococului in bila sau saruri biliare. Acestea favorizeaza si
eliberarea de autolizine, care vor determina liza pneumococilor. In cazul streptococilor viridans,
testul este negativ.
Testul de aglutinare pe lama cu anticorpi specifici anticapsulari: testul de umflare a capsulei.

6. Antibiograma: pentru testarea sensibilitatii la penicilina se utilizeaza disc de oxacilina de

1 g. Daca diametrul zonei de inhibitie a cresterii este > 20 mm, pneumococul este sensibil
la penicilina G. Desi diametrul de inhibitie poate fi mare, in vivo, actiunea penicilinei nu
este satisfacatoare; de aceea se cere determinarea valorii CMI la penicilina G, in special
in infectii sistemice (meningite, septicemii).

9. Diagnosticul de laborator in meningita bacteriana

1. MENINGITA MENINGOCOCICA
- omul: singura gazda naturala a meningococului
- 5- 10% din populatie este purtatoare (in nazo- faringe) de meningococ
- bacteriemie (def. Ptrundere n snge a unor bacterii care pot produce o infecie
localizat)

- strabate bariera hemato- encefalica

- meningita cerebro-spinala
- febra, redoare de ceafa, coma, rush purpuric, petesii, coagulare intravasculara (CID)
(coagulopatia de consum) caracterizata prin activarea sistemica a sistemului de coagulare a sangelui cu
generarea si depozitarea de fibrina si formarea de trombi microvasculari in diferite organe contribuind la
dezvoltarea insuficientei multiple de organ; consumul proteinelor de coagulare si plachetelor prin
activarea continua a sistemului de coagulare poate induce complicatii hemoragice severe.

Examen clinic neurologic:

~ Brudzinskis neck sign
~ Kernigs sign
2. PURPURA FULMINANS
(SDR. WATERHOUSE FREDERICHSEN):
- meningococemie fulminanta
- implicata endotoxina in tulburari hemodinamice
- activarea procesului de coagulare intravasculara (CID)
- febra mare, rush hemoragic, soc
- sechele meningo- encefalitice, la copii, necroze extremitati, deces etc
3. ALTE MANIFESTARI CLINICE
rinofaringite,
otite,
conjunctivite,
bronsite,
pneumonii,
bronhopneumonii,
artrite,
pericardite etc.

DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTII MENINGOCOCICE

I. PRELEVARE PROBE- REGULI GENERALE:
- In urgenta, inainte de administrarea tratamentului cu antibiotice
- Respectarea regulilor de asepsie, antisepsie
- Recipiente sterile, unica utilizare.
1. LCR:
- punctie lombara,
- tuburi sterile,
- 2-5 ml (copii),
- 5-10 ml (adulti),
 - unde si daca este posibil, insamantare la patul bolnavului, pe medii incalzite la 37C

2. HEMOCULTURA:
- minim 2 hemoculturi,
- Volum: 10 ml (adult), 1-3 ml (copil),
- Insamantare pe medii bifazice sau flacoane speciale pentru sisteme automate

3. ASPIRAT PETESIAL, BIOPSIE CUTANATA:

- Insamantare la patul bolnavului

4. SITUSURI ANATOMICE CU FLORA BACTERIANA ASOCIATA:

- Exsudat faringian, nazal (bolnavi, purtatori, contacti),
- Sputa, aspirat bronsic.

II. TRANSPORT:
- IMEDIAT (sange, LCR), la 37 C,
- Medii de conservare si transport: Stuart, Amies (exudat nazal sau faringian),
- Meningococii f. sensibili la conditiile de mediu extern: UV, uscaciune,TC ,
La temperatura ambianta se lizeaza in 2 ore,
Liza mai rapida in prelevat, la 37C, decat la temperatura camerei,
Nu se pastreaza la frigider sau termostat.

III. EXAMEN MACROSCOPIC LCR:

- tulbure, purulent (chiar clar, in functie de stadiul infectiei),
- consistenta,
- culoare,
- miros.
IV. EXAMEN CITOBACTERIOLOGIC:
a) Ex. citologic cantitativ
- Nr. elemente nucleate / mm cub,
b) Ex. citologic calitativ (frotiu AM, Giemsa):
- prezenta PMN neutrofile, limfocite, macrofage si raportul lor %,
c) Ex. microscopic (frotiu Gram)/ sediment:
- diplococi Gram (-) reniformi, in boabe de cafea, intra- si extraleucocitari,
! LCR clar (debutul meningitei): necesita diagnostic diferential cu meningita TBC (b. Koch),
virala, micotica (Cryptococcus neoformans).

V. DETECTIE ANTIGENE SOLUBILE DIRECT IN SUPERNATANT LCR:

* Reactie de latex- aglutinare (identificarea prezentei N. meningitidis in LCR si serogrupul
implicat in patogenia meningitei)
* Teste imunologice de umflare a capsulei,
* Identificarte cu Ac fluorescenti (I.F.) direct din produs,
* Imunelectroforeza (IEF),
* PCR (multiplex, real time etc.)

VI. CULTIVARE: germeni pretentiosi

* Produsele normal sterile se insamanteaza pe medii ca:
* BHI agar- 5-10 % sange berbec,
* Mueller Hinton +/- 5-10% sange berbec,
* Geloza Columbia- chocolat,
* Produsele pluribacteriene (exudat faringian, nazal, sputa etc) se insamanteaza pe medii
selective:
* Thayer Martin (lincomicina, colistin)
*Sange pentru hemoculturi:
- Flacoane cu mediu bifazic,
- Flacoane standard, FAN aerobe- anaerobe, uz pediatric pentru sisteme automate
(BACTEC, BacT/ALERT etc)
- Se inoculeaza pentru fiecare hemocultura o pereche de flacoane (aerob si anaerob)
VII. CONDITII DE INCUBARE:
- temperatura: 37C,
- atmosfera: aeroba cu 5% CO2,
- timp: 18- 24- 48 ore,
- umiditate,

Pentru hemoculturi:
* incubare 7 zile, cu treceri oarbe pe medii de cultura solide, neinhibante,
* in sistem automat, pozitivarea hemoculturii produce semnal luminos sau sonor.

VIII. IDENTIFICARE
a) Caractere microscopice:
coci Gram (-) reniformi, in diplo, capsulati, nesporulati,
b) Caractere culturale:
- Colonii S, M
- colonii netede, rotunde, margini regulate, stralucitoare, nepigmentate, translucide,
untoase, usor gri, nehemolitice,
c) Caractere biochimice:
- * Metabolizarea carbohidratilor:
- glucoza si maltoza, nu si lactoza, zaharoza
- (G+, M+, L-, Z-)
- * Produc citocrom- oxidaza
- (reactia oxidazei+),
- reactia catalazei +
- * Sisteme comerciale de diagnostic rapid: API, Microscan, Vitek
d) Caractere antigenice:
- 12 serotipuri,
- 13 serogrupuri,
- cele mai importante, serogrupurile:
 A, B, C, D, X, Y, Z, W
* reactii de aglutinare pe lama cu seruri polivalente,
* aglutinare in tuburi cu seruri monovalente

IX. ANTIBIOGRAMA
- Pentru tulpinile de N. meningitidis izolate din infectii sistemice (sange, LCR) se
recomanda determinarea valorilor CMI (metoda cantitativa):
* E- test, Vitek, Microscan etc
- Testarea tulpinilor izolate din alte prelevate se face de rutina prin metoda
difuzimetrica standard:
* Mediul Mueller Hinton cu sange berbec 5-7%,
- Pentru penicilina G si ampicilina:
* discuri de 2UI, 2 g ( diferentiaza tulpinile sensibile/ S de cele moderat rezistente/ R).

10. Diagnosticul de laborator in tuberculoza pulmonara

Tuberculoza este data de Mycobacterium tuberculosis.

Alte specii de mycobacterii, numite mycobacterii atipice (altele decat M. tuberculosis/
mycobacteria other than tuberculosis: MOTT sau non-tuberculosis mycobacteria: NTM)
determina de asemenea, tuberculoza pulmonara.

Mycobacterium tuberculosis- definitie

Bacili acido- alcoolo- rezistenti = BAAR
Perete celular bogat cu continut bogat in lipide si ceruri, conferind anumite prprietati:
- acido- alcoolo- rezistenta,
- rezistenta la tratamentul cu alcaline,
- rezistenta la antibiotice si chimioterapice,
- rezistenta intrafagocitara si capacitatea de a determina aparitia inflamatiilor
granulomatoase.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC AL TUBERCULOZEI- SPUTA

I. RECOLTAREA PRELEVATELOR CLINICE IN TUBERCULOZA

- Multitudine de prelevate clinice: sputa, aspirat bronsic, lichid pleural (tuberculoza

pulmonara), urina, sange, lichid cefalorahidian/LCR, alte lichide de punctie/ lichid peritoneal,
articular, fragmente biopsice/ganglioni (tuberculoza extrapulmonara) etc.
- Prelevatele care contin flora bacteriana mixta, trebuie prelucrate prin centrifugare si
decontaminare chimica pentru a reduce contaminarea culturii de Mycobacterium tuberculosis
cu flora bacteriana sau fungi saprofiti.
- Recoltarea corecta a prelevatului patologic, identificarea completa a probei/ etichetare
corecta, transportul rapid, prelucrare conform protocoalelor de lucru.
- inainte de inceperea chimioterapiei, in recipiente sterile, de unica utilizare, din material plastic
transparent (pentru evaluarea calitatii prelevatului: cantitate, aspect purulent/ nu saliva, in
cazul sputei), capac insurubabil.

Recoltarea sputei: sputa expectorata spontan reprezinta produsul care asigura

procentul cel mai mare de rezultate pozitive in diagnosticul tuberculozei pulmonare.
Sputa este corect recoltata cand este eliminata prin tuse profunda, nu are aspect de
saliva sau mucus nazal, este purulenta sau contine particule purulente. Cavitatea bucala
se curata in prealabil de resturi alimentare.
In cazul pacientilor care nu expectoreaza, a celor necooperanti sau a copiilor (care inghit
sputa), se face prin mai multe procedee:

- stimularea secretiilor, a senzatiei de tuse si expectoratie, cu ajutorul aerosolilor

expectioranti: ser clorurat 10%
- bronhoscopie si lavaj bronsic: produsul este recoltat de catre medic specialist
pneumolog, cu aparatura speciala, in conditii stricte de asepsie, direct din leziunea tuberculoasa
activa, de la nivelul aparatului respirator,
- spalatura laringo-traheala: dupa gargara cu xilina 10%, cu ajutorul unei seringi
prevazuta cu o canula incurbata, se introduce in laringe o cantitate de 4- 5 ml ser fiziologic
steril. Tusea violenta produce sputa de buna calitate.
- lavajul gastric: la pacientii necooperanti, copii, carora examenul clinic si radiologic
sugereaza diagnosticul de tuberculoza, se practica cu succes acest procedeu. O combinatie de
aerosoli expectoranti si lavaj gastric, a obtinut mai multe culturi de Mycobacterium tuberculosis
decat fiecare metoda in parte.

* Sputele sau alte produse necorespunzatoare calitativ (saliva, resturi alimentare) sau
cantitativ, vor fi eliminate, solicitandu- se repetarea recoltarii.
* Laboratorul de microbiologie clinica a convenit de comun acord cu medicii clinicieni din
compartimentul de pneumofiziologie sa prelucreze in scop diagnostic si saliva, desi e considerat
produs necorespunzator pentru analiza (experienta a demonstrat ca un numar redus de cazuri a
prezentat totusi microscopie pozitiva in saliva).

II. PRELUCRAREA SPUTEI

1. Omogenizarea si decontaminarea sputei

* Esantionul de sputa se introduce intr- un flacon cu perle de sticla, sterile, peste care se
adauga un volum egal de solutie NaOH 4% si o picatura de albastru de brom- timol.
* Se agita energic, manual, 15- 20 min. Contactul sputei cu NaOH nu trebuie sa depasasca 30
min.
* Se neutralizeaza cu HCl 8% pana la pH neutru ( galben- verzui).
* Se centrifugheaza la 3000 turatii/ min, timp de 15 min, in tuburi de centrifuga cu capac, dupa
echilibrare prealabila.
* Se decanteaza supernatantul, lasand 1 ml lichid. Cu pipeta Pasteur, folosind para de cauciuc,
se omogenizeaza lichidul ramas, apoi se depune o picatura pe o lama, marcata cu numarul
probei din registrul de laborator.
 2. Prepararea frotiului
Pe suprafata de lucru, in interiorul hotei cu aer laminar, se intinde o coala de hartie de
filtru imbibata cu solutie dezinfectanta. La sfarsitul manoperelor, hartia se strange si se
arunca in galeata cu materiale infecte.
Se folosesc lame de sticla noi, fara zgarieturi sau pete, subtiri, cu capat rodat.
Se identifica (nume, cod) lama pe suprafata mata, pe fata corespunzatoare frotiului, cu
creion rezistent la stergere si insolubil in alcool.
Se efectueaza un frotiu cu lungimea de 2 cm si latimea de 1 cm, fara sa se atinga
marginile lamei. Produsul se intinde uniform, in strat subtire, astfel incat atunci cand
este uscat sa se vada prin el literele unui text.
Lamele se usuca in hota. Fixarea lamelor se efectueaza prin trecere de 3 ori prin flacara,
timp de 3- 5 sec, cu ajutorul unei pense.
Materialele infectate se colecteaza in galeata de inox, cu capac si sac autoclavabil,
flacoanele de sticla in care s-a prelucrat sputa se autoclaveaza (1 ora la 2 atm, 134C).
Suprafetele de lucru se dezinfecteaza.

Etalare frotiuri din alte produse patologice decat sputa

Aceeasi tehnica de efectuare a frotiurilor se aplica si pentru alte produse biologice:

- Lichidele de punctie, normal sterile: lichidul cefalorahidian, lichidul pleural, lichidul
peritoneal, articular, se centrifugheaza si din sediment se efectueaza frotiul.
- Alte produse, potential pluricontaminate : aspirat bronsic, suc gastric, urina, ganglioni,
colectii purulente, materii fecale, sunt energic decontaminate, iar dupa centrifugare, se
efectueaza frotiul.

3. Colorarea frotiurilor

In mod curent sunt folosite 2 tipuri de coloratii:

a) Coloratia cu fucsina fenicata:
- coloratia Ziehl- Neelsen (coloratie la cald),
- coloratie Kinyoun (coloratie la rece),
b) Coloratie cu fluorocrom:
- auramin acridine orange,
- auramin- rhodamine B.
Ambele tipuri de coloratie se bazeaza pe legarea acidului micolic, component major al
peretelui celular.

* Frotiurile colorate cu fucsina fenicata trebuie sa fie examinate cu obiectiv cu imersie,

* Frotiurile colorate cu auramina pot fi examinate cu obiectivul de 25X, crescand astfel campul
vizual si reducand timpul de examinare.
* Frotiurile colorate cu fluorocrom necesita o sursa de lumina puternica (lampa cu vapori de
mercur) si o trusa de filtre cu rol de a selecta lumina emisa de colorantii fluorescenti.
Examinarea se face in camera intunecata. Pe fondul intunecat al preparatului, bacilii se
vad colorati in galben- portocaliu stralucitori, ceea ce confera un avantaj distinct in
 examinarea lamei. Bacilii sunt subtiri, usor incurbati, uneori granulati, izolati sau in
gramezi.

In practica curenta se realizeaza coloratia clasica Ziehl- Neelsen.

Tehnica :
- se asaza lamele cu frotiurile fixate, pe suportul de colorare, fara sa se atinga intre ele,
- se acopera complet lamele cu solutie de fuxina fenolata, turnata prin palnia cu hartie de filtru,
pentru 10 min,
- se incalzeste lama pana la emitere de vapori, trecand pe sub frotiuri flacara unui tampon
imbibat in alcool,
- colorantul nu trebuie sa fiarba, nici sa se usuce. Se completeaza colorantul pe lamele de pe
care acesta s- a scurs.
- operatia de incalzire se repeta de 3 ori in decurs de 10 min,
- se inlatura fuxina, se spala cu apa, se scurge apa,
- decolorare cu alcool- acid 3%, timp de 3 min,
- se spala cu apa de robinet, se repeta decolorarea daca frotiul ramane rosu,
- colorare cu solutie de albastru de metilen 0,3%, timp de 1 min.
- se spala bine lama sub jet de apa, se scurge apa, se usuca la temperatura camerei, asezandu-
se vertical pe suportul de lame.

4. Examinarea microscopica

Frotiurile colorate Ziehl- Neelsen se examineaza la microscop optic, binocular, obiectiv cu

imersie (90- 100).
Se depune o picatura de ulei de cedru pe frotiu, fara a atinge cu bagheta suprafata
frotiului (se poate contamina uleiul de imersie cu BAAR).
Se evidentiaza bacilii rosii, usor incurbati, deseori granulati, izolati sau grupati, pe fond
albastru.
Gramezile compacte de bacili se considera fiecare un singur BAAR, deoarece pe mediile
de cultura dau nastere la o singura colonie (unitate formatoare de colonii). Se asigura in acest
fel o concordanta mai buna intre microscopie si cultura.
Se parcurge frotiul in lungime de 1- 3 ori pe trasee diferite. Se examineaza camp dupa
camp separat, nu in miscare continua.
In functie de densitatea bacililor pe frotiu, se citesc intre 25 si 300 de campuri.

5. Notarea rezultatelor
5.1 Exprimarea semicantitativa a rezultatelor examenului microscopic :
ZIEHL- NEELSEN REZULTAT
0 BAAR negativ BAAR
1- 9 BAAR / 100 campuri nr. exact de BAAR / 100 campuri
10- 99 BAAR / 100 campuri POZITIV BAAR 1 +
1 10 BAAR / camp POZITIV BAAR 2 +
> 10 BAAR / camp POZITIV BAAR 3 +

5.2 Cauze de eroare in microscopie

Etape in prepararea frotiurilor :
- iluminare slaba a spatiului de lucru,
 - amestecarea frotiurilor,
- efectuarea prea multor frotiuri odata,
- refolosirea lamelor pozitive ,
- contaminarea produsului din neglijenta,
Factori ce tin de coloratie :
- folosirea lamelor refolosite, zgariate,
- fuxina nefiltrata,
- neglijenta la incalzirea fuxinei, cu uscarea ei si cristalizarea pe lama ( supraincalzire),
- decolorare insuficienta,
Examinarea microscopica :
- stergerea numarului in timpul colorarii,
- BAAR ramasi pe obiectiv de la o examinare anterioara,
- ulei de cedru contaminat cu BAAR,
Eroare de raportare a rezultatului.

III. CULTIVARE, INSAMANTARE, INCUBARE

Deoarece aspectul morfotinctorial al germenilor nu da indicatii asupra speciei de

Mycobacterium si nici asupra viabilitatii lor, diagnosticul microscopic trebuie sistematic
confirmat prin cultura.
In diagnosticul bacteriologic al tuberculozei cultura reprezinta metoda de baza.
Ea permite atat izolarea cat si identificarea bacililor tuberculosi, confirmand etiologia
si activitatea bolii; ea face posibila si testarea chimiosensibilitatii germenilor.
Este o metoda sensibila, cu un prag de 10- 100 BAAR / 1mL produs, fata de 5 000-
10 000 bacili / ml produs in cazul frotiului direct.
Dezavantajul consta in faptul ca omogenizarea- decontaminarea prelevatului
comporta o inevitabila pierdere de Mycobacterii viabile, precum si intarzierea cu care se
obtine rezultatul (microscopia are rol complementar).

Insamantare pe medii de cultura:

- S-a constatat ca mediile de cultura imbogatite cu ou, faina de cartof, glicerol, saruri
solidificate prin incalzire 85-90C, pentru 30-45 min, sunt eficiente pentru izolarea
Mycobacterium tuberculosis.
- Mai tarziu s-a constatat ca folosirea colorantilor de anilina, ca verde malachit sau cristal
violet, adaugati la compozitia mediului ajuta la inhibarea bacteriilor contaminante.
- Mediile de cultura utilizate trebuie sa ofere conditii optimale cresterii Mycobacteriilor,
chiar atunci cand se inoculeaza produse paucibacilare. Se utilizeaza mediul Lowenstein
Jensen.
- Inocularea se efectueaza cu pipeta Pasteur, in 3 tuburi cu mediu Lowenstein Jensen,
cate 0,2 ml ( 4 picaturi) din sedimentul esantionului de produs prelucrat.
- Se inclina fiecare tub pentru ca inoculul sa inunde toata suprafata mediului.
- Tuburile inoculate se aseaza in pozitie inclinata (25- 30), cu capacele semiinsurubate,
astfel incat, lichidul insamantat sa scalde suprafata mediului, fara sa atinga capacul.
- Se lasa 48 h pentru ca inoculul sa fie absorbit in mediu, apoi tuburile se inchid (se
insurubeaza capacul) si se aseaza vertical, in stative metalice, etichetate
Incubare:
Tuburile cu mediu se incubeaza in termostat, la 37C, la intuneric, timp de 60 zile.
In cursul incubarii culturile sunt controlate la intervale fixe, dupa cum urmeaza :
- la 48 h se identifica si se elimina culturile integral contaminate (cele 3 tuburi). Se consemneaza
in registrul de laborator suprainfectia, se comunica in clinica, se solicita repetarea recoltarii,
- la 5 7 zile de incubare se izoleaza Mycobacteriile atipice, cu crestere rapida si se triaza
tuburile infectate,
- in continuare, culturile se controleaza saptamanal, pana la 8 saptamani de incubare.

IV. INTERPRETARE

Aspect cultural

M. tuberculosis colonii R (Rough), alb- galbui,

M. bovis colonii S (Smooth), disgonice, alb- galbui,
M. atipice colonii S sau R, albe, galbui, portocalii, gri, roz.

Examen morfologic microscopic din culturi ( frotiu Ziehl Neelsen) :

M. tuberculosis gramezi BAAR sau cord factor,
M. bovis - gramezi BAAR,
M. atipice BAAR, coci dispersati

Schema minima de identificare :

- viteza de crestere ( crestere si dezvoltare) ;
M. tuberculosis > 7 zile,
M. bovis > 10 zile,
M. atipice cu crestere rapida : 1 3 zile,
- cu crestere lenta : 3 5 zile,
- fotocromogenitatea : pigmentarea in prezenta luminii,
- testul Konno : testul niacinei
M. tuberculosis pozitiv,
M. bovis / M. atipice : negativ.

Exprimarea rezultatelor

Crestere bacteriana Notarea rezultatului

< 30 colonii nr. exact de colonii/ tub

30 100 colonii
> 100 colonii izolate
Colonii confluente
Contaminare cu alte micro-
organisme decat Mycobacterii
Cultura Mycobacterium
Pozitiv 1+
Cultura Mycobacterium
Pozitiv 2+
Cultura Mycobacterium
Pozitiv 3+
Cultura contaminata
Rezultate fals positive (supradiagnostic):
Mycobacterii atipice, levuri sau microorganisme diagnosticate drept M. tuberculosis,

Rezultate fals negative (subdiagnostic):

- expunerea produsului patologic la lumina solara, sau raze ultraviolete,
- stocarea produsului timp indelungat inaintea insamantarii,
- suprainfectarea produsului cu mucegaiuri sau alte microorganisme,
- nealegerea particulelor purulente, in cazul sputelor,
- prelungirea peste 30 min a perioadei de decontaminare,
- neutralizarea incorecta ( alt pH decat 7,2),
- folosirea unor medii vechi, uscate, nesterile,
- incubarea necorespunzatoare (sub sau peste 37C),
- centrifugarea la turatii foarte mari : g > 3000 rot/ min,
-eliberarea unui rezultat de cultura negativa pe un singur tub (celelalte 2 tuburi fiind
suprainfectate sau uscate).

Sisteme automate de cultivare a Mycobacteriilor

- Prelucrarea produselor patologice in sistemele automate prevede aceleasi etape ca pentru

inocularea pe mediu solid.
- Sistemul colorimetric MB Bact (Bactec 9000) : senzorul colorimetric de la baza tubului isi
modifica culoarea de la verde inchis la galben in functie de acumularea CO2 in cursul
metabolizarii substratului.
- Citirea se efectueaza automat la interval de 10 min.

11. Caracterizati comportamentul biochimic al unei

enterobacterii insamantate pe medii diferentiale

ESCHERICHIA COLI vezi subiectul 3 Urocultura

KLEBSIELLA PNEUMONIAE
IDENTIFICARE:
- Caractere microscopice: bacili Gram (-) grosi, scurti, in diplo pe axul lung, capsulati,
- Caractere culturale:
- colonii lactozo (+) mucoase, care conflueaza pe medii neinhibitorii
- Caractere biochimice:
TSI: G+, L+, Z+
SIM: H2S-, I variabil, M-
Uree: +
Simmons: +
GENUL ENTEROBACTER
* Definitie: grupare de Enterobacteriaceae mobile,
- fermenteaza glucoza cu cantitati mari de gaz,
- NU produce: indol, H2S si fenilalanildeaminaza (FenAla),
- Spre deosebire de genul Klebsiella, bacteriile din genul Enterobacter au o activitate
fermentativa mai redusa si sunt mobile,
- 2 specii au importanta medicala:
* Enterobacter aerogenes,
* Enterobacter cloacae
*Identificare preliminara:
1. Caractere de cultivare
- medii nutritive simple (geloza simpla, geloza- sange),
- mediu diferential CLED (geloza lactozata),
- medii slab selective (MacConkey),
2. Set minim de teste biochimice: TSI, MIU, MILF, citrat,
* cultura pe mediul MacConkey:
- colonii mari,2-3 mm, rotunde, tipice S,
- lactozo (+)

*Identificare definitiva:
- tipare serologica,
- tipare biochimica,
- tipare genetica
 - rezistotipia:
Sensibilitate la floxacine, cefalosporine generatia a III-a, aminoglicozide,
Tulpinile de Enterobacter sunt rezistente la ampicilina, cefalosporine de generatia I,
cloramfenicol, tetraciclina.

GENUL PROTEUS
Bacteriile din Genul Proteus fac parte din flora bacteriana normala a intestinului uman,
- Sunt raspandite pe sol, in ape reziduale, ape de suprafata, alimente de origine umana
sau animala,
- Produce imbolnaviri umane, cea mai des intalnita fiind infectia urinara.
* Identificare preliminara:
- caracteristic:
- fenomenul de invazie,
- fenomenul de demarcatie Dienes,
- colonii lactozo (-),
* Caractere exoenzimatice si metabolice: pe medii multitest: TSI, MIU:
TSI: G+, L-, Z-
SIM: H2S+, I variabil, M+
Uree: +
Simmons: +

- Teste (+): H2S, Fen Ala, ureaza, citrat, indol +/-,

* Proteus mirabilis / indol (-),
* Proteus vulgaris/ indol (+),
- Teste (-): lipsa fermentarii lactozei (L-), absenta Lizindecarboxilazei (Liz -),
*Identificare definitiva:
- Identificare biochimica (API, VITEK, Microscan etc),
- Tipare serologica,
- Tipare bacteriofagica,
- Rezistotipia:
rezistenta intrinseca la tetraciclina, nitrofurantoin, colistin
Caractere biochimice:

GENUL SALMONELLA vezi subiectul 4 - Coprocultura

GENUL SHIGELLA
Inocularea prelevatelor.
- mediul ADCL, variante ale mediului Leifson sau Hektoen,
- SS,
- MacConkey.
Ca inocul se vor folosi cu predilectie mucozitatile cu sange, iar in lipsa acestora, se va face o
suspensie de materii fecale in ser fiziologic tamponat, in proportie de 1/ 5, din care se depun 2
3 picaturi la 1 cm distanta de marginile placii.
Dispersia se face cu ansa, pentru obtinerea de colonii izolate.
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC DIRECT
- Incubarea placilor se va face la 37C, timp de 20 48 ore.
- Examinarea culturilor: colonii lactozo- negative,
In cazul unor culturi in care se gasesc foarte numeroase colonii lactozo- pozitive si in care cele
lactozo- negative sunt mascate, nedetectabile, se recomanda contactul culturii cu vapori de
amoniac, timp de 20- 30 secunde.
Identificare preliminara, pe baza caracterelor exoenzimatice:
* medii de cultura:
- geloza MacConkey sau AABTL cu thiosulfat,
- medii politrope: TSI, MIU, MILF, cu banda pentru indol.
* Mediile insamantate se incubeaza 20 ore, la 37C.
Identificare pe baza proprietatilor biochimice
Identificarea serologica
Identificarea prin aglutinare cu seruri anti- Shigella, se efectueaza, de preferinta, cu culturile
dezvoltate pe mediul TSI.
In cazul in care se obtin reactii pozitive la aglutinarea pe lama, cu serul polivalent, se trece la o
identificare de serotip.
Aspecte culturale ale genului Shigella, pe diferite medii de cultura selectiv- diferentiale

Genul Mediul Mediul Mediul Mediul Mediul

(Specia) Leifson/ MacConkey Istrate- SS Wilson-
ADCL Meitert Blair
Colonii 1- 2 Colonii 12 Colonii 1-2 Colonii 1-2
mm, semi- mm, semi- mm, relativ mm, semi-
transparente, transparente, transparente, transparente,
in culoarea rotunde, netede, rotunde, Nu creste
Shigella mediului, in culoarea culoare suprafata
suprafata mediului. verde. umeda,
umeda, cu usor
centrul usor bombate,
bombat. in culoarea
mediului.

Comportarea pe medii politrope a genului Shigella

Mediul Substrat Modul de Observatii

comportare
Acid (galben -
Glucoza (partea fermentarea
dreapta) glucozei)
Alcalin (culoarea -
mediului-
Lactoza, zaharoza nefermentarea
TSI lactozei si
zaharozei)
Exceptie :
Formare gaz din - unele tulpini de
glucoza Shigella flexneri 6
H2S - -
Mobilitate - -
MIU Indol +/- -
Uree - -
Lizin- - -
MILF decarboxilaza
Fenil- - -
alanina
GENUL YERSINIA
Definitie:
- bacili scurti, Gram (-), colorati bipolar,
- nesporulati,
- catalaza (+),
- oxidaza (-)
- au gazda naturala animalele,
- produc boli umane, unele deosebit de grave (ciuma/ Y. pestis).
Yersinia enterocolitica
Yersinia pseudotuberculosis
se gasesc in tractul digestiv al omului si al unor animale: pasari, animale
domestice, animale de ferma/ porci.
produc imbolnaviri sporadice toamna si iarna, ceea ce sustine influenta
temperaturii asupra patogenitatii tulpinilor,
au capacitatea de a se inmulti la +4C, ceea ce face posibila multiplicarea lor in
alimente pastrate la frigider
DIAGNOSTICUL ETIOLOGIC
este un examen bacteriologic si consta in izolarea si identificarea germenului din materii
fecale.
In practicarea coproculturii pentru Yersinia enterocolitica trebuie avute in vedere 2
caracteristici majore ale speciei si anume:
necesitatea cultivarii la temperatura camerei (25 - 30C),
incubarea mai lunga, in medie 48 ore.
aceste caracteristici conditioneaza exprimarea fenotipica a unor proprietati biologice
ale speciei, cum ar fi: caracterele culturale, antigenice, biochimice si de
patogenitate.
Tehnica coproculturii
McConkey, CIN agar (placi incubate la temperatura camerei timp de 48 de ore sau
incubarea in continuare a placii inca 24 ore la temperatura camerei).
Tehnica imbogatirii
* mediul Rappaport Konforti modificat,
* selenit acid de sodiu modificat,
* imbogatire la rece (1- 3 saptamani la +4C),
medii politrope TSI, MIU si MILF, cu incubare 20 48 ore la 25- 30C, si, respectiv, 20
ore la 37C.
Caractere biochimice pe medii politrope:
TSI:
- desfacerea glucozei si zaharozei cu virarea consecutiva in galben atat a partii drepte,
cat si a celei inclinate,
- lipsa producerii de H2S,
- lipsa formarii de gaz,
MIU :
- testul ureazei + la temperatura camerei si la 37C,
- mobilitate slab (+) la 20 ore si (+) la 48 ore de incubatie la temperatura camerei si (-)
la 37C,
- indol (-) la 20 ore, dar dupa 36- 48 ore, in tubul incubat la temperatura camerei, reactia
poate fi (+) pentru unele tipuri biochimice.
Identificare serologica Yersinia enterocolitica
Culturile cu caracterele biochimice pe mediile politrope si colonii caracteristice pe
MacConkey, se testeaza prin aglutinare pe lama cu seruri O3 si O9,
Rezultatul unei aglutinari pozitive, corelat cu caracterele biochimice mentionate,
confirma diagnosticul de Yersinia enterocolitica serotip O3, respectiv O9.