LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

REGULI DE BUN PRACTIC DE LABORATOR

1. DEFINIII
GMP - reguli de bun practic de fabricaie (RBPF)
O descriere a practicilor de calitate specificate ca principii i linii directoare sau reguli, publicate de autoritile de
reglementare pentru fabricanii i distribuitorii de medicamente i alte produse medicale
GLP - reguli curente de bun practic de laborator
O descriere a practicilor de calitate specificate ca principii i linii directoare sau reguli, publicate de autoritile de
reglementare pentru lucru in laborator
FDA food and drug administration, este agenia federal american mandatat s protejeze sntatea public
Asigurarea Calitii - AC
Toate activitile planificate i sistematice necesare pentru a asigura i pentru a verifica sigurana i ncrederea n
calitatea proceselor efectuate n scopul obinerii unui produs sau serviciu de calitate.
Controlul Calitii - CC
Tehnici i activiti de operare, prin care se urmrete att monitorizarea unui proces, ct i eliminarea cauzelor
performanei nesatisfctoare n toate etapele proceselor, pentru ndeplinirea criteriilor de calitate i n scopul unei
eficiene economice.
Proceduri Standard de Operare - SOP-uri
Specificaiile i instruciunile ce trebuie urmrite pe toat perioada unei operaiuni, a unui proces sau a unei
activiti.
Validare
Aciunea sau aciunile desfurate cu obiectivitate pentru a demonstra i pentru a documenta eficiena
echipamentului i / sau a proceselor pentru a ndeplini cerinele de performan ale specificaiei / specificaiilor.
Calibrare
Ansamblu de operaii care stabilete, n condiii specifice, relaia dintre valorile indicate de ctre un aparat sau un
sistem de msur sau valorile date printr-o msurare material i valorile corespunztoare cunoscute ale unui
standard de referin.
Calificare
Operaie prin care se demonstreaz c un echipament funcioneaz corect i conduce n mod real la rezultatele
ateptate. Conceptul de validare este uneori extins pentru a cuprinde i conceptul de calificare.
Zon controlat
Incint construit i utilizat astfel nct s controleze o serie de parametri ca: temperatura, umiditate, presiune
diferentiala, contaminarea cu particule si cu microorganisme.
Camer curat (Cleanroom)
Incint cu control definit al mediului nconjurtor sub aspectul numrului de particule, al contaminrii
microbiene, construit i utilizat astfel nct s reduc introducerea, generarea sau reinerea contaminanilor i s
menin parametrii fizici (temperatur, umiditate, presiune) la numite valori, conform cerinelor de fabricaie.
Sas
O incint (camer), ce funcioneaz n aa fel nct s menin presiunea diferenial la intrarea i ieirea dintr-o
zon cu control al contaminrii.
Filtru HEPA (High Efficiency Particulate Air Filter)
Filtrele HEPA cur aerul care intr i iese din camera curat, prin ndepartarea particuleor i microorganismelor ce
cauzeaz contaminarea.
Contaminant
Orice material sau substan ce afecteaz adevers orice pies, component sau ansamblu.
Contaminare ncrucisata

1
Contaminarea unui material sau a unui produs cu un alt material sau produs. Alternativ, este prezena neintenionat
a unei substane ntr-o sau pe o alt substan.
Particule
Orice tip de materie.
Particule viabile
Microorganisme vii.
Steril
Absena total a microorganismelor vii.
Produs steril
Un produs lipsit de orice micro-organism viabil.
Sterilizare
Un proces prin care se distruge sau se ndeparteaza toate micro-organismele viabile.
Iradiere
Se refer la aplicarea radiaiilor (gamma, in general) pentru sterilizarea produselor ce nu pot fi sterilizate prin aburi
sau cldur.
Serie / lot
O cantitate definit dintr-o materie prim, material de ambalare sau produs prelucrat ntr-un singur proces sau serie
de procese, astfel nct s poat fi considerat omogen.
Numr de serie (lot)
Combinaie caracteristic de cifre i/sau litere care identific n mod specific o serie.
Materie prim
Orice substan utilizat n fabricaia unui produs medicamentos, excluznd materialele de ambalare.
Producie
Toate operaiile implicate n prepararea unui produs medicamentos de la recepia materialelor trecnd prin
prelucrare i ambalare pn la obinerea produsului finit.
Produs finit
Produs medicamentos care a trecut prin toate etapele de producie incluznd ambalarea n recipientul final.
Produs intermediar
Material parial prelucrat care trebuie s treac prin alte etape de fabricaie nainte de a deveni un produs vrac.
Produs medicamentos
Orice substan sau combinaie de substane utilizate pentru tratarea sau prevenirea bolilor la om.
Orice substan sau combinaie de substane care pot fi administrate la om n vederea stabilirii unui diagnostic
medical sau pentru tratamentul, ameliorarea sau modificarea funciilor fiziologice la om sunt de asemenea
considerate produse medicamentoase.
Produs vrac
Orice produs care a trecut prin toate etapele de fabricaie cu excepia ambalrii finale.
Reprelucrare
Reprocesarea total sau parial a unei serii de produs, de o calitate necorespunztoare de la o anumit etap de
producie, prin una sau mai multe operaii suplimentare, astfel nct calitatea sa s poat fi considerat
corespunztoare.
Ambalare
Toate operaiile, incluznd umplerea i etichetarea, pe care le suport un produs vrac pentru a deveni un produs
finit.Not: Umplerea steril nu trebuie privit ca parte a ambalrii, produsul vrac fiind umplut n recipiente primare,
dar nu n ambalaj final.
Material de ambalare
Orice material utilizat n ambalarea unui produs medicamentos, excluznd ambalajul exterior destinat transportului
sau expediiei. Materialele de ambalare sunt primare sau secundare dup cum sunt sau nu n contact direct cu
produsul medicamentos.
Carantin
Statutul materiilor prime, materialelor de ambalare, produselor intermediare, vrac sau finite, separate fizic sau prin
alte mijloace eficiente, n ateptarea unei decizii asupra eliberrii sau respingerii lor.
2
Limit de aciune
Criteriu stabilit care, dac este depit, necesit aciuni de urmrire i corectare imediate.
Limit de alert
Criteriu stabilit care alerteaz n ceea ce privete poteniala deviere de la condiiile normale, care nu necesit aciuni
corective, dar care necesit investigaii de urmrire.
Returnare
napoierea la productor sau distribuitor a unui produs medicamentos, care poate prezenta sau nu un defect de
calitate.
Distilare
Procesul de fierbere a unui lichid i condensare a vaporilor, care, n momentul rcirii, formeaz distilatul. Distilarea
se utilizeaz n scopul purificrii lichidelor sau pentru separarea amestecurilor lichide.
Deionizare
Deionizarea, care este n general n strns relaie cu purificarea apei, reprezint un proces prin care ionii dintr-un
compus sunt nlocuiti de ali ioni, cu aceeai ncarcatura, dar din alt compus.
Aseptic
Mijloc de procesare lipsit de microorganisme, dar care deseori este utilizat greit ca sinonim pentru "steril", datorit
ideii de "absen a micro-irganismelor viabile".
Procesare aseptic
Divizarea n recipiente sterile, prin introducerea n acestea a produselor sterile i prin etanarea cu dopuri sterile.
Acest proces este folosit pentru produsele ce nu pot fi supuse sterilizrii finale.
Tehnica aseptic
Ansamblu de operaii care asigur crearea unui mediu microbiologic specific i curat, prevenindu-se orice contaminare
microbian exterioar.
Control interfazic
Controlul efectuat n cursul fabricaiei unui produs medicamentos n vederea supravegherii i, dac este necesar, a
modificrii procesului, pentru a se asigura c produsul este conform specificaiilor sale. Controlul mediului
nconjurtor sau echipamentului poate fi considerat de asemenea un element al controlului interfazic.
Autoclav
Echipament n care se sterilizeaz articole cu aburi sub presiune.
Echipament de protecie
Echipament special, conceput n scopul protejrii produsului de contaminarea datorat personalului, dar si pentru
protectia personalului.
Sistem computerizat
Un sistem care include introducerea de date, prelucrarea electronic i furnizarea informaiei destinat a fi utilizat
fie pentru raportare, fie pentru control automat.
Dezinfectant
Un agent chimic folosit pentru dezinfecie, care este capabil s distrug formele vegetative ale bacteriilor, fungilor
i virusurilor ce produc mbolnaviri, dar nu i a sporilor bacterieni. Se folosete pe obiecte fr via.
Sporicid
Un agent chimic folosit pentru dezinfecie, care este capabil s distrug si sporii.
Ap potabil
Ap de but, dar care nu este adecvat n fabricaia produselor sterile.
Ap purificat
Apa care a fost tratat prin distilare, filtrare, schimb ionic, osmoz invers sau orice alt tratament adecvat n aa fel
nct s nu conin nici o substan adugat i s fie pe ct posibil lipsit de orice form de contaminare.
Ap pentru produse injectabile (Water For Injection - WFI)
Definete un anumit tip de calitate a apei cu grad ridicat de puritate chimic si microbiologic.

2. CERINE GMP PENTRU CONTROLUL CALITII

3
1 Controlul calitii presupune prelevarea probelor, redactarea specificaiilor i testarea, precum i organizarea,
documentaia i procedurile de eliberare care confirm c testele necesare i relevante sunt efectuate i c
materialele nu se elibereaz pentru folosire n fabricaie, nici produsele nu sunt eliberate pentru vnzare sau
distribuie pn cnd calitatea lor nu a fost declarat corespunztoare.
2 Controlul calitii nu se limiteaz la activitile de laborator, ci trebuie s participe la toate deciziile care pot
interesa calitatea produselor. Independena controlului calitii n raport cu producia este un element fundamental
pentru buna sa funcionare.

Generaliti
3 Fiecare posesor al unei autorizaii de fabricaie trebuie s aib un departament de controlul calitii. Acest
departament trebuie s fie independent de celelalte departamente i s fie condus de o persoan cu calificare i
experien corespunztoare, care are la dispoziia sa unul sau mai multe laboratoare de control. Departamentul de
controlul calitii trebuie s dispun de resurse suficiente pentru a asigura c cerinele sunt realizate efectiv i
corect.
4 Departamentul de controlul calitii n ansamblul su are i alte atribuii, cum ar fi stabilirea, validarea i
implementarea tuturor procedurilor de control al calitii, pstrarea probelor de referin ale materialelor i
produselor, etichetarea corect a recipientelor cu materiale i produse, monitorizarea stabilitii produselor,
participarea la investigarea reclamaiilor legate de calitatea produselor etc. Toate aceste operaii trebuie efectuate n
conformitate cu proceduri scrise i, unde este cazul, nregistrate.
5 Evaluarea produselor finite trebuie s ia n considerare toi factorii relevani, incluznd condiiile de fabricaie,
rezultatele controalelor n proces, verificarea documentelor de fabricaie (inclusiv de ambalare), conformitatea cu
specificaia produsului finit i examinarea ambalajului final.
6 Principalele cerinte pentru control Calitatii:
- existena echipamentelor i personalului adecvat pentru efectuarea controlului
- prelevarea conform procedurilor aprobate a probelor de materii prime, ambalajelor, produselor
intermediare, vrac, finite
- inregistrari de laborator pentru toate activitatile desfasurate
- pastrarea inregistrarilor
- validarea metodelor de analiz utilizate pentru analiza probelor
- investigarea rezultatelor in afara specificatiilor (necorespunzatoare)
- pstrarea contraprobelor

Specificaii
Trebuie s existe specificaii aprobate corespunztor i datate pentru materii prime, materiale de ambalare i
produse finite.

Specificaii pentru materii prime i materiale de ambalare

Specificaiile pentru materii prime i materiale de ambalare primar sau imprimate trebuie s conin sau,
dac este cazul, s fac referire la:
- descrierea materialelor, inclusive numele folosit n unitatea de fabricaie i numrul de cod intern de referin;
- referina la o monografie din Farmacopee, dac este cazul;
- numele furnizorului aprobat i, dac este posibil, al fabricantului original al materialului;
- o mostr din materialele de ambalare imprimate;
- instruciuni de prelevare i testare;
- caracteristici calitative i cantitative, cu limite de admisibilitate;
- condiii de depozitare i precauii;
- perioada maxim de depozitare naintea reexaminrii.

Specificaii pentru produse intermediare i vrac

4
 Specificaiile pentru produsele intermediare i pentru produsele vrac trebuie s fie disponibile pentru etapele
critice sau atunci cnd acestea sunt cumprate sau livrate. Aceste specificaii trebuie s fie similare cu cele ale
materiilor prime sau ale produselor finite, dup caz.

Specificaii pentru produse finite

Specificaiile pentru produsele finite trebuie s conin sau s fac referire la:
- numele folosit n unitatea de fabricaie i, dac este cazul, numrul de referin (codul);
- formula;
- descrierea formei farmaceutice i precizarea detaliilor privind ambalarea;
- instruciuni de prelevare i testare;
- caracteristici calitative i cantitative, cu limite de admisibilitate;
- condiii de depozitare i precauii speciale de manipulare, dac este cazul;
- perioada de valabilitate.

Recepia
Trebuie s existe proceduri scrise i nregistrri privind recepia fiecrei livrri de materie prim (inclusiv produs
vrac, intermediar sau finit), materiale de ambalare primar, secundar sau imprimate. nregistrrile de recepie
trebuie s conin:
- numele materialului nscris pe nota de livrare i pe recipiente
- numele dat materialului n unitatea de fabricaie (dac este diferit de cel prevzut la punctul a) i/sau codul
su;
- data recepiei
- numele furnizorului i numele fabricantului
- numrul seriei alocat de fabricantul materiei prime sau numrul de referin
- cantitatea total i numrul de recipiente primite
- numrul de serie atribuit produsului dup recepia sa
- orice comentariu relevant.
Etichetarea intern, carantina, depozitarea materiilor prime, materialelor de ambalare i altor materiale, dup
caz, trebuie s fac obiectul procedurilor scrise.

Prelevarea (preluarea probelor)

Trebuie s existe proceduri scrise pentru prelevare, care s includ:
- metoda de prelevare
7 - echipamentul utilizat
8 - cantitatea de prob prelevat
9 - instruciuni cu privire la subdivizarea probelor, dac este necesar
10 - tipul i statutul recipientului de prelevare utilizat
11 - identificarea recipientelor din care s-au prelevat probe
12 - oricare precauii speciale care trebuie respectate, mai ales cele cu privire la prelevarea materialelor sterile
13 sau periculoase
14 - condiiile de depozitare
15 - instruciuni pentru curarea i depozitarea echipamentului pentru prelevare.

Prelevarea probelor de materii prime, material3 de ambalare, produse finite

Prelevarea este o operaie important prin care numai o mic parte dintr-o serie este luat. Concluzii valide
privind ntreaga serie nu se pot baza pe teste care au fost efectuate pe probe nereprezentative. Prelevarea corect
este astfel o parte esenial a sistemului de asigurare a calitii.

Personalul care preleveaz probe trebuie s fie instruit iniial i periodic de continuitate n disciplinele
relevante pentru prelevarea corect. Aceast instruire trebuie s includ:

5
 - planuri de prelevare
- proceduri scrise de prelevare
- tehnicile i echipamentele de prelevare
- riscurile contaminrii ncruciate
- precauiile care trebuie luate n legtur cu substanele instabile i/sau sterile
- importana lurii n considerare a aspectului materialelor, recipientelor i etichetelor
- importana nregistrrii oricror evenimente neprevzute sau neobinuite.

16 Calitatea unei serii de materii prime poate fi evaluat prin prelevarea i testarea unei probe reprezentative.
Numrul probelor prelevate pentru obinerea unei probe reprezentative trebuie determinat statistic i specificat ntr-
un plan de prelevare. Numrul probelor individuale care pot fi amestecate pentru a forma o prob medie trebuie s
fie definit de asemenea, innd seama de natura materialului, de cunoaterea furnizorului i de omogenitatea probei
medii.
17 Planul de prelevare a materialelor de ambalare trebuie s in seama cel puin de urmtoarele elemente:
cantitatea primit, calitatea necesar, tipul materialului (de exemplu: materiale de ambalare primar i/sau materiale
de ambalare imprimate), metodele de fabricaie i ceea ce se cunoate despre sistemul de asigurarea calitii al
fabricantului materialelor de ambalare, pe baza auditurilor. Numrul de probe prelevate trebuie s fie determinat
statistic i specificat ntr-un plan de prelevare.
18 Planul de prelevare a roduselor finite trebuie sa tina cont de tipul produsului, marimea seriei,etc.

Prelevarea probelor de monitorizare a conditiilor de mediu si a utilitatilor

Se realizeaza de catre personal instruit, conform unor Programe de monitorizare.Fiecare program trebuie sa
cuprinda:
- locatiile de prelevare
- frecventa de prelevare
- personalul care efectueaza prelevarea
- laboratoarele care analizeaza probele
- tipul de analize efectuate
- limitele de admisibilitate (limite de alerta si actiune)
- modul de raportare a rezultatelor analizelor
- investigarea deviatiilor / a rezultatelor neconforme (OOS Out Of Specification)

Probe de referinta si contraprobe

Ghidul BPF pentru medicamente ofer ndrumri privind luarea i pstrarea probelor de referin de materii
prime, materiale de ambalare sau produse finite i de contraprobe de produs finit.
Probele se pot ncadra astfel n 2 categorii:
19 Prob de referin: o prob dintr-o serie de materie prim, material de ambalare sau produs finit, care este
pstrat cu scopul de a fi analizat n cazul n care aceast necesitate apare n timpul perioadei de valabilitate a
seriei respective. n cazul n care stabilitatea permite, trebuie pstrate probe de referin din etapele intermediare
critice (de ex. cele care necesit testare analitic i eliberare) sau din produsul intermediar care este transportat n
exterior, ieind de sub controlul fabricantului.
20 Contraprob: o prob constnd ntr-o unitate complet ambalat dintr-o serie de produs finit. Este pstrat n
scopuri de identificare. De exemplu, modul de prezentare, ambalare, etichetare, prospectul cu informaii pentru
pacient, numrul seriei, data de expirare dac aceast necesitate apare n perioada de valabilitate a seriei respective.
Pot exista circumstane excepionale, cnd aceast cerin poate fi ndeplinit fr pstrarea de probe duble, de
exemplu atunci cnd cantiti mici dintr-o serie sunt ambalate pentru piee diferite sau cnd se fabric medicamente
foarte scumpe.
21 Pentru produsele finite, n multe cazuri probele de referin i contraprobele vor fi prezentate n mod identic
cu unitatea ambalat complet. n asemenea situaii, probele de referin i contraprobele pot fi considerate a fi
interschimbabile.

6
 Probele de referin i/sau contraprobele servesc ca nregistrare a seriei de produs finit sau materie prim i
pot fi evaluate n cazul, de exemplu, al unei reclamaii privind calitatea unei forme dozate, al unei probleme
referitoare la conformitatea cu autorizaia de punere pe pia, al unei probleme privind etichetarea/ambalarea sau al
unui raport de farmacovigilen. nregistrri privind trasabilitatea probelor trebuie pstrate i puse la dispoziia
autoritii competente pentru verificare.

Probele de referin i contraprobele din fiecare serie de produs finit trebuie pstrate cel puin un an dup data
de expirare. Proba de referin trebuie pstrat n ambalajul su primar sau n ambalaj compus din acelai material
ca recipientul primar n care produsul este pus pe pia.

Probele de materii prime (altele dect solvenii, gazele sau apa folosit n procesul de fabricaie) trebuie
pstrate cel puin doi ani dup data de eliberare a produsului. Aceast perioad poate fi scurtat dac perioada de
stabilitate a materialului, aa cum este indicat n specificaia relevant, este mai scurt. Materialele de ambalare
trebuie pstrate pe perioada de valabilitate a produsului finit respectiv.

Probele de referin trebuie s fie n cantitate suficient pentru a permite efectuarea, n cel puin dou ocazii, a
controalelor analitice complete ale seriei, n conformitate cu dosarul de autorizare de punere pe pia care a fost
evaluat i aprobat de ctre autoritatea/autoritile competente relevante. n cazul n care acest lucru este necesar,
trebuie folosite ambalaje nedeschise atunci cnd se efectueaz fiecare set de controale analitice. Orice excepie
propus de la aceasta trebuie justificat i agreat de autoritatea competent relevant. Dac este cazul, trebuie
urmate cerinele naionale referitoare la mrimea probelor de referin i dac este necesar, a contraprobelor.
22
Probele de referin trebuie s fie reprezentative pentru seria de materie prim, produs intermediar sau produs
finit din care sunt luate. Alte probe pot fi luate, de asemenea, pentru a monitoriza cea mai dificil parte a unui
proces (de ex. nceputul sau sfritul unui proces). n cazul n care o serie este ambalat n dou sau mai multe
operaii de ambalare distincte, cel puin o contraprob trebuie luat din fiecare operaie de ambalare individual.
Orice excepie propus de la aceasta trebuie justificat i agreat de autoritatea competent relevant.

Trebuie s se asigure c toate materialele i echipamentele analitice necesare sunt nc disponibile, sau pot fi uor
obinute, pentru a efectua toate testele din specificaie un an dup data de expirare a ultimei serii fabricate.

Depozitarea probelor de referin ale produselor finite i ale substanelor active trebuie fcut n acord cu
Ghidul privind Declararea condiiilor de depozitare a medicamentelor i substanelor active. Condiiile de
depozitare trebuie s fie n acord cu autorizaia de punere pe pia (de ex. depozitare n frigider cnd este relevant).

Testarea
Trebuie s existe proceduri scrise pentru testarea materialelor i produselor n diferite etape de fabricaie,
detaliindu-se metodele i echipamentele folosite. Testele efectuate conform specificatiilor de calitate /
farmacopeeleor in vigoare trebuie s fie nregistrate. Metodele analitice utilizate trebuie sa fie validate.
Inregistrarile trebuie pastrate 5 ani sau minim 1 an dupa expirarea seriei.

Analiza calitii produsului

Trebuie s se efectueze, periodic, analiza calitii tuturor produselor autorizate, inclusiv a produselor destinate
numai exportului, n scopul verificrii consistenei procesului existent, corectitudinii specificaiilor curente, att
pentru materiile prime ct i pentru produsul finit, pentru a sesiza orice tendin i pentru a identifica modalitile
de mbuntire a produsului i procesului. Astfel de analize trebuie, n mod obinuit, s fie efectuate i
documentate anual, innd cont de evalurile anterioare i trebuie s includ cel puin:
- o evaluare a materiilor prime i materialelor de ambalare folosite n fabricaia produsului, n special n
cazul celor care provin din surse noi
- o evaluare a rezultatelor controalelor critice, n proces i ale produsului finit;
7
 - o evaluare a tuturor seriilor care nu s-au ncadrat n limitele specificaiei i a investigrii lor
- o evaluare a tuturor deviaiilor sau neconformitilor semnificative, a investigrii lor i a eficacitii
rezultatelor aciunilor corective i preventive ntreprinse
- o evaluare a tuturor schimbrilor survenite n procese sau n metodele analitice
- o evaluare a variaiilor la autorizaia de punere pe pia propuse/aprobate/refuzate, inclusiv a celor din
dosarele pentru ri tere (numai pentru export)
- o evaluare a rezultatelor programului de monitorizare a stabilitii i a oricror tendine negative
- o evaluare a tuturor produselor returnate, retrase i a reclamaiilor datorate neconformitilor de calitate,
precum i a investigaiilor efectuate la momentul respective
- o evaluare a justeii oricrei aciuni corective ntreprinse privind procesul sau echipamentele folosite
pentru produsul anterior
- o evaluare a angajamentelor post-autorizare, n cazul noilor autorizaii de punere pe pia i variaii
- statutul calificrilor echipamentelor i utilitilor relevante, de ex. nclzire, ventilaie, aer condiionat
(HVAC), ap, gaze comprimate, etc.
- o evaluare a contractelor/acordurilor tehnice, pentru a garanta c acestea sunt actualizate.

3. PERSONALUL
Instruirea
Fiecare persoan din cadrul laboratorului trebuie s aib studiile specifice, instruirea i experiena necesar
pentru ndeplinirea sarcinilor conform fiei postului.
Pentru desfurarea activitilor de testare microbiologic, personalul trebuie s aib studii specializate de
microbiologie sau de tiine biologice ct mai apropiate de microbiologie. Trebuie s li se atribuie responsabiliti n
funcie de nivelul de pregtire i experien. Analitii nu trebuie s efectueze n mod independent un test
microbiologic pn cnd nu sunt calificai pentru aceast activitate.
Instruirea personalului este esenial, mai ales din punct de vedere a nelegerii motivelor pentru care trebuie
realizat o anumit activitate, ntr-un anumit mod. Instruirea trebuie s se realizeze conform unui Program de
instruire care trebuie stabilit pentru fiecare angajat din cadrul laboratorului n funcie de postul specific ocupat.
Instruirea se face la angajare i apoi periodic, de ctre persoane calificate in acest sens. Periodic se realizeaz
evaluarea cunotinelor. Aceast evaluare trebuie s evidenieze competena n activitile din cadrul laboratorului
de microbiologie, n funcie de specificul postului ocupat de microbiolog.In cazul n care persoana evaluat nu
obine un calificativ mulumitor, se va realiza reinstruire.
Microbiologii care dein responsabiliti de supraveghere sau de conducere trebuie s aib studiile adecvate i
instruirea intern n abiliti de supraveghere, siguran de laborator, programare, investigaii de laborator,
elaborarea rapoartelor tehnice, a SOP-uri relevante i alte aspecte eseniale legate de procesele efectuate n cadrul
companiei i care fac parte din responsabilitile organizatorice ale unui ef de laborator.

Utilizarea echipamentelor de protecie

Utilizarea echipamentelor individuale de protecie se realizeaz :
- pentru protecia operatorilor impotriva agenilor biologici (microorganisme), agentilor chimici (substane
chimice), ageni fizici (curent electric, temperaturi joase sau nalte, etc), mecanici, etc
- pentru prevenirea contaminrii camerelor curate i a produselor de ctre personal

Personalul contribuie cu 80% la contaminarea din camerele curate, datorit exfolierii pielii, a
microorganismelor aflate pe pielea exfoliat i a altor microorganisme pe care le introduce. Standarele ridicate de
igien personal reprezint o parte intrinsec a tuturor normelor GMP i, pentru persoanele ce lucreaz n condiii
de sterilitate i asepsie, acestea trebuie respectate cu mai mult strictee. Aceasta nseamna standarde ridicate de
curenie personal corporal:
- ndepartarea produselor cosmetice i a bijuteriilor (care produc roaderea pielii i ascund contaminani, inelele pot
rupe mnuile)
8
- o atenie deosebit la splarea prului
- curenia minilor, ochilor i urechilor

Indiferent de ct de ateni suntem n aceste privine, corpul uman tot introduce contaminarea n mediu i
personalul care lucreaz n camerele curate trebuie s poarte echipament de protecie special pentru camerele
curate. Acestea sunt realizate din materiale speciale, cu textura firelor foarte deas i cu un nivel redus de formare
de particule, reprezentnd o barier ntre persoan i mediu; dac personaul este echipat corespunztor, riscul de
contaminare este redus la minim. n acelai timp, personalul trebuie s efectueze doar micri lente i controlate. Se
vor evita n permanen micrile brute sau rapide pentru a un provoca turbulene ale aerului carea ar putea antrena
contaminanii. Atingerea unui obiect se va face doar dac este necesar.

Trebuie evitat contactul direct ntre minile operatorilor i produsul expus,ct i cu orice parte a echipamentului
care vine n contact direct cu produsul.

Orice persoan care intr n zonele de fabricaie trebuie s poarte mbrcminte de protecie adecvat operaiilor pe
care le efectueaz.

Clas D:
- capion sau capelin ( prul s fie complet acoperit)
- halat cu mneci lungi
- nclminte special pentru camera respectiv
- mnui fixate peste mnecele halatului
- masc (trebuie fixat bine pe fa, s acopere faa pn la ochi)
Clas C
- capion care acoper prul complet
- costum de protecie dintr-o bucat sau din 2 piese (tunic i pantaloni), cu mneci lungi, strnse, cu guler nalt
- nclminte special pentru camera respectiv
- mnui fixate peste mnecele halatului
- masc (trebuie fixat bine pe fa, s acopere faa pn la ochi)
Clas B/A
- capion care acoper complet prul, partea de jos a capionului va fi introdus n gulerul salopetei
- ochelari de protectie
- salopet
- masc fixat pe fa
- mnui care acoper mnecile salopetei
- nclminte
Indiferent de clas de curenie, echipamentul ales nu trebuie s elibereze scame sau particule organice.
La nceputul sesiunii de lucru se mbrac un echipament curat i pregtit corespunztor.
Dac se utilizeaz acelai echipament, trebuie s se demonstreze meninerea calitii microbiologice.
Este recomandat testarea inial i periodic a integritii echipamentului pentru stabilirea valabilitii acestuia n
condiii de exploatare normal ( utilizare splare - sterilizare).
Contaminarea poate fi prevenit prin meninerea integritii echipamentului, sterilizrii i meninerii n stare steril
pn la utilizare.
Echipamentele de protecie reutilizate se vor spla i steriliza n instalaii separate, de preferat. Se vor trata astfel
nct s nu se deteriorizeze, s lase scame.

Starea de sntate
Trebuie s fie stabilite programe detaliate de igien, care s fie adaptate diferitelor cerine din unitatea de
fabricaie / laborator. Ele trebuie s includ proceduri referitoare la starea de sntate, practicile de igien i de
mbrcminte a personalului. Aceste proceduri trebuie s fie nelese i respectate strict de ctre fiecare persoan ale
9
crei ndatoriri sunt legate de zonele de producie i de control. Programele de igien trebuie s fie susinute de
ctre conducerea unitii de producie i discutate pe larg n timpul instruirilor.

Este obligatorie examinarea medical a personalului la angajare. Dup prima examinare trebuie efectuate
examinri ulterioare n vederea protejrii produciei i sntii personalului. Frecventa si tipul evaluarilor efectuate
variaza in functie de:
- zona in care personalul isi desfasoara activitatea
- activitatea desfasurata
Trebuie luate toate msurile practice posibile care s asigure c n fabricarea medicamentelor nu este angajat nici o
persoan afectat de o boala infecioas sau avnd leziuni deschise pe suprafaa expus a corpului.

Este interzisa activitatea operatorilor cu afectiuni respiratorii (ex. raceli), boli infectioase, boli ale pielii (eczeme),
taieturi, intepaturi, etc.
Trebuie evitat contactul direct ntre minile operatorilor i produsul expus, ct i cu orice parte a echipamentului
care vine n contact direct cu produsul.

4. APARATE SI ECHIPAMENTE
Aparatura i echipamentele necesare laboratoarelor de microbiologie:
- hote cu flux de aer laminar
- etuve
- autoclave
- incubatoare
- frigidere
- ph - metre
- balane
- centrifuge
- turbidimetre
- agitatoare
- bai de apa
- pipete mecanice / electronice
- numaratoare de colonii
- echipamente pentru efectuarea anumitori analize, etc
Aparatele si echipamentele din cadrul laboratorului de microbiologie trebuie sa fie corespunzatoare. Ele trebuie
astfel instalate nct s se evite orice risc de eroare sau contaminare.
Pentru toate echipamentele trebuie s existe ntr-un caiet de eviden care s menioneze, dup caz, toate validrile,
calibrrile, operaiunile de ntreinere, de curire sau de reparare, cu datele i numele persoanelor care au efectuat
aceste operaii.

Aparatura de control, cntrire, msurare, monitorizare i testare, care este critic pentru asigurarea calitii trebuie
s fie calibrat n acord cu proceduri scrise i dup un program stabilit. Trebuie precizat domeniul i precizia
adecvat operaiilor de producie i control.
Calibrrile echipamentului trebuie s fie realizate folosind standarde trasabile. nregistrrile acestor controale
trebuie s fie pstrate.Instrumentele care nu ndeplinesc criteriile de calibrare nu trebuie folosite.

Trebuie s existe proceduri de utilizare clare pentru cele mai importante echipamente de fabricaie i testare.
Pentru curarea echipamentelor trebuie stabilite proceduri scrise. Echipamentele i ustensilele trebuie s fie
curate, pstrate i, cnd e cazul, sanitizate sau sterilizate pentru a preveni contaminarea sau remanena unui
material care s altereze calitatea produsului sau analizei efectuate cu acel echipament.

10
nregistrrile utilizrii, curirii, sanitizrii sau sterilizrii echipamentelor trebuie nregistrate (data, ora, produs, nr.
articole, persoanele care au efectuat operaiile respective)

5. UTILITI
Toate utilitile care ar putea afecta lucrrile de laborator, rezultatele analizelor, calitatea produselor ( ex. ap, abur,
aer comprimat,ventilaie, sistem HVAC), trebuie s fie calificate i monitorizate corespunztor, conform unui
Program de monitorizare aprobat prin care sunt stabilite:
- locul de prelevare a probelor
- frecventa de prelevare
- persoana care preleveaza probele
- analizele efectuate
- criteriile de admisibilitate, limitele de alerta si limitele de actiune
- modul de interpretare statistica a rezultatelor
- modul de investigare a rezultatelor neconforme
- masuri care trebuie luate in cazul depasirii limitelor de alerta / actiune
nregistrrile rezultatelor monitorizrii trebuie pstrate.

Sistemul HVAC (Heating, Ventilation, and Air Conditioning)

Sistemele HVAC asigura mentinerea conditiilor/parametrilor de camera curata.
Ce trebuie sa satisfac un sistem HVAC?
- Calitatea produsului, protecia produsului prin:
- prevenirea contaminrii microbiene
- prevenirea contaminrii ncruciate
- depozitarea la temperatur i umiditate corespunztoare
- Protecia personalului participant la producie, analize,etc, prin:
- prevenirea contactului cu particule praf sau altele
- prevenirea contactului direct cu vapori, fum, aerosoli nocivi
- creare condiii confort
- Protecia mediului inconjurtor prin:
- evitarea eliberrii n atmosfer, n ape a particulelor de praf, vaporilor, aerosoli nocivi, adiferitilor
efluenti

Ventilaia adecvat, sistemele de aer filtrat i exhaustat trebuie s fie astfel proiectate i construite nct s
minimizeze riscul contaminrii ncruciate i s includ echipamente de control al presiunii, temperaturii, umiditii
i microorganismelor.

n camere curate critice nu se practic recircularea aerului.

n camerele controlate, dac aerul este recirculat trebuie msurat corespunztor pentru a controla riscul
contaminrii ncruciate.

Parametrii camerelor curate sunt monitorizati cu o frecventa prevazuta in Programul de monitorizare:

- temperatura
- umiditate
- presiunea diferentiala
- numar total de particule
- numar de particule viabile (contaminare microbiana) din aer, de pe suprafete, de la personal (amprenta
manusa si echipament individual de protectie).

Apa

11
Se utilizeaz:
- ap potabil consumul operatorilor, curatirea materialelor, echipamentelor, spatiilor din zone
neclasificate, etc
- demineralizat - in baile de apa, curatirea materialelor, echipamentelor, spatiilor din zone
neclasificate, etc
- purificat prepararea mediilor de cultura, clatirea finala a materialelor si striclariei de laborator,
curatirea camerelor curate clasa C si D
- ap pentru injecii - curatirea camerelor curate clasa A si B si a echipamentelor din aceste zone

Procesul de obinere a diferitelor categorii de apa trebuie s fie validat i monitorizat cu limite de aciune i alert
corespunztoare.
nregistrrile rezultatelor monitorizrii trebuie pstrate.
Conductele i robinetele fixe trebuie s fie clar etichetate indicndu-se coninutul lor i, unde este cazul, sensul de
curgere.
Conductele de ap trebuie s fie dezinfectate conform unor proceduri scrise care menioneaz limitele de
admisibilitate ale parametrilor de calitate i msurile care trebuie luate n cazul unor rezultate n afara specificaiei.

Aburul
Este utilizat pentru sterilizarea echipamentelor de protecie, aparaturii utilizate pentru analize, a mediilor de cultur.
Caliatea aburului trebuie monitorizata adecvat.

6. DOCUMENTAIA
Principiu
Documentaia corect constituie o parte esenial a sistemului de Asigurare a Calitii i este cheia
funcionrii n acord cu cerinele bunei practici de fabricaie. Toate tipurile de documente precum i mediile
utilizate trebuie definite de fabricant n sistemul su de management al calitii.
Documentaia poate exista ntr-o varietate de forme, incluznd documentaie pe hrtie, electronic sau pe
medii fotografice. Principalul obiectiv al sistemului de documentaie utilizat trebuie s fie stabilirea, controlul,
monitorizarea i nregistrarea tuturor activitilor care, n mod direct sau indirect, pot avea impact asupra tuturor
aspectelor privind calitatea medicamentelor
Documentaia trebuie s fie scris clar pentru a evita erorile inerente comunicrilor verbale i trebuie s
permit refacerea istoricului seriei. Specificaiile, formulele de fabricaie i instruciunile, procedurile i
nregistrrile trebuie s nu conin erori i s fie disponibile n scris. Documentele trebuie s fie scrise cite.
Documentele coninnd instruciuni trebuie s fie prezentate ntr-un mod ordonat i trebuie s fie uor de
verificat. Stilul i limbajul folosit n documente trebuie s fie adecvat utilizrii sale. Documentele reproduse trebuie
s fie clare i uor de citit. Reproducerea documentelor de lucru din documentele standard nu trebuie s permit
nicio eroare.
Documentele trebuie s fie aprobate, semnate i datate de persoane competente i autorizate. Trebuie
reevizuite periodic
Documentele nu trebuie s fie scrise de mn; totui, cnd un document necesit intrri de date, acestea pot fi
scrise de mn, dar clar, cite i de neters. Spaiul rezervat acestor date trebuie s fie suficient.

Cnd se fac nregistrri, acestea trebuie s se fac definitiv, n spaiile rezervate acestor nregistrri, imediat
dup efectuarea activitilor i trebuie ca persoana care face nregistrarea s se identifice. Corectrile nregistrrilor
trebuie datate, semnate i s permit citirea nregistrrii originale.

Orice corectur adus unui document trebuie s fie semnat i datat, corectura permind citirea informaiei
originale. Dac este cazul, trebuie s fie nregistrat motivul corecturii.

12
Documentaia de laborator cuprinde :
- specificaii;
- planul master de validare
- proceduri de prelevare a probelor;
- proceduri de testare i nregistrri (incluznd documente de lucru utilizate n timpul testrilor lor i/sau caiete de
laborator);
- rapoarte analitice i/sau certificate;
- date cu privire la supravegherea mediului, atunci cnd acestea sunt necesare;
- nregistrrile validrilor metodelor de testare, dac este cazul;
- proceduri i nregistrri cu privire la calibrarea instrumentelor i ntreinerea echipamentelor.

Specificaiile descriu n detaliu cerinele pe care trebuie s le ndeplineasc un produs. Ele servesc ca baz pentru
evaluarea calitii.

Procedurile standard de operare (SOP) prevd indicaiile necesare pentru realizarea diferitelor operaii : curarea,
mbrcarea, controlul mediului nconjurtor, prelevarea i testarea probelor, utilizarea echipamentului, etc.

Instruciunile de lucru prevd indicaiile necesare pentru operarea unui aparat / echipament, curirea, msurile de
sntate i securitate n munc, msurile de prevenire i stingere a incendiilor, msurile de protecia mediului,
nregistrrile i responsabilitile personalului implicat

nregistrri/rapoarte
nregistrrile furnizeaz dovezi ale diferitelor aciuni efectuate pentru a demonstra conformitatea cu
instruciunile, de ex. activiti, evenimente, investigaii i, n cazul seriilor fabricate, istoricul fiecrei serii de
produs, incluznd i distribuia acesteia. nregistrrile includ datele primare care au stat la baza generrii altor
nregistrri. Trebuie definite ca date primare cel puin toate datele pe care se bazeaz luarea unor decizii privind
calitatea.
Certificatele de analiz furnizeaz un rezumat al rezultatelor testrii probelor de produse sau materiale1
mpreun cu evaluarea conformitii cu o anumit specificaie.
Rapoartele documenteaz modul de efectuare al anumitor exerciii, proiecte sau investigaii, mpreun cu rezultate,
concluzii i recomandri.

Orice document al C.C. cu privire la o serie trebuie s fie pstrat un an dup data de expirare a seriei i cel
puin 5 ani dup certificarea la care se face referire n reglementrile naionale.
Se recomand pstrarea anumitor date (ca rezultatele testelor analitice, randamente, datele controalelor mediului,
etc.) n aa fel nct s fie posibil studiul evoluiei lor n timp.
n plus fa de informaia care face parte din nregistrarea seriei, trebuie s fie pstrate i alte date originale,
precum sunt caietele de laborator i/sau nregistrrile, care s poat fi gsite rapid.
Rezultatele obinute trebuie s fie nregistrate i verificate pentru a fi asigurat coerena lor. Toate calculele trebuie
verificate cu atenie.

nregistrri ale probelor analizate

Trebuie nregistrat metoda de analiz
Date despre mrimea probei analizate, referine utilizate (cantitate, lot referin), reactivi, soluii standard.

Testele efectuate trebuie s fie nregistrate i nregistrrile trebuie s includ cel puin urmtoarele:
- numele produsului i, dac este cazul, forma farmaceutic;
- numrul seriei i unde este cazul, numele fabricantului i/sau al furnizorului;
- datele despre specificaiile corespunztoare i despre procedurile de testare;
- rezultatele testelor, incluznd observaiile i calculele, ct i referiri la orice documente de testare;
- date de testare;
13
 - identitatea persoanelor care au efectuat testarea;
- identitatea persoanelor care au verificat testarea i calculele, dac este cazul;
- decizia clar de acceptare sau respingere (sau orice alt decizie asupra statutului produsului) i semntura datat
a persoanei responsabile desemnate.

Se adaug acolo unde este cazul grafice, spectre, etc, calculele care s-au efectuat pe parcursul analizei
unitile de msur utilizate, conversia lor dac este cazul, factori echivaleni.

nregistrri reactivi, materiale, medii de cultur, soluii, referine

Trebuie acordat o atenie deosebit calitii reactivilor, sticlriei gradate i soluiilor titrate, etaloanelor i
mediilor de cultur. Prepararea lor trebuie fcut n concordan cu proceduri scrise.

Reactivii de laborator de folosin ndelungat trebuie s fie inscripionai cu data de preparare i semntura
persoanei care i-a preparat. Pentru reactivii instabili i mediile de cultur trebuie s fie indicat pe etichet data de
expirare, mpreun cu condiiile speciale de pstrare. n plus, pentru soluiile titrate, trebuie indicat factorul i data
stabilirii lui.

Atunci cnd este necesar, trebuie s se indice pe flacon data primirii oricrei substane folosite pentru
operaiile de testare (exemplu reactivi i substane de referin). Trebuie s fie respectate instruciunile de utilizare
i conservare. n anumite cazuri, poate fi necesar efectuarea unei identificri i alte controale ale reactivilor la
primire sau nainte de utilizarea lor.
nregistrrile de laborator vor fi completate cu :
- Orice modificri aduse metodei stabilite
- Calibrrile periodice ale instrumentelor i aparatelor utilizate
- Investigarea rezultatele n afara specificaiilor

Metodele analitice microbiologice trebuie validate, cu excepia cazului cnd metoda folosit este inclus n
farmacopee sau n alt standard de referin recunoscut. Cu toate acestea trebuie s se verifice i s se demonstreze
dac toate metodele de testare utilizate sunt adecvate n condiiile actuale de utilizare.

Trebuie s se pstreze nregistrri complete ale oricror modificri aduse metodelor analitice validate.
Asemenea nregistrri trebuie s includ motivul modificrii i date corespunztoare pentru a verifica dac
modificrile conduc la rezultate la fel de corecte i demne de ncredere ca i metoda stabilit.

Controlul schimbrii (change control)

Trebuie s se stabileasc un sistem oficial de control al schimbrii pentru a evalua toate schimbrile care pot
afecta producia i controlul produselor
Trebuie s se asigure proceduri scrise pentru identificarea, documentarea, revizuirea corespunztoare i
aprobarea schimbrilor pentru materii prime, specificaii, metode analitice, faciliti, sisteme auxiliare, echipament
(inclusiv hardware-ul computerului), etape de proces, materiale de ambalare i etichetare i pentru software-ul
computerului.

Potenialul impact al schimbrii propuse asupra calitii produsului sau analizei efectuate trebuie s fie evaluat.

O procedur de clasificare poate fi util n determinarea nivelului de testare, validare i documentare necesare
pentru a justifica schimbrile ntr-un proces validat. Schimbrile pot fi clasificate (de ex. ca minore sau majore) n
funcie de natura i extinderea lor, i de efectele pe care aceste schimbri le pot avea asupra procesului. Printr-un
raionament tiinific trebuie s se determine ce studii de testare i validare suplimentare sunt adecvate pentru a
justifica o schimbare ntr-un proces validat.

14
 7. MASURI DE SECURITATE IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
In cadrul laboratorului de microbiologie se lucreaza cu microorganisme sau cu produse / parti ale acestora.
Lucrul intr-un astfel de laborator impune o serie de masuri de securitate pentru prevenirea riscului de contaminare
atat a culturilor de microorganisme cat si a operatorilor si a mediului inconjurator.

Din punct de vedere a riscului, microorganismele se impart in 4 grupe:

- grupa 1 - agenti biologici care nu sunt susceptibili sa provoace o boala la om;
- grupa 2 - agenti biologici care pot provoca o boala omului si constituie un pericol pentru lucratori;
propagarea lor in colectivitate este improbabila; exista, in general, o profilaxie sau un tratament eficace;
- grupa 3 - agenti biologici care pot provoca imbolnaviri grave la om si constituie un pericol serios pentru
lucratori; ei pot prezenta un risc de propagare in colectivitate, dar exista in general o profilaxie sau un tratament
eficace;
- grupa 4 - agenti biologici care pot provoca boli grave omului si constituie un pericol serios pentru lucratori; ei
pot sa prezinte un risc ridicat de propagare in colectivitate si nu exista in general o profilaxie sau un tratament
eficace

Microorganismele manipulate n laboratoarele noastre de microbiologie se situeaz n grupele de risc 1

(microorganismele cu riscul cel mai sczut asupra sntii personalului) i 2 (microorganisme care prezint riscuri
asupra sntii personalului din laborator dar care nu se pot transmite n afara acestuia) .
Toate culturile i probele microbiologice trebuie considerate patogene sau surse patogenice, mai ales dac
microorganismele respective se pot dezvolta la 37oC. Din acest motiv, laboratoarele, incubatoarele i frigiderele
utilizate n activiti microbiologice trebuie s fie inscriptionate cu mentiunea Risc biologic.

Desemnarea ariilor pentru efectuarea activitatilor din laborator

Amplasarea laboratorului de microbiologie trebuie s urmreasc cu atenie cerinele stabilite n normele de
bun practic microbiologic i de siguran n laborator. Este esenial s se limiteze contaminarea ncruciat a
culturilor microbiene ct mai mult posibil i la fel de important este ca probele microbiologice s fie manipulate
ntr-un mediu care s nu permit contaminarea.
n general, un laborator trebuie mprit n camere curate, camere destinate culturilor viabile i camere destinate
inregistrrilor pe parcursul activitii.
Zonele n care probele de mediu sau probele de produs steril sunt manipulate i incubate, trebuie meninute n
condiii de absen total de culturi viabile, dac acest lucru este posibil. Dac separarea complet a zonelor cu
culturi viabile de zonele curate nu poate fi realizat, atunci trebuie utilizate alte bariere/obstacole i practici aseptice
pentru reducerea posibilitii de contaminare accidental. Aceste bariere sunt: utilizarea echipamentelor de
protecie, a procedurilor de curire i de dezinfectare i incintelor de siguran biologic care sunt destinate doar
operaiunilor sterile sau aseptice.

n funcie de activitile efectuate, laboratoarele de microbiologie sunt mprite n mai multe zone:
- camere / zone curate de clasa A/B/C/D unde se efectueaza testele microbiologice
- camere controlate din punct de vedere a temperaturii unde se efectueaza incubarea probelor
- camere necontrolate unde se realizeaza primirea si pregatirea probelor, inregistrarile de laborator

Aceste zone se curata si se dezinfecteaz conform procedurilor aprobate.

Arhitectura camerelor curate

- finisrile construciilor sunt foarte importante.
- cldirile trebuie s fie durabile, s aib suprafee netede uor de curat, rezistente la agenii de curire i
decontaminare.
- pentru mbinri, etanri se utilizeaz silicon sau materiale siliconate.

15
 - in toate zonele trebuie s se asigure iluminare adecvat pentru a facilita curarea, ntreinerea i operaiile
propriu-zise.
- ferestrele sigilate att pe interior ct i n exterior.

Sticlaria, recipientele cu medii de cultura, reactivii, recipientele cu solutii dezinfectante, materialele se pastreaza in
zone dedicate functie de specificatiile de producatorului (frigider, camera termostat, pe rafturi / in dulapuri / mesele
de lucru din camerele laboratorului). Acestea se eticheteaza corespunzator.

Utilizarea tehnicii aseptice

Tehnica aseptic este un ansamblu de operaii care asigur crearea unui mediu microbiologic specific i curat, prevenindu-
se orice contaminare microbian exterioar. Regulile tehnicii aseptice sunt:
- recipientele, mediul de cultur, orice alte obiecte utilizate n manipularea microorganismelor trebuie s fie
sterile nainte de utilizare
- meninerea recipientului nchis, cu excepia timpului minim necesar pentru introducerea sau ndeprtarea
culturii
- lucrul la becul de gaz i flambarea gurii eprubetei/flacoanelor ori de cte ori se ndeprteaz dopurile, ceea ce
creaz o zon de protecie cu temperatur ridicat, n ambele sensuri, att spre interiorul recipientului ct i
spre exteriorul acestuia
- utilizarea tehnicilor de manipulare prin care se limiteaz orice posibilitate de contaminare ncruciat
(poriunea de lng deschiztura recipientului nu trebuie s vin n contact cu masa de lucru sau cu mna
operatorului)
- instrumentele de lucru care vin n contact cu mediul de cultur (ansele, vrfurile de pipete) trebuie s fie
sterile nainte de utilizare i s nu se contamineze cu alte microorganisme, prin contact accidental cu masa
de lucru, cu degetele sau cu partea exterioar a recipientului.
- lucrrile trebuie s se desfsoare la hota cu flux de aer laminar (orizontal sau vertical) n scopul prevenirii
contaminrii microbiene sau chimice
- minimalizarea contaminrii microbiene prin decontaminarea exterioar cu soluie alcoolic 70% steril, a
articolelelor introduse n zona aseptic
- reducerea numrului articolelor introduse n zona controlat, la strictul necesar
- plasarea articolelor cu distan ntre ele, pentru a minimaliza zonele de turbulen
- efectuarea manipulrilor spre exteriorul hotei
- accesul n camere curate clas A/B/C/D i la echipamente de clas A, se va face respectnd regulile:
- n camere curate i la echipamente de clas A, au acces numai persoane calificate, conform
procedurilor ntocmite pentru fiecare loc de munc
se utilizeaz echipamente de protecie individual sterile (clasA/B/C) / curate (clas D) iar
echiparea personalului se efectueaz conform procedurilor standard de operare
- la nceputul i la sfritul fiecrei etape de lucru se decontamineaz mnuile cu soluie alcoolic
70% (mn, fiecare deget, spaiul dintre degete, ncheietura minii)
- n cazul unei mprtieri accidentale, se cur i se decontamineau imediat suprafata, dup care se spal si se
decontamineaza minile
- nu se depoziteaz obiectele pe pardoseal pentru a evita pericolul de rsturnare i a limita mprtierea
accidental
- curatirea si dezinfectia spatiilor si a echipamentelor laboratorului se efectueaza conform programelor de
curatire si a procedurilor aprobate
- se sorteaz articolele depozitate, pe rafturi dedicate, etichetate

Limitarea mprtierii microorganismelor

Reguli de lucru, care s limiteze mprtierea microorganismelor sunt:

16
- limitarea accesului n laborator doar pentru persoanele autorizate, pentru a reduce numrul de persoane care vin n
contact cu microorganismele i ar putea s le rspndeasc
- accesul in laborator si in diferite zone ale acestuia se va face numai dupa echiparea corespunzatoare cu
echipament individual de protecie
- se va interzice depozitarea si consumul de alimente, bauturi si medicatie personala in spatiile laboratorului,
depozitarea obiectelor, a imbracamintei si incaltamintei personale se va face doar in vestiar
- echipamentul individual de protecie utilizat in camerele curate nu se utilizeaz n exteriorul acestor zone
- uile si geamurile din cadrul laboratorului trebuie s fie nchise
- aerul din camerele unde se manipuleaza microorganisme nu trebuie evacuat prin alte zone ale laboratorului
- in timpul/la finalul activitatilor se realizeaza curatirea si decontaminare echipamentelor si spatiilor.
- amestecarea soluiilor/suspensiilor prin micri circulare uoare, nu prin agitare energic, pentru a evita formarea
spumei si imprastierea picaturilor in exteriorul recipientelor
- evitarea mprocrii si picurarea pe masa de lucru, n timpul pipetrii
- interzicerea pipetrii cu gura
- recipientele utilizate la transferul mediilor lichide trebuie s fie n apropiere pentru a evita cderea picturilor
- ansele trecute prin flacr se utilizeaz numai dup ce s-au rcit, pentru a evita stropirea si distrugerea
microorganismelor manipulate
- recipientele utilizate la centrifugare nu trebuie suprancrcate pentru a evita curgerile
- recipientele ce conin culturi (flacoane, plci, eprubete) se transport i se depoziteaz ntotdeauna n stative sau n
alte ansambluri de susinere pentru evitarea picurrii sau stropirii accidentale
- materialele contaminate n lucrrile cu microorganisme se vor decontamina nainte de a le scoate din circuit

Curenia i ordinea n laborator

Curenia i ordinea n laborator se efectueaz respectnd regulile urmtoare:
- pe masa de lucru trebuie s se afle doar articolele necesare procesului n desfurare pentru evitarea
aglomerrii i limitarea mprtierii accidentale
- activitile se planific astfel nct operatorul s lucreze ntr-o poziie confortabil, avnd totul la ndemn
- la finalul fiecrei activiti, se ordoneaz toate obiectele, se debaraseaza masa de lucru, apoi aceasta se cur
si se decontamineaza conform procedurilor standard de operare
- la finalul activitatii se indeparteaza manusile (daca e cazul), se spal si se decontamineaza minile

8. MEDII DE CULTUR
Mediile de cultur sunt o combinaie de substraturi nutritive complexe formulate pentru cultivarea microorganismelor.

Mediile de cultur au diverse utilizri:

- meninerea microorganismelor n cultur i n subculturi;
- izolarea i/sau enumerarea microorganismelor din produsele alimentare, ap, aer, medicamente, produse cosmetice;
- izolarea patogenilor care provoac infecii;
- identificarea microorganismelor n scopuri terapeutice, epidemiologice i taxonomice;
- determinarea sensibilitii microorganismelor la agenii antimicrobieni;
- studierea caracteristicilor biochimice i fiziologice ale microorganismelor i capacitatea lor de a se adapta la
medii diferite;
- cultivarea microorganismelor n cantitate mare pentru producia de antibiotice, enzime, toxine, vaccinuri, etc.;
- evaluarea activitii biologice a preparatelor farmeceutice (antibiotice, vitamine, aminoacizi, dezinfectani) i
a activitii specifice a substanelor medicamentoase;
- testele de sterilitate / contaminare microbiana pentru produsele farmaceutice i pentru materialele i
echipamentele medicale.

Prepararea mediilor nutritive

17
 Componentele mediilor de cultura se cantaresc dupa care se adauga in apa purificata. Pentru o buna
solubilizare se recomanda incalzirea usoara a mediului de cultura. Mediile ce conin agar, gelatin sau cistin
trebuie aduse la punctul de fierbere pentru a se asigura dizolvarea lor complet. Metoda des folosit este nclzirea
mediilor pe o flacr. Pentru a reduce denaturarea componentelor mediului ct de mult posibil, se agit continuu
suspensia i de ndat ce soluia ncepe s fiarb, se ndeprteaz imediat sursa de cldur. Dizolvarea complet a
mediului este indicat de transparena perfect a soluiei la scurgerea acesteia pe pereii vasului.

Peptonele i extractele sunt elemente nutritive derivate din carne, cazein, semine din soia, levuri, ficat, mal,
geatin. Peptonele se formeaz prin hidroliza enzimatic, utilizndu-se enzime pancreatice, precum tripsina,
pepsina i enzimele extrase din fructe de papaia i prin hidroliza acid, utilizndu-se acizi anorganici concentrai,
precum acidul clorhidric i acidul sulfuric.

Carbohidratii se adaug la mediile de cultur ca surs de energie pentru a spori rata de cretere a organismelor;
acetia sunt prezen ca substraturi fermentabile n combinaie cu indicatoarele de pH pentru diferenierea
microbian. Carbohidraii cel mai frecvent utilizai n mediile de cultur sunt glucoza, lactoza, manitolul i
zaharoza.

Substanele indicatoare
Exist trei tipuri de substane indicatoare:
- indicatoarele de pH
- indicatoarele de reducere la oxidare
- indicatoarele de sulfur acid.
Dintre indicatoarele de pH, rou de fenol, rou neutru, albastru de bromotimol se utilizeaza cel mai des.
Indicatorul de pH urmrete depistarea formrii de acizi din carbohidrai i formarea de baze (ioni de amoniu) din
peptone, aminoacizi simpli sau amine.
Indicatoarele de reducere la oxidare utilizate la mediile de cultur sunt albastru de metilen i resazurin,
care se coloreaz n diverse nuane atunci cnd intervine oxidarea (la prezena oxigenului n mediu): albastru de
metilen se transform din incolor n albastru i resazurina din incolor n roz.
Indicatoarele de sulfur acid sunt, de obicei, srurile feroase (citrat feric, sulfat feric, sulfat
feriamoniacal, citrat feriamoniacal): sulfura acid produs de bacteriile din tiosulfatul sodic intr n reacie cu
sulfura feroas care se precipit n partea central a coloniei (colonii caracteristice cu centri negri).

Srurile prezente n mediile de cultur au sarcina de a oferi metalele necesare creterii microbiene (Mg, Mn, Fe,
Ca, Zn, Cu) separnd mediul (fosfaii de potasiu i sodiu) i meninnd o osmolaritate adecvat n mediul de cultur
(NaCl).

Agenii de selectare se aleg i se adaug la mediile de cultur pentru a suprima creterea organismelor nedorite,
favoriznd astfel dezvoltarea unuia sau a mai multor tipuri de microorganisme dorite.
Printre primii ageni de selectare utilizai n microbiologie au fost materiile colorante, acesta fiind i n
prezent utilizate n acest scop pentru unele formulri. Cristalul violetul de se folosete la agarul MacConkey pentru
a inhiba creterea bacteriilor Gram-pozitive; Pigmentul verde strlucitor se utilizeaz n combinaie cu srurile
biliare pentru inhibarea bacteriilor Gram-pozitive i pentru stimularea creterii Salmonellei. Dintre substanele de
origine biologic, srurile biliare sunt agenii de selectare cel mai frecvent folosii. Acestea sunt prezente att n
amestecuri i sub form de substane pure (dezoxicolat sodic) pentru inhibarea creterii bacteriilor Gram-pozitive
din medii pentru izolarea patogenilor intestinali.
O alt clas de ageni de selectare, o reprezint antibioticele. Aceste substane, fie c sunt luate individual, fie
combinate n amestecuri, care se gsesc deja n pulberi sau sunt furnizate separat n stare ngheat, au avantajul de
a selecta speciile bacteriene ce trebuie izolai printr-o mai mare specificitate.
O alt clas de ageni de selectare foarte diversificai i variai o reprezint srurile organice i anorganice.
Clorura de sodiu cu o concentraie foarte mare inhib flora Gram-negativ i cea Gram-pozitiv, cu excepia
bacteriilor stafilococe. Azida Sodic la concentraii diferite n mediile de cultur se ntrebuineaz la izolarea
18
selectiv a streptococilor i a enterococilor.Selenitul de sodiu dintr-un mediu separat stimuleaz creterea
Salmonellei i inhib bacteriile Gram-pozitive.

Agentul de solidificare principal utilizat n mediile de cultur pentru microbiologie este agarul.
Agarul este un extract de semine de alge de mare agarofite. Agarul din mediile de cultur are un rol unic ca agent
de solidificare i nu are proprieti nutritive pentru microorganisme.

Ageni de mbogire Pentru a mbunti proprietile de fertilitate ale mediilor de cultur necesare pentru
cultivarea microorganismelor (Neisseria, Haemopnflus, etc.) se adaug n mod normal diveri ageni de mbogire
dup autoclavare i rcire a mediului de baz la temperatura 50oC. Serul i sngele de la animale sunt agenii de
mbogire cel mai frecvent utilizai. n funcie de tipul de cercetare microbiologic, se folosesc soluii de
mbogire definite chimic, de exemplu pentru hemoglobin, albumin, glbenu de ou, ou ntregi.

Substraturi enzimatice. Prin incorporarea substraturilor sintetice sau naturale, care pot fi divizate n medii de
cultur cu ajutorul enzimelor microbiene specifice, s-a obinut o mbuntire substanial la identificarea unelor
specii i genuri microbiene. n funcie de tipul de substrat, divizarea/scindarea acestor produi prin enzimele
microbiene poate conduce fie la o colorare difuz, fie la formarea unui precipitat colorat n centrul coloniilor sau, n
caz contrar, la formarea unei aoreole opace sau clare n jurul coloniilor. Acest semnal vizual este ntotdeauna de o
mare importan pentru identificarea imediat a coloniilor. n cazul anumitor medii, identificarea se poate face la
nivelul specificat i, n privina altora, la nivelul de gen sau de grup. Specificitatea la detectare este corelat cu
specificitatea la activitatea enzimatic detectat i la formularea mediilor de cultur. Pentru a se spori specificitatea
i sensibilitatea de detectare microbian n mediile cromogenice, substraturile enzimatice se vor folosi mpreun cu
reactivii optimizai, cu compuii nutritivi i substanele de inhibare.

Sterilizarea mediilor de cultura

La mediile de cultur care rezist la temperaturi de peste 100oC, metoda de sterilizarea cea mai sigur i cea
mai folosit este sterilizarea prin cldur umed sub presiune, obinut n aparate care pot fi perfect entanate,
precum autoclavele. Cnd aerul prezent n autoclav a fost nlocuit complet de vapori, se formeaz o legtur ntre
presiune i temperatur. n cazul volumelor de pn la 1 litru, sterilizarea n autoclav se realizeaz n general la
121oC (1 atmosfer) timp de 15 minute. Temperaturile ntre 115 i 118 oC sunt uneori recomandate pentru medii ce
conin carbohidrai. Pentru o sterilizare complet, ntregul volum trebuie expus 15 minute la temperatura stabilit;
volumele mai mari necesit 20-30 minute sau mai mult. Este recomandabil ca, n fiecare caz, s se sterilizeze
mediile n cantiti mici n vase umplute pn la 1/3 din volumul lor total i s se acopere vasele cu bumbac
hidrofob sau cu capace de metal slbind n prealabil strnsoarea cu rotaie. Pentru sterilizare se recomand
urmrirea permanent a timpului i temperaturii . Autoclavele se vor verifica periodic pentru a se observa dac se
atinge temperatura de sterilizare. n acest scop, se folosesc fiolele sau benzile impregnate cu spori de B.
stearothermophilus sau benzile impregnate cu substane termoreactive care i modific culoarea dup temperatur.
Uile autoclavelor nu trebuie deschise pn la terminarea ciclului, de ex., la temperaturi sub 65oC.
La ndeprtarea baloanelor sau a cutiilor din autoclave, trebuie s se poarte echipament de protecie (mnui i halat
de protecie).

Verificarea calitatii mediilor de cultura

Dupa prepararea si sterilizarea fiecarui lot de medii de cultura se verifica:
- recipientele si capacele / dopurile acestora nu trebuie sa fie fisurate
- introducerea de cantiti inegale n recipiente
- deshidratarea care se observ prin apariia de crpturi sau ncreituri ale suprafeelor de pe mediul solid
- nchiderea exagerat a culorii sau modificarea culorii
- formarea de cristale
- formarea unui numr prea mare de bule
- sterilitatea mediului
- pH-ul
19
 - valoarea nutritiva

Depozitarea mediilor de cultura

Mediile de cultur deshidratate sunt higroscopice i sensibile la umezeal, cldur i lumin. Condiiile de
depozitare sunt indicate pe eticheta produsului.
Mediile preparate trebuie etichetate corespunztor prin atribuirea de numere de lot, date de preparare i
expirare i identificarea mediului. Se pastreaza in conditiile si pe o perioada de timp validate. Nu se utilizeaza medii
de cultura expirate. Mediul agar nu se depoziteaz la temperaturi de 0 o sau mai mici de 0o, pentru c prin congelare
se poate deteriora structura gelului. Pe perioada depozitrii, mediile trebuie ferite de lumin i de temperaturi
excesive. naintea depozitrii prelungite, plcile cu mediu agar trebuie introduse ntr-un ambalaj sau recipient
etanat n scopul ncetinirii procesului de pierdere n umiditate.

Factori care influenteaza calitatea mediilor de cultura

Defecte: pH neadecvat, turbiditate, precipitare, opacizare, gelifiere uoar, cretere bacterian insuficient i
selectivitate slab.

Cauzele posibile:
- cntrirea eronat a pulberilor datorit unei erori a operatorului sau a funcionrii deficiente a balanei.
- utilizarea pulberii din recipiente care au fost lsate descise i care s-au deteriorat n urma expunerii la cldur,
umiditate
- utilizarea de reactivi expirati
- msurarea incorect (inexact) a cantitii de ap purificata sau utilizarea de ap purificata de calitate
necorespunzatoare

Utilizarea sticlriei necurate adecvat, cu urme de detergent sau ali ageni chimici.
Utilizarea mediilor pe baz de agar, care nu au fost complet dizolvate sau care nu au fost amestecate corespunztor.
nclzirea excesiv a mediilor n timpul pregtirii, sterilizrii sau n timpul staionrii acestora n baia de ap.
Msurarea incorect a pH-ului prin adugarea de substane alcaline sau acide n exces la mediile la care pH-ul
trebuie s fie corectat. Pentru msurarea pH-ului, se transfer o prob ntr-un pahar de laborator, se las la rcit la
aprox. 20 - 25C i apoi se efectueaz msurarea prin imersarea unui electrod cu 2-3 cm.
Adugarea de ageni de mbogire nesatisfctori la medii (de ex., snge contaminat) sau adugarea de ageni de
mbogire atunci cnd mediile sunt prea fierbini (dezactivarea substanei adugate) sau prea reci (solidificarea
mediilor prin dispersia neuniform a aditivului).
Valoarea pH: pH-ul fiecrui lot de mediu trebuie verificat electrometric dup ce mediul a atins temperatura
camerei..
Sterilitatea: o prob reprezentativ din fiecare lot de mediu trebuie incubat pe o perioad de 2-5 zile la 35 37 oC.
Ca regul general, la un lot mai mic de 100 uniti trebuie s se testeze o prob de 3-5%. Pentru un lot mai mare,
se iau 10 plci sau tuburi aleatorii. Nu trebuie s existe dovezi de cretere microbian dup incubare.
Aspectul fizic: mediile trebuie examinate pentru culoare i claritate. Dac culoarea nu este cea corect, dac mediile
se precipit, dac culoarea incorect nu dispare la nclzirea sau amestecarea uoar, atunci mediile trebuie
ndeprtate dac nu trebuie s conin n mod normal componente insolubile.
Testarea performanei la cretere: laboratorul trebuie s pstreze o colecie de culturi stoc, care s aib caracteristici
cunoscute tipice, adecvate pentru testarea tuturor mediilor din laborator. Testarea performanei trebuie s se bazeze
pe utilizarea specific pentru care este destinat mediul i trebuie s cuprind organisme care s dea att rezultate
pozitive, ct i negative.

9. STERILIZAREA
Sterilizarea este un proces prin care se distrug sau se ndeparteaza toate micro-organismele viabile.

20
 Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist
mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de
microbiologie, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

Sterilizarea prin caldura

Cldura umed
Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare.
n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate), fungii si levurile sunt
omorte dup 15 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare.
Autoclavul permite:
- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea
microorganismelor;
- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C).
Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin, n cicluri de sterilizare
separate.

Timpul si temperatura de sterilizare variaza in functie de natura materialelor care trebuie sterilizate. Ele sunt
determinate prin studii de validare care vor avea n vedere distribuia i capacitatea de penetrare a cldurii.

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat cu ajutorul unor indicatori de sterilizare. Acestia sunt de
doua tipuri:
- indicatori chimici - benzi de hrtie speciala, imprimata cu benzi a caror culoare se modifica in momentul in
care temperature a ajuns la valoarea prevazuta
- indicatori biologici (bioindicatori) fiole cu mediu lichid sau benzi de hartie ce contin spori bacterieni de
Bacillus stearothermophilus. Sporii sunt distrusi doar daca sunt indeplinite conditiile de sterilizare (minim
15 minute la 1210C).

Cldura uscat
Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuve).
Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n
cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C.
Controlul eficienei sterilizrii este realizat cu ajutorul unor indicatori de sterilizare. Acestia sunt de doua tipuri:
- indicatori chimici
- indicatori biologici (bioindicatori) fiole sau benzi de hartie ce contin spori bacterieni de Bacillus atrophaeus

Depirogenarea este distrugerea endotoxinelor bacteriene (resturi de perete celular al bacteriilor Gram negative)
poate fi realizata doar prin caldura uscat:
- 30 minute la 2500C
- 60 minute la 2000C
- 180 minute la 1800C
Controlul eficienei depirogenarii este realizat cu ajutorul unor indicatori de endotoxina fiole ce contin o cantitate
cunoscuta de endotoxine bacteriene.

Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz
pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.
n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer.
Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast
zon de protecie.

Pasteurizarea
21
Pasteurizarea care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n
tratarea produsului la o temperatur n domeniul 560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n
mediu umed, n funcie de produs.
n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate.

Tyndalizarea
Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii
favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt
distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii:
nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore.
Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile.

Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine microorganismele.
Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane, cu pori de diferite dimensiuni.
Sterilizarea prin filtrare este foarte diferit fa de alte metode, prin faptul c nu distruge micro-organismele, ci le
ndeparteaza. Acest tip de sterilizare se poate folosi doar pentru lichide i gaze.

Sterilizarea prin gaze toxice

Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor
din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie.

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor

Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu
distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa
milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254
nm sunt utilizate pentru sterilizarea materialelor, a aerului.

Radiaiile gamma
Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de
produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.
Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau
pentru sterilizarea unor deeuri.

10. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie
deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice
depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.
Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:
- splarea
- uscarea
- executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra
umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate),
sterilizabile pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se
pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare.

Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor
microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la

22
etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate
n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane,
pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind
slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului
fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urmtoarele
etape:
- perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or;
- perioada de meninere a temperaturii de sterilizare;
- perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de
sticl prin oc termic, aprox. 2 ore.
n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180 o C i a unei durate de o or. Din
exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari.

Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii,
iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie.
Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea
ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul
tubului de sticl, ncepnd de la vrf.
Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar.
Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon.
Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup
aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului.

11. CULTURI DE MICROORGANISME

Cultura pur reprezint o mas de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu
nutritiv steril.
Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti
formatoare de colonie, atunci cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid.

Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru
conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese
biotehnologice.

Operaia de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar
fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum.
Repicarea periodic se efectueaz prin transfer de celule din eprubeta coninnd cultura pur, n care mediul este
epuizat, n eprubeta cu mediu nutritiv steril, proaspt, cu compoziie similar.
Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, compoziia mediului i temperatura de pstrare.

Repicarea se realizeaza in zona de clasa A, adica lipsita de alte microorganisme care ar putea contamina
cultura pura. Zona de clasa A se obtine la maxim 20 cm de flacara unui bec de gaz sau in hota cu flux de aer
laminar.

Insamantarea cu ansa
Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar
orizontal. n mna dreapt se ine ansa de repicat. Varful acesteia se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n
poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din ea. Se ine n flacr pn se nroete,
apoi se plimb de 2 -3 ori i restul, pn la mner, n flacr.

23
 Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar
dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un
motiv, ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce varful ansei
fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic
poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful ansei (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii
respective).
Se scoate ansa din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se
las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril.
Ansa de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se
procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic
n mna stng, se scoate dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul operaiei de
repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce ansa cu fragmentul de cultur, atingnd uor
mediul (n centrul eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de
cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el. Prin miscari in zig-zag a ansei se
imprastie materialul biologic pe intreaga suprafata a mediului de cultura.
Se scoate ansa din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i
captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid.
Se arde din nou varful ansei n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu
rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare.
Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede
pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu
prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de
care depinde foarte mult reuita unei repicri.
Astfel, trebuie avute n vedere:
- inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii
din atmosfer pe mediu;
- inerea ansei n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai
mare;
- scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de
contaminri secundare;
- arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale
eprubetei pot exista germeni de infecie secundar.

Insamantarea in placi Petri

Mediul de cultur agarizat steril se topete (fluidifica) pe baie de ap, dup care se rcete la 45 0C i se
repartizeaz n mod aseptic n plcile Petri. Se las mediul s se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie
de spaiu i pentru evitarea formrii unui condens prea abundent, plcile se pot aeza una peste alta, dac este
posibil.
Se agit tubul coninnd suspensia de microorganisme i se raspira cu pipeta aproximativ 1ml din cultur care
se transfera pe suprafata mediului din placa Petri. Suspensia se repartizeaz omogen, pe toat suprafaa, prin
miscari in zig-zag.
nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se poate face de asemenea, prin ncorporarea suspensiei de
microorganisme astfel: se pipeteaz n placa steril, goal, 1 ml din suspensie, dup care se toarn mediul topit i
rcit la 450C i se omogenizeaz pentru repartizarea uniform a celulelor din cultur. Se las s se solidifice.

12. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic
joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.

24
Microscopul optic
Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin
port-obiect i un sistem de iluminare.

Sistemul de transmisie optic

- ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic.
- obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o
imagine real a obiectului.

Sistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator.

- condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a
strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin
pentru o mai bun claritate a imaginii.
- sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei
cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza
macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric).

Examenul preparatelor in stare proaspata

Acest tip de operatie const n examinarea unui microorganism ntr-un mediu lichid ntre lam i lamel.
Se transfera o picatura de suspensie de microorganisme pe lama. Peste suspensie se aplica lamela astfel incat sa nu
se formeze bule de aer. Se examineaza lama la microscop utilizandu-se un obiectiv putere de marire adecvata.

Examenul preparatelor in stare uscata

Preparatele in stare uscata au avantajul ca sunt sterilizate prin fixare, sunt usor de manipulat si de examinat
si pot fi pastrate mult timp. Efectuarea unui preparat n stare uscat sau frotiu const n etalarea probei de studiat
urmat de o uscare, de o fixare i, eventual, de o colorare. Colorarea poate fi:
- simpla
- diferentiala

Coloratia simpla
Se transfera o picatura de suspensie de microorganisme pe lama. Frotiul se usuca dupa care se fixeaza prin
caldura sau prin lichide fixatoare, cum sunt: alcoolul metilic, alcoolul etilic, alcoolul-eter, etc.
Pentru fixare prin caldura se trece lama de 2-3 ori cu fata opusa frotiului, prin flacara unui bec de gaz.
Incalzirea se face la 60 - 70 oC (lama este suportata pe dosul mainii). Prin fixare bacteriile sunt omorate, evitandu-se
astfel pericolul infectarii. In plus, se mareste aderenta preparatului de lama, iar afinitatea sa pentru colorant creste.
O fixare corecta nu trebuie sa produca modificari ale formei si ale structurii microorganismului supus acestei
operatii.

Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite substante chimice, numite mordanti (de exemplu, solutia Lugol), in
scopul de a intensifica activitatea colorantilor. Mordantii, prin afinitatea puternica pe care o au atat fata de colorant,
cat si fata de substratul supus colorarii, faciliteaza si intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la obtinerea
unei coloratii mai intense si de o calitate mai buna. Pentru colorantii bazici se folosesc mordanti acizi (acid tanic,
acid picric, etc.) iar pentru colorantii acizi se folosesc mordanti bazici (sulfat de fier, alaun, etc.)

Coloratia simpla se poate realiza cu:

- albastru de metilen. Frotiul uscat si fixat apoi la flacara este acoperit cu o solutie de albastru de metil timp de
1-2 minute. Se spala dupa aceea frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop

25
 cu obiectivul cu imersie.Prin aceasta metoda, toate elementele din campul microsopic apar colorate in
albastru. Este o coloratie rapida, care pune in evidenta forma, gruparea si, viabilitatea microorganismelor.
- fucsina fenicata Ziehl diluata 1/10. Coloratia se efectueaza in acelasi mod ca si cea cu albastru de metilen.
Elementele din frotiu apar colorate in rosu.
- verde malachit. Coloratia se efectueaza in acelasi mod ca si cea cu albastru de metilen. Este utilizata pentru
colorarea sporilor bacterieni care apar colorati in verde.

Coloratia Gram
Colorarea difereniat a celulelor n funcie de structura peretelui celular, prin metoda Gram, are la baz o
tehnic n mai multe etape:
- in prima etap, celulele sunt colorate cu colorantul bazic cristal-violet, utilizat drept colorant primar.
- cea de a doua etap cuprinde tratamentul cu o solutie de I 2 / KI, cu rol de mordant, care mrete interacia
dintre colorant i componentele celulei.
- a treia etap este reprezentat de splarea cu alcool-aceton, unde se difereniaz cele dou tipuri de
bacterii ; cele Gram pozitive rein cristalul violet, n timp ce bacteriile Gram - negative pierd colorantul
primar i devin incolore.
- in final, acestea din urm sunt colorate cu un alt colorant, secundar, cum este safranina sau fuxina. n
acest mod, cele dou categorii de bacterii rmn colorate diferit, putnd fi difereniate n funcie de
structura peretelui lor celular.

13. ESTIMAREA DENSITII POPULATIILOR MICROBIENE

Numrarea microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de microbiologie, n vederea

aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite culturi folosite n industrie sau pentru determinarea
gradului de contaminare a unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n acelai timp
precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse i culturi poate s fie foarte ridicat, se
recomand n prima etap s se efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.

Tehnica obtinerii dilutiilor zecimale

Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei microbiologice, se recomand ca raportul ntre
produs i diluant s fie de 1:10, obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1).
Pentru efectuarea urmtoarelor diluii zecimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare,
se recolteaz 1 ml din diluia 1 i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml diluant steril, obinndu-se diluia a
douaa (diluie 10-2) i se continu procedeul pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat
de numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este mai mare, cu att se fac mai
multe diluii. 1 ml din fiecare dilutie se transfera pe cate o placa Petri cu mediu de cultura agarizat. Placile se
incubeaza la temperatura optima, pe o anumita perioada de timp.

Dupa incubare, placile se vizualizeaza, se numara coloniile dezvoltate (UFC unitati formatoare de colonii).
Pentru a calcula numarul de microorganisme din produs, se inmulteste numarul de colonii cu factorul de dilutie. De
ex, pentru pentru dilutia 1, numarul de celule obtinut pe mediul de cultura se inmulteste cu 10, pentru dilutia 2 se
inmulteste cu 100 etc).
Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie
prin rotirea eprubetei ntre palme, fie, cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1
ml destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din
mediul ambiant, lucrnd n zona de protecie din jurul flcrii becului de gaz sau lucrul in hota cu flux de aer
laminar i respectnd regulile de manipulare.

26
 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Suspensie iniial 1: 10 1 : 100 1 : 1000 1 : 10000

1 ml 1 ml 1 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

1 10-1 10-2 10-3

UFC/ml = Nr. colonii x coeficientul de diluie

14. METODE DE CONSERVARE A MICROORGANISMELOR

Microorganismele aflate n studiu ct i cele care prezint unele proprieti remarcabile trebuie pstrate n
colecii de culturi, denumite micoteci. Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe
prelungirea fazei staionare i evitarea etapei de declin, cele mai importante sunt urmtoarele:

Repicarea periodic prin transfer de celule din eprubeta coninnd cultura pur, n care mediul este epuizat, n
eprubeta cu mediu nutritiv steril, proaspt, cu compoziie similar. Intervalul de repicare este dependent de natura
culturii, compoziia mediului i temperatura de pstrare. Acest procedeu necesit un mare volum de munc, prezint
risc de contaminare i este greu de realizat atunci cnd numrul de culturi de ntreinut este mare.

Prelungirea intervalului ntre dou repicri prin scderea vitezei de metabolism a celulelor i deci evitarea strii de
declin ce poate duce la autosterilizare, se poate realiza prin mai multe procedee:

Meninerea culturilor la temperaturi sczute, n condiii de refrigerare sau congelare. n acest caz, de exemplu,
culturile de fungi pstrate la 50C se transfer anual, n timp ce dac pstrarea se face la 16 0C, repicarea va avea loc
la un interval de 6 luni.

27
Desicarea poate fi realizat n laborator la o pomp de vid, culturile fiind plasate n fiole speciale, care sunt apoi
nchise la flacr. Metoda desicrii are la baz reducerea umiditii mediului, care conduce la trecerea celulelor n
starea de anabioz, ce poate fi meninut timp ndelungat fr a se produce modificri intracelulare, ireversibile.

Liofilizarea const ntr-o congelare urmat de o sublimare. Prin acest procedeu se prelungete considerabil
intervalul de conservare a culturilor, fr s se produc modificri ale proprietilor lor fiziologice. Liofilizarea se
realizeaz n aparate speciale numite liofilizatoare, culturile fiind suspensionate n lichide protectoare (de obicei un
coloid hidrofil cum este laptele, glicerol 10%, gelatin, ser etc) i introduse n fiole speciale.

Revitalizarea preparatelor desicate sau liofilizate

Se nclzete gtul fiolei ce conine cultura desicat sau liofilizat, la vrful flcrii de gaz. Cu o pipet steril
se las s cad cteva picturi de ap steril rece pe gtul ncins al fiolei, care se va crpa; vrful se desprinde uor
cu o bucat de vat steril, se mai arde o dat marginea fiolei n flacr, dup care se introduce dopul inut n mna
dreapt. Cu o alt pipet steril se ia un mic volum din lichidul de revifiere sau ap steril i se pipeteaz uor peste
coninutul fiolei. Se agit cu grij i se las n repaos jumtate de or la temperatura camerei sau n termostat. Dup
acest interval, n zona steril a flcrii se deschide dopul fiolei, se arde gtul acesteia n flacr i se recolteaz din
cultura liofilizat un mic volum, cu ajutorul ansei. Se nsmneaz mediul de cultur din eprubet i se incubeaz
la temperatura optim de cretere. Dup dezvoltarea microorganismului, se observ aspectul culturii i eventualele
modificri morfologice.

28