Cursurile 12-14

METODE IMUNOCHIMICE DIRECTE

Evidențierile analitice directe, presupun precipitarea complexului AgAc într-un gel în care
ochiurile de rețea sunt mai mici decât dimensiunile complexului și astfel, acolo unde se
produc interacțiile Ag–Ac, complexele imune (AgAc) fiind imuabile (fără mișcare), se
formează depozite vizibile organoleptic. Cele mai cunoscute tehnici directe sunt:
⮚ imunodifuzia simplă și dublă (IDS și IDD);
⮚ contraimunoelectroforeza (CIEF);
⮚ imunoelectroforeza (IEF).

12.1. Imunodifuzia

Principiul care stă la baza evidenţierii interacţiilor antigen-anticorp prin imunodifuzie

şi precipitare, este difuzia (împrăştierea) speciilor imunochimice în mediu lichid sau semisolid
(gel), urmată de constituirea complexelor imune mari, care precipită (ies din sistem) la locul
de întâlnire al acestora.
Dacă imunodifuzia se realizează în mediu semisolid (gel), care se prezintă ca o reţea
tridimensională cu ochiuri de reţea, complexele imune de dimensiuni mari nu pot difuza după
formarea lor în urma interacţiei antigen-anticorp (dimensiunile ochiurilor de reţea sunt mai
mici decât dimensiunile macromoleculelor complexelor antigen-anticorp) şi astfel, rămân la
locul de constituire sub forma unor aglomerări (precipitate) vizibile.
Agenţii gelifianţi se utilizează în concentraţii cuprinse între 0,5 şi 1,5% în diverse
soluţii tampon, iar cei mai des folosiți sunt: agarul, agaroza, poliacrilamida, amidonul,
gelatina.
Pentru ca gelurile să fie elastice şi transparente, este necesar ca agenţii gelifianţi să fie
utilizaţi în concentraţii minime. În aceste condiţii, conţinutul mare de apă din geluri va
permite migrarea liberă a speciilor imunochimice în gel, prin imunodifuzie.
Imunodifuzia în gel a speciilor imunochimice este dependentă de legea difuziei libere
a lui Fick, conform căreia, viteza de difuzie (distanţa parcursă de un reactant imunochimic în
unitatea de timp) este direct proporţională cu gradientul de concentraţie şi invers
proporţională cu greutatea moleculară a acestuia.

77
 Prin difuzia ambilor reactanţi imunochimici din soluţii apoase ale acestora, prin gel,
conform gradientelor de concentraţie, unul către celălalt (imunodifuzie dublă) sau prin difuzia
unui singur reactant imunochimic din soluţia apoasă a acestuia, în gel, unde se află înglobat
celălalt reactant imunochimic (imunodifuzie simplă), se creează condiţii optime pentru
precipitarea complexelor imune formate. Astfel, în gelul transparent apar linii sau zone opace
(datorate prezenţei aglomerărilor de macromolecule mari în ochiurile reţelelor tridimensionale
ale acestuia) care se pot deplasa până la atingerea echilibrului în sistemul respectiv.
Reacţia de precipitare depinde de concentraţia reactanţilor, forţa ionică, pH-ul şi
temperatura mediului în care se realizează interacţia imunochimică, iar viteza de difuzie a
reactanţilor imunochimici depinde de următorii parametri: dimensiunile moleculelor
(moleculele mai mici migrează mai repede); pH-ul tamponului; temperatura mediului;
vâscozitatea gelului; gradul de hidratare al gelului (concentraţiile mari ale gelului diminuează
viteza de difuzie); prezenţa unor impurităţi în gel.

Anticorp Antigen

Anticorp Precipitat Antigen

Figura 12.1. Procesul de precipitare în imunodifuzia dublă

Imunodifuzia dublă (IDD): această tehnică presupune difuzia circulară a speciilor

imunochimice introduse în godeuri (gropi) alăturate, unul către celălalt.

78
(a)

Difuzia fiind circulară, la locul interacției dintre

strat de gel
cele două specii se constituie complexe de
~ ~~~~ ~ ~ difuzie
circularã AgAc, care nu mai pot difuza datorită
~ ~~~~ ~
~~~ ~
~ ~ ~Ag dimensiunilor mari ale acestora și care se
~ ~ ~~ ~ ~
~ ~ godeuri
depun sub forma unor precipitate.
~ ~ ~ ~ ~~ ~
linie de ~ ~ ~~ ~~ Gelurile care se utilizează sunt fie
precipitare ~ ~ ~Ac
~~~~
~ ~ ~~ ~ ~ macromolecule naturale, fie macromolecule
sintetice: agar, agaroză, poliacrilamidă
Figura 12.2. Imunodifuzia dublă (IDD).
(PAA), amidon.
Reprezentare schematică

Imunodifuzia simplă (IDS): aceasta se realizează ca și în cazul IDD, într-un gel depus pe
un suport inert. Deosebirea dintre cele două tehnici se referă la faptul că, apriori procesului de
imunodifuzie, în gel se înglobează unul dintre reactanții imunochimici, de regulă
imunoglobulina.

(a) strat de gel cu: (b)

Ig + Ac O
~ ~~~~ ~ ~ difuzie
~ ~~~~ ~ circularã
~ ~~~ ~ ~ ~
~ ~ ~~ ~ ~
~ Ag ~ diametrul
disc de ~ ~ ~ ~ ~~ ~ godeului
precipitare ~ ~ ~~ ~~ (gãurii)
~ ~ ~~ ~ ~ ~
~ ~ ~~ ~ ~ [Ag]
Figura 12.3. Imunodifuzia simplă (IDS)
(a). Reprezentare schematică a discului de precipitare
(b). Exemplu de dreaptă standard, necesară pentru determinarea concentrației
antigenului, în funcție de diametrul discului de precipitare

În aceste condiții, în gel se practică un godeu în care se introduce soluția de antigen (Ag),
care va avea tendința să difuzeze circular prin gelul în care a fost introdus anticorpul (Ac). În
urma interacției dintre Ag și Ac se constituie complexele AgAc, care rămân la locul de
formare și se constituie discuri de precipitare în masa gelului incolor, al căror diametru este
proporțional cu concentrația Ag din godeu.
Comparativ cu IDD, IDS este o tehnică imunochimică directă atât calitativă, cât și
cantitativă; în IDS se utilizează aceleași tipuri de geluri ca și în IDD; sensibilitatea celor două

79
metode este slabă, deoarece pentru evidențiere analitică sunt necesare cocncentrații mari ale
speciilor imunochimice.
Cele două tehnici imunochimice necesită minimum 16 ore pentru efectuare („over night”)
și din această cauză, ele sunt expansive în timp și necesită condiții de umiditate și depozitare
speciale.
Pentru diminuarea timpilor de lucru (timpului de difuzie) se utilizează difuzia forțată a
speciilor imunochimice (în câmpuri electrice) și astfel, se realizează contraimuno-
electroforeza (CIEF).

12.2. Contraimunoelectroforeza (CIEF)

Contraimunoelectroforeza (CIEF) este tehnica în care reactanţii imunochimici

migrează unul către celălalt, din godeuri apropiate, excavate într-un gel, sub influenţa unui
curent electric continuu.
Prin difuzia forţată (în câmp electric continuu) a celor doi reactanţi imunochimici, în
zona de interacţie a acestora se formează complexele antigen-anticorp, evidenţiate sub forma
unor linii de precipitare.
Deoarece imunoglobulinele în câmp electric continuu, în gel de agar, prezintă migrare
catodică, pentru realizarea practică a contraimunoelectroforezei (CIEF), antigenul trebuie să
prezinte migrare anodică. Din această cauză în contraimunoelectroforeză, imunoglobulinele
(imunoserul) se introduce în godeul dinspre anodul sursei, iar antigenul se introduce în godeul
dinspre catodul sursei.

(-) (+)

Ag Ac

Figura 12.4. Schema generală a contraimunoelectroforezei (CIEF).

80
 Antigenele care prezintă în câmp electric continuu migrare catodică, pot fi studiate
prin contraimunoelectroforeză (CIEF) după o prealabilă derivatizare (carbamilare, formilare,
acetilare).
Prin derivatizare se măreşte sarcina netă negativă a antigenelor, prin suprimarea
grupărilor amino bazice, crescând probabilitatea deplasării spre anodul sursei, în prezenţa
câmpului electric continuu.
Ca şi imunodifuzia dublă, contraimunoelectroforeza (CIEF) are aplicabilitate doar în
evidenţierile calitative ale interacţiilor antigen-anticorp. CIEF efectuată în câmp electric
continuu prezintă sensibilitate la fel de redusă ca şi tehnicile imunodifuzive, în schimb este
redus substanţial timpul de efectuare al testului (15-90 minute).

12.3. Imunoelectroforeza (IEF)

Prin cuplarea electroforezei unuia dintre reactanţii imunochimici (de regulă antigenul)
cu imunodifuzia fracţiilor electroforetice (anterior etalate) în raport cu celălalt reactant
imunochimic, se realizează imunoelectroforeza (IEF).
Imuno-electro-foreza (IEF) este o tehnică directă, imunochimică, în care se exploatează
constituirea precipitatelor în geluri, în urma interacției antigen – anticorp.
Principiul constituirii precipitatului este identic cu cel din imunodifuzii, însă această
tehnică se bazează atât pe difuzia dublă, cât și pe electroforeză. Din această cauză, realizarea
analizei se face în două etape distincte:
❖ etalarea într-un câmp electric continuu a Ag;
❖ imunodifuzia dublă a Ag și Ac.
Procesul de IEF se desfășoară pe o lamă de microscop pe care este depus un gel (agar,
agaroză, poliacrilamidă); în gel care se realizează două godeuri (găuri) în care se introduc
soluțiile de Ag. Lama de microscop este cuplată la o sursă de curent continuu (+ ; –) și se
efectuează electro-migrarea speciilor antigenice (Ag), în vederea etalării acestora de-a lungul
câmpului electric.

81
 Figura 12.5. Reprezentare schematică generală imuno-electro-foreză (IEF)

Speciile antigenice (Ag) etalate de-a lungul câmpului electric nu pot fi evidențiate
organoleptic și ele migrează dependent de teoria câmpului electric și sarcinile elctrice ale
speciilor antigenice. Pentru evidențierea gradului de deplasare a speciilor antigenice în
câmpul electric, se excavează un șanț central în masa de gel și în acest șanț se introduce
soluția de anticorpi (Ac).
Se decuplează lama de microscop de la sursa de curent continuu și se menține peste noapte
(min. 6ore), pentru realizarea imunodifuziei duble (anticorpii (Ac) din șanțul central migrează
către antigenele etalate, iar antigenele etalate migrează către șanț). În acest mod, prin
deplasarea reciprocă a speciilor imunochimice, se realizează interacția specifică dintre speciile
imunochimice, care se materializează prin constituirea complexelor Ag–Ac mari, care
precipită la rândul lor în masa de gel sub formă de arcuri de precipitare (pp.). Aceste arcuri
(pp.) rezultate sunt vizibile organoleptic și după poziția pe care o ocupă de-a lungul câmpului
electric continuu, pot fi evidențiate calitativ - Ag inițiale din proba de analizat.
Prin această tehnică pot fi evidențiate doar calitativ speciile imunochimice; din punct de
vedere al sensibilității și specificității, tehnica este asemănătoare cu imunodifuziile, însă oferă
avantajul în plus, în cazul probelor care conțin antigene într-un număr mare (polispecifice),
etalarea și evidențierea facilă, comparativ cu imunodifuziile.
Un exemplu de imunoelectroforeză este cea Grabar, care constă în migrarea
electroforetică în gel de agar, agaroză sau poliacrilamidă a antigenului, acompaniată de
etalarea fracţiilor proteice ale acestuia, urmată de imunodifuzia dublă faţă de imunoglobulina
(imunoserul) introdus într-un rezervor practicat în gel, paralel cu direcţia câmpului electric
continuu.
Prin imunoelectroforeza model Grabar, în gelul transparent se obţin arcuri de
precipitare corespunzătoare interacţiilor specifice, care se realizează între fracţiile antigenului,

82
etalate de-a lungul câmpului electric şi anticorpii (imunoserul) adăugaţi ulterior
electromigrării.
Componenţii antigenici cu mobilitate electroforetică identică, dar cu constante de
difuzie diferite, formează în imunoelectroforeză arcuri de precipitare distincte, poziţionate la
acelaşi nivel de-a lungul câmpului de electromigrare, mai aproapiaţi sau mai depărtaţi de şanţ,
dependent de dimensiunile acestora (componenţii mai mari vor difuza prin gel mai greu şi se
vor poziţiona la distanţă mai mică de şanţ). De asemenea, componenţii antigenici cu constante
de difuzie identice, dar cu mobilităţi electroforetice diferite, formează în imunoelectroforeză
arcuri de precipitare distincte de-a lungul câmpului electric.

13. METODE IMUNOCHIMICE INDIRECTE

Iniţial, evidenţierea interacţiei antigen-anticorp prin intermediul speciilor imunochimice

marcate, s-a folosit atunci când concentraţiile speciilor imunochimice erau mici şi foarte mici,
atunci când anticorpii nu erau nici precipitanţi și nici aglutinanţi. Ulterior, datorită
sensibilităţii, specificităţii şi uşurinţei de realizare, tehnici imunochimice indirecte s-au extins
şi au substituit din ce în ce mai mult tehnicile directe de evidenţiere.
Deoarece tehnicile directe necesită cantități mari de probe și sensibilitatea, cât și
specificitatea măsurătorilor sunt mici, în practica analitică tehnicile directe sunt utilizate
preferențial în ”screening”, iar pentru elaborarea diagnosticului probelor de
alimente/biologice, se utilizează tehnicile indirecte.

13.1. Markerii – compuși indispensabili în tehnicile imunochimice

indirecte

În tehnicile indirecte, una dintre speciile imunochimice este marcată cu un marker

preferențial și procesul imunochimic are loc între specia marcată și cealaltă specie
(nemarcată).

Figura 13.1. Interacțiunea dintre Ig (Ac) marcat cu marker-ul M și antigen

83
 Complexul Ag-Ac rezultat conține legat și markerul (M) și prin intermediul acestuia, este
evidențiat analitic complexul și respectiv, interacția Ag-Ac.
Așadar, prin interacţia dintre o specie imunochimică şi cealaltă specie imunochimică
marcată se constituie complexul imun, care conţine legat covalent şi markerul.
Prin evidenţierea analitică a markerului legat covalent, este evidenţiată indirect şi interacţia
antigen-anticorp.
Legarea covalentă prin intermediul unei grupări funcţionale dintre specia imunochimică şi
marker, trebuie să se realizeze în condiţii blânde, pentru a nu afecta proprietăţile de bază ale
moleculelor de după legare.
Complexul rezultat prin legarea covalentă a markerului de specia imunochimică se
numeşte conjugat imunochimic şi la nivelul acestuia, trebuie să se păstreze caracteristicile de
bază ale ambilor reactanţi.
Markerul este un compus care facilitează evidențierea analitică a complexului Ag-Ac, în
urma exploatării uneia dintre caractecteristicile sale (viraj de culoare, emisie, absorbție). Prin
folosirea markerelor în evidențierea analitică, crește foarte puternic sensibilitatea
determinărilor și astfel, sunt necesare cantități foarte mari de probe (μL) și respectiv,
concentrații foarte mici ale speciilor imunochimice (10-6 – 10-12 mol/L).

13.1.1. Tipuri de markeri utilizați în tehnici imunochimice

În practica analitică, se pot utiliza următorii markeri:

● fluorocromi;
● enzime;
● izotopi radioactivi – tehnici izotopice;
● unele metale (Au) – tehnici neizotopice.

Fluorocromii ca markeri:
Aceștia sunt compuși organici de dimensiuni mici, care au capacitatea de absorbi radiații
de energii înalte (din domeniul UV) și de a emite în urma excitației, radiații de energii mai
joase (din domeniul VIS). Prin acest proces fizic, fluorocromul incolor în condiții normale,
devine colorat în urma iradierii cu radiații UV.

84
 Figura 13.2. Mecanismul fluorescenței (diagrama energetică)

Procesul de fluorescență (figura de mai sus) decurge în două etape, și anume:

I. Prin absorbția unei radiații de înaltă energie din domeniul UV [vibrație (υ) înaltă,
lungime de undă (λ) mică], compusul fluorescent trece din nivelul de bază (Eo fundamental)
pe nivelul excitat (E).
II. Revenirea compusului fluorescent la starea fundamentală (Eo nivel de bază) se
realizează prin:
⮚ dezactivarea termică – materializată prin eliminarea în mediu a unei părți de
energie,
⮚ trecerea de la nivelul excitat (E) la nivelul fundamental (E o nivel de bază) prin
emiterea unei radiații din domeniu VIS de energie mai joasă [frecvență (υ) mică,
lungime de undă (λ) mare].
Procesul de fluorescență poate fi urmărit cu ajutorul unui microscop cu fluorescență; acesta
trebuie să aibă capabilitatea de a emite radiații UV, prin care să fie excitat compusul
fluorescent, pentru obținerea radiației (colorate) emise în domeniul VIS.
Tehnicile imunochimice în care se utilizează fluorocromi, poartă denumirea de
imunofluorescență (IF). Aceste tehinici necesită utilizarea microscoapelor cu fluorescență,
care permit evidențierea analitică calitativă, indirectă a interacției Ag – Ac, prin prezența
fluorocromului legat covalent de unul din reactanții imunochimici, care se găsește în final în
compusul Ag – Ac.

85
 Figura 13.3. Realizarea interacțiunii dintre antigen și anticorp marcat cu fluorocromi

În imunofluorescență se pot utiliza ca markeri:

⮚ fluoresceina;
⮚ izotiocianat de fluoresceină (FITC),
⮚ acridină.

Enzimele ca markeri:
Enzimele sunt compuși macromoleculari de natură glicoproteică, capabili să recunoască și
să interacționeze cu un substrat cu care să constituie un complex ES instabil termodinamic,
care se stabilizează prin transformarea substratului în produs de reacție și eliberează enzima,
aceasta fiind capabilă să reia ciclul catalitic.
Utilizarea enzimelor ca markeri în tehnicile imunochimice, presupune legarea chimică a
acesteia de unul dintre reactanții imunochimici (de preferat Ac) și astfel, ca și în cazul
anterior, enzima marker se regăsește în complexul Ag – Ac și ea poate acționa asupra
substratului specific adăugat în sistemul reactant, căruia îi modifică structura, transformându-l
în produs de reacție; acest produs este capabil să modifice culoarea mediului de reacție inițial.
Acestă modificare colorimetrică poate fi utilizată în evidențierile analitice atât calitative,
cât și cantitative, deosebindu-se de tehnicile cu fluorocromi care se pot utiliza doar în
evidențierile calitative.
Cele mai utilizate enzime în tehnica imunoenzimatică sunt:
⮚ fosfataza alcalină;
⮚ glucozoxidaza;
⮚ peroxidaza.
Pentru legarea chimică a enzimei de anticorp, se folosesc numeroase tehnici; cea mai
cunoscută tehnică se relizează prin intermediul glutaraldehidei, care este o dialdehidă ce
poate interacționa simultan cu două grupe amino (NH 2) libere, existente în două lanțuri
glicoproteice distincte, corespunzătoare Ig și respectiv enzimei.

86
 Procesul chimic este o condensare, cu formarea unui conjugat imunoenzimatic, printr-un
proces de condensare:

Enz – NH2 + O = CH – (CH2)3 – CH = O + H2N – Ig Enz – N = CH – (CH2)3 – CH = N – Ig +

+ 2H2O
glutaraldehida conjugat imunoenzimatic
(de la acidul glutaric)

În conjugatul imunoenzimatic, sunt legate 2 specii macromoleculare printr-o punte de 5

atomi de C. Prin această legare covalentă, se modifică structurile (configurațiile și
conformațiile) ambelor specii macromoleculare, ceea ce conduce la diminuarea atât a
activității enzimatice, cât și a activității anticorpice.
Chiar și în aceste condiții de scădere accentuată a activității enzimatice, tehnica
imunoenzimatică este larg utilizată, datorită procesului de amplificare indus de acțiunea
enzimei asupra substratului.
Tehnica imunoenzimatică în care se utilizează enzima ca marker, poartă denumirea ELISA
(”Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”).

Izotopii radioactivi – tehnici izotopice:

Aceștia pot fi utilizați ca markeri, în urma legării lor de unul dintre reactanții
imunochimici; prin utilizarea acestor markeri, sunt dezvoltate tehnicile RIA (”Radio Immuno
Away”).
Izotopii radioactivi au capacitatea de a elibera energia sub formă de cuante și posedă
capacități penetrante în raport cu materia. Pentru exploatarea izotopilor radioactivi în tehnicile
imunochimice, se utilizează centrele de radiații și astfel, un izotop radioactiv legat direct de
specia imunochimică, se regăsește și în complexul Ag – Ac, care este astfel capabil să emită
radiații penetrante.
Ca și tehnica ELISA, RIA poate fi folosită în tehnicile calitative și cantitative, deoarece
radiațiile emise pot fi măsurate atât din punct de vedere al intensității, cât și al dimensiunilor.
În ELISA, determinarea calitativă presupune virajul de culoare, iar evidențierea cantitativă
presupune măsurarea intensității culorii la o lungime de undă dată.
Din punct de vedere al sensibilității, imunofluorescența prezintă sensibilități înalte,
comparativ cu toate tehnicile directe, însă în raport cu ELISA și RIA, sensibilitatea este mai
slabă.

87
 Comparativ cu ELISA, RIA prezintă sensibilitate mai mare; cu toate acestea, tehnica RIA
este din ce în ce mai puțin utilizată în evidențierile analitice, deoarece:
→ radiațiile penetrante pot interacționa cu organismele vii și pot induce dezvoltarea unor
afecțiuni patologice (cancer, boala iradierii);
→ costurile investițiilor pentru implementarea tehnicii RIA sunt foarte mari, pentru că
este nevoie de spații mari și protejate, precum și materiale speciale pentru protecția
operatorilor contra iradierii.
În prezent, RIA are o utilizare limitată în laboratoarele curente și tinde să fie eliminată ca
tehnică aplicabilă.

Metalele ca markeri – tehnici neizotopice:

Utilizarea metalelor ca tehnică imunochimică este o realizare de ultimă perioadă și constă
în legarea metalului direct de unul dintre reactanții imunochimici.
De regulă, metalul este prețios (foarte scump) și se folosește sub formă coloidală sau de
nanoparticule și necesită microscopie electronică pentru desfășurarea procesului.
Chiar dacă această tehnică prezintă sensibilități apropiate de cele RIA, în practica analitică
se utilizează doar în laboratoarele specializate, datorită costurilor foarte mari ale instalațiilor
de microscopie electronică.

13.2. Metodele imunochimice indirecte - tehnici realizate pe fază solidă

În contrast cu tehnicile din chimia generală sau biochimie, în care interacţiile se

desfăşoară preponderent în fază omogenă, în microbiologie şi imunochimie se utilizează cu
predilecţie tehnicile pe fază solidă (în sistem heterogen) în care speciile imunochimice pot
fi sau nu marcate. În tehnicile realizate pe fază solidă, prima operaţie este căptuşirea
(acoperirea) acesteia cu unul dintre reactanţii imunochimici.
În operaţia de căptuşire, reactantul imunochimic este fixat pe suprafaţa solidă prin
intermediul forţelor de natură slabă şi din această cauză toate celelalte operaţii care se
efectuează în procesul de evidenţiere trebuie să protejeze aceste interacţii în vederea
menţinerii lor.
În tehnicile directe de evidenţiere, antigenul din proba de analizat căptuşeşte suprafaţa
solidă şi peste acesta se adaugă conjugatul imun (imunoglobulina marcată). Dacă între cele
două specii imune se realizează interacţia antige-anticorp (interacţie specifică), prin

88
intermediul markerului utilizat, aceasta poate fi evidenţiată. Această tehnică este puţin
utilizată şi este înlocuită de celelalte tehnici de evidenţiere.
În tehnica indirectă, un anticorp secundar marcat este utilizat pentru evidenţierea
interacţiei unui anticorp primar cu antigenul de căptuşire, prezent în proba de analizat.
Anticorpul secundar este o imunoglobulină biosintetizată într-o specie, rezultată în urma
stimulării antigenice cu imunoglobulina primară, care aparţine altei specii (anticorp
antianticorp).
Interacţia dintre anticorpul primar şi secundar este considerată o etapă de amplificare a
procesului imunochimic, deoarece fiecare anticorp primar legat de antigenul de căptuşire, este
capabil să lege alte molecule de anticorpi secundari, ceea ce determină creşterea sensibilităţii
de evidenţiere.
Marele avantaj al tehnicilor indirecte constă în faptul că anticorpii secundari marcaţi,
pot fi utilizaţi pentru evidenţierea analitică a oricărui tip de anticorpi primari proveniţi de la
aceeaşi specie, sau antigene specifice acestora
Comparativ cu tehnica directă de evidenţiere analitică, tehnica indirectă prezintă
specificitate diminuată datorită:
- posibilităţii prezenţei în serurile antiimunoglobulinice a unor anticorpi care pot
interacţiona încrucişat cu imunoglobulinele celeilalte specii;
- posibilităţii prezenţei unor anticorpi datoraţi unor infecţii acute ale animalului, pe
care s-au preparat antiserurile.

13.2.1. Tipuri de tehnici imunochimice indirecte

Tehnicile realizate pe fază solidă pot fi grupate în
✔ directe;
✔ indirecte;
✔ sandwich;
✔ competitive.

Tehnicile sandwich sunt utilizate exclusiv pentru evidenţierea analitică a antigenelor

(ca şi tehnicile directe sau indirecte) din diverse produse: sânge (plasmă, ser); urină; salivă;
alte lichide biologice sau extracte; extracte de produse agricole şi alimentare.

89
 Tehnici realizate pe faze solide, metode care utilizează specii imunochimice marcate
Evidenţierea antigenului Evidenţierea anticorpului

Direct M Competiţie
M
proba Anticorp
proba

Indirect Indirect Antigen

M M

M
proba Marker
proba

Sandwich Captură
M

M Anticorp din
probă
proba
proba
Antigen din
probă

Principiul acestor tehnici constă în faptul că anticorpii adsorbiţi pe faza solidă (de
căptuşire) interacţionează şi concentrează antigenele din probele de analizat, care apoi pot fi
evidenţiaţi direct cu un anticorp marcat, sau indirect prin aplicarea anticorpului corespunzător,
urmată de aplicarea unui anticorp antiimunoglobulină marcat.
Tehnicile sandwich prezintă sensibilitate relativ înaltă, iar specificitatea este net superioară
tehnicilor indirecte.
Dacă tehnicile directe, indirecte şi sandwich urmăresc cu predilecţie evidenţierea
antigenelor din probele de analizat (excepţie făcând doar tehnicile indirecte prin care se
puteau evidenţia şi anticorpii din probele de analizat) tehnicile prin competiţie şi prin
captură de anticorpi urmăresc exclusiv evidenţierea analitică a anticorpilor din probele de
analizat.

90
 În tehnicile prin competiţie, anticorpii specifici din probele de analizat sunt detectaţi
prin abilitatea lor de a inhiba legarea anticorpilor de referinţă, marcaţi, la nivelul aceluiaşi
antigen. În acest caz este o corelaţie inversă între prezenţa anticorpilor în proba de analizat şi
intensitatea semnalului dat de anticorpii de referinţă, care interacţionează cu antigenul
cunoscut, utilizat în căptuşirea suprafeţei solide
Nu numai concentraţia anticorpilor influenţează rezultatul obţinut, ci şi aviditatea
anticorpilor, deoarece anticorpii de referinţă prezintă o aviditate mai mică pentru antigen,
comparativ cu anticorpii din proba de analizat.
Tehnicile prin competiţie se utilizează larg pentru screening şi pun mai puţine
probleme de reacţii imunochimice încrucişate (reacţii fals pozitive) decât celelalte tehnici,
deoarece anticorpii marcaţi şi antigenele cunoscute sunt omoloage.
În tehnicile prin captură de anticorpi, faza solidă este căptuşită cu
antiimunoglobulină specifică (anti IgG sau anti IgM) şi apoi se adaugă proba de analizat în
vederea captării anticorpilor şi realizarea interacţiei antigen-anticorp.
Evidenţierea anticorpilor specifice se realizează prin adăugarea antigenului omolog,
cunoscut, urmată de adăugarea anticorpilor marcaţi, antiantigen omolog.
Fazele solide utilizate în tehnicile de evidenţiere a interacţiei antige-anticorp cu
reactanţi imunochimici marcaţi, pot fi: sticla; celuloza; sepharose; policlorura de vinil;
polistirenul. Aceste faze solide pot fi sub forma unor tuburi sau plăci, care pot fi prevăzute cu
godeuri, care pot fi umplute cu soluţiile reactanţilor imunochimici.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H

Figura 13.2. Placă cu godeuri utilizată ca fază solidă în evidenţierile imunochimice

Plăcile standard utilizate ca faze solide sunt constituite din 8 x 12 godeuri, compactate pe o
suprafaţă mică, în care volumele fiecărui godeu au 100-200 μL.

91
 Pregătirea suprafeţelor fazelor solide este de mare importanţă pentru eliminarea sau
diminuarea erorilor de măsură
Căptuşirea godeurilor cu una din speciile imunochimice se realizează prin adsorbţie, prin
intermediul forţelor de natură necovalentă: interacţii electrostatice (legături de hidrogen);
interacţii hidrofobe.
Caracteristica tuturor tehnicilor efectuate pe fază solidă se referă la faptul că rezultatele
cele mai bune se obţin atunci când concentraţiile speciilor imunochimice care interacţionează
trebuie să fie la valori cât mai joase, pentru eliminarea interacţiilor nespecifice.

13.3. Principalele metodele imunochimice indirecte

13.3.1. Imunofluorescenţa (IFA)

Imunofluorescenţa (immunofluorescence) este o tehnică de evidenţiere indirectă a

antigenelor, în prezenţa unor anticorpi marcaţi cu fluorocromi.
Fluorocromii sunt substanţe incolore în condiţii normale, dar care în prezenţa radiaţiilor
din domeniul ultraviolet (UV) de energie înaltă, pot emite radiaţii din domeniul vizibil (VIS)
de energie mai slabă şi astfel să apară colorate. Cealaltă parte de energie se va disipa în
sistem, sub formă de căldură (efect termic).
Fluorocromii utilizaţi în imunochimie pentru marcarea proteinelor, trebuie să posede
grupări funcţionale care să fie capabile să realizeze legături covalente stabile prin reacţii
simple şi rapide, iar lumina emisă trebuie să fie puternică.
Printre fluorocromii utilizaţi în marcarea reactanţilor imunochimici sunt:
- izocianatul de fluoresceină;
- izotiocianatul de fluoresceină;
- izotiocianatul de tetrametilrodamină;
- umbeliferona;
- chelaţi ai lantanidelor
Cel mai utilizat marker de fluorescenţă este izotiocianatul de fluoresceină (F-N=C=S),
care interacţionează prin intermediul grupării funcţionale izotiocianat cu gruparea amino
liberă din lanţurile polipeptidice (R-NH2), provenită din resturile lisinice:

92
 R – NH2 + S = C = N – F R – NH – C – NH – F

Chelaţii lantanidelor au timpul de viaţă pentru emisia în fluorescenţă mai lung (100 μs)
decâ al celorlalţi fluorocromi şi de aceea determină o înaltă sensibilitate şi specificitate a
testului (zgomotul de fond în fluorescenţă are un timp de viaţă foarte
scurt).Imunofluorescenţa se realizează practic după fixarea probei de analizat pe o lamă de
microscop, prin microscopie in ultraviolet.
Principalele etape ale acestei metode sunt următoarele:
a) pe o lamă de microscop se etalează (fixează) proba de analizat, care ar putea să conțină
antigenul căutat;
b) după fixarea probei, se adaugă acesteia anticorpul specific antigenului căutat;
c) lama se incubează pentru desăvârșirea interacției Ag – Ac („over night”);
d) după expirarea timpului de incubare lama se spală intensiv, pentru eliminarea
excedentului de anticorpi marcat;
e) lama astfel pregătită se introduce în microscopul cu fluorescență, unde este iradiată cu
radiații UV;
f) în urma iradierii se produce fenomenul de fluorescență (numai dacă a existat interacția
Ag - Ac) și ca urmare a emisiei de radiație în domeniul VIS, lama apare colorată la
microscop; dacă interacția Ag – Ac nu are loc, fenomenul imunofluorescenței nu este prezent
pe lamă și în urma iradierii cu UV, lama nu se colorează:

13.3.2. Tehnica RIA (Radioimmunoassay)

Prin marcarea speciilor imunochimice cu izotopi radioactivi s-au pus bazele tehnicii
radioimunometrice (radioimmunoassay) de înaltă sensibilitate (RIA).
Emisia radioactivă a izotopilor este contorizată cu γ-spectrofotometre cu cristale de
iodură de sodiu, în care cantitatea de radioactivitate detectată (counts/minut) este direct
proporţională cu cantitatea de specie imună marcată, care a reacţionat imunochimic.[9]
125
Izotopii cei mai utilizaţi pentru marcarea speciilor imunochimice sunt: I de energie
joasă şi 3H, 14C, 32P, 35S, ocazional utilizaţi.
Radioiodurarea, în raport cu ceilalţi markeri radioactivi, prezintă avantajul unei emisii
de mare viteză, care determină o sensibilitate înaltă de evidenţiere.

93
 Chiar dacă sensibilitatea tehnicilor radiometrice este mai mare decât a celorlalte
tehnici imunochimice, RIA se utilizează rar, datorită potenţialului de iradiere pentru
personalul care manipulează reactivii şi datorită costurilor foarte mari necesare protecţiei faţă
de radiaţi, chiar dacă acestea posedă energii joase (aproximativ 35 keV).

14. Tehnici imunoenzimatice

Tehnicile imunoenzimatice sunt cele mai utilizate, datorită simplităţii de aplicare şi

sensibilităţii lor deosebite.
Utilizarea anticorpilor sau antigenelor marcate cu enzime (conjugate imunoenzimatice)
necesită prezenţa unor substraturi, asupra cărora să acţioneze enzimele legate chimic, pentru
convertirea lor în produşi coloraţi.
Reacţia de culoare dezvoltată astfel, poate fi apreciată vizual sau poate fi măsurată la
lungimi de undă bine determinate, cu ajutorul spectrofotometrelor.
Pentru ca o enzimă să fie utilizată în tehnicile imunoenzimatice, trebuie să îndeplinească
unele caracteristici:
- obţinerea în condiţii de puritate avansată şi relativ uşoară;
- stabilitate termică;
- conservarea activităţii specifice după cuplarea cu reactantul imunochimic;
- absenţa enzimei din mediile biologice studiate;
- absenţa inhibitorilor sau activatorilor enzimatici în mediile biologice studiate.
Reactanţii utilizaţi în tehnicile imunoenzimatice nu necesită restricţii de manipulare sau de
păstrare şi din acesată cauză, sunt larg utilizaţi în evidenţierea analitică indirectă a speciilor
imunochimice din probele biologice.
Legarea covalentă a enzimelor (glicoproteine) de unul din reactanţii imunochimici, tot de
natură proteică, pentru obţinerea conjugatului imun, se poate realiza prin utilizarea unor
substanţe capabile să reacţioneze simultan cu cele două specii, prin intermediul grupărilor
amino libere prezente în lanţurile polipeptidice, provenite din resturile lisinice.

94
 Enzime şi substraturi utilizate în tehnicile imunoenzimatice

Culoarea
Enzima Substratul
dezvoltată
Acid 5-aminosalicilic Brun
Peroxidaza o-Fenilendiamina Brun
(HRP) 4-Cl-1-naftol Albastru
o-Dianisidină Galben-orange
Fosfataza p-Nitrofenilfosfat Galben
alcalină (PAL) 5-Br-4Cl-3-Indolilfosfat Albastru
Ureaza Purpură de bromcrezol şi uree Galben

Cea mai utilizată substanţă pentru obţinerea conjugatelor imnunoenzimatice este

glutaraldehida:

Enz – NH2 + O = CH – (CH2)3 – CH = O + H2N – Ig

Enz – N = CH – (CH2)3 – CH = N – Ig

Datorită modificărilor configuraţionale şi conformaţionale ale enzimei şi imunoglobulinei

din conjugatul imunoenzimatic, activităţile enzimatice şi anticorpice se diminuează
substanţial, faţă de enzima sau imunoglobulina libere.

14.2. Tehnica ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Titrarea imunoenzimatică este una din cele mai cunoscute tehnici imunoenzimatice
utilizată pe scară largă în ştiinţă (a fost pentru prima dată aplicată în anul 1972 de către
cercetătorii Engvall şi Perlman).
Aplicarea tehnicii ELISA- variantele sandwich şi indirectă sunt prezentate în figurile
următoare:

95
 Proba Anticorp

Conjugat Antigen

E E
Substrat Conjugat imun

Reacţie pozitivă

E E
Reacţie negativă

Figura 14.1. Principalele etape din tehnica ELISA, varianta sandwich.

Dacă în ELISA varianta sandwich se realizează căptuşirea godeurilor cu imunoglobulină

cunoscută, în varianta indirectă, căptuşirea se realizează cu antigen cunoscut, iar probele de
analizat conţin antigene şi respectiv anticorpi. În ELISA varianta sandwich se titrează
antigenele, în timp ce în varianta indirectă se titrează anticorpii prezenţi în probele de analizat.

96
 Anticorp

Antigen

E
Conjugat

E E

Reacţie pozitivă

E E

Reacţie negativă

Figura 14.2. Principalele etape din tehnica ELISA, varianta indirectă.

14.3. Immunobloting (western blotting)

Tehnica immunoblotting, constă în etalarea fracţiilor antigenice prin electroforeză în gel de

poliacrilamidă, urmată de transferul acestora pe o membrană (uzual nitroceluloză), în prezenţa
unui câmp electric continuu.
După blocarea situsurilor de legare a proteinelor de pe membrană prin incubare cu o
proteină (gelatină sau albumină), sau prin adaosul unui detergent neionic (Tween 20), fracţiile
transferate, sub forma unor benzi, sunt incubate prin adaosul probei de studiat.

97
 SDS-PAGE

Electroblotting

Tween 20

Blocare situsuri

Proba

Interacţia Ag-Ac

M
Conjugat

Interacţia cu conjugatul

Evidenţiere

Figua 14.3. Schema de principiu în tehnica immunoblotting.

Anticorpii (dacă sunt) din proba de studiat, vor interacţiona cu antigenele specifice
prezente în fracţiile transferate şi vor constitui complexe imune, care vor fi vizualizate prin
adaosul unei imunoglobuline antiimunoglobulină, marcată cu unul din markerii cunoscuţi:
izotop radioactiv, fluorocrom, enzimă
Avantajul utilizării membranelor constă în capacitatea mare de legare prin adsorbţie a
amestecurilor complexe şi difuzia limitată a fracţiilor etalate anterior prin electoforeză.
O aplicare simplificată a immunoblotting-ului este dot-immunoblotting-ul, în care etalarea
fracţiilor proteice antigenice nu se mai realizează prin electroforeză, ci antigenul este depus
direct pe membrană.

98
 14.4. Imunoluminescenţa (LIA)

Evidenţierea analitică indirectă a interacţiei antigen-anticorp se poate realiza şi prin

utilizarea chemiluminescenţei şi bioluminescenţei.
Chemiluminescenţa este emisia de lumină ca rezultat al unei reacţii chimice, în urma
căreia se formează un compus în stare excitată, la temperaturi joase, care prin transformarea
în starea fundamentală energetic, emite surplusul de energie sub forma unei radiaţii
luminoase.
Astfel, chemiluminescenţa poate fi definită ca fluorescenţa unui produs excitat electronic,
al unei reacţii chimice, iar spre deosebire de fluorescenţă, ea nu necesită o sursă externă de
radiaţie.
Chemiluminescenţa se produce atunci când reacţia chimică este puternic exergonică, când
se obţine produsul de reacţie într-o stare de excitare electronică, iar această reacţie este
întotdeauna de oxidare şi cu puţine excepţii, agentul oxidant este oxigenul molecular, sau
peroxidul de hidrogen (apa oxigenată).
Moleculele care suferă procesul de chemiluminescenţă sunt în general în stare redusă, care
pot fi uşor oxidate şi care conţin grupări funcţionale amino, hidroxil sau sisteme aromatice
policiclice.
Bioluminescenţa este emisia rezultată prin oxidarea unor substraturi specifice (luciferine)
în prezenţa unor enzime (luciferaze) sau a unor fotoproteine.
Luciferazele reacţionează cu substraturile şi oxigenul molecular cu formarea unor
intermediari în stare excitată, care emit radiaţii luminoase în urma rearanjării moleculare şi
revenirii la starea fundamentală.
Radiaţia luminoasă emisă prin chemiluminescenţă sau bioluminescenţă aparţine
intervalului din domeniul UV apropiat, până în domeniul infraroşu.
În general, majoritatea reacţiilor puternic exergonice emit radiaţii cu lungimi de undă mici
(albastru), în timp ce puţine reacţii chimice emit radiaţii cu lungimi de undă mari (verde şi rar
roşu).
Analizele bazate pe chemiluminescenţă sau bioluminescenţă sunt simple, ieftine şi prezintă
sensibilităţi înalte (limita de detecţie putând să atingă 10-15 mol/L ).
Tehnicile indirecte de evidenţiere a interacţiei antigen-anticorp prin intermediul markerilor
de bioluminescenţă, utilizează luciferaza ca merker al unuia dintre reactanţii imunochimici,
iar substratul folosit este luciferina şi ATP, sau luciferina şi NADP+.

99
 Transformarea catalitică în prezenţa oxigenului molecular a luciferinei în oxiluciferină, se
realizează cu emisia unei radiaţii luminoase cu lungimea de undă de 560 nm, care poate fi
măsurată cu ajutorul luminometrelor.
În ultima perioadă, creşterea sensibilităţii metodelor de evidenţiere a interacţiei antigen-
anticorp s-a realizat prin cuplarea proceselor de separare electroforetică pe gel, a unuia dintre
reactanţii imunochimici, cu detecţia cu ajutorul celuilalt reactant imunochimic marcat, printr-
una din tehnicile discutate anterior.
Etalarea moleculelor antigenului prin electroforeza în gel de poliacrilamidă, în prezenţa
dodecil sulfatului (SDS-PAGE), pe baza mobilităţii electroforetice, urmată de acoperirea
directă a gelului cu anticorpi marcaţi şi incubarea sistemului în vederea realizării interacţiei
imunochimice (imunofixarea), a fost un prim pas în realizarea creşterii sensibilităţii de
evidenţiere prin tehnici cuplate.
Utilizarea unor tehnici de incubare lungi induce difuzia benzilor pe gel, care determină
scăderea pronunţată a rezoluţiei de separare.

O2
ATP ADP
Luciferină Aciladenilat Oxiluciferină
(stare excitată)
Luciferază Luciferază

hν

Oxiluciferină
(stare fundamentală)

Figura 14.4. Fenomenul de bioluminescenţa în prezenţa luciferazei.

100