CAP.

1 INTRODUCERE

Enzimele sunt catalizatori biologici de regulă proteine simple sau

complexe, care catalizează reacţiile ce se petrec în organismele vii şi sunt
produse de celule vii:
- sunt substanţe solubile în apă (cu excepţia lipazelor) formând
soluţii coloidale

Holoproteide
Enzime
Heteroproteide

- sunt caracterizate prin posibilitatea de a cataliza reacţii în

soluţii apoase acide, neutre sau alcaline, la temperatură
obişnuită şi presiune normală.
- au fost utilizate de oameni din cele mai vechi timpuri înainte de
a li se cunoaşte structura. Folosirea lor a fost mult extinsă în
ultimele decenii în domenii ca: industria alimentară, textilă,
medicină, biotehnologii, farmaceutică, etc.
Deşi foarte eficiente în procesul de cataliză enzimele prezintă
dezavantajul că sunt în general instabile la temperaturi mari şi în prezenţa
unor cationi şi anioni. Enzima se poate denatura prin variaţia pH – ului sau în
urma diferitelor tratamente fizice şi chimice la care este supusă.
Pentru a elimina aceste dezavantaje, cercetătorii au încercat să fixeze
enzima pe suporturi solide de diferite naturi, folosindu-se în acest scop de
proprietăţile lor fizice.
Welson şi Griffin au fost primii cercetători care au descoperit că o
enzimă fixată pe suport îşi păstrează activitatea enzimatică.
În ceea ce priveşte provenienţa enzimelor sunt preferate enzime
microbiene.
Avantaje:
1) au un preţ de cost redus;
2) timp de producere scurt;
3) permite industrializarea procedeelor de obţinere;
4) nu condiţionează producţia de enzimă de alţi parametri(climă,
sezon, altitudine, etc.)
Enzimele pot clasificate în două categorii:
- intracelulare (trebuie extrase după dezintegrarea celulei)
- extracelulare (când se regăsesc în mediul de cultură al
microorganismului respectiv)
Chibata (1973) a prezentat prima dată în lume imobilizarea de celule
microbiene în scopul producerii acidului L – aspartic.

1
 Pentru manifestarea activităţii catalitice a unei enzime este necesară
conformaţiei specifice centrului catalitic activ, care interacţionează cu
substratul. Centrul catalitic activ prezintă o conformaţie tridimensională
necesară pentru exprimarea activităţii catalitice.
De aceea imobilizarea enzimelor trebuie realizată astfel încât să nu fie
afectată conformaţia tridimensională a centrului activ, ceea ce ar avea efect
scăderea dramatică a activităţii enzimei imobilizate.
Grupările funcţionale ale moleculelor de enzimă implicate în
imobilizare sunt:
- grupările amino - libere ;
- grupările carboxil ;
- grupările sulfihdril ale cisteinei;
- grupările inidazol ale histidinei;
- grupările fenolice;
- grupările hidroxil ale serinei şi treoninei;
Pentru menţinerea activităţii enzimatice este important ca grupările
funcţionale din centrul activ să nu participe la imobilizare.

2
 2. Metode de imobilizarea a enzimelor

2.1 Clasificarea enzimelor imobilizate

Enzimele imobilizate sunt definite ca „ enzime fizic limitate sau

localizate într-o regiune definită a spaţiului cu păstrarea activităţii lor
enzimatice şi care pot fi folosite continuu şi repetat. Enzimele sunt
imobilizate pe suporturi şi sunt aduse într-o formă insolubilă în apă.
Sistemul de clasificare este următorul:
Clasificarea metodei de imobilizare a enzimelor

Metode

A Metode de a B Metode de legare

enzimei pe suport pe un suport sensibil
insolubil în apă în apă

Legare Fixare -
imobilizare

Imobilizare Fibre Micro

Reticulare gel perforate încapsulare

Legare de un
suport

Adsorbţie Legare Legare Legare

fizică covalentă metalică covalentă

3
Componentele majore folosite în procesul de imobilizare sunt:
 enzima;
 matricea;
 modul de interacţiune al enzimei cu suportul;
După enzimă, cea mai importantă componentă ce contribuie la
performanţa sistemului este suportul.
Un suport bine ales poate contribui la stabilitatea operaţională a
enzimei imobilizate. Deşii, se ştie că nu există un suport universal, un anumit
număr de caractere ar trebui să fie enzimele de imobilizare.
Proprietăţi ale suportului:
- suprafaţa specifică mare ;
- permeabilitate;
- caracter hidrolitic;
- insolubil în apă;
- să aibă stabilitate chimică şi termică;
- rigiditate înaltă a particulelor;
- rezistenţă la atacul microbian;
- regenerabilitate;
- netoxic;
- preţ scăzut;
Suportul poate fi:
- membranar;
- insolubil în apă;
- matrice polimeră;
În funcţie de compoziţie suporturile pot fi clasificate:

poros
morfologic neporos
tip gel

chimic

La alegerea unui suport trebuie să se ţină cont de o serie de proprietăţi

ale matricii, ca:
poroase
 morfologie
neporoase

 compoziţie
În funcţie de compoziţia lor, suporturile pot fi clasificate în suporturi
organice şi anorganice

4
 2.2.1 Clasificarea morfologică

2.2.1.1 Matricile neporoase

- prezintă de obicei un dezavantaj major pentru imobilizarea

enzimelor. Suprafaţa suporturilor fără pori, este foarte mică şi de
aceea suprafaţa disponibilă pentru cuplarea enzimelor este limitată.
Pentru a creşte gradul de vizualizare a enzimelor, pot fi folosite
particule sau fibre foarte fine. În acest ultim caz, apar dificultăţi deoarece
aceste particule fine sunt greu de separat din reacţia în care au fost implicate
şi pot fi utilizate cu dificultate într-o reacţie continuă, deoarece determină
creşterea presiunii şi scăderea vitezei de curgere a fluidului.
Un avantaj major al acestor suporturi neporoase este următorul:
- difuziunea componentelor primare în componentele solubile poate fi
redusă sau chiar eliminată prin micşorarea dimensiunii particolelor
sau prin creşterea presiunii fluidului. Acest fenomen are loc în
momentul în care enzima este deja imobilizată pe suprafaţa externă
a suportului şi este în contact cu mediul înconjurător.

2.2.1.2 Matrici poroase

Ambele tipuri de matrici poroase, organice şi anorganice, au o mare

suprafaţă externă pe unitate de masă, iar acest lucru le face ideale pentru
reactoarele industriale.
Dezavantajul major al acestor suporturi poroase, este că mare parte din
suprafaţa disponibilă cuplării enzimelor se află în interior.
Suporturile poroase au fie o mare, fie o controlată distribuţie a porilor.
În cazul suporturilor cu mulţi pori, numai o limitare a numărului de pori ar
putea permite o acomodare a ambelor componente: enzima şi substratul şi
doar o mică porţiune din toată suprafaţa să fie efectiv folosită.

5
 Tabel 1. Compararea suporturilor
Clasificare Avantaje Dezavantaje
morfologică
Neporoase - difuziune limitată - suprafaţă de acţiune mică;
- încărcare mică de enzime;
- folosirea de particule
foarte fine,
- dificultăţi la manipulare;
- dificultăţi la conducerea
procesului;
- viteză de curgere limitată;
- presiune înaltă;
Poroase - suprafaţă mare de - suprafaţă internă mare;
acţiune; - difuziune mare,
- încărcare mare de - cost ridicat;
enzimă; - presiune mare;
- protecţia cestora faţă de
mediul înconjurător

2.2.2. Clasificarea chimică

Suporturile pot fi clasificate în funcţie de compoziţia lor chimică:

organice
naturale

anorganice care la rândul lor pot fi clasificate în

sintetice
 Suporturile anorganice naturale:

 polimerii naturali

- sunt cele mai frecvent folosite suporturi, toate fiind polizaharide,

în special cele constituite din celuloză şi alge, fiind folosite atât
pentru entrapare cât şi pentru cuplarea enzimelor

 proteinele inerte , fără activitate enzimatică, au fost

folosite la diferite metode de imobilizare cum ar fi:
- complexarea enzimelor cu colagen;
- entraparea enzimelor cu ajutorul matricelor gelatinoase;

6
 - reticularea enzimelor cu sau fără suport preexistent.

Suporturile proteice au mai multe avantaje:

 natura lor hidrofilă;

 manevrare uşoară la imobilizare;

Stabilitatea chimică, mecanică şi termică depinde de natura lor.

Suporturile proteice sunt obiectul atacului microbian şi regenerarea este
imposibilă. Cele mai folosite suporturi proteice sunt : - colagenul
- gelatina;
- albumina

Colagenul
Este cel mai abundent constituent proteic al vertebratelor superioare.
Este foarte uşor de izolat, din foarte multe surse biologice şi poate fi
reconstituit în diferite forme fără să-şi piardă structura nativă. Colagenul are
numeroase avantaje ca şi suport de imobilizare a enzimelor: natura proteică
insolubilă face posibilă o puternică absorbţie fizică a enzimelor.
Gelatina
Are proprietăţi care o fac atractivă ca suport pentru imobilizarea
enzimelor. Este uşor de obţinut

7
 2.3.4 Entraparea

2.3..4.1 Entraparea în gel

Metoda de entrapare în gel implică prinderea enzimelor înăuntrul

spaţiilor interstiţiale ale gelului polimeric insolubil în apă.
Reţeaua polimerică poate fi obţinută din monomeri şi precursori oligo
sau polimerici prin schimbarea parametrilor de solubilitate cu solventul,
temperatura, tăria ionică şi pH-ul dar ţinând cont de reacţia de reticulare.
Tipurile de entrapare care pot fi discutate sunt:

A. – entraparea în gel cu precursori monomerici ;

B. entraparea în gel cu precursori oligomerici;
C. entraparea în gel cu lanţuri polimerice lungi;

2.3.4.2 Entraparea prin includerea în poliacrilamidă

Includerea în poliacrilamidă reticulată a fost prima tehnică de entrapare

utilizată pentru imobilizarea enzimelor:
- Tripsină;
- Chimiotripsină;
- Papaină;
-  - amilază;
Procedeul de formare a poliacrilamidei se bazează pe polimerizarea
radicalică în soluţie apoasă, a unei enzime solubile, folosind ca agent de
reticulare de obiceim n- metilen – bisacrilamida (B.I.S.).
Polimerizarea este iniţiată cu persuflat de sodiu sau riboflavină şi este
catalizată de -dimetilaminoproprionitril (DM. APN) sau N, N, N`, N
tetrametiletilendiamină (TEMED). Blocul de gel rezultat poate fi dispersat
mecanic în particule de diferite dimensiuni. Aceste geluri sunt foarte slabe din
punct de vedere mecanic şi sunt constituite din reţele cu o largă distribuţie a
porilor.
Dezavantajele metodei se elimină prin optimizarea gradului de
înlănţuire.
Pentru polimerizarea acrilamidei au fost folosite razele X şi radiaţiile.
Gelul pentru entrapare a fost produs îngheţând soluţia de monomer şi enzimă
la –50 C şi polimerizând compoziţia rezultată prin iradiere cu surse de 60Co
şi 166Co.
Dezavantajele privesc costul procesării şi al echipamentului necesar.

8
 2.3.4.3 Entraparea în geluri din precursori oligomerici

Prepararea polimerilor din fracţiuni oligomerice faţă de cea din

monomeri prezintă unele avantaje:
- numărul moleculelor din sistem este mic;
- dimensiunea lor este mare;
- intensitatea reacţiei este redusă în comparaţie cu gradul de
polimerizare al precursorului.
Lungimea lanţurilor oligomerice poate controla porozitatea gelului, iar
compoziţia chimică a precursorului de polietilenglicol determină
hidrofilicitatea matricei.
Avantajele acestei metode constau într-o bună stabilitate chimică şi
mecanică în diferite structuri geometrice.

2.3.4.4 Entraparea în geluri cu lanţuri polimerice lungi

Pe lângă polimerii sintetici, entraparea în gel a enzimelor s-a făcut şi în

geluri produse natural, cele mai importante fiind:

colagenul
- protenele
gelatina

agar
alginat de calciu
- polizaharidele
chitosan
K caragena

Enzimele entrapate în geluri se pot obţine prin diferite mecanisme de

formare a reţelei cu ar fi:
 entraparea prin formare de reţele ionice,

este un exemplu de tehnică de polimerizare de polielectroliţi cu ioni

multivalenţi. Această metodă este foarte uşor adaptabilă, utilizează
componente toxice, de aceea se utilizează preferenţial pentru imobilizarea
celulelor vii şi pentru celulele foarte sensibile cum sunt cele ale plantelor şi
protoplastele, în special când se foloseşte ca suport alginatul de calciu.
 entraparea prin precipitare,

se realizează prin precipitarea unor polimeri sintetici sau naturali prin

schimbarea unuia sau a mai multor parametri ai soluţiei cum sunt
temperatura, salinitatea, pH-ul sau solventul.

9
 Enzimele au fost imobilizate în colagen prin trei metode:
- complexare;
- impregnare;
- electrodepunere.

2.3.4.5 Entraparea în fibre sintetice

Este o metodă de utilizare a enzimelor, prin entraparea lor în

microcavităţile fibrelor sintetice, fiind descoperită de Dinelli în 1972. Fixarea
fizică a enzimelor se realizează prin dizolvarea fibrelor polimerice (triacetat
de celuloză) într-un solvent organic nemiscibil cu apa (cloroform, tetraclorură
de carbon) şi emulsionarea acestei soluţii cu soluţia apoasă a enzimei.
Emulsia este scufundată într-un lichid coagulant (toluen eter ), polimerul
precipitând în forme filamentoase.
Această metodă oferă numeroase avantaje, fibrele sunt rezistente la
acizi slabi şi alcali şi au o mare putere ionică.
Entraparea în fibre a enzimelor are aplicaţii în industria farmaceutică şi
în cea alimetară.

2.3.5 Microîncapsularea

Enzimele pot fi imobilizate în microcapsule preparate din polimeri

organici. Membrana, care include enzima, este semipermeabilă, pentru
substrat şi pentru produs.
Printre avantajele acestei metode de imobilizare se include o foarte
mare suprafaţă exterioară de contact a substratului cu enzima, un volum
relativ mic şi posibilităţi de realizare a imobilizării simultane a diferitor
enzime într-o singură etapă, indiferent dacă enzimele solubile au fost
mobilizate prin alte metode.
Principalele dezavantaje ale metodei sunt:
 ea nu poate fi aplicată în cazurile în care substratul are o greutate
moleculară mare :
 inactivarea ocazională a enzimelor, în cursul procedurii de
imobilizare;
 enzimele pot fi încorporate într-o membrană groasă;
Tehnicile de obţinere ale enzimelor microcapsulate pot fi clasificate în
4 categorii:
a) separarea fazelor;
b) polimerizarea interfazială;
c) membrane lichid – surfactant;
d) metoda uscării;

10
 2.3.5.1 Separarea fazelor

Numeroase enzime au fost microîncapsulate prin separarea fazelor.

Fenomenul fizic folosit pentru purificarea polimerilor, implică
dizolvarea acestora într-un solvent organic, urmat de reprecipitarea prin adiţia
unui alt solvent care este miscibil cu primul, dar care nu dizolvă polimerul.
Pentru imobilizarea enzimelor prin această tehnică, soluţia apoasă de enzimă
este prima oară emulsionată într-un solvent organic insolubil în apă, care
conţine polimerul şi la faza organică care conţine micropicături, se adaugă
încet sub agitare un alt solvent organic în care polimerul nu este solubil.
Polimerul este astfel concentrat şi sedimentează în jurul micropicăturilor de
soluţie apoasă enzimatică.
Dezavantajul metodei constă în dificultatea scoaterii complete a
solventului organic rămas pe membrana polimerului.

2.3.5.2 Metoda de polimerizare la interfaţă

Metoda se bazează pe procese chimice şi anume pe sinteza un

copolimeri insolubili în apă la interfaţa picăturii. Un monomer cu
comportament hidrofil este parţial solubil în ambele faze: organică şi apoasă.
Alt monomer este hidrofob fiind solubil numai în faza organică. Aceşti doi
monomeri, polimerizează la nivelul interfeţei rezultând un copolimer, o
membrană semipermeabilă.
Această metodă este foarte asemănătoare cu metoda separării fazelor: o
soluţie apoasă de enzimă şi un monomer hidrofil sunt emulsionate într-un
solvent organic nemiscibil în apă. În emulsie, monomerul hidrofil este
adăugat încet, agitând emulsia.
Polimerizarea prin condensare sau adiţie a celor doi monomeri, produce
o interfaţă între faza apoasă şi cea organică a solventului în cadrul emulsiei.
Prin această metodă, enzimele din faza apoasă sunt incluse într-o
membrană semipermeabilă alcătuită din copolimer.

2.3.5.3 Metoda uscării (evaporarea)

Metoda uscării se bazează pe microîncapsularea enzimei prin dispersia

într-o soluţie organică, nemiscibilă în apă a unui polimer urmată apoi de
dispersia într-o soluţie apoasă şi apoi de uscare. Soluţia enzimatică este
emulsionată într-un solvent organic ce are punctul de fierbere mai mare decât
apa (benzen, ciclohexan, cloroform), care conţine polimeri ce formează
membrana folosind un surfactant hiposolubil. Această emulsie conţine
micropicături de fază apoase enzimatică dispersată în mediul apos ce conţine
substanţe protectoare coloidale (gelatină, surfactanţi).

11
 În final, se obţine microincapsularea enzimelor prin eliminarea
solventului.
Avantajele majore ale metodei constau în următoarele:
- slaba sau lipsa totală a inactivării enzimelor în decursul
formării membranei;
- nu sunt necesari agenţi de activare ca în cazul polimerizării
interfazice;

12
 CAP. 3 EFECTELE METODELOR DE IMOBILIZARE
ASUPRA CINETICII ŞI PROPRIETĂŢILOR
ENZIMELOR

Imobilizarea poate schimba cinetica şi alte proprietăţi ale enzimelor, de

obicei prin scăderea activităţi specifice a enzimei. Modificările proprietăţilor
enzimelor sunt produse de câţiva factori:
 efectul conformaţional – când are loc o modificare
conformaţională a moleculei de enzimă, modificări conformaţionale ale
proteinei enzimatice şi modificări provocate de enzimă.
 efectul steric – când interacţiunea substratului cu enzima este
afectată de împiedicarea sterică.
 efectele de partiţie, în legătură cu natura chimică a materialului
suportului pot apărea prin interacţiuni electrostatice sau hidrofobe între
matrice şi moleculele de dimensiuni mici ale speciilor prezente în soluţie,
conducând la o modificare a micromediului.
 transferul de masă sau efectul difuzional poate să apară prin
rezistenţa difuzională a transportului substratului din soluţie prin situsurile
catalitice şi prin difuzia produşilor de reacţie înapoi în masa de soluţie.
Această rezistenţă difuzională poate fi clasificată în :
 efect de transfer de masă intern sau intraparticulă atunci

când enzima este localizată într-un mediu poros;

 efect de transfer de masă extern sau interparticulă, care are

loc între soluţie şi suprafaţa exterioară a particulei enzimă

– matrice.
Modificările observate la proprietăţile enzimelor imobilizate sunt
rezultatul interacţiunilor acestor factori, un efect exact al unui factor dat, fiind
dificil de determinat.

3.1 Parametrii cinetici

Parametrii cinetici ai enzimelor imobilizate sunt de obicei diferiţi faţă

de cei ai formelor native din cauza efectelor sterice, de conformaţie şi
difuzionale care pot să apară.
Afinitatea dintre enzimă şi substrat poate fi de asemenea schimbată de
efectele conformaţionale în cazul enzimelor imobilizate.

3.1.1 Constanta Michaelis – Menden

Valoarea constantei poate fi modificată sau nu după imobilizarea

enzimelor în funcţie de procedeul ales. Determinarea valorii constantei
Michaelis, care reflectă afinitatea dintre enzimă şi substrat, este importantă

13
pentru că în urma imobilizării enzimelor acest parametru poate să crească sau
să scadă. O scădere a valorii constantei în imobilizarea enzimelor, corespunde
unei viteze mai mari de reacţie, iar o creştere a valorii constantei după
imobilizare implică necesitatea unei concentraţii mai mari de substrat pentru a
ajunge la viteza obţinută cu enzime libere.
Schimbarea conformaţiei moleculelor enzimatice este de obicei legată
de o descreştere a afinităţii dintre enzimă şi substrat. Aceste efecte sunt mai
pronunţate în tehnica de legare covalentă , în care moleculele enzimatice sunt
modificate chimic.

Tabel 3. Constanta Michaelis în enzime imobilizate

Enzima Metode de Substrat Km (Mm)

imobilizare Enzimă Enzimă
liberă imobilizată
1. Entrapare în gel
ASPARAGINAZA de L– 1,8 x 10- 3,3
2
poaliacrilamidă asparagina
Entrapare în
2. UREAZA lichid membranar Ureea 3,4 1,8 x 102
Legătură ionică
(DEAE – Acid DL – 5,7 3,5
3. celuloza) metionină
AMINOACILAZA Alchilare
(iodoacetil – Acid DL - 5,7 6,7
celuloză) metionină
Legare ionică
(DEAE – TAME 0,12 2,5
sephadex)
4. TRIPSINA Legătură
peptidică (CNBr – TAME 0,12 6,2
sepharoză)

3.1.2 Profilul pH – activitate

Activitatea enzimatică este afectată de condiţiile de mediu, în special de

pH – ul mediului apos şi de natura proteică a enzimei. În cazul imobilizării
enzimelor pH-ul se poate modifica sau nu, aşa cum se prezintă în tabelul 4.

14
 Tabelul 4. pH optim al enzimei imobilizate.

pH - optim
Enzimă Metode de Substrat
imobilizare Enzimă Enzimă
liberă imobilizată
Legare ionică
(DEAE – TAME 8,5 7,0
1. TRIPSINĂ sephadex)
Legare
peptidică (CNBr 8,5 9,5
– sepharoză) TAME
Legare ionică
(DEAE – TAME 5,4 3,4
celuloză)
2. INVERTAZA Entrapare în gel
de Zaharoză 5,0 5,5
poliacrilamidă
Adsorbţie fizică
(bentonită) Zaharoză 5,2 6,3
3. NADH - Reticulare
DEHIDROGENAZA (glutarat NADH 6,0 5,5
aldehidă)

Schimbarea profilului curbei de pH şi a pH-ului optim depinde de

reactivitatea moleculei enzimatice sau de natura suportului.

3.1.3 Stabilitatea la pH

Efectele partiţiei pot îmbunătăţii stabilitatea la pH în imobilizarea

enzimelor. De exemplu stabilitatea enzimelor: tripsina, chemotripsina şi
papaina a fost mărită prin alcalinizare la imobilizarea lor pe suporturi
polianionice. Efectele difuziunii cât şi efectele de conformaţie responsabile de
creşterea stabilităţii în ambele sensuri, alcalină şi acidă, în operaţiile de
imobilizare a glucoamilazei pe silicat poros prin legare covalentă.

15
Figura 15. Curba pH – stabilitate pentru glucoamilaza solubilă şi imobilizată.

3.1.4 Efectul temperaturii

Temperatura optimă a enzimelor imobilizate prin entraparea în gel şi,

uneori, prin legare covalentă şi ionică este mai mare decât în cazul enzimelor
native. Aceasta se poate datora efectelor de difuziune în cazul entrapării şi
legării pe suporturi poroase, care protejează enzimele împotriva denaturării
termice.
Această rezistenţă poate fi obţinută când moleculele enzimatice sunt
fixate pe suport prin legături ionice sau covalente.

16
 CAP. 4 BIOREACTOARE

Principalul scop al biotehnologiei este obţinerea de produse sau servicii

utile activităţii umane cu ajutorul organismelor vii.
Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic”, după cum
procesul de bază în tehnologia chimică este „procesul chimic”. În mod
asemănător, spaţiul în care se desfăşoară un proces biologic se numeşte
bioreactor.
În bioreactor, transformarea materiilor prime este realizată de sistemul
enzimatic al microorganismelor vii, al celulelor animale şi vegetale sau de
enzime izolate din acestea.
Bioreactorul este „inima” oricărei fermentaţii sau conversii enzimatice.
Alegerea tipului de bioreactor este în strânsă legătură cu tipul bioprocesului
ce urmează a se desfăşura în el. Bioreactoarele cilindrice cu sau fără agitare
sunt cele mai des utilizate în biotehnologie. Tipuri noi de bioreactoare au fost
construite pentru aplicaţii speciale cum ar fi:
 culturi de ţesuturi vegetale sau animale;
 bioreactoare pentru celule imobilizate.
După natura proceselor biotehnologice, reactoarele pot fi clasificate în:
 reactoare biologice în care se desfăşoară procesul de fermentaţie
( cu biomasă);
 reactoare biochimice în care se desfăşoară procese enzimatice.
Reactoarele biochimice pot fi :
- cu enzime libere;
- cu enzime imobilizate;
- cu fază solidă.

4.1 Bioreactoare cu enzime imobilizate

Utilizarea preparatelor enzimatice la transformarea substanţelor în

cataliză heterogenă prezintă următoarele avantaje:
 permite utilizarea repetată a enzimei întrucât cu aceeaşi cantitate
de enzimă se poate prelucra o cantitate mai mare de substrat;
 permite lucrul în instalaţii semicontinue şi continue (volum mic
ocupat de instalaţie, permite automatizarea proceselor);
 se elimină faza de inactivare termică întrucât enzima nu se
regăseşte în produs;
 scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produs, nu se
formează produse secundare.
Există şi posibilitatea imobilizării celulelor de microorganisme.
17
 În timpul procesului de imobilizare, o parte din activitatea enzimatică
se pierde. Bilanţul de activitate este:
A0 = A1 + A2 + A3,
unde:
A0 = activitatea enzimatică iniţiată în U/g;:
A1 = activitate enzimatică regăsită în preparatul imobilizat în U/g;
A3 = activitatea enzimatică pierdută în procesul de imobilizare.
Randamentul de imobilizare este :

 = 100 
A1
A0
Randamentul total de menţinere a activităţii enzimatice este:

 = 100 
A1  A2
A0
Reactivitatea preparatelor imobilizate este influenţată de următorii
factori:
 granulometria lor : activitatea specifică este adeseori invers
proporţională cu diametrul mediu al particolelor;
 masa moleculară a substratului: difuziunea şi împiedicările
sferice limitează accesibilitatea substraturilor cu masă
moleculară ridicată, la centri activi ai catalizatorului enzimatic;
 pH-ul mediului de reacţie: diferenţa de comportament a enzimei
libere faţă de cea imobilizată este determinată de sarcinile
electrice ale materialului suport, de anumite modificări chimice
suferite de enzime în timpul cuplării;
 stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate. De obicei,
stabilitatea termică, stabilitatea de depozitare, stabilitatea faţă de
denaturanţi a enzimelor cresc prin imobilizarea acestora, în
special, la preparatele obţinute prin cuplare covalentă. Sporul de
stabilitate este determinat de faptul că, în urma imobilizării,
structura conformaţională a proteinei enzimatice este mai puţin
stabilă la acţiunea factorilor externi.

18
 CAP. 5 APLICAŢIILE IMOBILIZĂRII
ENZIMELOR

5.1 Aplicaţiile imobilizării în chimia analitică

Tabelul 5. Senzori enzimatici pentru analize chimice.

Analize Sistem enzimatic Electrod

1. Alcool Alcool – oxidaza H2O2
2. Aminoacid L – Aminoacid oxidaza H2O2
3. Colesterol Colesterol – oxidaza O2; H2O2
4. Creatinină Creatinaze NH4
5. Glucoză Glucozoxidaza O2; H2O2
6. Zaharoza Invertaza, Glucozoxidaza sau O2
Colagen
6. Uree Urează NH4

5.2 Terapia medicală

intracorporală

extracorporală

19