UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE PROTECŢIA MEDIULUI

PROGRAMUL DE STUDII: SIGURANȚĂ ȘI
SECURITATE AGROALIMENTARĂ
FORMA DE ÎNVĂȚĂMÂNT: CU FRECVENȚĂ

DETERMINAREA PRIN
CROMATOGRAFIE ÎN STRAT SUBȚIRE A
PIGMENŢILOR DIN ARDEI

COORDONATOR:
Șef lucr. dr. ing. CHIȘ ADRIANA

MASTERAND:
TODERICI DELIA- DIANA

Oradea
2019
 CUPRINS

INTRODUCERE........................................................................................................................2
CAPITOLUL I. CARACTERISTICI GENERALE.................................................................4
1.1. Cromatografia în strat subțire...................................................................................4
1.2. Determinare calitativă…..........................................................................................4
1.3. Determinare cantitativă..............................…..........................................................4
1.4. Ardeiul………….....................................................................................................5
1.4.1. Pigmenții naturali din ardei…...................................................................5
CAPITOLUL II. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR PRIN CROMATOGRAFIE ÎN
STRAT SUBȚIRE.....................................................................................................................6
2.1. Carotenoidele...........................................................................................................6
2.2. Principiul metodei....................................................................................................6
2.3. Componentele sistemului CSS.................................................................................6
2.4. Materiale și reactivi..................................................................................................7
2.5. Pregătirea probei......................................................................................................7
2.6. Tehnica de lucru......................................................................................................7
CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII.......................................................................9
CAPITOLUL IV. ARTICOLE ȘTIINȚIFICE.......................................................................12
4.1.Cromatografie în strat subțire în analiza alimentelor și agricolă............................12
4.2. Extragerea și purificarea carotenoizilor din legume..............................................13
CONCLUZII...........................................................................................................................14
BIBLIOGRAFIE.....................................................................................................................15

1
 INTRODUCERE
Metoda cromatografică se bazează pe repartiția diferită a componentelor unui amestec
între o fază mobilă și una staționară, având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a
componentelor purtate de către faza mobilă de-a lungul fazei staționare.
Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gamă extinsă de
sisteme cromatografice care au în comun faptul că utilizează o fază mobilă lichidă.
Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul că permite și
analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul că și faza mobilă participă la
separare oferă posibilități suplimentare pentru realizarea unor separări eficiente.
Aceste sisteme care se folosesc azi în separările cromatografice lichid-solid, au permis
realizarea separării unor amestecuri complexe de substanțe în condiții foarte bune, însă viteza
de separare este mică iar analiza suplimentară a compușilor separați prin metode
spectroscopice este mai dificilă.
Cromatografia de lichid-solid are trei tehnici posibile:
1. cromatografie lichid-solid clasică pe coloană- numai în scopuri preparative
2. cromatografie lichid-solid de înaltă performanță- mai ales în scop analitic, dar și
preparativ
3. cromatografie în strat subțire- pentru a testa posibilitatea separării unui amestec de
compuși.

În cazul cromatografiei în strat subțire nu există îngrădiri în privința utilizării unor

solvenți ca eluenți ce absorb în UV (de exemplu: toluen, acetona, acetat de etil etc.) și care
prezintă selectivități bune într-o serie de separări. De asemenea nu există limitări în privința
utilizării unor reactivi pentru detecție sau identificare.
Separarea cromatografică a componenților unei probe are loc ca urmare a echilibrelor
ce se realizează la interfață fază mobilă - fază staționară. Curgerea fazei mobile peste faza
staționară se realizează în condițiile unei suprafețe foarte mari a interferenței dintre cele două
faze. Acest fapt se concretizează în multiplicarea echilibrelor între cele două faze de un număr
foarte mare de ori.
Cromatografia în strat subțire folosește un strat subțire și uniform de silicagel sau
alumină acoperit pe o bucată de sticlă, metal sau plastic rigid.
Cromatografia în strat subțire are două faze:
 Faza staționară
Este necesar să se cunoască măcar aproximativ structura substanțelor de separat,
respectiv polaritatea lor și masa lor moleculară. Pentru substanțe nepolare se recomandă
adsorbenți polari, alumina și silicagelul adecvate (cromatografie de adsorbție); pentru
substanțe polare se recomandă adsorbenți mai puțin activi, silicagelul dezactivat cu apa sau
chimic modificat, poliamida, celuloza etc., în timp ce substanțele ionizabile se separă pe
schimbători de ioni.
În cazul când componentele sunt de aceeași clasă, diferind foarte puțin în ceea ce
privește natura grupărilor polare se preferă cromatografia de repartiție. Când substanțele din
amestec diferă prin natura grupărilor funcționale sau prin structură se preferă cromatografia
de adsorbție.

2
 În alegerea adsorbentului și a liantului trebuie să se țină cont de metoda de vizualizare
folosită. Ca materiale granulare pentru confecționarea straturilor subțiri pot fi utilizate în
principiu oricare din substațtele solide puțin solubile în eluentul utilizat, având o granulație
suficient de mică pentru o adsorbție suficientă, dar destul de mare pentru a se asigura o viteză
de migrare rapidă. Distribuția granulometrică nu trebuie să fie prea largă pentru a se realiza
straturi uniforme.

 Faza mobilă
Alegerea fazei mobile pentru o separare dată constituie etapa cheie în vederea
realizării unei bune separări în cromatografia pe strat subțire. Ca și fază mobilă se folosesc o
serie de solvenți organici sau amestecuri ale acestora.
Pentru ca un solvent să poată fi utilizat ca fază mobilă trebuie să îndeplinească
următoarele condiții: tărie proprie, vâscozitate scăzută, compatibilitate cu sistemul de detecție,
stabilitate și compatibilitate cu adsorbentul, volatilitate pentru a facilita recuperarea
componentului, să fie uzual, ușor de purificat și ieftin. (SCRIGROUP, 2019)

3
 CAPITOLUL I
CARACTERISTICI GENERALE

1.1. Cromatografia în strat subțire

Cromatografia în strat subțire este o tehnică simplă ca aparatură, care ne oferă posibilități
multiple de separare. Această tehnică se mai numește și cromatografia plană. În ultimul
deceniu s-au înregistrat progrese însemnate atât în privința fazelor staționare cât și a
perfecționării aparaturii de măsurare. (SCRIGROUP, 2019)

Principalele avantaje ale cromatografiei în strat subțire:

- rapiditate
- aplicabilitate la compuşi care prezintă instabilitate termică, atât hidrosolubili cât şi
liposolubili
- posibilitatea analizării simultane a mai multor probe
- reproductibilitatea rezultatelor.

Cromatografia în strat subțire are și dezavantaje:

- sensibilitate mai mică decât în cromatografia de lichide pe coloană
- necesitatea unei purificări mai avansate
- repetabilitate scăzută în cazul unor temperaturi sau umidităţi ambientale ridicate (risc
scăzut în condiţiile climatice din ţara noastră) (Chiș Adriana)

1.2. Determinarea calitativă

În cazul în care compușii sunt colorați sau în urma pulverizării rezultă compuși
colorați, identificarea se poate face și pe baza culorii colerată cu valoarea Rf-ului.
Identificarea se poate realiza și pe baza spectrului de absorție în UV-VIS direct de pe placă.
După separare “spotul poate fi decupat” și componentul poate fi transferat în soluție,
identificarea relizându-se prin alte metode: spectru UV, IR.

1.3. Determinarea cantitativă

În cazul cromatografiei în strat subțire determinările cantitative se pot realiza atât
direct pe placă prin fotodensitometrare în UV-VIS , cât și prin eluția prin diverse metode a
compusului de pe placa urmată de determinarea cantitativă printr-o metodă instrumentală
potrivită - tehnici de transfer. Cea mai uitlizată metodă este cea de determinare în situ,
deoarece sunt evitate pierderile de substanță care pot avea loc în timpul transferului.
Fotodensitograma obținută este prelucrată în același mod ca și cromatogramele din
cromatografia de lichide.
În cazul cromatografiei în strat subțire pentru determinarea cantitativă se preferă
utilizarea curbei de calibrare. Aria picurilor de interes se determină automat prin programul cu
care este echipat fotodensitometrul.

4
 Analiza cantitativă decurge în două etape:
- obținerea ecuației curbei de calibrare A= f (m) unde A= aria picului cromatografic
corespunzător unei cantități de compus dată –m.
- pe baza ariei picului cromatografic corespunzător compusului din proba necunoscută
și pe baza ecuației de regresie se determină cantitatea de compus din spot.
(SCRIGROUP, 2019)

1.4. Ardeiul

Dintre speciile legumicole cultivate în țara noastră, ardeiul ocupă un loc important
având numeroase întrebuințări. Fructele de ardei se pot consuma în stare proaspătă, ceea ce
prezintă mare importanță deoarece vitaminele sunt utilizate integral de către organismul
uman. Fructele de ardei se folosesc la prepararea unei game foarte largi de mâncăruri, se
pretează pentru a fi prelucrate în industria conservelor sau pentru prepararea boielei de ardei.
Gustul poate fi de la dulce la picant, în funcție de soi.
Cel mai important din punct de vedere fitoterapeutic – medical, este ardeiul iute de
Cayenne. Acesta conține α și β carotene, acid cafeic, campestrol, capsaicină, carvonă, acid
clorogenic, acid citric, hesperidină. Kaempferol, limonen, luteină, quercitină, zeaxantină,
aminoacizi, calciu, acizi grași esențiali, fier, magneziu, fosfor, potasiu, zinc, complexulde
vitamine B, vitamina C și vitamina E.
Ardeiul iute ajută la digestive, îmbunătățește circulația sângelui, stopeaza sângerarea
în ulcer. Capsaicina este bun în artrite, rheumatism, infecții ale sinusului, răceli.
Conținutul în vitamina C depinde de gradul de maturitate, de culoarea și mărimea
fructelor. Condițiile de cultură influențează conținutul în vitamina C, aceasta fiind mai mare la
culturile în câmp, comparativ cu cele din sere.
Ardeiul iute, datorită conținutului în capsaicină, are întrebuințări și în industria
farmaceutică. Astfel, tinctura capsici este folosită la prepararea vatei termogene și a unor alifii
utile în tratarea bolilor reumatice. (Indrea Dumitru si col.,2007)

1.4.1. Pigmenții naturali din ardei

Pigmenții sunt constituenți esențiali ai lumii vii, iar contribuția lor la evoluția și
menținerea vieții este evidentă. Există o serie de documente ce atestă folosirea pigmenților în
diverse domenii înca din antichitate.
Pigmenții sunt prezenți în toată materia vie, oferă culori atractive și joacă roluri de
bază în dezvoltarea organismelor. Această revizuire prezintă informațiile de bază despre
pigmenți, concentrând atenția asupra celor naturali ai plantelor: carotenoizi și antocianine.
Caracteristicile lor deosebite sunt luate în considerare, informațiile biochimice și
biologice moleculare generate în elucidarea lor și proprietățile de prelucrare și stabilitate ale
acestor compuși sub formă de coloranți alimentari.
Din fructele de ardei se pot extrage coloranți alimentari foarte solicitați în industrie.
Ardeii conțin o serie de pigmenți naturali: clorofila, caroten și licopen. (Indrea
Dumitru si col.,2007)

5
 CAPITOLUL II
DETERMINAREA CAROTENOIDELOR PRIN CROMATOGRAFIE
ÎN STRAT SUBȚIRE

2.1. Carotenoidele

Carotenoidele sunt pigmenți naturali foarte răspândiți de culoare galben sau portocaliu.
Se găsesc în multe flori, fructe, semințe sau rădăcini. Cel mai frecvent este β-carotenul,
pigment prezent în morcovi, portocale, ardei. La fel de importanți sunt alfa și gama-caroten,
licopen, zeaxantină, criptoxantină, luteină. Unele carotenoide sunt scindate în țesutul
intestinal de vitamina A, care este apoi transportată prin limfă și sânge, și depozitate în ficat.
Funcționarea incorectă a enzimelor digestive împreună cu o dietă deficitară de proteine, pot
limita producerea de vitamina A.
Carotenoidele conțin lanțuri lungi, formate din 22 sau mai mulți atomi de carbon, unde
legăturile covalente simple dintre atomii de carbon alternează cu legăturile duble.
În regnul vegetal se găsesc în fructe, legume, ciuperci, flori, alge și în regnul
animalelor în ouă, ficat, unt.
Carotenoidele sunt insolubile în apă, dar solubile în solvenții organici. Prezintă aspecte
specifice de absorbție care ajută la identificarea lor. În contactul cu aerul se auto-oxidează
rapid și se degradează.
Una dintre metodele de analiză cantitativă și calitativă pentru carotenoizii sunt metode
cromatografice. Cromatografia pe coloană este o metodă de separare a carotenoizilor în
diferite extracte.
Carotenoidele au coeficienți de absorbție molară mai mari și prin urmare, sunt puternic
colorate și ușor detectate cu ochiul liber în cantități de micrograme pe fundalul alb al plăcilor
de TLC. (Ganea Mariana si col.)

2.2. Principiul metodei

Cromatografia pe strat subțire este o tehnică foarte răspândită datorită simplității ei și

posibilității de analizare a unor amestecuri complexe din punct de vedere calitativ și
cantitativ.
Similar cu alte metode cromatografice, cromatografia în strat subțire se bazează, de
asemenea, pe principiul separării.

2.3.Componentele sistemului CSS

 Plăci CSS, de preferință pregătite cu o fază staționară: Acestea sunt plăci stabile și
inerte chimic, unde se aplică un strat subțire de fază staționară pe întregul său strat de
suprafață. Faza staționară pe plăci are o grosime uniformă și are dimensiuni fine ale
particulelor.

6
  Camera CSS, acesta este utilizat pentru dezvoltarea plăcii TLC. Camera menține un
mediu stabil în interior pentru dezvoltarea corectă a petelor. De asemenea, previne evaporarea
solvenților și menține procesul fără praf.
 Faza mobilă, acesta cuprinde un solvent sau un amestec de solvenți. Faza mobilă
utilizată trebuie să fie lipsită de particule și de cea mai înaltă puritate pentru dezvoltarea
corectă a petelor. Solvenții recomandați sunt inerți chimic cu proba, o fază staționară.
 O hârtie de filtru, aceasta este umezită în faza mobilă, pentru a fi plasată în interiorul
camerei. Acest lucru ajută la creșterea uniformă a unei faze mobile pe toată lungimea fazei
staționare. (Jim Clark, 2007)

2.4. Materiale și reactivi

Reactivii care au fost folosiți sunt de tipul pa (pro analysis): hexan, acetonă, toluen,
metanol, butanol, acetat de metil, eter de petrol, cloroform, acid acetic, apă distilată. Se
utilizează pahare de sticlă Berzelius și Erlenmeyer, pipetă, mojar, plăci de sticlă sau folie de
aluminiu acoperite cu silicagel sau alumină.

2.5. Pregătirea probei

Se prepară un amestec de hexan: acetonă 1: 1; 20 g de legume sunt tăiate în bucăți

mici, introduse într-un mojar și tratate cu 10 ml amestec solvent (hexan + acetonă). Când
separarea este completă, suspensia obținută este filtrată și materialul filtrant este spălat cu 5
ml amestec solvenți. Filtratul care conține β-caroten este extras și analizat prin cromatografie
în strat subțire.

2.6. Tehnica de lucru

Tehnica de lucru constă în aplicarea probei (soluției), sub formă de spot sau bandă la
1-2 cm de marginea inferioară a plăcii cromatografice, pe o linie imaginară numită linie de
start. Probele pot fi aplicate automat sau manual cu microcapilare, micropipete sau
microseringi. Placa cromatografică este formată dintr-o placă de sticlă sau folie de aluminiu
acoperită cu un strat subțire de adsorbent (silicagel, silicagel chimic modificat, alumină, etc.).
După ce solventul în care a fost dizolvată proba s-a evaporat, placa este introdusă cu partea
inferioară într-o cuvă ce conține solventul sau amestecul de solvenți de developare.
Developarea se poate realiza în camere normale (N) sau camere sanwich (S). Nivelul
eluentului se va situa sub nivelul liniei de start. Eluentul migrează de-a lungul plăcii
cromatografice datorită forțelor de capilaritate, purtând cu viteze diferite componenții
amestecului de analizat, fapt care se concretizează în separarea lor. Nivelul până la care se
ridică eluentul se numește linie de front. După ce frontul eluentului parcurge o anumită
distanță (≈8cm) placa se scoate și se usucă. Petele pot fi văzute într-o cameră de lumină UV
adecvată.
Se depun probe sub formă de pete mici și uniforme pe plăci cromatografice folosind
capilare calibrate. Plăcile sunt uscate și introduse în camera de developare. Developarea este

7
urmărită până când frontul solvent ajunge la aproximativ 1 cm de partea de sus a plăcii. Placa
este scoasă din pahar și uscată. (Ganea Mariana si col.)

8
 CAPITOLUL III
REZULTATE ȘI DISCUȚII

Procedura de extracție folosind solvenți s-a dovedit a fi extrem de eficientă.

Purificarea folosind cromatografia în strat subțire nu a fost foarte eficientă pentru anumite
probe.
Extracția de carotenoid din probele de legume folosind metoda de extracție a
solventului într-o pâlnie de separare este prezentată în Fig.1.

Fig.1. Extracția pigmenților

Diferitele probe au fost colectate în eprubete pentru analize ulterioare (Fig. 2).

Fig.2. Pigmenții extrași

9
 Placa TLC în care este prezentată o pată a extractului și păstrată într-o cameră de
dezvoltare pentru a se separa în diferite benzi este prezentă în Fig. 3 și placa TLC dezvoltată
cu punctul portocaliu este prezentată în Fig.4.

Fig.3. Placă TLC în interiorul camerei de dezvoltare Fig.4. Placă TLC

Absorbanța extractului derivat din fiecare legumă s-a citit la 630 nm iar valoarea era
obișnuită. Rezultatul este prezentat tabelar în tabelul 1. Se poate deduce că la 100g din probă
de legume, morcovul conține cea mai mare cantitate de carotenoizi și brocoli conține cel mai
puțin.

Tabelul 1. Conținutul de beta-caroten în proba de legume

Legume Conținutul de carotenoizi (mg / 100g din
probă)
Morcov 18.3
Spanac 5.6
Ardei gras roșu 2.4
Ardei gras galben 2.4
Sfeclă 1.9
Brocoli 1.3

10
 Extractul a fost purificat folosind metoda cromatografiei în strat subțire și a fost
calculat factorul de întărziere (Rf) în tabelul 2.

Tabelul 2. Rezultatele cromatografiei în strat subțire

Proba de legume Factorul de întârziere (Rf)

Carotenoide Xantofile
Morcov 0.95 0.31
Spanac 0.77 0.44
Ardei gras roșu 0.94 0.36
Ardei gras galben 0.88 0.38
Sfeclă 0.84 0.42
Brocoli 0.81 0.52

Rezultatele astfel obținute au fost fie identice, fie marginal diferite pentru toate
legumele, comparativ cu câteva studii similare care au fost întreprinse pe baza carotenoidelor.
Studiile afirmă că absorbția se modifică în conformitate cu solventul utilizat, concentrație de
pigment, rezultate ale experimentului și calcul. Cu toate acestea, rezultatele ar trebui să fie
similare cu următoarea valoare tipică: caroten - 0,95, xantofile - 0,35.
Folosind lucrările lui Tomkins în lucrarea „extragerea rapidă și separarea rapidă a
pigmenților din frunze folosind cromatografia în strat subțire ”, publicată în 1994, s-au făcut
comparații între rezultatele ambelor studii și s-a constatat că sunt în concordanță unul cu altul.
(Jeyanthi et al, 2014)

11
 CAPITOLUL IV
ARTICOLE ȘTIINȚIFICE

4.1. Cromatografie în strat subțire în analiza alimentelor și agricolă

12
 4.2. Extracția și purificarea carotenoizilor din legume

CONCLUZII

 Pe baza rezultatelor, se poate remarca faptul că morcovii conțin cea mai mare
concentrație de carotenoizi, urmată de spanac, ardei gras roșu, ardei gras galben și sfeclă.
Brocoli a fost raportat a avea cea mai mică cantitate de carotenoizi din cele șase legume care
au fost alese pentru studiu.

13
 BIBLIOGRAFIE

1. Chiș Adriana, Cromatografia în strat subțire, curs

2. Ganea Mariana, Moisa Corina, Cozma Alina, Bota Sanda, DETERMINATION OF
CAROTENOIDS BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
http://protmed.uoradea.ro/facultate/publicatii/protectia_mediului/2016A/miscellaneous
/04.%20Ganea%20Mariana.pdf
3. Indrea Dumitru si col.,2007, Cultura legumelor, Editura Ceres, București
4. Jeyanthi L. Rebecca, Sharmila S., Das Merina Paul and Candace Seshiah, 2014,
Extraction and purification of carotenoids from vegetables, Journal of Chemical and
Pharmaceutical Research, 2014, 6(4):594-598

14
 http://www.jocpr.com/articles/extraction-and-purification-of-carotenoids-from-
vegetables.pdf
5. Jim Clark, 2007, THIN LAYER CHROMATOGRAPHY,
https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html
6. Jordi Oliver , Andreu Palou, Chromatographic determination of carotenoids in foods
Journal of Chromatography A, 881 (2000) 543–555
https://www.researchgate.net/publication/227860452_Chromatographic_determination
_of_carotenoids_in_foods
7. Joseph Sherma, Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis, Journal
of Chromatography A Volume 880, Issues 1–2, 2 June 2000, Pages 129-147
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0021967399011322
8. SCRIGROUP, 2019, CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE
http://www.scrigroup.com/educatie/chimie/CROMATOGRAFIA-PE-STRAT-
SUBTIRE75881.php

15