FIZIOLOGIA BACTERIILOR ȘI

METABOLISMUL MICROBIAN

CULTIVAREA BACTERIILOR
METODA BACTERIOLOGICĂ
 ◦ natura microorganismelor (caracterele de
specie)
◦ compoziţia chimică
◦ faza de dezvoltare (vârsta culturii)
◦ forma vegetativă sau sporulată a bacteriilor.
Pe de altă parte, efectul acţiunii este
determinat de:
◦ intensitatea sau concentraţia agentului
◦ timpul de expunere
◦ concentraţia ionilor de H+ sau OH- etc.
stimulatoare, de atenuare, de oprire a multiplicării sau de
distrugere a bacteriilor.
Efect bacteriostatic: inhibă înmulţirea bacteriilor fără ale
omorî, fenomen reversibil
Efect bactericid: omoară microorganismele prin lezarea
integrităţii sau a funcţiei bacteriene, fenomen ireversibil.
◦ practica sterilizării
◦ dezinfecţiei
◦ obţinerea de variante şi de produse
biologice - conservarea bacteriilor etc.
Septic – infectat, contaminat cu germeni patogeni.
Aseptic (steril) – lipsit de microbi patogeni sau
nepatogeni.
Asepsie – ansamblul de metode prin care se evită
contaminarea unui substrat steril.
Sterilizare – distrugerea sau îndepărtarea oricăror forme de
viată, a tuturor microorganismelor patogene sau
nepatogene, forme vegetative sau sporulate de pe o
suprafată sau dintr-un substrat inert
Dezinfectie – distrugerea formelor vegetative microbiene
(mai rar a celor sporulate) de pe suprafata unor substraturi
inerte, cu ajutorul dezinfectantelor.
Dezinfectant – substanţă chimică, toxică pentru ţesuturi
vii, cu acţiune microbicidă, ireversibilă.
Antisepsie – distrugerea sau îndepărtarea temporară a
formelor vegetative microbiene de pe substraturi vii
(mucoase, tegumente, plăgi), cu ajutorul antisepticelor.
Antiseptic – substantă chimică, netoxică pentru tesuturile
vii, cu actiune reversibilă, bacteriostatică asupra
microorganismelor.
Temperatura poate fi favorabilă sau defavorabilă
microorganismelor, cea din urmă acţiune datorându-se ruperii
legăturilor intramoleculare ale proteinelor şi ale altor molecule
în stare nativă, prezenţa apei mărind labilitatea legăturilor
chimice.
În general, formele vegetative ale bacteriilor patogene sunt
omorâte începând de la 50 – 70°C.
Sporii, prezentând o compoziţie chimică diferită (cu deosebire
în natura proteinelor şi lipidelor – conţinând acid dipicolinic)
şi conţinut de apă foarte redus, sunt mult mai rezistenţi, fiind
omorâţi la temperaturi de 100 - 160°C.
Cea mai eficientă metodă de sterilizare, faţă de spori, este cea
prin autoclavare la o atmosferă (121°C) – timp de 15 minute.
Are ca mecanism de actiune coagularea proteinelor si degradarea enzimelor.
1. temperaturi sub 100°C – sunt aplicate pentru formele vegetative ale
bacteriilor mezofile si criofile aflate în solutii apoase.
◦ pasteurizarea – expunere termică + refrigerare imediată;
◦ tindalizarea
◦ Autoclav cu robinetul de vapori deschis
2.temperatura de 100°C – metoda imperfecta de sterilizare fiind utilizată la
decontaminarea apei, alimentelor, lenjeriei, instrumentarului etc. Se folosesc
fierbătoare încălzite electric sau la flacără.
3. temperatura de peste 100°C – este temperatura la care se realizează
sterilizarea. Se folosesc autoclave care folosesc vapori de apă sub presiune: 0,5
atm - 115°C; 1 atm - 121°C; 2 atm - 134°C.
Are ca mecanism de actiune carbonizarea structurilor
bacteriene.
1. flambare – metodă de completare a sterilitătii, metodă
de asepsie;
2. încălzire la incandescentă – pentru ansa sau acul de
platină;
3. incinerare – pentru materiale contaminate, reziduuri,
animale;
4. sterilizare cu aer supraîncălzit– se realizează în
cuptorul Pasteur (Poupinel; etuvă) la 180°C timp de 1 or
ă, sau la 160°C timp de 2 ore.
 refrigerarea – temperaturi de 0 – 7° au efect bacteriostatic
asupra majoritătii microorganismelor; unele bacterii mor (N.
meningitidis, N.gonorhoeae, H. influenzae), altele se pot
multiplica.
congelarea – dacă este făcută lent, la temperaturi de
(-20°C) favorizează formarea cristalelor de apă care lezează
membrana citoplasmatică a celulei bacteriene care va fi
distrusă (efect microbicid).
congelarea rapidă la (-80°C) în bulion glicerinat duce la
solidificarea amorfă a apei intracelulare ceea ce face ca celula
microbiană să rămână în viată.
socul rece – unele bacterii pot fi distruse prin scăderea bruscă
a temperaturii, de la 45°C la 15°C.
Prin îndepărtarea apei din celula bacteriană, în citoplasma
lor apar numeroase schimbări chimice şi fizice, precum şi
denaturarea proteinelor.
Formele vegetative ale unor bacterii, mor repede prin
desicare, în ore (pneumococul, gonococul, vibrionul
holeric) sau în câteva zile (bacilul tuberculozei), în timp
ce sporii îşi pot păstra viabilitatea un timp îndelungat.
Uscarea în vid a culturilor congelate (liofilizarea) în
prezenţa unei soluţii protectoare de proteine, prin zăpadă
carbonică la -78°C, este o metodă de conservare.
Radiatii neionizante – radiatiile UV au efect microbicid,
dar au putere de penetrabilitate mică.
Se pot folosi la
◦ dezinfectia aerului
în încăperi
din boxele de lucru
◦ la dezinfectia suprafetelor
în laboratorul de microbiologie, ca o metodă complementară
măsurilor de curătenie si dezinfectie chimică.
Acestea, ca şi razele beta, gama şi alte tipuri de radiaţii
penetrante, produc ionizarea moleculelor, formarea
peroxidului de hidrogen, inactivarea proteinelor, inclusiv a
enzimelor, locul important al acţiunii lor fiind ADN-ul
Această metodă de sterilizare se utilizează pentru
medicamente, instrumentar confectionat din material
degradabil termic. Ca surse de radiatii gama sunt folosite
cobaltul 60 sau celsiul 137.
 Determină liza celulelor bacteriene prin ruperea peretelui
celular şi dezintegrarea structurilor, ca urmare a ruperii şi
golirii conţinutului celular prin procesul de cavitaţie.
De asemenea, în cursul acţiunii undelor ultrasonice, se
ating temperaturi de 50 - 80°C, care determină moartea
microorganismelor.
Bacteriile diferă mult în privinţa sensibilităţii lor la
efectele sonice.
Sporii sunt extrem de rezistenţi.
 Prin procesul de trecere a unui lichid sau gaz printr-un
material poros, pot fi retinute, mecanic sau electrostatic, cele
mai multe dintre bacterii dacă dimensiunea porilor este de
aproximativ 0,22 μm.
Filtrele cu dimensiunea porilor de 0,01 μm pot retine si
virusurile mici, aceste filtre având în mod real rol sterilizant
al materialului filtrat.
Este o metodă se sterilizare la rece aplicată solutiilor
denaturabile termic.
Se poate aplica si aerului din incaperi.
Există o serie de alte substante chimice cu efect
bacteriostatic sau bactericid.
Aceste substante sunt :
◦ antibiotice,
◦ chimioterapice,
◦ antiseptice,
◦ dezinfectante.
 Agenţii chimici aplicaţi în cadrul metodelor de dezinfecţie
duc la distrugerea formelor vegetative,
Un dezinfectant fiind un agent chimic care omoară
microorganismele patogene şi nepatogene
Un antiseptic este un agent chimic aplicat pe ţesuturi vii,
care inhibă sau omoară microorganismele.
- să omoare bacteriile la concentraţii joase într-o perioadă
scurtă şi să prezinte un spectru microbian larg;
- să fie solubil şi stabil în apă sau într-un solvent, fără a
pierde puterea bactericidă;
- să fie relativ netoxic pentru ţesuturi;
- să fie cât mai penetrant şi să nu se combine cu materialul
organic etc.
 ◦ cationici,
◦ anionici
◦ neionici
Detergenţii cationici: cei mai importanţi fiind grupul
compuşilor de amoniu cuaternar.
În soluţii apoase, ca rezultat al disociaţiei, se
formează cationi cu încărcătură pozitivă (radicalul
amoniu) care se absoarbe pe suprafaţa membranei,
fiind activi atât faţă de bacteriile gram negative cât
şi gram pozitive, prin ruperea şi liza membranei.
 Coloranţii, larg utilizaţi în bacteriologie pentru colorarea
germenilor, dar şi pentru activitatea lor bacteriostatică şi
bactericidă (violetul de genţiană, cristal violetul, etc),
interferând cu sinteza acizilor nucleici.
Cristal violetul este folosit în tratarea infecţiilor bacteriene
gram pozitive şi unele infecţii fungice, ex. Infecţia orală cu
Candida (cu o soluţie de 0,5%).
 a. de nivel înalt – substante care distrug toate
microorganismele cu exceptia unui număr redus de spori
bacterieni, cu conditia timpului de contact de cel putin 20 de
minute
◦ peroxid de hidrogen stabilizat (6%),
◦ acid peracetic,
◦ hipoclorit de sodiu (5%, 25%),
◦ glutaraldehida (2%),
◦ cloramina B (2%);
 – substante care distrug virusuri, fungi, formele vegetative
bacteriene (inclusiv Mycobacterium tuberculosis) dar nu
distrug endosporii bacterieni si unele virusuri fără învelis
extern (rhinovirus, enterovirus).
Timpul de contact este de 10 minute:
◦ fenoli,
◦ iodofori,
◦ alcooli,
◦ compusi pe bază de clor etc;
 – substante care distrug majoritatea formelor vegetative
bacteriene, unele virusuri, unii fungi dar nu distrug M.tuberculosis,
endosporii bacterieni si virusurile nude.
Timpul de contact este de 10 minute:
◦ clorhexidina,
◦ compusi cuaternari de amoniu
Actiunea antimicrobiană a antisepticului sau dezinfectantului
depinde de
◦ concentratie,
◦ timpul de contact
◦ prezenta substantelor organice
 Studierea creşterii şi multiplicării bacteriilor, a
metabolismului bacterian este esenţială pentru
înţelegerea funţionării bacteriilor, a dinamicii lor şi
de asemenea pentru tratamentul infecţiilor bacteriene.
 La bacterii se întâlnesc sub forme asemănătoare sau
identice principalele căi metabolice şi cicluri de la
celulele eukariote.
 Multe din reacţiile biochimice privind metabolismul
celular au fost descrise iniţial la bacterii.
 Celulele umane prezintă variaţii mici în ceea ce
priveşte caracteristicile metabolice sau activităţile
biochimice.
1. Este un metabolism unicelular
2. Este un metabolism necompartimentat (pentru că
lipsesc organitele celulare)
3. Bacteriile au o mare flexibilitate metabolică, prin care
acestea se adaptează la condiţiile variate de mediu.
4. Este un metabolism de mare intensitate, care are drept
rezultat multiplicarea rapidă a celulelor bacteriene. Tg
mediu=20 min.
În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici
specifici - enzimele
 Caractere generale:
- Substanţe proteice
- Active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH
(2-9)
- Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu
un substrat catalizând un tip de reacţie)
- Specificitatea este determinată de centrul activ al
enzimei, complementar cu receptorul de pe substrat
- Nu se modifică în cursul reacţiei
I. Constitutive (permanente)
II. Inductive (adaptive), se sintetizează în prezenţa substratului
(ex.: lactaza)
III. Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a
produsului reacţiei catalizate
După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)
După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze,
transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
După impactul asupra ma/o
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificări
patologice ale ţesuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza,
colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, etc.
1. Rol în identificarea şi clasificarea bacteriilor
(enzimele determină activitatea biochimică
specifică a bacteriilor)
2. Unele substanţe chimice, antibiotice interferează cu
activitatea unor enzime, inhibând creşterea
bacteriilor (tratament)
3. Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor
(unele enzime sunt responsabile de producerea
leziunilor în ţesutul gazdei)
4. Aplicarea industrială a enzimelor
Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din
mediu substanţele necesare pentru metabolism.

Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.

Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP

pentru a fi antrenate în metabolismul celulei. Se obţin din
alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o
digestie prealabilă (proteine, polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- şi în
spaţiul periplasmic)
 1. Difuzie simplă (conform gradientului de concentraţie, fără
utilizarea energiei): O2, CO2, acizi graşi, nutrienţi liposolubili
 2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) –
permite transportul transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport specifice integrate in MCP
- permeaze.
 3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie,
necesită energie). Participă permeazele şi alte proteine de
transport /fixare specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.
 4. Translocaţie – substratul este modificat chimic (ex.:
fosforilat) în timpul transportului membranar; necesită energie
- Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi
importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K în cantităţi mici şi urme
de Co, Cu, Zn, Mo.
Bacteriile prototrofe sunt capabile a-şi realiza integral
sinteza metaboliţilor esenţiali.
- Necesităţi specifice. Bacteriile auxotrofe solicită
suplimentar compuşi organici preformaţi (factori de
creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.: AA,
baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în
mediul de cultură este indispensabilă creşterii acestor
bacterii.
 Bacterii psycrophile sau cryophile (iubitoare de rece)
– temperatura optimă este sub 20°C.
Bacterii mezophile – ele cresc între 20°C - 45°C, dar
temperatura optimă este de 35°C - 37°C – majoritatea
bacteriilor de importanţă medicală.
Termophile – temperatura optimă 45°C – 60°C
Hipertermophile- sunt bacterii care cresc in izvoarele
calde sau alte medii cu temperatură înaltă.
 Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de
carbon (nepatogene)
 Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii
organici (glucide, acizi graşi, alcooli, etc)
- Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt
saprofite (reciclarea materiei organice)
- Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul
organismelor vii, aducându-le prejudicii
- Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav
gazda, provocând maladie sau moarte.
Pe baza necesităţilor de oxigen, bacteriile se pot
clasifica în bacterii: aerobe, anaerobe şi
microaerophile.
Multe bacterii sunt aerobe şi cresc doar în prezenţa
oxigenului atmosferic. Deseori aceste bacterii sunt
patogeni ai căilor respiratorii sau a mucoaselor, ca de
ex. Mycobacterium tuberculosis.
Unele bacterii sunt anaerobe, ceea ce înseamnăcă ele nu
folosesc oxigenul, în timp ce unele sunt strict anaerobe,
ceea ce înseamnă că pe acestea oxigenul atmosferic le
omoară.
 Majoritatea bacteriilor anaerobe trăiesc în tractul
gastrointestinal şi pot cauza abcese profunde (de ex.
Bacteroides spp), iar altele sunt prezente în mediul
înconjurăror sub formă de spori şi pot cauza boală când
sunt introduse intr-un mediu care le asigură anaerobioza
(Clostridium spp).
 Ar părea ciudat, dar există anaerobi în cavitatea bucală a
omului (Bacteroides, Fusobacterium, streptococi
anaerobi – în şanţurile gingivale).
 Escherichia coli sunt bacterii capabile să crească atât în
condiţii aerobe, cât şi de anaerobioză. Multe din aceste
bacterii se găsesc la nivelul tractului digestiv şi pot cauza
infecţii ale plăgilor, leziuni ale tractului gastrointestinal,
infecţii urinare, etc.
Bacterii microaerophile au nevoie de oxigen, dar nu pot
creşte în aerul atmosferic, ele au nevoie de o presiune mai
redusă de oxigen (de ex. Neisseria spp, Campylobacter spp.)
1. Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) –
pH 6-7,5
2. Bacterii acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus)
3. Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)
 Presiunea osmotică
1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc în
concentraţii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul
intern al gazdei) – mi/o patogene
2. Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-
30%) – stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)
In raport cu obţinerea energiei:
bacterii fototrofe, care folosesc energia din radiaţia
luminoasă, bacteriile fotosintetice;
bacterii chimiotrofe: folosesc energia prin oxidarea chimică a
diferitelor substrate (organice sau anorganice, majoritatea
bacteriilor cu importanţă medicală)
 bacterii autotrofe: capabile să se dezvolte pe medii
alcătuite numai din substanţe anorganice, care utilizează de
obicei CO2 dizolvat în mediu ca sursă de carbon.
bacterii mixotrofe, pot folosi atât substanţe organice cât şi
CO2 din substanţe anorganice
bacterii heterotrofe, folosesc ca sursă de carbon substanţele
organice, ele sunt bacteriile cu imporanţă medicală.
bacterii paratrofe, care nu se dezvolta decat pe celule vii
(Ricketsii si Chlamydii)
 Unele bacterii, precum E. coli, pot creşte pe medii de
cultură simple, care conţin doar săruri, clorură de
amoniu şi glicerol.
 Alte bacterii sunt extrem de pretenţioase şi au un
necesar nutritiv complicat. Mai mult decât atât,
Treponema palllidum are un necesar de creştere atât de
complex, încât încă nu s-a reuşit obţinerea unui mediu
de cultură sintetic, care să-i permită dezvoltarea.
 Bacterii cu dezvoltare strict intracelulară (Chlamydiae
şi Rickettsiae) nu au crescut niciodată pe medii de
cultură sintetice, şi ele se cultivă pe linii celulare
eukariote (celule fibroblastice de şoarece sau celule de
embrion de găină) sau pe ou embrionat.
Acest fapt nu înseamnă că ele sunt virusuri (ele sunt de
fapt bacterii gram negative), si le face extrem de greu de
lucrat cu ele. Laboratoarele clinice nu au posibilitatea
cultivării lor.
 Cunoaşterea proprietăţilor metabolice ale
bacteriilor sunt în principal legate de cunoaşterea
necesităţilor nutritive ale bacteriilor patogene, în
vederea izolării acestora din produsele patologice
ale bolnavului cu scopul de ale identifica, de a le
cunoaşte proprietăţile patogenice şi cu scopul de a
determina gradul lor de sensibilitate la antibiotice
La bacterii, ca şi la alte organisme vii se produc procese
de anabolism şi catabolism.

Procesele de oxidoreducere sunt principalele mecanisme

prin care bacteriile îşi obtin energia mai ales din
substanţe organice, în urma cedării de electroni de către
un substrat donator, unui acceptor, care va fi redus.
Donarea de electroni este însoţită de eliberare de
hidrogen, reacţie de dehidrogenare.
• Fiziologia bacteriană studiază viaţa şi activităţile
bacteriilor – nutriţia, respiraţia, creşterea şi multiplicarea,
condiţiile de cultivare a bacteriilor.
• Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii
biochimice care au loc în celula vie.
- Catabolism – reacţii chimice de descompunere a
substanţelor complexe în elemente simple, însoţită de
degajarea energiei (metabolism energetic)
- Anabolism – reacţii chimice de sinteză a substanţelor
complexe din elemente simple, necesită energie
(metabolism constructiv, de sinteză)
Respiraţie oxibiotică, aerobă,
Respiraţia anaerobă
Fermentaţia
Respiraţie oxibiotică, aerobă
donatorul de electroni este o substanţă organică, iar
acceptorul final este oxigenul;
transferul are loc prin lanţul respirator, cu implicarea
citocromilor; se produc 38 de molecule de ATP;
Este întâlnită la bacterii care folosesc drept donor de
electroni substanţe organice,acceptorul final fiind o
substanţă anorganică: nitriţi, nitraţi, sulfaţi, etc., în care
intervine de asemenea lanţul respirator, însă cu alţi
cytocromi;
se produc 16-38 (de obicei mai puţin de 30) molecule ATP.
Procesele care se realizează folosind cantităţi mici de
oxigen, printr-o oxidare parţială a substratului, donatorul
şi acceptorul final de electroni este o substanţă
organică.În majoritatea cazurilor, fermentaţia are loc în
absenţa oxigenului sau în prezenţa, dar fără participarea
lui.
Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului
structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sinteză
Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe o unitate
de suprafaţă sau de volum
- Diviziune binară
- Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)
 Bacteriile se multiplică prin diviziune binară. Prin
acest proces, bacteria se alungeşte, îşi dublează
volumul şi formează un sept, care împarte bacteria în
două segmente egale. Când septul este complet, iau
naştere două celule fiice identice.
 Dacă o cultură bacteriană s-ar dubla o dată la fiecare 20
de minute (majoritatea bacteriilor) şi ar continua să se
multiplice neabătut 48 de ore, o bacterie (de ex.
Escherishia coli) ar produce 2144 celule bacteriene.
 Din fericire, creşterea bacteriană este autolimitantă.
Chiar şi în condiţii ideale, majoritatea culturilor
bacteriene se multiplică logaritmic doar pentru 3 – 5 ore.
Ele repede îşi consumă nutrienţii esenţiali şi acumulează
produşi toxici de metabolism.
1. Faza de latenţă (Lag);
2. Faza de multiplicare logaritmică (Log);
3. Faza staţionară;
4. Faza de declin (de moarte celulară
1. Faza de latenţă (Lag):
Când bacteriile sunt transferate într-un nou mediu de cultură,
este o perioadă iniţială când bacteriile trebuie să se acomodeze la
noile condiţii. Pot fi modificări de temperatură, nutrienţi
disponibili, etc. În această fază, bacteriile nu se multiplică, ele îşi
programează activitatea metabolică pentru aceste noi condiţii ale
mediului de cultură respectiv.
 Odată multiplicarea începută, numărul bacteriilor
sporeşte exponenţial. Timpul de generare (Tg) este timpul
necesar populaţiei bacteriene pentru a-şi dubla numărul .
Tg: 20 min. pt E coli,
24 ore pt. M. tuberculosis. În această fază celulele
bacteriene sunt foarte sensibile la condiţiile de mediu, deci
sunt susceptibile şi la antibiotice.
La un moment dat, mediul de cultură va rămâne fără
substanţele nutritive cheie, şi se vor acumula produşi de
metabolism toxici.Când aceasta începe, timpul de
generaţie se prelungeşte simţitor, iar rata de creştere a
bacteriilor se va echilibra cu numărul de bacterii care mor.
Această fază staţionară alterează mult susceptibilitatea
bacteriilor la antibiotic.
 Înaceastă fază finală, lipsa substanţelor
nutritive si acumularea de produşi toxici
de metabolism, duce la moartea celulelor.
Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei
pâna la următoarea diviziune
1. Faza C – replicarea ADN
2. Faza G – de latenţă, segregarea cromozomilor
3. Faza D – de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar
separarea cromozomilor şi diviziunea intervin în
momentul când celula atinge o lungime - limită
Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare. Se cultivă
bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale
(prelevate patologice, alimente, apă, etc).
Izolarea bacteriilor se realizează pentru:
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. Testarea sensibilităţii lor faţă de antibiotice
3. Obţinerea unor produşi de biosinteză (antibiotice, AA),
bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli,
acizi organici, etc), producerea vaccinurilor,
probioticelor...
Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii
fizico-chimice adecvate.
- Sursă nutritivă adecvată
- Sursă de energie
- Apă
- Temperatura potrivită
- pH adecvat
- Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2
- Presiune osmotică adecvată
Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide care asigură
nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare cultivării
bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea)
bacteriilor, testarea sensibilităţii la antibiotice, stocarea sau
transportul culturilor bacteriene.
Cerinţele faţă de mediile de cultură
- Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor
- Umiditate optimală
- pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon)
- Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5,
aerobi – rH2>10)
- Să fie izotonice (0,5% NaCl)
- Să fie sterile şi transparente
După provenienţă
1. Empirice, naturale. Au la bază produse de origine
animală sau vegetală (sânge, ser, lapte, ouă, cartof,
extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc).
Compoziţia lor chimică precisă nu poate fi controlată
2. Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia
chimică este cunoscută cu exactitate
3. Semisintetice
1. Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei
bacteriene şi a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar
(polizaharid extras din alge roşii, t° topire 80-100°C,
solidificare 42°C). Placa de geloză în cutii Petri este
utilizată pentru izolarea culturilor pure, geloza înclinată (în
pantă) – pentru acumularea culturilor pure
3. Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru
studierea activităţii biochimice sau a mobilităţii bacteriilor.
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Apă peptonată (apă + 1% peptonă + 0,5% NaCl)
2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1%
peptonă + 0,5% NaCl)
3. Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la
cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min
1 Medii elective – formate din medii simple cu adaos de
componente care permit creşterea mi/o exigente nutritiv
(bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi,
neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)
II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente
sau cu condiţii fizico-chimice particulare care
stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor
specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină -
vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)
Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate
pentru îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de
asociaţie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
Etapă premergătoare însămânţării pe medii selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) – pentru
Salmonella
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) –
Salmonella
- Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella
- Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru
anaerobi
– permit diferenţierea speciilor bacteriene în baza activităţii lor
biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-
reducere…)
Sunt construite după următoarea schemă:
Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietăţilor zaharolitice
Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)
Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi
biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo,
Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
 Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii
negre – reducerea sulfitului în sulfura de Bi)
Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru
Corynebacterium diphtheriae (colonii negre)
Studierea proprietăţilor lipolitice
Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un
halou opac în jurul coloniei
Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat)
În cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zonă clară
Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
Kligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
Indicatorul Andrede – fucsină+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la
modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în
galben.
În pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), în
coloană-glucoza (fermentare).
Producerea H2S – înnegrirea mediului
- Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi
ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi indicator.
Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia
bulelor de gaz (acid şi gaz - AG)
- Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi indicatori
IV. Medii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii
(Finn, Popescu, Loewenstein-Jensen –pentru agenţii
tuberculozei, Sabouraud – fungi)
– destinate transportării sau stocării unui material (prelevat),
care va fi examinat ulterior.
Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerină 30%
- Soluţie tampon-fosfat
- Soluţie NaCl 3%
- Mediul Cary-Blair
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na,
albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc
 Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material
ce conţine bacterii (inoculum) se întroduce într-un mediu
de cultură (însămânţare, inoculare), care ulterior va fi
incubat în termostat (pentru asigurarea temperaturii
optime).
 În timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se
divid, formând o cultură bacteriană (totalitatea
bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis – 3-5 săptămâni
V.cholerae – 6-12 ore
 Cultură pură – formată din bacterii de aceeaşi
specie (indispensabilă identificării)
 Cultură mixtă – compusă din bacterii de specii
diferite
 Tulpină – populaţie microbiană constituită din
descendenţii unei singure izolări în cultură pură,
care va fi studiată ulterior.
 Clonă – populaţie care rezultă din multiplicarea
unei singure celule
 În mediu lichid
- Turbiditate uniformă
- Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului
(vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment
la fundul tubului sau pe pereţi
(streptococi, Bacillus anthracis)
Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o
singură celulă sau un grup de celule (UFC - unitate
formatoare de colonii) pe suprafaţa unui mediu solid
 Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice
(caracter util în identificare)
Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-
2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) – regulat/neted, ondulat, zimţat,
lobat, dantelat, etc
Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată,
etc
Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă,
neregulată
Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc
Densitate – opacă, transparentă, etc
Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă
Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede,
lucioase
Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa
uscată, rugoasă
În funcţie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se
disting:
- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone

Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor în volum

limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obţinute şi utilizate în
laboratorul microbiologic
I. Faza de lag – faza de adaptare la condiţiile mediului,
bacteriile sunt active metabolic, cresc în dimensiuni, dar nu
se divid.
Durata este variabilă (2-4 ore); depinde de starea bacteriei,
condiţiile mediului, etc
II. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu viteză
maximală constantă, curba evoluează exponenţial. Bacteriile
sunt foarte sensibile la agenţi antimicrobieni (culturi utile
pentru testarea sensibilităţii la antibiotice).
Durata – 8-10 ore
III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică scade
treptat, numărul celulelor vii rămâne constant mai multe
ore.
Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea metaboliţilor
toxici.
Morfologia bacteriilor este tipică speciei, apar incluziuni,
spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la
agenţii antimicrobieni scade. Durata – 10-12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv
Cultura continuă – se realizează când mediul de cultură
este continuu reînnoit şi îmbogăţit cu oxigen cu evacuarea
unei cantităţi de cultură. Se realizează în chemostate sau
turbidostate, cultura aflându-se permanent în faza
exponenţială. Se utilizează în microbiologia industrială.
În intestin – culturi continue.
Culturi sincrone – culturi în care bacteriile se divid în
acelaşi timp
Laboratorul de Microbiologie medicală are rolul de a
preciza:
- diagnosticul etiologic al unei infecţii,
- sensibilitatea bacteriilor identificate la antimicrobiene, în
vederea alegerii preparatului cel mai performant pentru
tratament
- evoluția speciilor şi a rezistenţei la antimicrobiene într-un
spital, regiune
Examenul bacteriologic constă în inocularea (însămânţarea)
prelevatelor pe medii de cultură pentru izolarea culturilor
pure de bacterii (tulpini) care vor fi ulterior identificate,
testate la sensibilitate vis-a-vis de antibiotice, eventual
conservate.
Examenul bacteriologic constă din câteva etape succesive,
de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice până la
remiterea rezultatelor.
Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele examenului
clinic şi paraclinic). În ordonanţă se fixează identitatea
medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestările
patologice, data apariţiei, alte date: imunosupresie, tratament
cu antibiotice, graviditate, etc.
Prelevarea probelor
- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul
multiplicării sau/şi din căile de eliminare ale agentului
patogen) şi momentul prelevării
- Secreţii rino-faringiene, bronşice
- Spută
- Puroi
- Exsudate, transsudate
- Sânge
- LCR
- Urină, secreţii genitale
- Mase fecale, bilă, suc duodenal
- Bioptate, punctate
- Material cadaveric, etc
Sângele este un produs în mod normal steril, având la
dispoziţie capacităţi de clearance microbian.
Ca produs patologic acesta poate fi recoltat pentru examen
bacteriologic sau pentru examen serologic.
Pentru examenul bacteriologic se efectuează hemocultura,
care stabileşte prezenţa bacteriilor în sânge prin însămânţarea
unei probe de sânge într-un mediu de cultură adecvat.
Este indicată în cazul pacienților cu suspiciune de
a. septicemie/bacteriemie,
b. cu sindrom febril prelungit/sindrom infecțios sever,
c. afecțiuni valvulare, febra de cauză neprecizată etc.
- antiseptizarea tegumentelor cu o soluţie de alcool şi
chlorhexidină,
- după puncţia venoasă - se însămânţează sângele imediat
pe: 3 seturi de flacoane (de tip BACTALERT® sau
BACTEC®), care conțin medii de cultură lichide pentru
bacterii aerobe, anaerobe și fungi,
- cu asigurarea unui raport adecvat sânge/mediu (1/10-
1/5), adică 5- 10 ml sânge venos la 50 ml mediu lichid de
cultură (raport optim pentru diluarea sângelui şi
împiedicarea activităţii factorilor antimicrobieni naturali)
- înainte de iniţierea antibioterapiei!!!!
În cadrul examenului serologic se urmăreşte punerea în
evidenţă a anticorpilor din serul de cercetat.
În acest scop se recoltează 10 ml de sânge integral într-un
recipient steril şi se lasă la temperatura camerei timp de 1-2
ore pentru depunerea cheagului de sânge deasupra rămânând
plasma.
Plasma se decantează într-un recipient steril şi este apoi
centrifugată obţinând serul din care se fac teste pentru
diagnosticul serologic.
Recoltarea LCR se efectuează la patul bolnavului, prin puncţie
lombară (rahidiană) sau occipitală, în condiţii riguros aseptice.

Volumul necesar pentru examenele bacteriologice, biochimice şi

citologice este de 10-15 ml la adulţi şi 2-10 ml la copii, volum
repartizat în mod egal în trei eprubete diferite.

Transportul la laborator se face imediat şi la o temperatură cât mai

apropiată de 37°C (meningococul fiind foarte sensibil la variaţiile
de temperatură).
- Apă
- Alimente
- Sol
- Aer
- Lavaje
- Vectori, etc
- În recipiente sterile
- Respectând regulile de autoprotecţie
- La debutul bolii
- Până la administrarea antibioticelor
- Cantitate suficienta
Transportarea
- Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea
condiţiilor speciale după necesitate
- În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- În fişa de însoţire să fie indicată identitatea pacientului,
vârsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevării,
scopul investigaţiei, ş.a.)
- Prelevatul este supus examenului macroscopic
(modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare în
diagnostic
- După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru
investigaţie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)
- Examinarea microscopică (preparate native, Gram,
Ziehl-Neelsen, Loeffler...) – prezenţa mi/o, forma,
cantitatea, G+/-.
Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj
de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. O
colonie separată constituie o cultură pură.
Tehnici utilizate:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia
Petri (însămânţare în striuri paralele, însămânţare în
cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii).
2. Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză
topită şi răcită la 50º C (10-1, 10-2,...), apoi turnate în
cutii Petri sau eprubete.
Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în funcţie de TG).
- A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului
80º C – 20 min
- A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabilă cu acid a
prelevatului şi neutralizarea ulterioară cu o bază
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:
îmbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând medii de
îmbogăţire
- A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare:
inocularea la animalele de laborator sensibile
- Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă,
culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor
suspecte, confirmarea purităţii culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă
(înclinată) pentru acumularea culturii pure
- Termostat, 37º C, 18-24 ore
- Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)
- Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere
specifice ale acestei culturi pentru a o include într-o familie,
gen, specie, variantă
Se studiază caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultură
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice
1. Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui,
etc)
2. Activitatea proteolitică
- Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a
serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)
- Evidenţierea enzimelor ce intervin în degradarea AA
(decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu
detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S,
NH3, indol, etc…
Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de Fe de
culoare neagră în mediile multitest – Kligler, Olkeniţki,
etc; utilizarea benzilor de hârtie de filtru îmbibate cu
acetat de Pb care se prind între dopul eprubetei cu BP în
care creşte cultura studiată (formarea sulfurii de Pb
înnegreşte hârtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) –
benzi de hârtie îmbibate cu acid oxalic. În prezenţa
indolului indicatorul virează în roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se
colorează în albastru.
Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)
(cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată – apariţia bulelor
de gaz)

Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei din lanţul

respirator)
Reactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de
hârtie îmbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului – culoare violetă-neagră
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% - formarea unui
halou opac în jurul coloniilor

Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac în jurul

coloniilor (precipitarea acizilor graşi)
Depistarea hemolizinei – geloză-sânge 5-10% - zonă clară în jurul
coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37º C, 18-24 h
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de
timp, spaţiu, material)
Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase
alveole care conţin fiecare un mediu deshidratat diferit
(glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie
bacteriană testată şi incubate. Ulterior la necesitate se
adaugă reactive pentru detectarea metaboliţilor particulari.
Lectura – conform unui cod de cifre sau computerizat
API Staph permite identificarea speciilor din genul
Staphylococcus,
API 20 Strep sau 32 Strep identifică speciile de streptococi,
API 10S sau 20E sistem de identificare al bacililor gram
negativi de tipul enterobacteriilor și non-enterobacterii,
API 20NH sistem de identificare a bacteriilor gram negative
din genurile Neisseria şi Haemophilus,
API 20A și rapid 32A pentru identificarea anaerobilor din
genurile: Bacteroides, Fusobacterium și Prevotella,
API Candida și C AUX pentru identificarea speciilor de
Candida și dermatofiţi etc.
 În ultimul timp s-au dezvoltat analizoare automatizate şi
computerizate care utilizează carduri de reacţii
miniaturizate, cititoare automate şi o bază de date care
permite identificarea corectă a bacteriilor (analizor
Vitek®, Microscan® etc.) sau spectrometre de masă de
tip MALDI-TOF®.
Sistemul VITEK® 2 Compact are ca obiect de activitate identificarea
bacteriilor şi a fungilor şi testarea sensibilităţii bacteriilor cu efecte
semnificative din punct de vedere clinic.
Sistemul include aparatul VITEK® 2 Compact, un computer (o staţie de
lucru) şi o imprimantă.
 Aparatul VITEK® 2 Compact este un sistem integrat care
combină operaţiile de inoculare a cardului de testare,
incubare a cardului de testare şi citire a rezultatelor.
ETAPELE:
 1. Izolarea culturii pure
 2. Pregatirea probelor (a suspensiei bacteriene)
 3. Introducerea cardurilor de testare şi a
eprubetelor cu probe în casetelor corespunzătoare.
4. Încărcarea casetei în Staţia de umplere (umplerea
celulelor cardurilor de testare).
 5. Transferarea casetei în staţia de încărcare a casetei
 6. Procesarea cardurilor de testare (citirea codului de bare, sigilarea
tubului de transfer, incubarea si citirea cardurilor de testare)
VITEK® 2 Compact realizează analizele de identificare şi de
sensibilitate prin monitorizarea continuă a creşterii şi a activităţii
microorganismelor din interiorul celulelor din cardurile de testare.
Sistemele optice de transmisie utilizează lumina vizibilă pentru
măsurarea directă a creşterii microorganismelor. Aceste sisteme
optice se bazează pe o citire iniţială a luminii de la nivelul unei
celule înainte de începerea unei creşteri semnificative. Determinările
transmisiei luminii la nivelul aceleiaşi celule la fiecare 15 minute
măsoară creşterea microorganismelor în funcţie de cât de mult este
împiedicată lumina să traverseze celula.
7. Ejectarea cardului
Durata analizei – 2 – 10 ore
MALDI - abreviere de la "Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization.“
TOF – Time Of Flight

MALDI/TOF este utilizat pentru identificarea

microorganismelor (bacterii sau fungi) în baza
spectrometriei de masă
O colonie izolata este etalata direct pe o placa metalizata si
acoperita cu matrice (absorbent de energie). Amestecul
este ionizat in mod automat cu raze laser. Matricea
absoarbe razele laser si le transforma in energie termica,
incalzindu-se rapid (nsec) si generand ioni de analit de
diferite dimensiuni. Ionii sunt identificati dupa mass-to-
charge ratio.
Spectromeria de masa generata este analizata cu un anumit
soft si apoi comparata cu profilele stocate (biblioteca).
Identificarea speciilor este mult mai rapidă, mai exactă și
mai ieftină decât alte proceduri bazate pe teste
imunologice sau biochimice.
se face în prezent în format electronic în majoritatea
laboratoarelor, prezentând avantajul:
- stocării unui număr nelimitat de informaţii,
- al posibilităţii de reactualizare a oricărui rezultat,
- al efectuării interpretării statistice a trendurilor de
rezistenţă bacteriană,
- precum şi al colaborării rapide cu alte laboratoare de
specialitate etc.
- Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor
bacteriene cunoscute pentru a găsi asemănări.
- Exemplu de răspuns:
Din proba examinată a fost izolată tulpina de
Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibilă
la ...., rezistentă la .....
Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat -
100º C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină; însămânţarea
în geloză în coloană)
2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică – utilizarea anaerostatului
- Metoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce
fixează oxigenul (pirogalol+bază); utilizarea gas-
pachetelor
- Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a
aerobilor şi anaerobilor
- Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-
Tarrozzi regenerat
- Încălzirea unui tub la 80º C, 20 min – distrugerea florei
nesporogene
- Incubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc multiplicarea
anaerobilor)
- Studierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului,
descompunerea bucăţilor de ficat, etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin
metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T pe
3 cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv). Incubarea în
anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h
Metoda Weinberg – diluţii succesive ale culturii în geloză
glucozată lichefiată şi aspirarea în tuburi lungi şi înguste,
închise ermetic. Incubarea în termostat, 24 h
- Studierea macroscopică a coloniilor
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor
suspecte
- Repicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea
culturii pure
- Incubarea în termostat, 24 h
- Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu
respectarea condiţiilor de anaerobioză)

V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR,

FORMULAREA ŞI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI