NOTILTNI INTRODUCTIVE DE CROMATOGRAFIE 6

Cromatografia reprezrntd, a metodd fizico-chimicd de analizl ce permite separarea.

identificarea gi dozarea unor componente cu structuri asemindtoare, din amestecuri
complexe, folosind diverse sisteme de separare gi diverse suporturi pentru fi'acfionare. Analiza
cromatografici se bazeazd pe comportamentul diferit al componentelor din amestec privind:
solubilitatea, adsorbpia pe anumi[i adsorban;i, capacitatea de schimb ionic etc.
Metodele cromatografice de analizd. pot fi clasificate in funclie de mecanismul
procesului de separare gi in funcfie de natura suportului folosit. Principalele tipuri sunt:
- cronxatografia de adsorb;ie - realizeazd separarea componentelor din amestec pe
baza capacitefii lor diferite de adsorbgie pe suportul (mediul) folosit;

- crontatografia de partilie - realizeazl separarea componentelor din amestec, pe hArtie

de filtru sau coloanL,pebazacoeficientului diferit de repartilie intie doul lichide nemiscibile
sau parlial miscibile;

- ct'omatografia de afinitate - rcalizeazd separarea unui component din amestec prin

relinerea lui pe un suport insolubil pentru care manifestd afinitate;
- cromatografia de schimb ionic - rcalizeazd. separarea substanlelor polare datorita
grupdrilor lor ionizabile (acide sau bazice) ce pot fi relinute qi eliberate ulterior pe un suport
numit schimbltori de ioni;
- cromatografia de excludere moleculard - realizeazii separarea componentelor din
amestec pebaza dimensiunilor lor;

- eromatografia fn strat sublire - realizeazi separarea componentelor din amestec pe

baza proceselor de adsorblie gi repartilie diferita a lor, pe un suport din material adsorbant
dispus intr-un strar sublire tcelulozd. siiicaeel etc..1:

' cromatograrta in fazd gazoasd - realizeazd separarea componentelor din amestec

intre o fazd stalionari (lichid reginut pe o coloanl realizatd, din suport solid) gi o faz6 mobilA
(fazd, gazaasd ce se deplaseazi de-a lungul fazei stafionare).

Cromatografia de partifie pe hArtie

in analiza biochirnicd foarte fotositi este cromatografia de parti;ie pe hartie. prin
aceastf, metodi se pot separa amestecuri de glucide, aminoacizi, acizi organici, alte
componente biochimice.
 Metoda se bazeazd' pe separarea componentelor ditr ameste c pe baza
solubilitdlii qi a
repartiliei lor diferite intre doud faze nemiscibile sau partial miscibile.
Suportul material folosit este hartia cromatograficd; o hArtie de
filtru cu proprietrfi
speciale din punct de vedere al omogenitelii, densitilii, puritilii gi grosimii.

Fazele lichide nemiscibire sau parliar miscibile sunt:

- un solvent polar (apa), refinut pe hdrtia de filtru (fibrele de celulozd
sunt putemic hidrofile),
care constituie faza s talionard (fixe);

- un solvent apolar (solvent organic), care se deplaseazi de-a lungul hdrtiei gi reprezin td
faza
mobild.
\'1 Componentele din amestec sunt antrenate de solven{i redristribuindu-se
continuu i'tre
cele doud faze lichide-Yiteza de deplasare de-a lungul hArtiei a
componentelor din amesrec
este in func$e de solubilitatea fieclrui component in solventul polar gi respectir ip cel
organic' Yiteza de migrare va ficu atat mai mare cu cdt componentul este mai solubil in
solventul organic (faza mobil[) gi distanfa parcurs[ va fi mai
mare.
Observarea componentelor dupl separare se face printr-o
reaclie de culoare specificd
compugilor analizafi. Pe hdrtia cromatograficl apar spoturi colorate.
Se obline astfel o
cromatogramd.
Identificarea componentelor separate (spoturilor) se face cu ajutorul
coefcientuttti Rf
(coeficient de reten{ie). Acesta reprezintd o mdsur6 a coeficientului
de repartifie al
componentului intre cei doi solvenli. in mod practic, Rf-ul se
determin[ fic6nd raportul dintre
distanla (d) parcursi de fiecare component separat din amestec
ai distanfa (D) parcursi se
solvent.

Rf = d/D
Coeficientul Rf ne arati. pozifia fiecdrui component pe cromatogramd;
are o valoare
subunitard caracteristicd unui component in aceleagi condi{ii
de lucru:
- Rf mare inseamn6 o migrare mai rapidi gi o pozilie mai apropiatd a
componentului de
frontul solventului:
- Rf mic inseamni o pozilie mai apropiat[ de punctul de
start (pozilia de aplicare a probei).
Identificarea componentelor din amestec se face prin compararea
valorilor Rf oblinute
cu cele gasite pentru o cromatogrami martor, lucratd in aceleagi
condilii, pentru substanle
cunoscute.

Crontatografia de partilie pe hdrtie se poate realiza diferit

in functie de sensul de
migrare al solventului:

- (l) cron'tatografie ascendentd - h6rtia cromatografici este agezatr in pozilie

vertical5 iar sensul de migrare al solventului este de jos in sus (ascendent);
 - (2) cromatografie descendentd - hdrtia cromatograficl este agezatd in pozilie

verticald iar sensul de migrare al solventului este de sus in jos (descendent);

- (3) cromatografie bidimensiotnald - migrarea se face in doud etape: prima migrare

ascendentl sau descendentd cu un lichid de irigare (a) iar a doua migrare se face perpendicr.rlar
pe prima direclie de migrare utilizAnd un lichid de irigare diferit de primul (b);

- (4) cromatografie circulard - hArtia cromatograficd este agezatl in pozilie orizontald

iar direc{ia de migrare este radiald de la centru hArtiei spre extremitifi.

{n
(<. ' .'
_:?.=,
s{,

FT.
il
gl-gt " I
i;
at h
o
u
3 o.-

Separarea aminoacizilor prin cromatografie de partifie pe hArtie

Principiul metodei
Aminoacizii provenili din hidrotiza proteinelor. izolate dintr-un material biologic se pot

separa, identifica qi doza pe baza solubilitdlii gi repartifiei lor diferite intre o fazl apoas6

(stalionari) gi o fazi organicl (mobila). Cele doul faze sunt parlial miscibile.
Identificarea se face prin reacfia aminoacizilor cu ninhidrina (reacfie de culoare); are
loc revelarea spoturilor 5i obtinerea cromatogramei.
U
il
.oH
-"\ \{+ R-CH-COOH
,/ \oH I
NHz
lt
o

Purpura lui Ruhemann

3
 Pentru fiecare aminoacid separat din amestec se calculeazi Rf-ul gi se comparl cu Rf-
urile gisite pentru aminoacizii existenfi pe o cronratogrami martor.
\4ajoritatea aminoacizilor in reaclie cu ninhidrina se coloreazi in albastru-violet.
Existi gi excepfii:
- fenilalanina gi tirozina se coloreazdin albastru;
- prolina gi hidroxiprolina se coloreazi in galben;
- cisteina gi cistina se coloreazd in brun deschis;
- histidina gi triptofanul se coloreazdinviolet-brun.

Etape de lucru
I. pregdtirea hdrtiei cromatografice - se folosegte hArtie speciald (Whatman - 1) ce se
decupeazi in funclie de tipul de cromatografie; se stabilegte linia de start gi se marcheazd la
distanle egale pozigiile de aplicare a probelor;
2. pregdtirea bacului cromatografic - se folosesc vase paralelipipedice sau circulare
acoperite etang; se prepard lichidul de irigare.dinbutanol: acid acetic: apdin proporfie de
4 :1 :1; se introduce lichidul de irigare in bac,din timp pentru a realiza o saturarb cu vapori a
atmosferei din vas;
3- aplicarea probelor Si a martorilor - se face in punctele de start, prin aplicare cu
micropipeta, in cantitifi mici; se agteapti uscarea spoturilor gi dacd se consideri necesar se
face o noui aplicare;
4. developarea (irigarea) - se introduce hdrtia cromatograficl in bac ai se urm6regte
avansarea frontului solventului cdtre extremitatea hArtiei; cAnd frontul solventului a ajuns la
extremitatea hdrtiei se scoate h6rtia din bac, se noteazi frontul solventului gi se usuci hirtia;
5. revelarea - se face prin pulverizarea hdrtie cu o solu{ie alcoolicl de ninhidrind;
urmeazd uscare la etuvd, la 105 - 110 oC; dup6 5 minute se observi spoturile colorate.

Evaluarea rezultatelor
Evaluarea rezultatelor se poate face atit calitativ(l) cdt gi cantitativ (2):
l. - pentru identificarea aminoacizilor separali din probi se face intdi o comparare a

spoturilor din probi cu spoturile aminoacizilor martor; aminoacizii de la acelagi nivel gi avdnd
coloratii asemdnAtoare se consicierd identici:
- se calculeazi coeficientul Rf- se mdsoari cu rigla distanfa de la start pdni in centrul
spotului de aminoacid (d); se mdsoard"qi distanfa de la start pind la frontul solventului (D)
dup[ care se calculeaza RFul ( Rf : d / D ) pentru fiecare aminoacid din probi gi martori; se
compard valorile gdsite; aminoacizii cu Rf-uri identice se considerd identici;
2. - spoturile revelate se contureazd,cu creionul, se decupeazd gi se introduc mdruntite
in eprubete; se adaugi alcool metilic ca eluant; se derermini spectrofotometric extinclia,
soluliilor colorate oblinute, la l":570 nm.