TOIINFECII PRODUSE DE SALMONELLA SPP.

Salmon i Smith, n anul 1885 izoleaz o bacterie de la porcii bolnavi de pest denumit Bacillus cholerae suis, ulterior, n 1888, Grtner descrie o t.i.a. prin consum de carne de vit care a mbolnvit 58 de persoane, microorganismul implicat fiind denumit B. enteritidis. n Romnia primul caz de t.i.a. cu salmonele a fost descris n anul 1905, de ctre Babe, t.i.a. fiind produs prin consum de carne de miel.

 Habitat - Salmonelele sunt bacterii ubicvitare aflndu-se n mediul nconjurtor, de unde ajung n intestinul omului i animalelor. Factorul uman ca surs primar joac un rol mai puin important, rolul decisiv este reprezentat de activiti incorecte, mai ales cnd este purttor: manipulare, preparare, depozitare, comercializare, etc.; Animalele bolnave i/sau purttoare sunt adesea implicate n transmiterea salmonelelor, n contaminarea materiilor prime, a alimentelor destinate consumului.

 Salmonele fac parte din genul Enterobacteriaceae sunt bacterii nepatogene, slab patogene sau patogene care au ca biotop intestinul animalelor i a omului. Acesta reprezint un biotop complex, cu multiple variaii n funcie de substratul nutritiv oferit, ceea ce determin o variaie i o selecie continu a enterobacteriilor care-l populeaz.

 Rezervoare i ci de infecie purttorul uman reprezint unica surs de infecie pt. Salm. Paratyphi A, B, i C; furajele contaminate, n special finurile furajere utilizate n hrana porcilor i psrilor; oul cel mai frecvent aliment contaminat cu Salm., n special servar. enteritidis, utilizat n prepararea fr prelucrare termic a unor: maioneze, creme, torturi, ngheate, etc.; carnea de pasre, n special carnea de ra, dar i gin, gsc, etc.;

 laptele i produsele lactate se realizeaz prin utilizarea materiei prime contaminate sau contaminare la procesare, contaminare ulterioar; carnea animalelor de mcelrie este mai rar incriminat, mai ales cnd nu corespund condiiile de abataj; petele, produsele din pete, crustacee, molutele sunt tot mai frecvent contaminate datorit extinderii numrului de cresctorii; vegetatele se contamineaz prin intermediul apei de irigare, splare, utilizate n stare crud, iar indirect prin minile personalului;

 tehnologia de preparare a ciocolatei favorizeaz dezvoltarea salmonelelor, n aceste produse supravieuind n timp ndelungat; alte produse pe baz de cacao, condimentele, diferite adaosuri, etc., pot fi contaminate; Factorii de virulen Capacitatea agresiva a salmonelelor este datorat a dou mecanisme de patogenitate: virulen i toxicitate;

S. PARATYPHI A
S. BISPEBJERG S.PARATYPHI B S. JAVA

S.OTHNMARSCHEN
S. HAELSINGBORG S. ORANIENBURG S. THOMPSON

C 1

C-1

C 1

C 1

S. ABONY
B

S. SINGAPORE
C 1

S. ABORTUS BOVIS
B

S. CONCORD
C 1

S. WIEN
B

S. IRUMU
C 1

S. SCHLEISSHEIM
B

S.BONN
C1

S. san-diego S. aguna S. essen S. california S. kingston S. typhmurium ...0.S. agama S. brendeney

B B
B B B
/

Speciile de Salmonella i entittle determinate GAZDA SEROTIPURI DE SALMONELLA Om S. typhi; S. paratyphi; S. schatmuelleri S. enteritidis; S. typhimurium; Febra tifoida febra paratifoida, toxiinfecii alimentare Bovine S. dublin; S. typhimurium; S.bovimorbificans i altele - excretori subclinici, purttori, enterita, septicemie, meningita la viel, avort, osteomielita, artrita, gangrena uscata a extremitilor la viel, enterita i septicemie;

 Porcine S. cholerae suis; S. cholerae suis biotip Kunzendorf S. typphisuis; S. thyphimurium i altele; izbucniri clinice severe, similare cu cele din pesta porcina; complicaii secundare n pesta porcin. enterita cronica la porcii tineri; mai puin virulenta dect S. Cholerae suis; enterit sau septicemie;

Cabaline S. abortus equi; S. typhimurium i altele avort la iapa; enterita sau septicemie mai ales la mnji i la adulii supui stresului Ovine S. abortus ovis; S. montevideo; S. dublin; S. typhimurium; S. anatum i altele avort la oaie; enterita sau septicemii;

 puluroza - transmisie transovarian; tifoza psrilor la toate vrstele, mai ales adulte, transmisa prin oua, infecii severe (enterite i septicemii) la puii de gin i curcan; Transmiterea prin ou se ntlnete i la reptile; infecie inaparent, enterite i septicemii; poate fi transmis prin ou; S. typhimurium produce adesea moartea (septicemie) la puii de porumbel i artrite ale aripilor;

Mecanisme de aciune

 ataarea este un mecanism complex, proces de adeziune la nivelul receptorilor glicoproteici localizai pe microvilii sau glicocalixul enterocitelor; supravieuirea i multiplicarea n celulele gazd prin declanarea unui proces inflamator cu eliberare de mediatori vasodilatatori; eliberarea de endotoxin; existena plasmidelor de virulen - care stimuleaz bacteria purttoare la o multiplicare mai rapid n celula gazd depind capacitatea acesteia de a se apra.

 Toxigenitatea Salm. elaboreaz 2 tipuri de toxine bacteriene: exo i endotoxine Exotoxinele proteine termolabile, cu greutatea molecular de 90 i 110KDa; Citotoxina - protein termolabil citotoxic, cu greutatea molecular de 56-78 Kda, localizat n membrana citoplasmei bacteriene. Citotoxina inhib sinteza proteic pt. celula gazd determinnd liza acesteia;

 Endotoxinele eliberate dup fagocitoz, -i exercit rolul toxic pa mai multe ci: declanarea mecanismului coagulrii intravasculare cu eliberare de mediatori vaso-paralitici; efecte citolitice de tipul TNF Tumor Necrosis Factor de ctre macrofage i celuleepiteliale; Efect pirogen prin factori eliberai de polimorfonucleare, .a.

 Simptomatologie cea mai mare parte a serotipurilor de Salm. sunt antropozoonotice indiferent de gazd, unele serotipuri sunt patogene numai pentru o anumit specie: ex. ser. Typhisuis porcine, Abortus ovis ovine, ser. Gallinarum pasri; febrele enterice la om sunt produse de ser. Typhi, ser. Paratyphi A, B i C nu sunt considerate t.i.a., dei transmiterea se face pe cale alimentar sau hidric.

 Salmonelele enterice sunt cele mai rspndite i sunt cea mai frecvent form de mbolnvire simptomatologia salm. enterice, necomplicate sunt preponderent digestive, nsoite de cortegiul de simptome adiacente: diaree profuz, deshidratare, slbiciune, etc. i constant apare febra; debutul bolii apare dup o incubaie de 8-72ore, cu alterarea strii generale, cefalee, ameeli, anxietate, transpiraii reci, frisoane, etc.; fenomenle digestive: greuri, vrsturi, dureri epigastrice, crampe abdominale i diaree.

 Tabloul digestiv poate avea intensiti variabile, de la scaune moi nsoite sau nu de vom, la forme severe de diaree pn la diaree holeiform (20-40 scaune pe zi) , nsoit de febr mare. Concomitent apar stari clinice alarmante: adinamie, reacii meningeale, stri de agitaie, confuzie, delir. Tahicardie, nsoit de puls slab, neregulat, microhemoragii capilare. Recent se admite existena a dou forme majore: enterice i septicemice.

 Forma septicemic - apare la btrni, copii, diabet, infecii cronice, bolnavii neoplazici, .a., cu evoluie grav, generalizat tulburri cardiovasculare, chiar sindrom de coagulare intravascular diseminat. Localizrile secundare pulmonului, meningelui, hepatice, splenice, articulare, nsoesc formele generalizate sau sunt urmare a acestora.

Izolarea Salmonella spp.

Pe plan mondial, cel mai des incriminat agent etiologic al toxiinfeciilor alimentare (TIA) sunt salmonelele. TIA sunt considerate cea mai frecvent zoonoz, morbiditatea n cazul salmonelozelor este mult mai ridicat n Europa dect n America, dei n ultimii ani s-a constatat o escaladare a numrului de mbolnviri pe ambele continente. n Romnia, numai n 1997, au fost confirmate i tipizate de ctre Centrul Naional de Referin pentru Salmonella de la Institutul Cantacuzino din Bucureti un numr de 1 475 de tulpini de Salmonella spp.

Incidena tulpinilor izolate de Salmonella spp la om este n relativ scdere, comparativ cu cele izolate de la mamifere i psri. Raportarea privind preponderena diverselor serotipuri izolate din carnea de pasre sunt relativ diferite n funcie de autori, de zona geografic, de exemplu: Spania, Albania sau de produsele studiate, contaminarea crnii de pasre fiind cel mai frecvent citat n literatura de specialitate. n Romnia, sunt citate izolri frecvente din carnea de pasre dezosat mecanic, din organele de pasre sau carnea de pasre, de pe carcasele de pasre i din alte tipuri de alimente de origine animal.

 Metode de izolare i confirmare Salmonella spp. utilizate n laboratoarele veterinare de diagnostic din Romnia: SR EN ISO 6579/2003 actualizat n 2006 i 2007 Metod orizontal pentru detectarea (izolarea i confirmarea) bacteriilor din genul Salmonella. completat cu SR EN ISO 6579/2009; SR-EN 12 824/2004 i alte normative i prevederi din literatura de specialitate.

 DEFINIIE conform SR-EN -ISO 6579/2006-2007 Microorganismele care formeaz colonii tipice sau mai puin tipice pe medii selective solide XLD i RVS cu soia, (respectiv alte medii HK, IM, .a.) i care posed caracteristici biochimice i serologice descrise conform prezentului standard, sunt considerate Salmonella spp. SCOP conform SR-EN -ISO 6579/2006-2007 Detectarea prezenei sau absenei germenilor din genul Salmonella ntr-o cantitate determinat de produs (25g), atunci cnd analiza este efectuat conform prezentului Standard Internaional.

Ziva Prima zi

Etapa Preincalzirea APT

Descriere

Se vor pregati la sfarsitul zilei de lucru suficiente baloane , fiecare continand 225 ml APT si se vor incuba la 37 C 1 C. In pungile de stomacher cu probele de analizat (25g came) adaugati cate 225 ml APT. Omogenizati proba in punga stomacher pentru aproximativ 1 minut. - pentru detectia Salmonella spp.- se incubeaza cei 250 ml timp de 18 h 2 h la 37 C 1 C. Pentru detectia Salmonella se iau : - 0.1 ml din APT si se introduc intr-o eprubeta continand 10 ml RVS; se incubeaza la 41.5 1C pentru 24 3 h; - 1 ml din APT Si se introduce intr-o eprubeta continand 10 ml MKTTn; se incubeaza la 37 1C pentru 24 3 h.

Ziua a II-a

Preimbogatirea

Ziua a III a

Imbogatirea selective

Ziua a IV a

Izolarea

Ziua a V-a Ziua a VI-a

Confirmare biochimica a Salmonella spp. Confirmarea serologica a Salmonella spp.

- Pentru detectia Salmonella - din RVS si MKTTn se inoculeaza agar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Si se incubeaza la 37 1C pentru 24 3 h. Al doilea mediu este lasat la discretia laboratorului, dartrebuie sa se respecte cu strictete instructiunilefabricantului in ceea ce priveste pregatirea lui pentru folosire. Confirmarea prin teste biochimice a coloniilor suspecte de Salmonella spp.
Confirmarea serologica ( grup 0) a coloniilor suspecte de Salmonella spp. prin metoda aglutinarii pe lama conform SR EN ISO 6579/2003 AC/2009.

 Etapele de lucru I- Prembogirea (mbogire neselectiv). Din proba de analizat se preleveaz 25 de grame (din profunzime) care se nsmneaz n unul din mediile de prembogire: bulion lactozat sau ap peptonat tamponat. Mediul de prembogire - ap peptonat tamponat (APT), este utilizat i pentru efectuarea diluiilor. APT se folosete n cantitate de 225ml la care se adaug 25 g prob, respectnd raportul prob/mediu de 1/10. Incubaia se efectueaz la 350 C sau la 370C -/+ 10C, timp de 16-20 ore.

II - mbogirea selectiv. din mediul de prembogire se preleveaz 0,1 ml de cultur (din mediul de prembogire) care se introduce n 10 ml de bulion cu verde malahit i clorur de magneziu, denumit i mediul Rappaport Vassiliadis cu soia (R-VS), iar 1 ml din cultur se introduc n 10 ml de mediu Muller Kauffman tetrationat novobiocin (MKTTn).

Incubaia se efectueaz astfel: eprubeta cu RappaportVassiliadis cu soia (RVS) se incubeaz timp de 24 ore +/-3 ore la 41,50C; eprubeta cu Muller Kauffman tetrationat novobiocin (MKTTn) se incubeaz la 370C +/- 10C, timp de 24 ore +/-3 ore .

III - Izolare i identificare cu ansa bacteriologic ncrcat cu cultura obinut din MKTTn i RVS (medii de mbogire selectiv) se striaz pe suprafaa uscat a unei n plci Petri de dimensiuni 10 cm diametru, n care s-a turnat mediul OBLIGATORIU - xiloz-lizin-deoxicolat (XLD) i o alt plac cu un alt mediu selectiv LA ALEGERE: agar Hektoen (HK), agar Mac-Conkey (McK), Istrati-Meitert (IM), agar-dezoxicolat-citrat-lactoz (ADCL), Drigalsky (Dky), etc. din cultura obinut n mediile selective se testeaz biochimic, dup modalitatea pe care o vom descrie la confirmarea tulpinilor care formeaz colonii caracteristice sau mai puin caracteristice dar suspecte de a fi Salmonella;

 Citirea caracteristicilor coloniilor de Salmonella pe mediile menionate prezint urmtoarele aspecte: Mediul obligatoriu este mediul XLD, conform acestui standard; Coloniile de Salmonella sunt pe mediul XLD (xiloz, lizin, lactoza, dezoxicolat) (bioMerieux), de culoare roie, deoarece acestea nu utilizeaz lactoza. Tulpinile de E. coli, Citrobacter, Enterobacter, etc., care folosesc att lactoza ct i xiloza, determin apariia coloniilor de culoare galben n prezena indicatorului rou fenol, deoarece pH-ul devine acid. Acest mediu este recomandat n special pentru diferenierea coloniilor de Salmonella de cele de Shigella, deoarece permite producerea de H2S, aceste colonii avnd centrul negru.

Colonii transparente (roii) de Salmonella spp. H2S pozitive, pe mediul XLD

 Mediul Hektoen (bioMerieux), este inhibitor al speciilor de E. coli, Citrbacter i Proteus, ns nu inhib dezvoltarea vibrionului choleric. Salmonella H2S (+) produce colonii de culoare verde cu centrul negru, iar Salm. H2S (-) prezint colonii de culoare verde cu centrul albastru. Coloniile de culoare roz pot fi de Salm. Arizonae, dar se pot dezvolta slab i colonii de E. coli, Enterbacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, chiar cu acelai aspect. Coloniile roz cu centru negru sunt produse de Proteus vulgaris. Acest tip de colonii este ntlnit i n cazul dezvoltrii speciilor de Shigella, M. morgani, P. rettgeri, Providencia, Pseudomonas, iar Vibrio cholerae produce colonii roz.

 Interpretare: Pentru diferenierea coloniilor de Salmonella de Shigella urmrim: colonii de culoare verde cu centrul negru sunt considerate colonii suspecte, posibil de P. mirabilis sau de Salmonella, colonii verzi sau albastre sunt considerate suspecte i pot fi de Shigella, tulpini H2S- de Salmonella, M. Morganii, Providencia rettgeri sau Pseudomonas, colonii roz, galbene, cu sau fr centru negru nu sunt suspecte i pot fi colonii de: E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, P. vulgaris, etc., Limitele mediului constau n faptul c speciile Salm. Arizonae i Sh. Sonnei nu sunt suspecte n aparen.

Formerea coloniilor H2S-pozitive, pe mediul Hektoen, la 24 i 48 ore (3x10)

Alte medii recomandate pt. Salmonella spp.; Mediul cu rou fenol i verde briliant, BGA sau Edel i Kampelmacher (Oxoid); Pe mediul Edel-Kampelmacher coloniile prezumtive de salmonele sunt: de dimensiuni mici, 1-2mm, roii, rotunde, cu suprafaa bombat, umed; mediul din jurul coloniei prezint coloraie rou-aprins sau roz-rou; este un mediu utilizat pentru selectarea i izolarea Salmonella spp. din produse alimentare, n special bacteriile care se gsesc n numr mic.

 Principiu mediul cu rou fenol i verde briliant are urmtoarele proprieti: verdele briliant inhib bacteriile Gram pozitive i unele bacterii Gram-negative, comparativ cu mediul Cristensen, acesta este mbogit cu factori nutritivi, inhibitori i reductori, mediul conine carbohidrai, sucroz i lactoz, care prin fermentare schimb pH-ul mediului, n prezena roului fenol ca pH indicator vor aprea colonii galbene n cazul bacteriilor care folosesc aceste zaharuri, Salmonella produce colonii de culoare roz.

 Interpretare Mediul cu rou fenol i verde briliant prezint urmtoarea citire: Colonii roz sau roii, lactoz/sucroz negative, sunt colonii suspecte de Salmonella, colonii roz, proliferate, rugoase sunt tulpini de Proteus, colonii mici roz, sunt reprezentate de Pseudomonas, colonii galbene, galben-verzui, nconjurate de o zon galben, sunt colonii de Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter , deci tulpini lactoz i sucroz pozitive, bacteriile Gram-pozitive sunt inhibate pe acest mediu.

Mediul Istrati-Meitert produce colonii de culoare verde-albastr pentru Salmonella spp., cu centrul negru n cazul coloniilor H2S (+), cu diametrul de 2mm, semitransparente, lucioase, luminoase, uneori prezint centrul mai ntunecat sau chiar negru (in cazul salmonelelor care produc H2S), iar mediul din jurul coloniei vireaz n albastru.

Salmonella spp., pe mediul SS

Salmonlla spp. produce colonii negre pe mediul Wilson Blair

Salmonella produce colonii roii, iar bacteriile coliforme colonii albastre pe mediul RAMBACH

 Salmonella spp., pe mediul nz

IV - Confirmarea Salmonella spp.: Efectuarea testelor biochimice; Efectuarea reaciilor serologice; Testarea AND-ului prin testul PCR. Efectuarea testelor biochimice; Mediul TSI glucoz, lactoz, zaharoz Interpretarea reaciilor biochimice se face prin vizualizarea culorii pe coloana i panta mediului TSI: coloana galben a mediului denot fermentarea glucozei (reacie pozitiv); coloana roie sau neschimbat indic neutilizarea glucozei (reacie negativ); apariia coloraiei negre, denot producerea de hidrogen sulfurat;

 producerea de gaz din glucoz se vizualizeaz prin apariia bulelor de gaz n mediu sau chiar prin ruperea mediului. panta mediului de culoare galben denot fermentarea lactozei i/sau zaharozei (lactoz i/sau zaharoz pozitiv), iar culoarea roie sau neschimbat indic neutilizarea lactozei i/sau zaharozei (lactoz i/sau zaharoz negativ);

Salmonella nu produce indol, reacia este negativ pe banda de hrtie impregnat cu para-dimetilamino-benzaldehid. Cu excepia serotipurilor Gallinarum i Pullorum toate clelelalte serotipuri sunt mobile.

 Mediul MILF mobilitate, indol, lizin, fenilalanin apariia unei coloraii violete dup incubare indic o reacie pozitiv, deci producerea lizindecarboxilazei, salmonelele fiind de regul lizindecarboxilaz pozitive; verificarea producerii de feninalanindecarboxilaz se verific prin adugarea clorurii ferice la suprafaa mediului, salmonelele fiind feninalanindecarboxilaz negative nu se produce virarea culorii n verde (reacie negativ); mobilitatea tulpinilor nsmnate determin modificarea turbiditii mediului, indiferent de modificrile de culoare care pot aprea;

Mediul citrat Simmons - bacteriile din genul Salmonella utilizez citratul de sodiu - reacie pozitiv, apariia coloraiei albastre a mediului, deci virarea din verde n albastru, dup incubare; - reacie negativ nu se modific culoarea iniial a mediului.

 Mediul MIU i Christensen este utilizat pentru verificarea utilizrii ureeii prin hidroliz germenii din grupul Salmonella nu folosesc ureareacie negativ, coloraia mediului (maronie pentru MIU i galben deschis la mediul Cristensen) nu este modificat; reacia pozitiv se produce o nglbenire a mediului.

Utilizarea ureii de Salmonella spp. pe mediul MIU

Utilizarea citratului de Salomnella spp. pe mediul Citrat Simmons

DECARBOXILAREA ORNITINEI - pe mediul MIO

Teste biochimice pentru identificare i confirmare