Sisteme complexe cu activitate antioxidant.

Sintez i caracterizare fizico-chimic

Cuprins

I.Sisteme complexe cu activitate antioxidant............................................................................ 2

II. Sinteza i caracterizare fizico-chimic ................................................................................... 5
2.1.Caracterizarea morfologic i structural ........................................................................ 7
a. Rezonan magnetic nuclear ..................................................................................... 7
b. FT-IR ............................................................................................................................... 8
c. Difracia prin raze X ...................................................................................................... 9
d. Analiza EDX ................................................................................................................... 9
e. Caracterizarea TEM .................................................................................................... 10
f. DLS ................................................................................................................................ 11
2.2. Analizele termice .............................................................................................................. 11
a. DSC pentru compleci de incluziune ............................................................................. 12
b. DSC pentru nanoparticule magnetice funcionalizate ................................................. 12
2.3. Caracterizare electrochimic .......................................................................................... 14
a. Voltametria ciclic a compuilor de incluziune ......................................................... 14
b. Voltametria ciclic a nanoparticulelor magnetice funcionalizate .......................... 15
c. Caracterizarea magnetic............................................................................................ 16
d. Teste de disoluie n fluide simulate ............................................................................ 16
2.4. Caracterizarea biologic ................................................................................................. 16
a. Activitatea antioxidant ................................................................................................. 17
b. Teste de citotoxicitate (MTS).......................................................................................... 18
c. Teste de eliberare controlat ....................................................................................... 19
III. Concluzie ............................................................................................................................... 20

1
 I.Sisteme complexe cu activitate antioxidant

Denham Harman a avansat teoria radicalilor liberi n anii 1950. Aceti radicali liberi sunt atomi
sau molecule care au un electron liber pe ultimul strat. [1]Aceast particularitate i face foarte instabili i
agresivi din punct de vedere chimic, activi din punct de vedere biochimic, dei durata lor de via este de
cteva milionimi dintr-o secund. Radicalii liberi pot interaciona cu structurile moleculare ntlnite,
acest lucru lund forma unei reacii n lan. La nivel celular, acetia pot ataca lipidele membranare,
proteinele i ADN-ul.[2]

Dezechilibrul dintre oxidani i antioxidani n favoarea oxidanilor conduce la stres oxidativ, care
poate fi intra sau extracelular. Ambele tipuri sunt citotoxice,avnd ca rezultat necroza sau
dezorganizarea celulei.

Radicalii liberi rezult din reaciile de ardere parial a anumitor compui, prezentnd grupri ce
pot interaciona cu suprafaa membranei celulare sau cu interiorul, prin reacii de oxidare. Sursele de
radicali liberi sunt procesele normale din organism (cum ar fi fagocitoza, catabolismul incomplet,
detoxifierea hepatic), dar i din mediul exterior (fumul de igar, aerul poluat, anumite medicamente i
alimente). Primii prezint o surs endogen, iar ceilali exogen.[3]

Cei mai puternici radicali liberi sunt ionii superoxid, peroxid, hidroxid, oxid nitric.

Anumite substane chimice non-medicamentoase (poluani atmosferici, tabagici, etanol)

determin o hiperproducie de anion superoxid, care se solubilizeaz n lipidele membranare, antrennd
ptrunderea intracelular a calciului.

Ozonul si oxizii de azot inhalai pot agresa epiteliul alveolar, fcndu-l sensibil la poluarea
atmosferic. Glutationul redus este principalul antioxidant din lichidul alveolar, prezent n concentraii
de 200 milimoli/l.[4]

Radicalii liberi endogeni se pot produce la nivelul mitocondriilor (prin procesul generrii de
molecule macroergice ATP), al peroxizomilor, citocromului P450 sau fagocitelor. De exemplu, procesul
de respiraie mitocondrial, prin care oxigenul molecular este redus de ctre citocromii respiratori
celulari duce la generarea de ioni superoxid, peroxid de hidrogen si radical hidroxil. Peroxizomii sunt o

2
surs important de producere a peroxidului. n ceea ce privete fagocitele, acestea ader la bacterii i
le inger, principalul mecanism bactericid fiind oxigeno-dependent. Citocromul p450 este un grup de
enzime care detoxific medicamentele i un numr mare de ageni poluani din mediu.[5]

Radicalii liberi sunt specii nalt reactive datorit electronilor nepereche, avnd roluri importante
n procese metabolice normale (sisteme redox de semnalizare, procese imune, homeostazia sanguin).
Condiiile de mediu anormale duc la creterea radicalilor liberi (radiaii ultraviolete, poluani), ceea ce
genereaz leziuni celulare. Stresul oxidativ poate determina mai multe tipuri de leziuni-ale ADN-ului,
oxidarea acizilor grai polinesaturai din lipide i oxidarea aminoacizilor din proteine.

Enzimele (superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza) si moleculele antioxidante (acidul

ascorbic, tocoferolul, acidul uric) pot apara celulele de atacul speciilor reactive.[6]

Stresul oxidativ apare in momentul in care balanta redox nu mai poate fi mentinuta. Superoxid
dismutaza transform superoxidul n peroxid de hidrogen, mpiedicnd astfel crearea altor radicali
nocivi.

Exist trei tipuri de SOD, bazate pe tipul de metal din centrul catalitic. Astfel, se disting Fe-
SOD,Mn-SOD,Cu, Zn-SOD. n aceste cazuri, Cu 2+ contribuie la actul catalitic iar Zn2+ stabilizeaza centrul
catalitic.[7]

SOD catalizeaz dismutarea anionului radical superoxid, inhibnd producerea de oxigen singlet
i peroxidarea acizilor grai polinesaturai.

Glutation peroxidaza(GPx) catalizeaz degradarea hidroperoxizilor organici, asigurnd protecia

proteinelor, lipidelor i acizilor nucleici fa de aciunea oxidanilor. Este o enzim selenium dependent,
care se gsete n special n mitocondrii, unde ajut la metabolizarea peroxidului. Dezechilibre la nivelul
GPx se observ n cancer, boli cardiovasculare, diabet zaharat. Avantajele GPx sunt eficiena sporit fa
de catalaz i detoxifierea tuturor tipurilor de peroxizi existeni n mediile biologice.[8]

Datorit specificitii largi de substrat, GPx are un potenial antioxidant mai mare dect SOD i
catalaza. Un alt rol important este n reglarea biosintezei de prostaglandine.

Catalaza este o enzim prezent n peroxizomii majoritii celulelor, unde reduce nivelul
peroxidului de hidrogen. Alturi de alte dou enzime (fumaraza i acetilcolinesteraza), catalaza intervine
n reacii eseniale pentru via. n principiu, ea convertete peroxidul de hidrogen n alte specii
3
inofensive pentru organism. Catalaza se gsete n principal n ficat, rinichi, hematii, precum i la nivelul
hepatocitului.[9]

n cadrul sistemelor neenzimatice de aprare se remarc mai multe tipuri de molecule.

Una dintre acestea, glutationul, joac rol de coenzim, fiind sintetizat n ficat din aminoacizii
cisteina, glutamina i glicina. De altfel, glutationul se gsete depozitat cel mai mult n ficat. De nivelul de
glutation din organism depinde eficiena vitaminelor C,E i a coenzimei Q10.[10]

Printre efectele sale se numar cel antitumoral, prin care se reduc mutaiile ADN-ului. Se
remarc, de asemenea, inhibiia absorbiei i eliminarea din organism a metalelor grele, coloranilor,
supradozelor medicamentoase. Se consider c stresul oxidativ produs prin deficit de glutation intervine
n patogeneza cancerului, astmului, bronitei cronice, autismului, maladiei Alzheimer, sclerozei multiple.

Vitamina C (acidul ascorbic) este sintetizat n plante, organisme monocelulare i o parte din
animale, aciunea sa antioxidant fiind dat de reacia cu radicali liberi de tip hidroxi. Vitamina C este
hidrofilic, avnd o distribuie larg n esuturi, n special n glanda suprarenal i hipofiz. n afar de
reaciile de oxidare, vitamina C particip i la hidroxilare, avnd rol de transportor de electroni.[11]

Vitamina E, ce conine 4 tocoferoli, are ca structur de baz tocolul. Aceti tocoferoli se

concentreaz n structurile lipidice ce sunt expuse la presiuni ridicate de oxigen, cum ar fi membrana
eritrocitar sau cea a arborelui respirator.[12]

Vitamina A sau beta-carotenii au funcie de scavengeri datorit particularitilor de aranjare

structural n lanuri lungi, cu duble legturi conjugate.[13]

Capacitatea de rezisten a organismului este dat de echilibrul dintre oxidani i antioxidani.

Dezechilibrul este incriminat n multe patologii, cum ar fi bolile respiratorii, renale, diabet zaharat,
hipertensiune arterial, boala Parkinson.

Stresul oxidativ este considerat promotor al leziunilor celulei endoteliale. Celulele participante la
aterogenez produc radicali liberi, la care se adaug i ali factori de risc (hipertensiunea, fumatul,
dibetul zaharat), care altereaz statusul redox din peretele vascular.[14]

Dup ce lipoproteinele sunt oxidate, se declaneaz o ntreag cascad de evenimente care

determin lezarea endoteliului.

4
 De asemenea, n cancer exist un stres oxidativ permanent, n care radicalii liberi sunt
recunoscui ca ageni mutageni. Acetia produc modificri feno i genotipice, ce conduc de la mutaie la
neoplazie.[15]

Stresul oxidativ este incriminat n diabetul zaharat, unde crete peroxidarea lipidelor i scade
activitatea enzimelor antioxidante eritrocitare. Dup ce proteinele sunt oxidate, crete coninutul n
carbonil al acestora, formndu-se aldehide i cetone. Exist i alte modificri structurale ale proteinelor
plasmatice datorate radicalilor liberi, cum ar fi glicozilarea neenzimatic.

Hiperglicemia cronic duce la autooxidarea glucozei, care va forma produi de glicozilare

avansat. n acest caz se produc noi radicali liberi, ce vor genera disfuncii endoteliale, responsabile de
multe complicaii.[16]

La nivelul pielii, n cazul psoriazisului, o boal inflamatorie cronic, este incriminat o cretere a
speciilor reactive ale oxigenului.[17]

n cadrul proiectului de cercetare s-a ncercat sintetizarea unor sisteme terapeutice pe baz de
antioxidani, care s acioneze eficient mpotriva radicalilor liberi de la nivelul plcilor de aterom, ce
produc de multe ori restenozarea, dup intervenia percutanat coronarian.

n cazul unei astfel de abordri terapeutice sunt necesare att meninerea unui nivel adecvat de
antioxidani la locul de interes (de exemplu, vasul afectat de ateroscleroz), ct i stabilitatea pe termen
lung i eliberarea adecvat a agentului terapeutic.

O propunere interesant, care ia n considerare att proprietile antioxidante, ct i cele

termice ale nanoparticulelor este aceea de a implementa nanoentiti capabile s transporte
intravascular specii chimice antioxidante ntr-o manier controlat, pentru a reduce radicalii liberi, ct i
a eradica celulele canceroase prin efect de hipertermie.

II. Sintez i caracterizare fizico-chimic

Acest studiu descrie sinteza unui nanotransportor compus din nanoparticule de oxid de fier,
acoperite cu polietilenimin i acid protocatehuic, pentru transportul i eliberarea activ a agentului
terapeutic.

Polimerul i agentul terapeutic sunt stabilizai electrostatic pe suprafaa nanoparticulei.

5
 Muli antioxidani naturali prezint o solubilitate sczut n ap, fiind util ncapsularea lor n
molecule macrociclice cum sunt ciclodextrinele sau calixarenele. Ciclodextrinele sunt biocompatibile i
prezint o bun solubilitate n ap. O ciclodextrin ce prezint grupri anionice se poate adsorbi selectiv
n stratul de polielectrolii al nanoparticulei datorit forelor electrostatice.[18]

Acidul protocatehuic este un acid fenolic natural ce provine din plantele tradiionale chinezeti.
Efectele farmacologice ale acidului protocatehuic sunt n strns relaie cu proprietile antioxidante ale
acestuia. Unele studii indic o activitate antioxidant mai bun a acestuia in vitro dect Trolox.
Mecanismul prin care acioneaz PCA este ce al neutralizrii radicalilor liberi prin donarea unui atom de
hidrogen sau a unui electron.[19]

n acest studiu am propus o metod de funcionalizare a nanoparticulelor magnetice acoperite

cu PEI i ncrcate cu PCA i compusul su de incluziune. Avantajele unui astfel de sistem sunt conferite
de natura electrolitic a polimerului adsorbit pe suprafaa nanoparticulei, care poate incorpora
ciclodextrine modificate prin interaciuni electrostatice.

Un astfel de sistem permite eliberarea n dou etape, prin excluderea din stratul polimeric a
complexului de ciclodextrin, urmat de dezintegrarea sa, n etapa a doua. Aceste nanofluide pot fi
eficiente att pentru imagistica prin rezonan magnetic, ct i pentru eliberarea de medicamente.[20]

n ceea ce privete prepararea nanoparticulelor magnetice, aceasta se poate face prin metoda
clasic a coprecipitrii. n mod practic, peste un amestec de sruri ferice i ferose se adaug soluie
amoniacal (20ml,25%), sub atmosfer de azot i agitare intens la temperatura de 70 grade C pentru 30
min. PH-ul atins este de 11-12. Nanoparticulele nou sintetizate au fost splate de mai multe ori cu ap i
etanol.

Pentru acoperire, se utilizeaz o suspensie de magnetit n ap (8 ml, 50 mg/ml), peste care se

adaug 10 ml de soluie PEI 10% (1.8kDa), amestecul fiind vortexat timp de 15 min. S-a testat de
asemenea i PEI 2.5 KdA.

Complexele de incluziune ale SBE-CD i BCD cu PCA s-au preparat prin utilizarea unui raport
molar 1:1. SBE-CD (1.84 g) a fost dizolvat separat n 50 ml ap. Acidul protocatehuic (0.25 g) a fost
adugat ulterior, amestecul fiind agitat pn la obinerea unei soluii limpezi. Acest pas a fost urmat
ulterior de liofilizare.

6
 Pentru imobilizarea PCA-ului, 1 ml soluie PCA (10 mg/ml) a fost adugat peste o suspensie de
magnetit acoperit cu PEI (1 ml, 100 mg/ml), fiind vortexat pentru 10-15 min. Utiliznd acelai
procedeu, nanoparticulele au fost funcionalizate cu SBE-CD i complex de incluziune SBE-CD/PCA.

2.1.Caracterizarea morfologic i structural

a. Rezonan magnetic nuclear

Rezonana magnetic nuclear este o tehnic ce poate proba formarea unui complex de
incluziune ntre o molecul oaspete i cavitatea hidrofobic a unei ciclodextrine. Acest lucru este
evideniat de deplasrile chimice ale moleculei oaspete i ale protonilor gazdei n complex, comparativ
cu aceleai deplasri ale componetelor libere.[21]
n spectrul H-RMN toate picurile protonilor PCA prezint deplasri n jos ntre 0.06ppm-
0.006ppm. De remarcat faptul c nu doar anumii protoni sufer aceste deplasri, ci toi sunt modificai,
sugereaz faptul c PCA poate fi inclus n mai multe moduri, ntr-o manier dinamic. Se remarc
prezena unui efort conformaional al ciclodextrinei pentru adaptarea geometriei moleculare unui
complex supramolecular.

Complexarea este un proces dinamic, n care PCA oscileaz ntre starea liber i cea legat.
Spectrele ROESY evideniaz prezena unor semnale ntre protonii fenolici i aromatici ai PCA i unii
protoni din cavitatea ciclodextrinei.

Fig.1. Spectru H-MRI al PCA i SBE-CD obinut n ap

7
 Fig.2. Spectru ROESY al SBE-CD/PCA

b. FT-IR

Caracterizarea structural prin spectroscopia n infrarou cu transformat Fourier prezint benzi

de vibraie caracteristice fiecrui component adugat n mantaua structurilor magnetice.[22]
Picurile de la 572 cm-1 i 630 cm -1 se asociaz vibraiilor de ntindere ale legturilor Fe-O din
structura cristalin a nanoparticulelor. Aminele contribuie prin benzile de vibraie de la 3240 cm-1 i
1545 cm-1, asociate vibraiilor de ntindere i ndoire ale legturilor N-H, n timp ce la 1467 cm-1 i n
regiunea 1000-1330 cm-1 apar vibraii de ntindere ale legturilor C-H din PEI.[23]
Spectrele FT-IR ale MPEI-PCA i MPEI-SBE-CD/PCA au anumite similariti datorate prezenei
vibraiilor caracteristice de la 1365 cm-1 i 1357 cm-1, care corespund vibraiilor de ndoire ale
gruprilor fenolice ale PCA i SBE-CD/PCA. Exist i vibraii de ntindere corespunztoare CO sau OH din
COOH (al PCA) la 1117, 1096 i 1046 cm-1 n MPEI-PCA, precum i benzile 1087 i 1040 cm-1 n SBE-
CD/PCA. Vibraiile de ntindere ale grupului carbonil sunt vizibile n 1690-1680 cm-1. Diferenele care
apar ntre cele dou spectre se datoreaz ncapsulrii PCA-ului n cavitatea ciclodextrinei.

8
 Fig.3. Spectru FT-IR al MNP(a) MPEI (b) MPEI-PCA (c) MPEI-SBE-CD/PCA(d)

c. Difracia prin raze X

Structura cristalin a nanoparticulelor magnetice a fost analizat prin difracie cu raze X. Analiza
indic faptul c indicii Miller ce corespund planelor de reflecie principale pot fi atribuii structurii spinel
inverse cubice Fe3O4.

Fig.4. Pattern de difracie cu raze X al MNP neacoperite

d. Analiza EDX

Analiza spectral cu energie dispersat de raze X arat prezena elementelor precursorilor

Fe,C,O,N i S. Azotul este semntura PEI, n timp ce carbonul provine att de la PEI, ct i de la PCA
adsorbii pe suprafaa nanoparticulelor magnetice, n cazul MPEI-PCA, la care se adaug contribuia SBE-
CD.
9
 Procentul elementelor variaz pentru diferite localizri ale analizei, datorit diferitelor grade de
PEI i medicament adsorbite. Pentru o mai bun precizie a identificrii elementelor, se utilizeaz
analizele punct pe diferite particule.

Analiza EDX nu poate distinge ntre cele dou tipuri de nanoparticule doar pe baza procentelor
de C sau O, n ciuda faptului c PCA este eliminat singur din stratul de PEI n primul caz i sub forma
complexului de incluziune cu SBE-CD n cel de-al doilea caz. Singura diferen ntre cele dou spectre
este dat de prezena atomilor de sulf ce provin de la SBE-CD n cazul nanoparticulelor MPEI-SBE-
CD/PCA.

Fig Spectru EDX a MPEI-PCA(a) i MPEI-SBE-CD/PCA(b)

Tabelul 1. Compoziia elemental a MPEI-PCA i MPEI-SBE-CD obinute prin EDX (valori %)

Nanoparticule Fe C O N S
MPEI-PCA 10.89 27.28 55.38 06.44 -
MPEI- 15.55 31.48 46.96 05.43 00.58
SBECD

e. Caracterizarea TEM

Imaginile TEM ale nanoparticulelor funcionalizate ilustreaz forma sferic, cu un diametru

de 10 nm, care nu variaz considerabil dup acoperire i care este adecvat pentru aplicaii biomedicale.
Se constat o tendin de agregare a nanoparticulelor, care sunt vizibile, n special prin miezul metalic.

10
 Fig.5. Imagini TEM ale MNP (a) MPEI-PCA(b) i MPEI-SBE-CD/PCA (c)

f. DLS

Nanoparticulele magnetice au un diametru hidrodinamic (dispersie apoas) de 480 nm,

msurat prin metoda difuziei dinamice a luminii.(DLS) Msurtorile de potenial Zeta indic o valoare
negativ de -24 mV(pH 11)/-1 Mv(pH 7), care confirm o bun stabilitate a dispersiei n ap.
Particulele MNP-PEI preparate prin dispersia MNP ntr-o soluie de PEI conduc la cretere a
diametrului hidrodinamic la 690 nm. Aceast valoare ridicat a razei hidrodinamice este dat de
expansiunea i solvarea polimerilor ataai de magnetit n ap. Msurtorile de potenial Zeta indic o
valoare pozitiv de +43Mv, care confirm adsorbia PEI pe suprafaa nanoparticulei. Aceste date indic
ionizarea gruprilor funcionale aminice, care contribuie suplimentar la expansiunea polimerilor de pe
suprafa datorit repulsiei electrostatice, amplificnd creterea diametrului hidrodinamic.
Prepararea MPEI-SBE-CD/PCA printr-o metod similar celei a MPEI a permis includerea PCA n
matricea polimeric. Msurtorile DLS arat o valoare a diametrului de 573 nm. Scderea acestui
diametru comparativ cu MPEI se datoreaz inseriei complexului de incluziune, ce conine ioni solvatai-
SO3-, care compenseaz o parte din sarcinile pozitive ale PEI, diminund repulsia electrostatic inter i
intramolecular. Potenialul Zeta pentru aceste nanoparticule este +40 Mv, probnd stabilitatea
dispersiei n ap.
Diferena ntre doimensiunile msurate prin DLS i cele prin TEM este cauzat de agregarea
nanoparticulelor n structuri mai mari n ap, ct i de so9lvatarea polimerilor adsorbii pe suprafaa
nanoparticulelor.

2.2. Analizele termice

11
 a. DSC pentru compleci de incluziune

DSC este o tehnic important care confirm apariia interaciunilor de tip gazd-oaspete n
stare solid. Aceasta se datoreaz att reducerii i deplasrii, ct i dispariiei complete a temperaturii
de tranziie a moleculei oaspete dup includerea n cavitatea moleculei gazd.[24]
Molecula oaspete (PCA) prezint un profil intens de topire la 205 grade C, care poate fi observat
pentru toate amestecurile fizice. Curba DSC a complexului de incluziune a SBE-B-CD/PCA indic o
reducere semnificativ a intensitii i a deplasrii spre temperaturi mai ridicate ca o consecin a
proteciei termice a moleculei oaspete de ctre cavitile gazd, indicnd formarea unor noi faze solide
datorit complexrii.
Eficiena de includere de 99.56% a fost obinut prin aplicarea ecuaiei
Includere(%)=100(1-hic/hug)
Profilele largi endotermice se datoreaz cristalizrii moleculelor de ap ce se pierd din cavitile
moleculei oaspete.

Fig.6. Curbele de nclzire DSC ale SBE-CD(a) amestec fizic de SBE-CD i

PCA(b) i SBE-CD/PCA (c)

b. DSC pentru nanoparticule magnetice funcionalizate

DSC reprezint o tehnic analitic important n monitorizarea interaciunilor strii solide.

Analizele calorimetrice evideniaz dou tipuri de interaciuni. Prima descrie interaciunile ionice dintre

12
polietilena pur cu nanoparticulele magnetice, acidul protocatehuic i SBE-CD, pe cnd ultima se
concentreaz asupra interaciunilor gazd-oaspete dintre SBE-CD i PCA.
Dup cum este indicat n fig. 5A,B, toi compuii studiai exprim un profil endotermic larg n
intervalul 50-150 grade C, corespunznd deshidratrii fizice.
PEI-ul pur arat o temperatur de tranziie sticloas caracteristic (Tg) la -57 grade C. Dup
adugarea MNP la PEI, deplasrile Tg spre domenii de temperatur ridicat, meninndu-se n intevalul
de la -25 grade C la -34 grade C, datorit reducerii volumului liber dintre macromoleculele de PEI
datorit creterii semnificative n capacitatea de mpachetare structural. Aceasta apare datorit
compensrii sarcinilor dintre suprafaa negativ a nanoparticulelor magnetice i entitile pozitive PEI ce
rezult din protonare (confirmat de potenialele Zeta) i posibil chiar legarea prin legturi de hidrogen
ntre lanurile PEI la mpachetare.
Molecula pur PCA indic o temperatur nalt de tranziie (Tm) la 205 grade C cu o valoare a
entalpiei de 135.6 Jg-1. Aceast tranziie se reduce semnificativ n intensitate de la 135.6 J g-1 LA 10.06 j
G-1 la MPEI-PCA. Aceast reducere a cristalinitii PCA se poate atribui mpachetrii suplimentare a
lanurilor libere PEI ce rmn la suprafaa nanoclusterelor datorit acidului protocatehuic ncrcat
negativ ce rezult din disocierea acidic, rezultnd ntr-o creterea Tg de la -31 grade C la -25 grade C.
Dup nlocuirea PCA cu SBE-CD, Tg descrete de la -25 grade C n MPEI-PCA la -34 grade C n MPEI-SBE-
CD; cu ct SBE-CD este mai voluminoas, cu att comportamentul ionic este acelai ca al PCA. n acest
mod se genereaz steric mai mult volum liber ntre lanuri. Acest aspect se reflect n curbele de
nclzire ale probelor MPEI-SBE-CD/PCA, unde valoarea Tg este 30 grade C, apropiat de -34 grade C.
Se tie c dup formarea complexului de incluziune, profilul de topire al moleculei oaspete fie se
reduce n intensitate sau dispare. Acest lucru se ntmpl i cu proba MPEI-SBE-CD/PCA, pentru care
valoarea entalpiei profilului de topire se reduce mult comparativ cu cea a PCA pur (135.6 Jg-1) i PCA n
MPEI-PCA (10.06 Jg-1), indicnd formarea unei noi faze solide datorit complexrii.

Fig.7. Curbele de nclzire DSC ale nanoparticulelor magnetice funcionalizate

13
2.3. Caracterizare electrochimic

a. Voltametria ciclic a compuilor de incluziune

Voltametria ciclic a fost utilizat n ultimii ani n aplicaiile biomedicale, n analiza alimetelor i
plantelor, metodele electrochimice putnd estima capacitatea antioxidant.
Datorit multiplelor date publicate n domeniu n ultimii ani, exist posibile corelri structur-
funcie, dar i relaii structur-capacitate antioxidant. Exist o bun corelaie ntre structura
polifenolilor i proprietile electrochimice, realiznd o legtur ntre abundena gruprilor hidroxil i
conjugarea electronic.[25]
Utiliznd electrodul glassy carbon, voltamogramele PCA arat un pic anodic i unul catodic la +0.3
V/+0.1 V n PBS. n general, oxidarea compuilor fenolici cu grupri hidroxil n poziie orto conduce la
formarea quinonei.
Scanrile succesive au fost realizate pentru determinarea stabilitii electrochimice i a descreterii
lente a intensitilor picurilor ce sugereaz faptul c un film subire este depozitat pe electrod. Aceste
rezultate sunt n acord cu studiile anterioare, unde diferena dintre valorile potenialelor pic anodice i
catodice indic procese de electrod ireversibile.
Voltamogramele compuilor de incluziune arat o descretere uoar a pic-ului catodic comparativ
cu PCA, ceea ce nseamn c activitatea nu se reduce n mod esential datorit includerii PCA n cavitatea
SBE-CD.
Potenialul catodic este deplasat n direcia pozitiv, n timp ce pic-ul anodic este deplasat n
direcia opus n curba compusului de incluziune.
Dac PCA intr n cavitatea SBE-CD, scderea simultan a semnalului cu deplasrile potenialelor
electrochimice se explic deoarece ciclodextrina poate aciona ca izolator n procesele electronice. De
asemenea, scderea intensitii curentului se datoreaz scderii coeficientului de difuzie al compuilor
de incluziune. Deplasarea potenialelor electrochimice se poate corela direct cu formarea compuilor de
incluziune.
Semnalul nu dispare odat cu includerea oaspetelui n cavitatea gazdei, care se poate datora
caracterului dinamic al structurii complexului de incluziune, care poate permite ieierea PCA. Pe de alt
parte, procesele electrochimice pot aprea n interiorul cavitii SBE-CD dac proprietile fizico-chimice
i conformaionale ale PCA oxidat cu structura quinonic permit formarea unei arhitecturi stabile a
14
compusului de incluziune. Ambele ipoteze sunt posibile din momet ce PCA este ncapsulat ntr-o cavitate
deschis.
Stabilitatea electrochimic a complexului de incluziune SBE-CD/PCA are aceeai curb ca PCA.

Fig.8. Stabilitate electrochimic a 1 mM PCA pe GC n PBS

Fig.9. Voltamograme ciclice a 1mM PCA (1) i 1 m M SBE-CD/PCA pe GC n 0.1 M PBS (a)
i stabilitatea electrochimic a 1 m M SBE-CD/PCA pe GC n 0.1 M PBS 0.1 M-scan 1 (1) i
20(2)(b)

b. Voltametria ciclic a nanoparticulelor magnetice funcionalizate

Voltamogramele nanoparticulelor magnetice pe electrod screen-printed au evideniat picuri

redox la -0.4 V/-0.7 V datorit proceselor de transformare Fe2+/Fe3+. Picurile redox ale nanoparticulelor
s-au diminuat dramatic n cazul nanoparticulelor, tranziia Fe2+/ Fe 3+ fiind eclipsat de stratul de PEI.
Adugarea PCA-ului n stratul de PEI al nanoparticulelor a dus la apariia picurilor caracteristice
PCA, acest trend fiind meninut cnd SBE-CD/PCA este adsorbit n stratul PEI al nanoparticulelor.

15
 Fig.10. Comparaie ntre voltamogramele ciclice ale MNP (1) i MPEI (2) pe SPE
n PBS

Fig.11. Voltametrie ciclic a a MPEI(1) PCA (2) i MPEI-PCA(3) pe SPE n PBS (a) i
comparaia ntre voltamogramele ciclice ale MPEI-PCA (1) i MPEI-SBE-CD/PCA (2) pe
SPE n PBS (b)

2.4.Caracterizarea magnetic

Caracterizarea din punctul de vedere al proprietilor magnetice al probelor s-a determinat prin
msurtori ale susceptibilitii magnetice. Valorile scad odat cu adiionarea polimerului,
medicamentului i a compusului de incluziune al acestuia. Acest trend este uor de explicat prin
creterea fraciei masice a acoperirii diamagnetice.

2.5. Caracterizarea biologic

a. Teste de disoluie n fluide simulate

16
 Avantajele utilizrii compuilor de incluziune bazai pe medicamente i ciclodextrine sau
ciclodextrine modificate chimic sunt conferite de ciclodextrine. Unul din primele avantaje este creterea
solubilitii n solveni apoi. Pe de alt parte se are n vedere creterea biodisponibilitii i protecia
chimic a medicamentelor. Testele de disoluie n condiii fiziologice, cum sunt fluidul gastric simulat
arat o cretere a solubilitii PCA. Cel mai important este creterea solubilitii n condiii acide
(pH=1.2), unde PCA, care este de asemeni un acid, are o solubilitate natural sczut.

Fig.12. Histogram reprezentnd procentul de disoluie al PCA i SBE-CD/PCA n condiii

fiziologice, cum ar fi fluidul gastric simulat p H =1.2 (a) i fluid intestinal simulat p H =6.8
(b)

b. Activitatea antioxidant

Proprietile antioxidante i de scavenger ale PCA sunt bine cunoscute, rezultatele indicnd c
PCA acioneaz ca scavenger radicalic prin ambele mecanisme, donarea unui atom de hidrogen sau a
unui electron. Pentru caracterizarea funcional a complexului de incluziune s-au realizat mai multe
teste, cum ar fi cel de scavenger radicalic, evaluarea puterii reductoare i evaluarea inhibiiei
lipoxigenazei. Cnd antioxidanii sunt ncapsulai n ciclodextrine, exist posibilitatea diminurii
proprietilor utile datorit obstacolelor sterice din interiorul cavitii SBE-CD. Testele in vitro au artat
c, n general, activitatea PCA se conserv n timpul ncapsulrii cu SBE-CD.
Pentru a msura activitatea de scavenger a radicalilor liberi, proprietile de decolorare ale
DPPH au fost utilizate n prezena antioxidanilor. O soluie DPPH proaspt preparat manifest o
coloraie violet nchis, cu un maxim de absorbie la 517 nm. Aceast culoare n general dispare cnd
moleculele de antioxidant sting radicalii liberi i i convertesc ntr-un produs incolor, rezultnd ntr-o
scdere a absorbaei la 517 nm. Procentul de inhibiie a fost calculat utiliznd urmtoarea ecuaie[26]
%inhibiie=((Acontrol-A prob)/A control)*100

17
 Fig Activitatea antioxidant a agenilor terapeutici protocol DPPH(a) protocol de
reducere a puterii (b) i protocol de inhibiie a lipoxigenazei (c)
Ambele tipuri de nanoparticule, MPEI-PCA i MPEI-SBE-CD/PCA au proprieti de scavenger
radicalic n diverse rapoarte. Aceleai cantiti de DPPH au fost luate n considerare pentru ambele
tipuri de nanoparticule. Diferenele sunt explicabile i au legtur cu faptul c aceeai cantitate de
nanoparticule conine diferite cantiti de PCA pur iar cellalt un complex de incluziune. Pe de alt parte,
adsorbia medicamentelor n stratul PEI este diferit pentru PCA i complexul su de incluziune.

Fig Test DPPH al MPEI-PCA (a) i SBE-CD/PCA (b)

c. Teste de citotoxicitate (MTS)

Testele de viabilitate celular au fost realizate prin reducerea MTS, ca o funcie a activitii
mitocondriale.
Citotoxicitatea a trei compui a fost testat pe fibroblaste dermice umane normale utiliznd
CellTiter 96 Aqueus One Solution Cell Proliferation Assay de la Promega. Fibroblastele au fost
multiplicate i meninute n mediu alfa-MEM (Lonza) suplimentat cu ser bovin fetal 10% (FBS,Gibco) i
amestec 1% penicilin-streptoimicin-amfotericin la 37 grade C i 5% CO2 sub atmosfer umed.
Pentru evaluare, celulele NHDF au fost plantate n plci de 96 godeuri (5*103 celule densitate n
100 ul) timp de 24 h. Dup adeziunea celular, mediul a fost schimbat i nlocuit cu soluii avnd a arie
larg a concentraiilor de tratament (de la 0.39 la 50 ug/ml). Godeurile de control au primit doar mediu
de cultur.

18
 Dup 44 h de incubare, un volum de 20 ul de CellTiter96AqueusOne Solution reagent a fost
adugat n fiecare godeu i plcile au fost incubate pentru 3 h la 37 grade C. Absorbana la 490 nm a fost
nregistrat cu un cititor de plci (EnSight, Perkin Elmer), iar viabilitatea celular (%) a fost calculat prin
(Atest/Acontrol)*100. 8 replicate au fost msurate iar rezultatele prezentate ca medie+/-deviaie
standard.
Rezultatele nu arat efecte citotoxice ale produselor testate.

Fig. Grafic viabilitate celular-concentraie prin metoda MTS

d. Teste de eliberare controlat

Profilele de eliberare controlat arat o cretere continu a ratei de eliberare a PCA pentru
MPEI-PCA, dar i pentru MPEI-SBE-CD/PCA (ce are o descretere considerabil a concentraiei maxime a
complexului de incluziune ) n decursul a trei zile. Aceast eliberare continu a fost obinut dup dou
nlocuiri consecutive ale supernatantului cu soluie tampon fosfat proaspt (15 ml PBS extras, 15 ml
PBS adugat). Ipoteza a fost aceea c medicamentul este readsorbit electrostatic n stratul polimeric PEI
dup un timp. Eliberarea medicamentelor (PCA i SBE-CD/PCA) este provenit de creterea concentraiei
acestora n mediul de eliberare datorit afinitii ridicate dintre contraioni asigurat de mantaua de PEI
i agenii terapeutici. Cu ct este mai mic cantitatea de fluid n care are loc eliberarea, cu att apare
echilibrul ntre eliberarea i reabsorbia medicamentelor.

19
 Fig. Profilele de eliberare ale MPEI-PCA (a) i MPEI-SBE-CD/PCA (b)

III. Concluzie

Nanoparticulele magnetice au fost sintetizate prin coprecipitare i acoperite cu PEI pentru a

evirta aglomerarea. Anumii ageni terapeutici, cum sunt PCA i SBE-CD/PCA au fost adsorbii n stratul
de PEI i caracterizai extensiv (fizico-chimic, structural i morfologic, biologic). Dimensiunea
nanoparticulelor magnetice crete dup funcionalizare, edideniind succesul modificrilor i meninnd
n acelai timp o dimensiune adecvat pentru aplicaii biologice. Nanosistemele au evideniat o eliberare
continu a agentului terapeutic, o bun activitate antioxidant i lipsa citotoxicitii, indicnd un
potenial considerabil ca ageni de eliberare intit n terapia bolii coronariene.

20
Bibliografie

1. Harman, D., About "Origin and evolution of the free radical theory of aging: a brief personal
history, 1954-2009". Biogerontology, 2009. 10(6): p. 783.
2. Kehrer, J.P. and L.O. Klotz, Free radicals and related reactive species as mediators of tissue injury
and disease: implications for Health. Crit Rev Toxicol, 2015. 45(9): p. 765-98.
3. Yashin, A., et al., Antioxidant Activity of Spices and Their Impact on Human Health: A Review.
Antioxidants (Basel), 2017. 6(3).
4. Hiraku, Y., et al., Nitrative DNA damage induced by carbon-black nanoparticles in macrophages
and lung epithelial cells. Mutat Res, 2017. 818: p. 7-16.
5. Sies, H., C. Berndt, and D.P. Jones, Oxidative Stress. Annu Rev Biochem, 2017. 86: p. 715-748.
6. Bjorklund, G. and S. Chirumbolo, Role of oxidative stress and antioxidants in daily nutrition and
human health. Nutrition, 2017. 33: p. 311-321.
7. Griess, B., et al., Extracellular superoxide dismutase and its role in cancer. Free Radic Biol Med,
2017. 112: p. 464-479.
8. Ahmadinejad, F., et al., Molecular Mechanisms behind Free Radical Scavengers Function against
Oxidative Stress. Antioxidants (Basel), 2017. 6(3).
9. Glorieux, C. and P.B. Calderon, Catalase, a remarkable enzyme: targeting the oldest antioxidant
enzyme to find a new cancer treatment approach. Biol Chem, 2017.
10. McBean, G.J., Cysteine, Glutathione, and Thiol Redox Balance in Astrocytes. Antioxidants (Basel),
2017. 6(3).
11. Covarrubias-Pinto, A., et al., Old Things New View: Ascorbic Acid Protects the Brain in
Neurodegenerative Disorders. Int J Mol Sci, 2015. 16(12): p. 28194-217.
12. Grimm, M.O., J. Mett, and T. Hartmann, The Impact of Vitamin E and Other Fat-Soluble Vitamins
on Alzheimer s Disease. Int J Mol Sci, 2016. 17(11).
13. Metzler, M.A. and L.L. Sandell, Enzymatic Metabolism of Vitamin A in Developing Vertebrate
Embryos. Nutrients, 2016. 8(12).
14. Yang, X., et al., Oxidative Stress-Mediated Atherosclerosis: Mechanisms and Therapies. Front
Physiol, 2017. 8: p. 600.
15. Saha, S.K., et al., Correlation between Oxidative Stress, Nutrition, and Cancer Initiation. Int J Mol
Sci, 2017. 18(7).
16. Jagadish, S., et al., Novel oxolane derivative DMTD mitigates high glucose induced erythrocytes
apoptosis by regulating oxidative stress. Toxicol Appl Pharmacol, 2017.
21
17. Schiattarella, M., et al., Paraoxonases and psoriasis: negative imbalance of anti--oxidant
endogenous mechanisms. G Ital Dermatol Venereol, 2017.
18. Cutrone, G., J.M. Casas-Solvas, and A. Vargas-Berenguel, Cyclodextrin-Modified inorganic
materials for the construction of nanocarriers. Int J Pharm, 2017.
19. Krzysztoforska, K., D. Mirowska-Guzel, and E. Widy-Tyszkiewicz, Pharmacological effects of
protocatechuic acid and its therapeutic potential in neurodegenerative diseases: Review on the
basis of in vitro and in vivo studies in rodents and humans. Nutr Neurosci, 2017: p. 1-11.
20. Sundar, L.S., et al., Enhanced thermal conductivity and viscosity of nanodiamond-nickel
nanocomposite nanofluids. Sci Rep, 2014. 4: p. 4039.
21. Gaddam, S., G. Lemberskiy, and A.B. Rosenkrantz, Characteristics of the Most Recently Awarded
Magnetic Resonance Imaging Patents in the United States. Curr Probl Diagn Radiol, 2017.
22. Lopes, J., et al., FTIR and Raman Spectroscopy Applied to Dementia Diagnosis Through Analysis
of Biological Fluids. J Alzheimers Dis, 2016. 52(3): p. 801-12.
23. Ratanajanchai, M., et al., Polyethylenimine-immobilized core-shell nanoparticles: synthesis,
characterization, and biocompatibility test. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014. 34: p. 377-83.
24. Matencio, A., F. Garcia-Carmona, and J.M. Lopez-Nicolas, The inclusion complex of
oxyresveratrol in modified cyclodextrins: A thermodynamic, structural, physicochemical,
fluorescent and computational study. Food Chem, 2017. 232: p. 177-184.
25. Hoyos-Arbelaez, J., M. Vazquez, and J. Contreras-Calderon, Electrochemical methods as a tool
for determining the antioxidant capacity of food and beverages: A review. Food Chem, 2017.
221: p. 1371-1381.
26. Hussain, Z., et al., Exploring recent developments to improve antioxidant, anti-inflammatory and
antimicrobial efficacy of curcumin: A review of new trends and future perspectives. Mater Sci Eng
C Mater Biol Appl, 2017. 77: p. 1316-1326.

22