METODE DE LABORATOR

UTILIZATE IN COMPARTIMENTUL
DE BIOCHIMIE CLINICA

Prof. Dr. Crăciun Alexandra

I. SPECTROFOTOMETRIA
II. ELECTROFOREZA
III-IV. TURBIDIMETRIA/ NEFELOMETRIA
V. FLAMFOTOMETRIA
I. SPECTROFOTOMETRIA
 I. Spectrofotometria
Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu
măsurarea cantitativă a proprietăților de reflexie sau de transmisie
ale unui material (substanță dintr-o soluție) în funcție de lungimea de
undă cu care interacționează.

Energia luminoasă realizează modificări structurale ale substanțelor

chimice prin absorbirea unei anumite cantități de energie.

Metodele optice sunt folosite la determinarea structurii chimice, sau la

dozarea unor substanțe dintr-o soluție.
 Radiația electromagnetică

Lungime de undă ()

Termenul de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care
este utilizată radiația electromagnetică din spectrul:
 ultraviolet (UV)
 vizibil (VIS) - COLORIMETRIA
 infraroșu (IR)
 Metode spectrofotometrice

 Absorbția luminii:
Totală: negru
Parțială: colorat
Nulă: alb

 Transmisia luminii:
Parțială: colorat și transparent
Totală: incolor și transparent
Spectrofotometrul
 Lumina monocromatica este obținută prin permiterea fasciculul de lumină
să treacă printr-o prismă numită monocromator (filtru).

 Lumina monocromatică este direcționată printr-o cuvă care conține proba,

iar lumina transmisă atinge fotocelula.

 Curentul dezvoltat de fotocelulă este transformat în % de transmisie (T%)

sau de absorbție printr-un galvanometru .

 Apoi, puteți citi absorbanța pe galvanometru .

 Absorbanța se mai numește extincție sau densitate optică.

 Astfel, spectrofotometrul este utilizat pentru a măsura
absorbția luminii unei substanțe la o anumită lungime de
undă, în funcție de culoarea substanței expuse.

 Chiar și compușii care nu absorb lumina pot fi tratați cu un

reactiv rezultând un produs colorat.

 Concentrația substanței, care va genera compusul colorat, va

fi direct proporțională cu lumina absorbită.

 Concentrația substanței originale poate fi determinată prin

calcule sau prin compararea absorbanței probei cu
absorbanța etaloanelor de concentrație cunoscută.
Componentele unui
spectrofotometru
Un spectrofotometru este format în principal dintr-o sursă de lumină
(1), un sistem optic pentru producerea luminii momocromatice,
compus din lentile (2), un sistem de fante (3), un sistem
monocromator (4) cu rețea de difracție sau cu prismă, spațiu pentru
cuve cu soluție de referință și cuve pentru soluția de analizat (5), un
detector de radiație luminoasă (6), un amplificator (7) și un sistem
de afișare.

Sursele luminoase cele mai utilizate în domeniul UV-VIS, sunt:

-lampa cu incandescență (VIS-IR), -lampa cu deuteriu (UV)
Un spectrometru prevazut cu ambele surse, poate acoperi tot
domeniul.

Detectorul transforma semnalul luminos in semnal electric.

Intensitatea semnalului recepționat va depinde de lungimea de
undă.
Absorbanța luminii și culoarea soluțiilor

LUNGIMI DE UNDĂ CULOAREA CULOAREA

pentru absorbtia luminii ABSORBITĂ SOLUȚIEI
380-430 Violet Galben
430-475 Albastru Portocaliu
475-495 Albastru verzui Roșu-Portocaliu
495-505 Verde albăstriu Portocaliu-Roșu
505-555 Verde Roșu
555-575 Galben verzui Violet-Roșu
575-600 Galben Violet
600-650 Portocaliu Albastru
650-780 Roșu Verde
 Blankul

 Spectrofotometrele compară lumina transmisă prin probe

cu lumina transmisă prin blank.
 Cuva cu blank, are același conținut ca și cuva cu
probă cu excepția analitului de măsurat
 Determinarea colorimetrică

 Determinări cantitative ale unei substanțe

(analit) dintr-o soluție care, prin reacția cu
anumiți reactivi chimici, se transformă într-un
produs de reacție colorat.

 Intensitatea culorii este proporțională cu

cantitatea analitului prezent în soluție.
 Domeniul de linearitate

 = domeniul liniar- se referă la

domeniul concentrațiilor pentru care
metoda prezintă o proporționalitate
între concentrație și absorbanță.

 Dacă concentrația
analitului este prea mică
sau prea mare,
spectrofotometrul nu
poate citi absorbanța cu
exactitate.
 Metode de evaluare a reacțiilor chimice

 Punct final (Endpoint)

Analiți: Alb, Glu, Col, TG, TP, TBil/Dbil,
UA, Ca, MG, Fe, Hb, RF, CO2

 Cinetic (Kinetic)
Enzime: ALT, AST, ALP, CK,
AMY, LIP, GGT, LDH, …
 Forma curbei de reacţie
exemple: GLU, COL, TG, PROT, AC. Uric
ABS

Absorbanţa creşte,
după care atinge un
platou maxim care se
stabilizează

Adaugam proba+reactivul, incubam si incepe reactia.

TIMP

Adăugare probă Adăugare reactiv

 Forma curbei de reacţie
exemplu: Fier seric
ABS După adăugarea R2,
absorbanţa se
schimbă aproape
instantaneu
Cu R1
absorbanţa
rămâne la un
anumit nivel

TIMP

Adăugare Adăugare Adăugare reactiv R2

probă reactiv R1
 Forma curbei de reacţie
exemple: BIL, HDL
ABS
După adăugarea R2,
absorbanţa creste şi
atinge un platou

Cu R1
absorbanţa
rămâne
neschimbată

TIMP

Adăugare Adăugare Adăugare reactiv R2

probă reactiv R1
 Ce se poate măsura?

1. Absorbanţa într-un singur punct (A)

2. Diferenţa de absorbanţă dintre 2 puncte (DA)

3. Rata de creştere/scădere a absorbanţei (DA/Dt)

 Măsurarea absorbanţei într-un singur punct
exemple: GLU, COL, TG, PROT

ABS A

Se citeşte
absorbanţa într-un
singur punct, la un
singur moment de
timp, de obicei
punctul final
(endpoint)

TIMP
Măsurarea diferenţei de absorbanţă dintre două puncte
exemplu: Fe

A doua măsurare
se face de obicei la
punctul final (A2)
ABS

A2

Se calculează
Prima măsurare se diferenţa:
face de obicei DA = A2-A1
inainte de
adăugarea R2 (A1)

A,

TIMP
 Măsurarea ratei de creştere sau scădere a absorbanţei
exemple: ALP, AMYL, GGT, AST, ALT, CREA, UREE (teste cinetice)

ABS
Se fac măsurători într-un
interval dintre două
puncte, la scurt timp
după adăugarea
reactivilor
Se calculează
a tg(a) = DA/Dt

TIMP
 Calibrarea

Prin calibrare, valorile măsurate (A, DA, sau DA/DT) se

corelează cu valori de concentraţie cunoscute.

Se folosesc cel puţin 2 calibratori de concentraţii cunoscute.

De obicei, un calibrator are concentraţia zero.
 C0 şi Ccal sunt cunoscute
A0 şi Acal se determină prin calibrare
Ax se măsoară

Relaţia dintre A (absorbanță) şi C (concentrație) este o funcție liniară,

deci poate fi caracterizată prin ecuaţia unei drepte de forma y= ax+b

unde y - este valoarea măsurată Ax

x - este concentraţia, Cx
a - este factorul de pantă a dreptei
b - este valoarea A0 măsurată la conc zero C0
Un mod şi mai simplu de deducere a ecuaţiei de
calcul: pe baza similarităţii triunghiurilor

Absorbanţa, DA, sau DA/Dt măsurată

Acal

Ax

A0
C0 Cx Ccal CONCENTRAŢIA
Pornind de la relaţia
𝐶𝑥 − 𝐶0 𝐴𝑥 − 𝐴0
=
𝐶𝑐𝑎𝑙 − 𝐶0 𝐴𝑐𝑎𝑙 − 𝐴0

Dacă C0 = 0 dar A0 nu este neglijabil

𝐶𝑥 𝐴𝑥 − 𝐴0
=
𝐶𝑐𝑎𝑙 𝐴𝑐𝑎𝑙 − 𝐴0

Forma generală a ecuaţiei se scrie astfel:

𝐴𝑥 − 𝐴0
𝐶𝑥 = 𝐶𝑐𝑎𝑙
𝐴𝑐𝑎𝑙 − 𝐴0
SURSE DE INTERFERENŢĂ ÎN REACŢIILE
BIOCHIMICE
 Interferenţă

„efectul unei substanţe prezente în probă care alterează

valoarea corectă a rezultatului la determinarea unui analit”

„the effect of a substance present in the sample that alters the correct
value of the result for an analyte”

Kroll, M.H. and Elin, R. J. (1994) Interference with Clinical

Laboratory Analyses. Clin. Chem. 40 (11), 1996-2005.

Lichidele biologice pe care le studiem in lab. medicale sunt soluții foarte

complexe cu numeroase componente, unele cunoscute altele mai putin, ce pot
influența rezultatele măsurătorilor. Aceste influențe sunt așa zise interferențe.
 Surse de interferenţă

Exogene Endogene

Medicamente Lipemie

Aditivi Hemoliză

Efectul de matrice Bilirubinemie

Paraproteinemie
Surse exogene: Medicamente

 Medicamentele, fiind biologic

active, reacţionează cu componentele
reactivilor sau cu substanțele de
analizat.
Ex: acidul ascorbic – efect negativ
asupra determinării glucozei cu
glucozo-oxidaza.

 Metaboliții medicamentelor, de
asemenea, provoacă interferențe,
fiind uneori chiar mai reactivi decât
compusul original.
 Surse exogene: Aditivi

Materialele adăugate la probă ca

anticoagulanţi, conservanţi sau
stabilizatori, pot interfera cu
determinarea multor analiţi.

Exemple:
– Fluorurile interferă cu determinarea multor enzime
– Agenţii chelatori interferă cu determinarea cationilor de metal
 Surse exogene: efectul de matrice

O deplasare sau diferenţă a rezultatului, cauzată

MATRIX de o proprietate alta decât nivelul substanţei
determinate, incluzând interferenţe fizico-chimice,
EFFECT mecanice şi analitice, precum şi prezenţa unor
forme izomere ale substanţei.
„a bias or difference caused by a sample property other
than the level of the substance or property that is intended
to be measured. It includes physiochemical, mechanistic, and
analytical interferences and substance isoforms”
Lasky, I.D. (1993) Achieving accuracy for routine clinical
chemistry methods. Arch. Pathol. Lab. Med. 117, 412-419.

De exeplu masurarea unui analit dintr-o solutie apoasă, poate

fi diferită față de măsurarea aceluiași analit dintr-un ser, sau o
plasmă, datorită proprietăților fizico-chimice ale mediului
(adică a matricei care înconjoară analitul).
Efectul de matrice are importanţă foarte mare
pentru acurateţea rezultatelor!
Un studiu efectuat în 977 laboratoare, pe 37
sisteme specifice instrument/reactiv a arătat că
cca. 70% dintre determinări au fost influenţate
de efectele de matrice.

Se poate demonstra o diferenţă semnificativă

(eroare sistematică proporţională) între
rezultatele obţinute din aceleaşi probe,
în urma calibrării cu
standard în soluţie apoasă
Sau cu un calibrator pe bază de ser.
Surse endogene: lipemia

Particule lipidice circulante, respectiv VLDL și

chilomicronii, cauzează:
 turbiditate din cauza împrăştierii razelor de lumină

 schimbări ale volumului probei prin dislocarea

soluţiiei apoase.

Exemple:
 Efectul dispersiei luminii de către lipemie poate
interfera cu analizele de glucoză, bilirubină,
proteine ​totale, fosfor și acid uric. De asemenea,
dispersia luminii poate afecta profund testele
turbidimetrice nefelometrice.
 Alterarea volumului poate duce la rezultate fals
scăzute la determinarea natremiei.
Surse endogene: hemoliza

Hemoliza in vitro apare în timpul recoltării, transportului şi

manipulării probei:
Venostază; aspirare, ejectare sau agitare cu forţă
excesivă; păstrare prelungită a sângelui integral; contaminare
cu detergenti, apă sau alcool; încălzire sau răcire excesivă;
viteză excesivă la centrifugare
Interferenţe prin 3 mecanisme diferite:
1. Hemoglobina interferă cu determinarea
spectrofotometrică, datorită propriei sale culori – în
acest caz gradul de interferenţă depinde de lungimea
de undă folosită.
2. Hemoglobina sau celealte substanţe eliberate pot
afecta unele reacţii chimice (ex. diazotarea bilirubinei,
activitatea lipazei serice, activitatea creatinkinazei)
3. Componentele celulare eliberate se adaugă la
substanţa măsurată din ser, ducând la valori fals
crescute ale LDH, Mg, K.
Surse endogene: bilirubina

Mai multe mecanisme de acţiune:

 Prin abilitatea de a reacţiona cu componentele

reactivilor. (ex. influenţă negativă asupra
determinării creatininei, interferenţă cu metodele
care folosesc peroxidaza – Glucoză, Trigliceride,
Acid uric)

 Bilirubina pote afecta citirea spectrofotometrică

prin proprietăţile sale spectrale (absoarbanţă
puternică între 400-540 nm)

Bilirubina poate să crească in sânge în anumite boli hepatice si in ictere,

este o culoare galben-portocalie, are culoare proprie, galben-verzui
intens, si poate influenta rezultatele prin mai multe mecanisme.
Surse endogene: paraproteinemia

Paraproteinele (cantităţi mari de

lanţuri de imunoglobuline în sânge)
apar în anumite boli (ex. mielom
multiplu) şi pot să mărească
viscozitatea sângelui ducând la
probleme în pipetarea exactă a
volumelor.

De asemenea, imunoglobulinele se
pot complexa cu unele enzime,
prelungind timpul de circulaţie a
acestora în sânge, şi ca urmare pot
duce la valori fals crescute în
determinările de CK, LDH, amilază.
 Interferenţe datorate limitelor detectorului

 Limitări ale instrumentului de măsurare

La absorbanţe mari ale probei, numai o cantitate din ce în ce mai mică de lumină
transmisă ajunge la detectorul spectrofotometrului, fiind mai dificilă detectarea
acesteia. Deci atunci când se măsoară nivele ridicate de analit, va exista o eroare
spectrofotometrică mai mare, în special la instrumentele cu sensibilitate scăzută.
Pentru a micșora această eroare, se foloseşte un blank de probă și/sau diluarea
probei.

 Limitări datorate modului de calcul al absorbanţei

În spectrofotometrie, concentrația de cromogen și absorbanță sunt direct
proporționale una cu alta. Însă absorbanța este doar o valoare calculată, legată
logaritmic de procentul de lumină transmisă (T), cantitatea care se măsoară de fapt.
Ca urmare, la ambele capete ale scarei de absorbanţă, mici schimbări de procente
T (T%) vor avea ca rezultat schimbări disproporționat de mari în valoarea calculată
a absorbanţei, conducând la erori de analiză crescute.
Pentru a minimiza acest tip de eroare, trebuie să se asigure că măsurătorile se fac la
absorbanță între 0.1 și 1.1 ori de câte ori este posibil.
 Exemple pentru interferenţa medicamentelor
Medicamente care duc
Analit Medicamente care duc la valori crescute sau fals+ la valori scăzute sau
fals negative

Altopurinol, Azathioprine, Carbamazepine, Isoniazid

Cephaloridine, Chlorpropamide, Clindamycin, Oxalates, Phosphate,
Fosfatază
Erythromycin, Estrogens, Imipramine, Methyldopa, Propranolol,
alcalină
Nitrofurantoin. Novobiocin, Phenothiazines, Rifampin, Vitamin D
Sulfonamides, Tetracycline, Tolbutamide

Acetazolamide, AIIopurinol, PAS, Anabolic steroids

Amphotericine B, Ascorbic acid, Azathioprine,
Barbiturates, Caffeine,
Carbamazepine, Chloroquine, Chlorpropamide,
Citrate, Protein,
Clindamycin, Diazepam, Erythromycin, Ethambutol,
Salicylates (large
Bilirubină Flourazepam, Gentamicin, Imipramine, Indomethacin,
amounts),
Isoniazid, Levodopa, Menadione, Mercaptopurine,
Sodium chloride,
Methotrexate, Nitrofurans, Novobiocin, Primaquine,
Penicillin, Urea
Propylthiouracil, Pyrazinamide, Sulfonamides,
Tetracyclines, Tolbutamide
 Medicamente care duc la valori crescute sau fals Medicamente care duc la valori
Analit
+ scăzute sau fals negative
Acetone, Alkaline antacids, PAS, Amphotericin B,
Ascorbic acid, Bacitracin, Ethacrynic acid,
Furosemide, Gentamicin, Hydantoins, Indomethacin,
Chloramphenicol, Dextrose
Uree / BUN Kanamycin, Methicillin, Methyldopa, Mithramycin,
infusions, Phenothiazines
Nalidixic acid, Nitrofurantoin, Polymyxin B,
Propranolol, Salicylates, Sulfonamides, Tetracyclines,
Thiazide diuretics, Vancomycin
Acetazolamide, Aspirin,
Alkaline antacids, Estrogens, Potassium,
Corticosteroids, Gentamicin,
Calciu Proge~tins, Sodium, Thiazide diuretics,
Hepadn, insulin, Methicillin, Oxalate,
Urea, Vitamin D
Sulfadiazine
PAS, Ascorbic acid, Bile salts,
Aminopyrine, Anabolic agents, Aspirin,
Chlortetracycline,
Chlorpromazine, Clofibrate, Iodides,
Colesterol Colchicine, Estrogens, Glucose,
Penicillamine, Phenothiazines, Salicylates,
Heparin, Kanamycin, Nicotinic acid,
Thiouracil, Urea
Phenformin

Albumin, Amphotericin B, Ascorbic acid,

Creatinină Barbiturates, Clofibrate, Colistin, Glucose, Viomycin
Kanamycin, Levodopa, Mannitol, Methicillin
 Medicamente care duc la
Medicamente care duc la valori crescute sau
Analit valori scăzute sau fals
fals pozitive
negative
Anabolic steroids, Clofibrate,
Acetaminophen, Acetazolamide, PAS, Caffeine, Cyproheptadine,
Diphenylhydantoin, Estrogens, Furosemide, Guanethidine, Isoniazid, MAO
Glucoză
Imipramine, Nalidixic acid, Nitrofurantoin, inhibitors,
Tetracycline, Thiabendazole Nitrazepam, Propranolol,
Reserpine
Dextran, Pyrazinamide,
Proteine totale Bilirubin, Clofibrate, Lipemia, Tolbutamide
Salicylates

Ampicillin, Ascorbic acid, Cephalothin, Chloroquine,

Clindamycin, Cloxacillin, Diphenylhydantoin,
Erythromycin, Ethambutol, Gentamicin,
GOT
Indomethacin, Isoniazid, Methotrexate, Nalidixic
acid, Nitrofurantoin, Propranolol, Suffamethazole,
Tetracycline, Tolbutamide

Cardiotonic glycosides, Clindamycin, Codeine,

Desipramine, Erythromycin, Ethionamide,
GPT Flurazeparn, Gentamicin, Indomethacin,
Isoniazid, Methyldopa, Morphine, Phenothiazines,
Propranolol, Pyrazinamide, Tetracycline
 Medicamente care duc
Medicamente care duc la valori crescute sau
Analit la valori scăzute sau
fals +
fals negative

Acetazolamide, Acetaminophen, Aminophylline,

Acetohexamide,
Ampicilin, Ascorbic acid, Aspirin, Coffee,
AIIopurinol,
Acid uric Ethambutol, Gentamicin, Levodopa,
Anticoagulants,
Mercaptopurine, Methicillin, Methotrexate,
Mannitol, Phynylbutazone
Penicillin, Pyrazinamide, Spiranolactone

Dichlorphenamide,
Sodiu Calcium, Copper, Iron, Methyldopa, Protein
Furosemide, Heparin

Acetazolamide,
Amiloride, Calcium, Cephaloridine, Copper, Amphotericin B,
Potasiu Iron, Isoniazid, Mannitol, Methicillin Carbanexolone,
Tetracyclines Furosemide, Polymyxin B,
Salicyiates,

Insulin, Phenothiazine,
Fosfor Methicillin, Tetracyclines
Promethazine
Bibliografie
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC345
3568/pdf/12291_2008_Article_BF02867865.pdf
INTERFERENCES IN CLINICAL CHEMISTRY ANALYSIS
K. S. S. Saibaba, M. Vijaya Bhaskar et al. - Indian Journal of
Clinical Biochemistry, 1998, 13(2), 55-62

 http://www.westgard.com/lesson27.htm
INTERFERENCE AND RECOVERY EXPERIMENTS
II. ELECTROFOREZA
II. ELECTROFOREZA
Principiul metodei:

Migrarea diferenţiată a particulelor unui amestec (soluție, ser)

aplicat pe un suport semisolid (gel agaroză, acetat de
celuloză, hârtie), conectat la un câmp electric continuu.

Migrarea particulelor în câmpul electric depinde de sarcina

electrică a particulelor şi de masa lor moleculară (mărimea
particulei).
 Electroforeza

 Aplicații clinice
 proteine serice, urinare
 imunoglobuline
 hemoglobina
 izoenzime
 lipoproteine
 pH izoelectric

 pH– ul soluției de migrare joacă un rol important în preluarea sarcinilor

electrice. În cazul proteinelor, migrarea are lor în soluție tampon alcalină,
ce imprimă proteinelor o încărcare electronegativă.

 În migrarea particulelor spre polul pozitiv (anod), acestea se vor separa

în funcție de încărcarea lor electrică și mărimea lor.

 Migrarea unei particule se oprește în momentul când aceasta va atinge

punctul în care care sarcina ei globală este nulă, respectiv forma
amfionică (structuri chimice care, în cadrul aceleași molecule, conțin
ambele tipuri de sarcini și are sarcina totală=0)

 O proteină se află în formă amfionică la pH-ul său izoelectric.

O proteină într-o soluţie care are un pH inferior punctului sau izoelectric
se va comporta ca o bază şi va accepta protonii H+.
Ea va deveni astfel încărcată pozitiv. În mediu acid:

O proteină într-o soluţie care are un pH superior punctului său izoelectric

se va comporta ca un acid şi va ceda protonii H+.
Ea va deveni astfel încărcată negativ. În mediu bazic:
Electroforegrama proteinelor serice =
Proteinograma


 Prin electroforeza serului, în condiţiile amintite mai sus, se obţin cinci sau
șase fracţiuni: albumina, α1-, α2-, β- (β1, β2) si γ- globuline.

Varsta Albumina (%) Alfa 1(%) Alfa 2 (%) Beta (%) Gama (%) A/G

< 1 an 40-65 2-5 6.6-13.5 8.5-14 10-21 1.16-2.23

1 – 16 ani 50-65 2-5 6-15 8.5-15 10-22 1.06-2.48

> 16 ani 52 – 68 2-5 6,6-13,5 8,5 -14 11 – 21 1.39-2.23

Valori de referință – sunt dependente de vârstă

 Etapele electroforezei

Pregătirea probei
Pregătirea/tratarea suportului semisolid
Aplicare
Migrare
Colorare
Decolorare
Uscare
 Migrarea

 Toate proteinele au o sarcină electrică.

 Probele sunt plasate pe un suport special semisolid (de exemplu un gel,

hârtie sau acetat de celuloză) pe care se aplică un curent electric.
Particulele de proteine vor migra în funcție de puterea lor ionică
formând benzi.

 Moleculele pozitive migrează spre un electrod negativ (catod) și

moleculele încărcate negativ migrează către un electrod pozitiv (anod).

 Evaluarea se efectuează cu un instrument numit densitometru ce

măsoară/ evaluează aceste benzi.
 Reactivii necesari

1. Suportul
Alegerea suportului este în funcție de materialul supus separării
– hârtie: substanțe cu greutate moleculară mică (aminoacizi, peptide,
pirimidine și nucleotide)

– acetat de celuloză: proteine serice, hemoglobină, lipoproteine

– gel de agaroză
 Reactivii necesari

2. Soluția tampon
 Tăria ionică a soluției tampon este factorul decisiv în
separarea ionică

 Când pH-ul tamponului este alcalin pH> 7 toate proteinele

cu sarcini negative migrează de la electrodul negativ
(catod) la electrodul pozitiv (anod)
 Reactivii necesari

2. Colorantul
 Este utilizat pentru vizualizarea moleculelor separate.
 Frecvent: – roșu Ponseau
– albastru de bromofenol
– albastru de metil timol
 Reactivii necesari

3. Decolorant
Conţine: acid citric 2,5%
Acționează doar pe zona unde nu s-au produs legături
chimice, decolorând restul foliei.

4. Transparentizant
transparentizează folia
 Aparate

 Sisteme manuale – toate etapele se executa manual

 Semiautomate – citirea se face separat (densitometru, scanner)

 Automate – toate etapele se efectuează automat
Părțile componente unei linii de electroforeză

 cameră de migrare (electrozi de grafit sau platină)

 stabilizator de tensiune
 aplicator
 băi -colorare, decolorare, transparentizare
 uscător
 cititor
 Tipărire curba Levey -Jennings
Acuratețe, precizie, deviație standard
III. TURBIDIMETRIA/
NEFELOMETRIA
 III. TURBIDIMETRIA
Turbiditatea este opacitatea sau lipsa de transparență a unei
soluții, provocată de particule foarte fine, care nu pot fi
observate cu ochiul liber și care, aflate în stare de suspensie în
lichid, difuzează și reflectă lumina.
Prin turbidimetrie se înțeleg metode de măsurare a turbidității,
ca metodă de analiză pentru determinarea concentrației unui
component dintr-o soluție, prin adăugarea unui reactiv.
Măsurarea turbidității, numită turbidimetrie, este o metodă de
analiză ce constă în măsurarea concentrației unei emulsii,
comparându-i transparența cu un preparat etalon.
IV. Imunonefelometrie
Principiul metodei:
Nefelometria se bazează pe măsurarea
intensității luminoase difuzate printr-un mediu
neomogen.

Este o metodă de analiză folosită pentru

determinarea concentrației unui suspensii, utilizând
intensitatea opalescenței, cu ajutorul luminii difuzate
lateral de particulele aflate în suspensie.
 Efect Tyndall

 Efectul de difuzie laterală a luminii printr-o

suspensie se numește efect Tyndall. De
obicei intensitatea difuzată se percepe la un
unghi de 90 grade fata de intensitatea
luminii incidente. Raportul dintre Io si It este
efectul Tyndall, si are aplicabilitate in
determinarea suspensiilor mai diluate.

 Se măsoară intensitatea luminii difuzate

datorat particulelor insolubile, rezultate în
urma reacției dintre proteinele specifice
solubile din probă, cu antiserul specific
acestora.

 Intensitatea luminii este direct proporțională

cu concentrația proteinelor. Concentrațiile
sunt calculate în mod automat prin
interpolare la curba de calibrare existentă pe
cardul kitului sau de pe curba de calibrare.
Proteine speciale determinate prin turbidimetrie
– imunoturbidimetrie-nefelometrie

KAP
IgA IgM CER C3
Lant usor K
IgG ALB AT3 C4 LAM
bCRP
PAB C1IN breast cancer
HS CRP ASO
prealbumiin C1 Inactivator resistance prot
ein

mALB
TRF CRP A1AT
D-dimer U-
A1 Antitrypsin
microalbumin

BMG
APOA1 HPT APOB
RF B2
heptoglobin
Microglobulin
a1-AG
HbA1c UsCRP
Acid Glycoprotein
 Imunonefelometria imbunătățită
cu particule latex

Această metodă utilizează particule (Ac legați pe suprafața unor bile de

polistiren/latex), crescând astfel semnificativ sensibilitatea față de testele
convenționale, și permițând determinarea proteinelor ce se află în
concentrație scăzută.
V. FLAMFOTOMETRIA
V. Flamfotometria
= metodă fizico-chimică de analiză cantitativă a unor elemente
chimice, numită și analiză spectrală de emisie în flacără

Elementul de dozat solubilizat este pulverizat în flacăra unui

arzător de gaz.

Radiaţia flăcării este trecută printr-un filtru care reţine toate

radiaţiile cu excepţia celei caracteristice elementului de dozat.
 Radiaţia reţinută, proporţională cu concentraţia elementului, este
dirijată pe o celulă fotoelectrică.

 Curentul electric produs este măsurat cu un galvanometru. Din

valorile intensităţii curentului indicat de galvanometru, prin
interpolare pe o curbă de calibrare se deduce concentraţia
elementului în proba analizată.

 se poate folosi pentru determinarea litiului, sodiului, potasiului,

rubidiului, cesiului, calciului, stronţiului, bariului, cuprului, existente
în diferite materiale: sol, produse biologice (ser, urină) etc.
Componentele unui flamfotometru
 Tabel care prezintă lungimile de undă emise
de diverși ioni metalici

EMISIA
ELEMENT LUNGIME DE UNDĂ (nm) CULOAREA FLĂCĂRII

Sodiu (Na) 589 yellow

Potasiu (K) 766 violet
Bariu (Ba) 554 Lime green
Calciu (Ca) 662 orange
Litiu (Li) 670 Red
 Utilitatea flamfotometriei în domeniul medical

 Evaluarea concentrației serice a sodiului, potasiului,

calciului, nivelul de litiu în probe de ser, urină, LCR și
alte fluide corporale.
 Sodiul este cationul principal al plasmei și lichidul
interstițial (extracelular)
 Potasiul este cationul principal în spațiul intracelular
 Dozarea litiului este necesară în unele tulburări
psihice, unde este folosit terapeutic.
Valori de referință pentru principalii ioni determinați din ser

 sodiu 137-147mmol/l
 potasiu 3,5-5mmol/l
 calciu 4,5-5,8 mmol/l
 magneziu 1,4-2,2 mmol/l
 clor 103 mmol/l
 fosfor 1,7-2,6 mmol/l
 Modificări ale sodiului seric

 Creșteri ale Sodiului ( hipernatemia)

 Boli renale

 Aport redus de apă

 Diaree

 Vărsături

 Scăderi ale Sodiului ( hiponatemia)

 Insuficiență cardiacă

 Pacient cu arsuri extinse

 Afecțiuni renale
 Modificări ale potasiului seric

 Creșteri ale potasiului (hiperpotasemia)

 Medicamente
 Distrucție celulară excesivă
 Transfuzie masivă de sânge

 Scăderi ale Potasiului (hipopotasemia)

 Boli renale
 Transpirații abundente
 Vărsături
 Diaree
 Tulburări de alimentație