ELECTROFOREZA

• Definiţii
• Teoria Electroforezei
• Tehnici Electroforetice
• Proceduri generale
• Electroforeza capilara
• Aplicatii

1
 Electroforeza
– Migrarea substanţelor incărcate electric
dizolvate într-un mediu lichid si supus unui
câmp electric
– Multe molecule biologice au grupe ionizabile de
exemplu: aminoacizi, proteine, nucleotide, acizi
nucleici
– Sub un câmp electric particule
încăcate migrează la anod (+) sau catod (-)

• Se poate determina marimea, forma si sarcina unei

molecule.
• Se utilizeaza diferite variante ale electroforezei
pentru a determina diverse proprietati. 2
 Electroforeza
• Definitie: Migrarea ionilor prin
atractie sau respingere intr-un
camp electric.
– Separarea componentilor unui
amestec prin aplicarea unui camp
electric extern
• v=EQ/f
– v = viteza moleculei
– E = intensitatatea campului electric
– Q = sarcina moleculei
– f = coeficientul de frecare
3
 Electroforeza: aspecte
teoretice
Forta electromotoare (emf)

+
Analitul

+ V Q –
Femf  EQ 
d
Fdrag  6r
cand Femf  Fanalit , vitezaconsa nta
4
TEORIA ELECTROFOREZEI

• Multe molecule biologice există ca:

(a) anionii sau (b) cationi

• Soluţie cu pH < pI => Amfolitul are sarcina +ve

• Soluţie cu pH > pI => Amfolitul are sarcina –ve

• Într-un câmp electric:

 Cationii migrează la catod (-)
 Anionii migrează la anod (+)
5
Viteza de migrare depinde de:

• Sarcina electrică netă a moleculei

• Dimensiunea si forma moleculei
• Puterea câmpului electric
• Proprietăţile mediului (electrolitului)
• Temperatura de separare

6
 CONSIDERAŢII TEHNICE

Electro-endo-osmoza / Endo-osmoza

• suport în contact cu apa = ioni hidroxil adsorbiţi =>

sarcină negativă (solvatare)

• Sarcina negativă de pe suport atrage ionii pozitivi

în soluţie => potenţial Stern

• creşte distanţa de la suprafaţa încărcată negativ

creşte numărul de ioni negativi
potenţial zeta ()
numărul eventual de ioni - = nr. ioni +
7
 Endosmoza
- -
- -
- -
- + -
-
- - -

+ –

• Mari, extrem de incarcate,

proteinele pot migra intre electrozii
incarcati (polarizati) diferit 8
• Când se aplică curent sistemului
 sarcinile - rămân fixate pe suport
 norul de ioni din soluţie se muta la electrozi
 foarte hidrataţi
 odată cu mişcarea norului ionic, solventul se mişcă de
asemenea

• Mişcarea relativă a solventului de pe suportul fix

=> endosmoză

• Mişcarea apei într-o singură direcţie

• Macromolecule se deplasează în direcţia opusă fluxului de

ioni + hidrataţi
=> pot rămâne imobile sau să fie atrase la polul opus
9
• În acetat de celuloză şi gel de agaroză

• Reducerea endo-osmozei prin:

- Eliminarea / modificarea grupurilor
incărcate de pe suport
- Adăugarea de zaharoză sau sorbitol
=> creştere a osmolalitatii
10
Electroforeză Zonală

• Migraţia moleculelor încărcate

• Mediu de migrare depus pe un suport
 Medii poroase de exemplu: acetat de celuloza sau
agaroză
 Pot fi uscate şi reutilizate
• Acelaşi pH şi domeniu de rezistenţă electrica

• Separare bazată pe mobilitate electroforetică

• Separă coloizi macromoleculari de

exemplu: proteine în ser, urină, LCR, eritrocite,
acizi nucleici
11
Ionoforeză

• Migrarea ionilor mici

• Sistem electrolitic discontinuu

- Electrolit (L-ioni)
- Electrolit (T-ioni)

• Aplicarea soluţiei la suprafaţa interfazei dintre L şi T

• Aplicarea unui câmp electric

 fiecare tip de ion se aranjează între ionii L şi T
 zone discrete

 Separarea anionilor, cationilor, acizi organici si aminici,

peptide, nucleotide, nucleozide, proteine
12
3. TEHNICI ELECTROFORETICE

3a. Instrumente şi reactivi

• Cutii tampon cu plăci tampon => conţine soluţia

tampon

• Electrozi de carbon sau platină => conectati la

sursa de curent electric continuu

• Suport pentru electroforeza => cu fitil pentru

contactul cu soluţia tampon

• Capac => minimalizează evaporarea

13
3b. Surse de alimentare

• Sursă de alimentare: curent continuu între 2 electrozi

• Flux de curent => căldura produsă

 Creşterea vitezei de migraţie => extindereaprobe separate
 Formarea de curenti de convectie => amestecarea
probelor
 Instabilitate termică a probelor sensibile la căldură

• Evaporarea apei => concentrarea ionilor => creşte

vâscozitatea soluţiei tampon => scade rezistenţa

• Pentru a minimiza problemele: se utilizeză surse de

alimentare cu putere constantă si mare
14
3c. Soluţii Tampon

• Pentru a transporta curentul electric aplicat şi a

stabiliza valoarea pH-ului
 determină sarcina electrică si gradul de ionizare
 electrodul la care să migreze

• Forta ionică a soluţiilor tampon

 [ion]  => norul ionic  => mişcarea moleculelor

 - Grosimea norului ionic => viteza de migrare =>
claritatea zonelor electroforetice

• Soluţii tampon barbital şi acid triboric-EDTA

15
3d. Spoturile de proteine

• Pentru a vizualiza / localiza fracţiunile

separate de proteine

• Coloranţi: intensitatea colorarii depinde de:

Tipul proteinei
Gradul de denaturare a proteinelor prin
agenţii de fixare

16
4. PROCEDURI GENERALE
4a. Separarea

• Plasarea materialului de suport în camera PE

• Indepărtarea excesului de soluţie tampon de pe materialul

de suport

• Plasarea suportului în contact cu soluţia tampon în camera

electrodului

• Aplicarea probei pe suport

• Separarea componentelor prin tensiune constantă sau

curent constant pentru o durată de timp

17
• Îndepărtarea suportului, apoi

uscarea sau aplicarea unui fixator

tratarea cu un fixator de colorare
spălarea colorantului în exces
uscarea (agaroză) sau adăugarea unui
agent de spălare

18
4b. Detecţie şi cuantificare

• Rapid ca:
-% din fiecare fracţiune prezentă sau
- concentraţia absolută

• Prin densitometrie:
- Benzile electroforetice se trec printr-un
sistem optic de masurare
- Absorbanţa fiecărei fracţiuni afisată pe o
diagramă
19
 5. TIPURI DE ELECTROFOREZA

a. Electroforeză în gel de agaroză

b. Electroforeză în acetat de
celuloză
c. Electroforeză în gel de
poliacrilamidă
d. Concecntrare izoelectrică
e. Electroforeză bidimensională
20
21
5a. Electroforeză în gel de agaroză (AGE)

• Foloseşte agaroză ca mediu de migrare

- Concentraţie scăzută => dimensiunea porilor
mare
- Concentraţie mai mare=> dimensiunea porilor
mică

• Proteine ​​serice, variante de Hb, lactat de

hidrogenaza, izoenzimele CK, fracţiunile LP

• Agaroza pură
=> nu are grupuri ionizabile
=> nu are loc endo-osmoza
22
• Avantaje:
- Afinitate scăzută pentru proteine
- Prezintă fracţiunile clar după uscare
- Temperatura de topire scăzută –
re-lichiefiere la 65oC

• Dezavantaje:
- Slabă elasticitate
- Nu este potrivită pentru un sistem cu bare

23
5b. Electroforeză în acetat de celuloză (CAE)

• anhidridă acetică + celuloză => CA

• Are 80% spaţiu aerian => se umple cu lichid atunci când

este scufundat în tampon

• Pot fi făcute transparente pentru densitometrie

• Avantaje:
- Viteza de separare
- Posibilitatea de a stoca membrane transparente

• Dezavantaje:
- Presoaking înainte de utilizare
- Curăţare pentru efectuarea densitometriei
24
• Metoda:

- CA umedă în tampon PE
- Se incarcă proba până la aproximativ o treime din
lungul benzi
- CA se întinde în benzi peste un pod
- Podul se plasează în camera PE =>benzile se
scufundă direct în zona-tampon
- După EP, colorare, ​​decolorare, vizualizarea
proteinelor
• Pentru diagnosticul bolilor

Schimbare în profilul de proteine ​​serice

25
5c. Electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE)

• Celula PE în formă tubulară

 Se toarnă gel de separare cu pori mici
 Se adaugă gel cu pori mari în partea de sus
 Soluţie de monomer cu pori marei + proba deasupra celui
de-al doilea gel

• Electroforeza
 Toţi ionii proteinelor ​​migreaza prin gelurile cu pori mari
 Se concentrează în gelul de separare
 Se separă din cauza denaturării unor proteine

• Dimensiunea medie a porilor în 7,7% din gelul de

separarea PAGE este de aproximativ 5nm
 Permite proteinelor ​​serice să migreze
 Impiedică migrarea proteinelor ​​mari de exemplu:
fibrinogen, 1-lipoproteine, 2-macroglobuline 26
 • Avantaje:

- Termostabil, transparent, puternic, chimic

inert
- Gama larga de dimensiuni ale porilor
- Neacoperite => nu are loc endo-osmoza

• Dezavantaje:

- Cancerigene

27
Denaturarea

• Se fierbe o proba timp de 5 minute în soluţia tampon ce

conţin b-mercaptoethanol & SDS

• b-mercaptoethanol: reducere puntile disulfitice (S-S)

• SDS: se leaga puternic de proteinele şi le denaturează

• Proteine ​​denaturate -> se rup structurile în formă de

tijă =>”ghem” sunt separate în funcţie de dimensiunea lor

• Utilizare:
- Pentru a evalua puritatea proteinei
- Pentru a determina MW proteinelor
28
• Utilizarea unor condiţii non-denaturare
=> nu SDS sau -mercaptoethanol
=> proteinele nu denaturează

• Separarea proteinelor se bazează pe:

- Mobilităţile electroforetice diferite
- Efectul de “sitare” al gelului

• Utilizare
- Pentru a obţine proteine native / enzime
- Pentru a studia activitatea biologică
29
5d. Concentrarea izoelectrică (isoelectrofocusing)

• Pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine)

• Proteinele se deplaseaza în zona în care:

pH-ul mediu = pI => sarcina = 0

• pI este limitat într-un domeniul de pH îngust

=>zone ascuţite pentru proteine

• Metoda:
- Folosirea gelurilor orizontale pe sticlă / folii de plastic
- Să introduc amfoliţii în gel => se crează gradientul de pH

30
- Se aplică o diferenţă de potenţial în gel

- Anod => zona cu pH-ului cel mai mic

- Catod => zona cu pH-ului cel mai mare

- Proteinele ​​migraează până când se ajunge la

pH = pI

- Se spală cu soluţie de fixare pentru eliminarea

amfoliţilor

- Colorare, decolorare, vizualizare

31
5e. Electroforeza bidimensinală (2D) (ISO-Dalt)

• prima dimensiune utilizând IEF EP

 într-un mediu cu pori mari
 amfoliţii formează gradientul de pH

• a doua dimensiune utilizând EP-dependentă de greutatea

moleculară
 in poliacrilamidă
 liniar sau gradient

• Metoda: O'Farrell:
- Folosirea β-mercaptoethanol (prima D) şi SDS (a doua D)

• ​​Detectează proteine folosind coloranţi Coomassie,

radiografie, fluorografie
32
• Separă 1100 de culori (autoradiografie)
Princiipiile electroforezei capilare

Cum separarea diferitilor compusi

farmaceutici reprezinta o problema de
actualitate, s-au pus la punct diverse
tehnici de a realiza acest lucru

Una dintre cele mai eficiente tehnici de

separare este electroforeza capilara(CE)
33
Electroforeza capilara – bazele
instrumentatiei
• Electroforeza ce are loc in tuburi capilare
ce contin un electrolit
• Fiecare tub capilar are un diametru
interior de circa 25-100 μm.
• Cand se aplica o tensiune solutiei,
moleculele migreaza catre electrodul de
sarcina opusa
• In functie de sarcina acestora,
moleculele pot migra cu viteze diferite
– In final are loc separarea componentilor

34
Se utilizeaza un fotoreceptor pentru a masura
absorbanta moleculelor in timp ce acestea migreaza
in solutie

Semnalul analitic este analizat de catre

un computer si reprezentat grafic 35
Migrarea diferitelor specii (ionizate sau neionizate) de analiţi
sub influenţa fluxului electro-osmotic

36
37
Instrumente pentru realizarea
electroforezei capilare

38
 “Curgerea” electro-osmotica

• O caracteristica importanta a CE este

reprezentata de curgerea lichidului prin tuburile
capilare.
39
• Acest fenomen poarta numele de electro-osmoza
 Profilul de curgere al electro-osmozei
• O alta caracteristica importanta a “curgerii” electro-
osmotice este profilul plan de curgere al acesteia,
spre deosebire de cel parabolic, realizat de o
pompa peristaltica
• Profilul acestei curgeri este plan datorita fortei
uniform distribuite de-a lungul tubului capilar, ce
pune in miscare particulele, ceea ce inseamna ca
nu vom avea caderi de presiune, iar viteza de
curgere va fi aceeasi pe toata lungimea tubului.
• Profilul plan al EOF(electro-osmosis flow) este
important deoarece permite separari foarte
eficiente.
40
41
 Electroferograma
• Datele furnizate de CE sunt
prezentate sub forma unei
electroforegrame aceasta fiind
similara cu cromatograma.
• Electroforegrama reprezinta un
grafic al timpului de migrare in
functie de raspunsul
detectorului.
• Raspunsul detectorului
depinde de obicei de
concentratie, cum ar fi
aborbanta UV-vizibil sau
fluorescenta.
42
 Echipament
• Tub capilar
• De lungime variabile, in
general intre 25-50 cm
• Diametrul mic al tubului si
grosimea silicei joaca un rol
important
– Folosind tuburi cu
diametre mici si pereti
grosi se previne aparitia
incalzirii de tip Joule,
datorate voltajului.

43
• Detector
– Absorbanta UV/Vizibil
– Fluorescenta
– Radiometric (pentru substante radioactive)
– Spectrometru de masa 44
 Aplicatii

• Analiza carbohidratilor • Avantaje

• Metoda rapida
• Analiza anionilor • Probe mici
anorganici • Metoda relativ ieftina
• Identificarea de ADN • Aparatura automatizata

• Identificarea proteinelor
• Dezavantaje
• Nu se pot identifica specii
neutre
• Aparitia efectului Joule

45
1. CE se bazeaza pe principiile separarii electroforetice.
2. Viteza de migrare a speciilor este determinata de
sarcina acestora dar si de marimea lor.
3. Particulele mici cu sarcina ridicata vor migra mai
repede decat cele mari si cu sarcina scazuta.
4. Curgerea fluidului este cauzata de EOF.
5. Viteaza EOF poate fi ajustata prin modificarea pH-ului
solutiei.
6. Profilul de curgere al EOF este plan, ceea ce
reprezinta eficiente ridicate de separare/identificare.
7. Datele sunt reprezentate grafice sub forma unei
electroforoegrame.

46
 Separarea proteinelor
plasmatice
• Electroforeza
– Amidon gel, agar gel, acetat celuloza,
PAGE, EC

47
Optimizarea electroforezei
• Separarile electroforetice
optimizate trebuie sa fie echilibrate
intre valorile vitezei si rezolutiei
– Voltajul ridicat mareste viteza, dar
temperatura cauzeaza evaporarea si
poate denatura proteinele
– Rezistenta ionica ridicata mareste
conductivitatea, dar imbunatateste
efectele endo-osmotice
48
 Electroforeza proteinei
serice
Albumin 1 2  

+ -

49
 PRINCIPIUL CHIMIC
O proteina in solutie care are un pH inferior punctului sau
izoelectric se va comporta ca o baza si va accepta protoni de hidrogen.
Proteina va deveni astfel incarcata pozitiv.
In mediu acid:

O proteina in solutie care are un PH superior punctului sau

izoelectric se va comporta ca un acid si va ceda protoni de hidrogen.
Proteina va deveni astfel incarcata negativ.
In mediu bazic:

Prin electroforeza serului uman se obtin astfel sase fractii

proteice: albumina, alfa1, alfa 2, beta 1 si 2 si gama globuline.
Se realizeaza astfel o migrare reprezentata grafic
50
(electroforegrama).
 Albumina
• Este proteina preponderenta din
plasma (aproximativ jumatate din
totalul de proteine)
– sintetizata in ficat
– t½=15-19 zile
• Functii principale
– Mentinerea echilibrului fluidelor
– Transportator
– Activitate antioxidanta
51
– Tampon
 Pre-albumina
• Tirotoxina – proteina (o forma
incipienta a albuminei), denumita de
asemenea si transtiretina sau TBPA
– De asemenea complexe cu retinol-
proteina (RBP)
• Numai proteina care migreaza
anodal la albumina
• Markerul sensibil al starii nutritionale
este de numai 2 zile
52
 1-Antitripsina
• Este un inhibitor proteic care leaga
si inactiveaza tripsina
• Deficienta este asociata cu:
– Emfizem pulmonar
– Ciroza
• SPE este numai un test de
screening pentru deficienta de AAT.

53
 Alte 1 proteine
• 1-acid glicoproteic (orosomucoid)
– Functia biologica este necunoscuta
• 1-Fetoproteina (AFP)
– Este proteina fetala principala,
utilizata in detectia anomaliilor fetale
(defecte ale tubului neural)

54
 2-Macroglobulina
• Cea mai mare non-imunoglobulina
din plasma
• Inhibitor proteic
• Increased in nephrotic syndrome
(size)
• Dimensiune crescut in sindromul
nefrotic
• Deficienta genetica este complet
necunoscuta. 55
 (2) Ceruloplasmina
• Transportul proteinei cuprice
• Participa la reactiile redox in plasma
• Nivelurile Cu fluctueaza cu o
varietate de stari fiziologice, dar
masurarea se realizeaza pentru
depistarea bolii Wilson
– Cu din plasma este scazut datorita
inhibarii (bio)sintezelor.
56
(2) Haptoglobina
• Se leaga si se pastreaza numai
hemoglobina nu si mioglobina.
– Complexul are de asemenea
activitate peroxidazica si poate fi
implicata in raspunsul inflamatoriu
• Bolile hemolitice pot diminua
nivelurile Hp

57
 () Transferina
• Transport proteina ferica si de
asemenea leaga cuprul
• Transferina este crescuta in anemie
deficitara de fier, in sarcina si
terapie cu estrogen
• Este crescuta in inflamatii,
malignitate sau boli ale ficatului.

58
2-Microglobulina
• Proteina mica (MW=11.8K)
• BMG este filtrata in glomerule, dar
este reabsorbita in tubii renali.
• Nivelurile BMG urinara sunt o
masura a sensibilitatii functionarii
tubilor renal
• Nivel crescut in cedarea renala

59
 () Complementul
proteinelor
• C3 si C4 migreaza in regiunea .
• Complementul proteinelor este
scazut in deficientele genetice si
crescut in inflamatii.

60
 -Regiune
• Include imunoglobuline (IgG, IgA,
IgM) si proteina C-reactiva
• Singurul pic ascutit indica o
paraproteina asociata cu o
gammopatie monoclonala (mieloma
multipla)
• CRP este cel mai sensibil indicator
al fazei acute de reactie
– Inflamatie, trauma, infectie, etc.
61
 Reactivii Fazei Acute
10
C-proteina reactiva
X upper limit of normal

1-Antitripsina C3

1
1 2 3 4 5
Ziua
• Alti ACP’s includ: 1-acid glicoproteina,
haptoglobina si ceruloplasmina 62
 SPE Normal

Albumin 1 2  
63
 Model de raspuns imediat
Scaderea in albumina
Cresterea in APR haptoglobinei

Albumin 1 2  
64
 Model de raspuns intarziat
A scazut albumina
A crescut haptoglobina
Au crescut gamma globulinele

Albumin 1 2  
65
 Hipogammaglobulinemia
Au scazut gamma globulinele

Albumin 1 2  
66
 Sindromul nefrotic
A scazut albumina
A crescut 2-macroglobulina
Au scazut gamma globulinele

Albumin 1 2  
67
 Ciroza hepatica
A scazut albumina (sinteza)
Au crescut gamma globulinele
(Gammopatie policlonala)
“- bridging”

Albumin 1 2  
68
 Gammopatie monoclonala
A scazut albumina
Varful ascutit in regiunea gamma

Albumin 1 2  
69
 Enteropatia pierderii de
proteina
A scazut albumina
Au scazut gamma globulinele
A crescut 2-macroglobulina

Albumin 1 2  
70