Lucrare de laborator Nr. 2. Proprietăţi fizico-chimice ale proteinelor.

Reacţii calitative specifice pentru proteine. Reacţii de culoare.

Principiul metodei: Identificare calitativă a proteinelor se axează pe două

feluri de reacţii: asupra legăturilor peptidice, de exemplu, reacţia biuretului;
asupra radicalilor aminoacidici (reacţiile de culoare). Mecanismul fiecărei
reacţii, ce urmează a fi înfăptuită, se va analiza în parte.
Utilaje și reactive: baie de apă; termometru de laborator, hârtie de filtru;
tifon; stativ cu eprubete; pipete gradate (10 ml); pahare (100 ml); pâlnii de sticlă,
hârtie de indicator universal; hârtie de lacmus; petricele sponge; soluţie proteică
nediluată (albuş de ou) şi soluţie diluată de ovoalbumină (vezi: lucrarea 1.2.1.);
soluţie de proteină vegetală (la 40 g de făină de grâu se adaugă 160 ml apă
distilată, se agită şi balonul cu amestecul se ţine la frigider 24 de ore. Iarăşi se
agită, apoi se filtrează mai întâi prin vată higroscopică, apoi prin hârtie de filtru,
filtratul conţine, în principal, albumine; hidroxid de sodiu, soluţii 10%, 5%,
20%; sulfat de cupru, soluţie 1%; ninhidrină, soluţie 1% în acetonă (95%); α-
naftol, tinctură 0,2%; hipobromit de sodiu (la baia de gheaţă se dizolvă 1 g de
brom în 50 ml hidroxid de sodiu, soluţie 5%; reactivul se păstrează în frigider,
având un termen de valabilitate de două săptămâni); acid acetic glacial, acizi
minerali conc.: sulfuric, clorhidric, azotic; gelatină, soluţie 1%; nitrit de sodiu,
soluţie 0,5%; acid sulfanilic, soluţie 1% în acid clorhidric, soluţie 5%; carbonat
de sodiu, soluţie 10%; acid clorhidric, soluţie 5%; aldehidă formică, soluţie
2,5%; acetat de plumb, soluţie 1%.

1.3.1. Reacţia ninhidrinică

Mod de lucru: În eprubetă se introduc 2 ml soluţie proteică diluată, se
adaugă 3-4 picături soluţie de ninhidrină în acetonă. Soluţia obţinută se
amestecă, apoi se introduce în baia de apă la temperatura de 70°C pentru câteva
minute. Se obţine o coloraţie albastră-violetă caracteristică pentru α-aminoacizi.
Iniţial, în urma interacţiunii α-aminoacidului cu ninhidrină se formează o bază
Schiff. Aceasta suportă transpoziţie, decarboxilează şi se descompune în
aldehidă şi aminodicetohidrinden:

Aminodicetohidrindenul se condensează cu încă o moleculă de ninhidrină;

compusul obţinut se enolizează, transformându-se într-o combinaţie colorată
albastru-violet:

În prezenţa solvenţilor organici (acetonă, etanol etc.), folosiţi de obicei

pentru prepararea soluţiei ninhidrinice, parcurge reacţia:
 Produsul acestei reacţii conţine în componenţa sa radicalul R al
aminoacidului iniţial care condiţionează coloraţia diferită (albastră, roşie etc.) a
compuşilor formaţi în urma interacţiunii aminoacizilor cu ninhidrina.
Reacţia poate fi utilizată nu doar pentru recunoaştere, dar şi pentru dozarea
aminoacizilor.

1.3.2. Reacţia biuretului

La 2 ml soluţie proteică diluată se adaugă un volum egal de hidroxid de
sodiu, soluţie 10%, se agită, apoi se picură 2-3 picături sulfat de cupru, soluţie 1
%. La agitare se observă o coloraţie violetă, care demonstrează prezenţa
legăturilor peptidice.
Pentru comparaţie reacţia se repetă cu biuretul, care lesne poate fi obţinut
prin încălzirea ureei:

Pentru aceasta se introduc câteva cristale de uree într-o eprubetă şi se

încălzesc atent la flacăra arzătorului. După răcire în eprubetă se adaugă puţină
soluţie de hidroxid de sodiu de 10%, se agită şi se picură câteva picături din
soluţia sulfatului de cupru de 1%. Conţinutul eprubetei se colorează în albastru-
violet.
În ambele cazuri coloraţia este cauzată de formarea unei combinaţii
complexe a cuprului. În mediu bazic biuretul suportă enolizare totală potrivit
schemei:
 Două molecule aparţinând formei dienolice a biuretului interacţionează cu
hidroxidul de cupru(II), formând un compus complex, în care legăturile
coordinative i-au naştere din contul perechilor de electroni ai atomilor de azot ai
grupelor imine:

În mod analogic se formează combinaţia complexă a cuprului cu grupele

peptidice enolizate ale oricărui polipeptid:

Complexele de acest fel demonstrează, preponderent, coloraţie roşie

(maximul de absorbţie se află în limitele 520-535 nm). În cazul formării
complecşilor cuprului cu participarea a trei sau doi atomi de azot coloraţia este
predominant violetă sau albastră (cu maximuri de absorbţie în regiunile 540-580
nm şi 615-670 nm respectiv). Acestea explică apariţia culorii soluţiilor, la
efectuarea reacţiei biuretului, de la albastră până la roşie, cu predominarea
nuanţei violete.

1.3.3. Reacţia xantoproteică

Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie proteică diluată, la care se adaugă
5-6 picături de acid azotic concentrat. Apare un sediment alb, care la încălzire
până la fierbere se îngălbeneşte şi se dizolvă.
Amestecul este supus răcirii, după care se adaugă atent cu picătura apă
amoniacală concentrată până la reacţie bazică a mediului. Lichidul se colorează
în oranj.
Pentru comparaţie, încercaţi proba xantoproteică cu soluţia de gelatină şi
cu benzen. Proba xantoproteică este caracteristică pentru aminoacizii aromatici
(fenilalanina, tirozina şi triptofanul). Pentru gelatină, spre exemplu, în care
aminoacizii aromatici lipsesc, testul xantoproteic este negativ.
Reacţia parcurge în două etape. Iniţial, ca rezultat al reacţiilor de nitrare a
radicalilor aromatici ai aminoacizilor se obţin nitrocompuşi coloraţi în galben:

Notă: poate fi obţinut un amestec de nitro- şi dinitroderivaţi, în funcţie de

cantitatea de acid azotic adăugat.
La etapa a doua produsele nitrării interacţionează cu hidroxidul de
amoniu, formându-se sarea de amoniu de coloraţie oranj:
 Fiind specifică pentru proteine, peptide şi aminoacizi aromatici, reacţia
xantoproteică este caracteristică, fireşte, şi compuşilor aromatici simpli: benzen,
fenol etc.

1.3.4. Reacţia Adamkiewicz-Hopkins-Cole

Într-o eprubetă se introduc 5-6 picături de soluţie proteică nediluată, apoi
se adaugă 1-2 ml soluţie de acid acetic glacial. Se încălzeşte atent până la
dizolvarea precipitatului obţinut. Amestecul răcit se substratează cu 1 ml acid
sulfuric concentrat (pentru aceasta eprubeta se înclină de la sine, turnând cu
atenţie pe pereţi acidul, astfel, încât lichidele să nu se amestece). La hotarul
fazelor lichide apare un inel violet-roşietic. La încălzire reacţia parcurge mai
rapid.
Se repetă testul cu soluţia gelatinei.
Aceasta este o reacţie de culoare specifică pentru triptofan, prin urmare în
cazul soluţiei de gelatină, în care triptofanul lipseşte, discul violet nu va fi
semnalat. Coloraţia indicată apare datorită condensării triptofanului cu formolul,
eliminat în urma interacțiunii acidului sulfuric concentrat cu acidul glioxilic,
prezent în acidul acetic glacial ca impuritate:

Produsul condensării suportă oxidare până la bis-2-triptofanilcarbinol:

Acesta în prezenţa acizilor minerali formează săruri colorate în albastru-violet.

1.3.5. Reacţia Pauly

Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie acid sulfanilic, se adaugă 2 ml
soluţie nitrit de sodiu 0,5%, se agită puternic şi imediat se adaugă 2 ml soluţie
proteică diluată. După amestecare se mai adaugă 6 ml soluţie de carbonat de
sodiu, în urma agitării apare o coloraţie vişinie-roşie.
Apariţia culorii se datorează prezenţei radicalilor de histidină şi tirozină în
moleculele proteice. La interacţiunea soluţiei acidulate a acidului sulfanilic cu
nitritul de sodiu are loc reacţia de diazotare, în rezultatul căreia se formează
acidul diazobenzensulfonic:
 Prin combinarea ultimului cu histidina se formează 2,5-bis-p-
sulfobenzenazohistidina de culoare roșie-vișinie:

1.3.6. Reacţia Sakaguchi

Un volum de 2-3 ml soluţie proteică diluată se alcalinizează cu 1 ml soluţie
hidroxid de sodiu 10%. Se adaugă câteva picături de α - naftol, tinctură 0,2%.
După agitare se adaugă 0,5 ml soluţie de hipobromit de sodiu şi iarăşi se agită.
Apare o coloraţie caracteristică oranj-roşie.
Este o reacţie de recunoaştere a argininei. Apariţia coloraţiei specifică se
explică prin interacţiunea α - naftolului, în prezenţa oxidantului, cu grupele
guanidinice ale argininei:
La oxidarea ulterioară a naftilargininei se obţine o combinaţie de felul
chinoniminei:

Se ştie, că derivaţii chinoniminelor, în care atomul de hidrogen al

iminogrupei e substituit printr-un radical aril sau alchil, au coloraţie roşie-oranj.
Nu poate fi exclusă şi posibilitatea oxidării ulterioare a celorlalte grupe NH ale
restului guanidinic şi a nucleului benzenic al α - naftolului.

1.3.7. Reacția Vuazene

La 2 ml soluţie proteică diluată se adaugă o picătură de formol, soluţie de
2,5%. Se agită, apoi se adaugă 6 ml acid clorhidric concentrat. Peste 10 min se
adaugă la agitare 10 picături soluţie nitrit de sodiu 0,5%. Apare o coloraţie
intensă albastră-violetă.
Se repetă reacţia cu soluţia gelatinei.
Reacţia Vuazene parcurge numai cu proteinele ce conţin triptofan, având
un chimism analogic celui discutat mai sus pentru reacţia Adamkiewicz -
Hopkins - Cole.
 1.3.8. Identificarea sulfului
În eprubetă se introduc 1,5 - 2 ml soluţie proteică diluată, se adaugă un
volum dublu de hidroxid de sodiu, soluţie de 20%, câteva bucăţi de fierbător şi
amestecul se fierbe cu atenţie timp de 1 - 2 min. Sedimentul slab format se
dizolvă la fierbere. Se adaugă 2-3 picături soluţie de acetat de plumb de 1%.
Apare o coloraţie brună-neagră sau neagră, în funcţie de concentraţia soluţiei
proteice şi de conţinutul aminoacizilor sulfuraţi în molecula proteică. Se
controlează prezenţa sulfului în soluţia gelatinei.
Se cunosc trei aminoacizi proteinogenici sulfuraţi: cisteina, cistina şi
metionina. În moleculele cisteinei şi cistinei sulful este legat relativ slab şi la
hidroliză alcalină lesne se elimină sub formă de hidrogen sulfurat, care
reacţionează cu baza, formând sulfura de sodiu, în urma interacţiunii ultimei cu
plumbitul de sodiu se formează precipitatul negru sau brun- negru al sulfurii de
plumb. Fenomenele au loc conform următoarelor scheme de reacţii:
1.

2. Pb(CH3COO) 2 + 2 NaOH →Pb(OH)2 + 2 CH3COONa

Pb(OH)2 + 2 NaOH→Na2PbO2 + 2 H2O
3. Na2S + Na2PbO2 + 2H2O → PbS↓ + 4 NaOH