Biochimie - Curs 13 - 2022

Lipidele
Lipidele (grec. lipos, grăsime) constituie o altă clasă de molecule prezente în toate
celulele. În contrast cu proteinele, polizaharurile sau acizii nucleici (care sunt polimeri)
aceste substanţe sunt relativ simple. Una din cele mai importante funcţii ale lipidelor este
aceea de a se situa în membrana celulelor (matricea membranară) sub forma unor
agregate. Funcţiile biologice ale lipidelor sunt diverse (la fel ca şi structura lor chimică).
Grăsimile şi uleiurile constituie rezerva principală de energie din multe organisme.
Fosfolipidele şi sterolii sunt elemente structurale majore ale membranelor biologice. Alte
lipide, deşi prezente în cantităţi relativ mici, joacă diverse roluri în organism: cofactori
enzimatici (fosfatidil serina), acomodează purtătorii de electroni (coenzima Q) în
membrană sau pigmenţi care absorb lumina (zeaxantina), ancora hidrofobă pentru
proteine, chaperoni (proteine care ajută la împachetarea altor proteine – sunt implicate în
controlul calităţii acestor proteine în reticulul endoplasmatic), agenţi de emulsifiere în
tractul digestiv, hormoni (steroidici) şi mesageri intracelulari.

Glicerofosfolipidele (fosfogliceridele) sunt o componentă a membranelor biolo-

gice. Acestea sunt esteri micşti ai glicerinei cu acizii graşi (de obicei poziţia 1 este ocupa-
tă de un acid gras saturat, iar poziţia 2 de un acid gras nesaturat) şi un rest al acidului
fosforic. În mod curent pe gruparea fosforil este grefată o grupare polară (Figura 1).
Din acest motiv glicerofosfolipidele sunt molecule amfifile (cu o “coadă” alifatică şi un
“cap” polar). Prin autoorganizarea acestora se pot forma membrane, entităţi necesare
pentru funcţionarea adecvată a tuturor celulelor.

unde

Figura 1. Structura generală a unui fosfolipid și a grupărilor polare

care apar în structure glicero-fosfo-lipidelor

1
 Biochimie - Curs 13 - 2022

În organismul uman fosfolipidele joacă rolul de agenţi de emulsifiere (în bilă) sau
de agenţi de umezire aflaţi la suprafaţa unor organe (în plămâni, intestine sau rinichi).
Fosfolipidele formează ansamble (LDL sau HDL) cu lipoproteinele circulatorii permiţând
transportul nutrienţilor mai greu solubili în organism.
Fosfatidil-colina (lecitina, în greacă ”lekihos” = gălbenuş de ou) este cea mai
abundentă fosfolipidă din plante şi animale, atingând în unele situaţii cantităţi mai mari
de 50% din totalul lipidelor aflate în straturile bilipidice. În particular, se află într-o
proporţie considerabilă în stratul
exterior al membranei celulare. De
asemenea, este fosfolipidul principal
care circulă în plasmă, unde este o
componentă principală a lipopro-
teinelor (HDL). Pe de altă parte este Figura 2. Structura 1-stearoil-2-oleoil-3-fosfatidil-colinei
prezentă în cantităţi modeste (mai
puţin de 10%) sau chiar absentă în
membranele microorganismelor. Prin
intermediul grupării sale încărcate
pozitiv fosfatidil-colina permite livrarea radicalilor metil spre ficat. Aceste reacţii de
metilare sprijină o serie de căi metabolice şi sunt necesare pentru procesul de duplicare a
genelor, etapă care precede diviziunea celulară. Comparativ cu alte lipide, fosfatidil-
colina joacă un rol important în activarea, proliferarea, maturarea sau regenerarea
celulară. În zile noastre lecitina este frecvent folosită în industria alimentară, drept agent
de emulsifiere, drept agent de curgere în industria ciocolatei, stabilizator în panificaţie,
potenţiator de aromă sau supliment în alimentaţia animalelor.
Dipalmitoil-fosfatidil-colina este o componentă majoră a lipidelor prezente pe
suprafaţa celulelor pulmonare (complexul fosfolipide-proteine din celulele alveolare de
tip II formează surfactantul pulmonar).
Fosfatidil serina este o fosfolipidă componentă a membranei celulare care este
localizată îndeosebi în stratul lipidic interior al acesteia. Fosfatidil serina este importantă
pentru funcţiile cognitive ale creierului (memoria, învăţarea sau reînprospătarea informa-
ției; starea de spirit). Datorită instabilităţii reduse în apă, suplimentele bogate în fosfatidil
serină sunt în formă solidă (pudre, cereale sau batoane). De asemenea, fosfatidil serina
poate fi sintetizată în organism.
Fosfatidil-etanolamina (cefalina, PE) ocupă locul al doilea între cele mai
abundente fosfolipide din animale și plante, după fosfatidil colina, și este larg râspândită
și în membranele microbiene. Poate atinge până la 20% din fosfolipidele ficatului și 45%
din totalul de fosfolipide de la nivelul creierului, cu o pondere mai mare în mitocondrii
comparativ cu alte organite celulare. Analog fosfatidil serinei este localizată îndeosebi în
stratul lipidic interior al membranei celulare și în ambele monostraturi ale membranei
mitocondriale. În situația în care este modificată oxidativ poate conduce la o modificare a
metabolismului fierului cu acumularea de hidroperoxizi.
PE este o componentă funcțională importantă a contactului membranar dintre
reticulul endoplasmatic și mitochondrie. În celulele eucariote, în special cele din insecte,
se pare că acest tip de fosfolipid crește rigiditatea bistratului lipidic. În membranele
bacteriene rolul PE este de a descrește densitatea de sarcină negativă de pe alte
fosfolipide anionice.

2
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Glicerofosfolipidele pot fi scindate enzimatic de către enzimele numite

fosfolipaze. Acestă tip de enzime (din clasa
mare a hidrolazelor) scindează selectiv
legăturile esterice sau fosfoesterice ale
glicerofosfolipidelor. Fosfolipaza A2 (izolată
din pancreas sau rinichi, veninul de şarpe sau
al albinelor) clivează restul acidului gras grefat
la carbonul 2 al scheletului provenit din
glicerină. Compusul rezultat (lizofosfolipidul)
este un detergent puternic sau un marker
tumoral (în fluidul ascitic sau plasmă) pentru
cancerul ovarian. Lizofosfolipidul asistă la
scindarea altor lipide prin ruperea globulelor Figura 3. Modul de acțiune al fosfolipazelor
de grăsime şi desfacerea acestora în micelii asupra fosfolipidelor
de dimensiuni reduse. Lecitina este secretată
la nivelul ficatului, secretată în bilă iar mai târziu secretată la nivelul intestinului, unde
este scindată de fosfolipaza A2 (Figura 3), contribuind la procesul de digestie a
grăsimilor.
Plasmalogenii constituie o subclasă de glicerofosfolipide de tip eteric care au
grefate resturi alchil nesaturate la atomul de carbon din poziţia 1 a glicerolului.
Plasmalogenii (Figura 4) constituie o clasă importantă de lipide localizate în membrana
ţesutului nervos. Cei mai cunoscuţi plasmalogeni sunt derivaţi ai etanol-aminei, serinei
sau colidinei. Datorită restului vinilic aceşti compuşi pot avea un rol important în
protejarea celulei față de radicalii de oxigen liberi. O serie de reacţii metabolice care
conduc la plasmalogeni se desfăşoară în peroxizomi şi din acest motiv o serie de boli
peroxizomale pot fi asociate deficiențe ce pot afecta procesul de biosinteză a acestor
compuşi.
Plasmalogenii etanol aminici sunt fosfolipide
predominante în creier, plămâni și mușchii scheletici. În
ultimele două decenii a crescut interesul asupra studiului
acestor compuși datorită rolului biologic pe care îl au
aceștia și posibilității asocierii cu diferite boli. Astfel, s-a
constatat faptul că nivelurile reduse de plasmalogeni, de
tip etanol aminic, din plasmă, pot fi asociate cu boala
Alzheimer, bolile cardiovasculare, hipertensiune, cancer și
bolile respiratorii.
Figura 4. Structura plasmalogenilor

Sfingolipidele sunt derivaţi de sfingozină (amino-

alcool cu 18 atomi de carbon, Figura 5) şi sunt abundente în ţesutul nervos. În general
acest tip de lipide se concentrează în partea exterioară a membranei plasmatice. Derivaţii
N-acil-sfingozinici sunt cunoscuţi sub numele de ceramide.
În urma ataşării restului acil la gruparea amino a sfingozinei se formează o
legătură amidică care este rezistentă la hidroliză în soluţie alcalină, iar pe baza acestei
proprietăţi pot fi diferenţiaţi de acil-gliceroli care au legături esterice.

3
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Figura 5. Structurile sfingozinei și a ceramidelor derivate

Există 3 tipuri de ceramide:
a) Sfingomielinele sunt ceramide care au o grupare fosfocolinică (sau fosfoetanol-
aminică). Acestea constituie 10-20% din totalul lipidelor membranei celulare.
Sfingomielinele (Figura 6) sunt componente ale membranei mielinice (care înconjoară
axonii celulelor nervoase).
Boala Niemann-Pick (NPD) este o tulburare de stocare a lipidelor ca urmare a deficienței
unei enzime lizozomale numită sfingomielinază acidă. NPD de tip A, care este o
tulburare fatală ce apare în copilărie și este caracterizată de hepatosplenomegalie și
probleme neurodegenerative, progresive, cauze care conduc la deces la vârste fragede (de
2-3 ani).

b) Cerebrozidele sunt glicofosfolipide

(ceramide) ce conţin o monohexoză
(glucoză sau galactoză, Figura 7) legată
prin intermediul unei legături 1-O--
glicozidice de o grupare alcoolică
primară a N-acil-sfingozinei (N-
sfingoid). În plante monozaharida este
de regulă glucoza, iar în animale acest zahar Figura 6. Structura sfingomielinei
este galactoza (în creier), deşi acest rest poate
varia în funcţie de ţesut, glucoza fiind prezentă în cerebrozidele din sânge. În plante
sfingoidul este de obicei fitosfingozina, în animale sfingozina sau dihidrosfingozina
(sfinganina). Cerebrozidele conţin frecvent cantităţi însemnate de acizi graşi cu catenă
lungă (acidul behenic-22:0, lignoceric-24:0, nervonic-24:1 sau 2-hidroxi-acizi graşi
cum ar fi acizii 2-hidroxi-nervonic şi -hidroxi cerebronic 24:0). Sinteza
cerebrozidelor presupune acilarea psihozinei sau transferul glucozei sau galactozei la o
molecula de ceramidă.
Lipidele din porumb pot fi extrase folosind solvenți organici în scopul utilizării în
industria cosmetică. Glicozil-sfingolipidele sunt în particular folosite în produsele
dedicate hidratării pielii.

4
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Figura 7. Structura de bază a cerebrozidelor și gangliozidelor

derivate de la ceramide

În boala Gaucher, cantități anormale de cerebrozide se acumulează în ganglionii

limfatici, ficat, splină și măduvă osoasă. Enzima defectă este glucocerebrozidaza.
Excesul de lipide, stocate în celule Gaucher dilatate este tipic bolii, interferă cu funcția
acestor celule și se manifestă sub forma a două sindroame distincte:
(i) o formă cerebrală acută afectează în principal copiii, care aparent sunt normali la
naștere, dar în curând devin apatici și retardați; extinderea abdomenului lor este
urmată de simptome severe ale sistemului nervos, iar decesul survine în primului an de
viață.
(ii) o formă mai cronică, care poate deveni evidentă la orice vârstă, se caracterizează
printr-o extindere a splinei, prin anemie, și printr-o pigmentare maro inconsistentă a
pielii; forma oaselor prezintă modificări caracteristice, și interferențele cu procesul de
calcifiere pot conduce la fracturi și deformări osoase.
c) Gangliozidele sunt ceramide care au ataşate oligozaharide (ce conţin şi resturi de acid
sialic, asemeni glicoproteinelor, Figura 8). Glicolipidele cu o moleculă de acid sialic
sunt numite monosialogangliozide (indice M), iar cele cu două molecule de acid sialic
sunt numite disialogangliozide (D). Gangliozidele (cunoscute - aproximativ 60) sunt
în principal componenţi ai membranei celulare şi constituie 6% din lipidele creierului.
GM1, GD1a şi GD2a sunt principalele gangliozide din creier. Gangliozidele sunt
receptori pentru proteine toxice (toxinele holerică, tetanusului sau botulinică).

Figura 8. Rest de oligozaharid din

monosialogangliozida GM2
Glc = glucoza
Gal = galactoza
GalNAc = N acetil-galactozamida
Neu5Ac = N-acetil-neuraminidat (acidul sialic)

5
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Sterolii au roluri fiziologice importante

Sterolii sunt substanţe comune localizate în
membrana organismelor eucariote, unde aceştia joacă
un rol important în asigurarea stabilităţii acestora.
Sterolii sunt mai puţin întâlniți în membranele
procariotelor.
Colesterolul este cel mai cunoscut sterol
deoarece acest compus poate fi asociat cu ateroscleroza.
În plante şi alge se află în cantitate apreciabilă
sitosterolul (70%) şi stigmasterolul (20%).
Figura 9. Tipuri de nuclee din moleculele
sterolilor
Drojdiile acumulează o cantitate mare de steroli (peste 10% din masa uscată), în
timp ce ficomicetele (ciupercile parazite inferioare) conţin exclusiv ergosterol. Acest tip
de sterol este majoritar şi în alte drojdii sau ciuperci. Moleculele acestor steroli posedă un
element structural comun – trei nuclee de șase atomi de carbon condensate (ciclurile A, B
şi C) la este ataşat un nucleu de ciclopentan (ciclul D, Figura 9).

Colesterolul liber constituie o componentă majoră a membranelor celulelor

animale (reprezintă un procent de 30-40% din totalul lipidelor) şi a lipoproteinelor din
plasma sangvină. Datorită grupării –OH colesterolul are un caracter amfifilic moderat.
Prezenţa celor patru nuclee conferă colesterolului o rigiditate crescută comparativ cu
celelalte lipide. În glandele cortico-suprarenale colesterolul participă la sinteza
hormonilor steroidici (glucocorticoide, aldosterone şi androgeni sau estrogeni).
Colesterolul (Figura 10) poate fi de asemenea esterificat cu acizii graşi. În forma
esterificată este depozitat în citoplasma celulelor sau poate circula în sânge (în
componenţa lipoproteinelor). În contrast, în creier şi alte ţesuturi nervoase, unde
colesterolul este o componentă a membranei mielinice, cantitatea de colesterol esterificat
este foarte mică.
Ateroscleroza este un termen general folosit pentru o serie de boli care cauzează
subțierea sau pierderea elasticității peretelui arterial. Unele dintre formele cele mai
comune și grave ale aterosclerozei sunt bolile coronariene și cerebrovasculare. În
ateroscleroză apar plăci nedorite (ateroame) la nivelul arterelor medii și mari. Aceste
depuneri conțin lipide, celule inflamatorii, celule musculare netede și țesut conjunctiv.
Dintre factorii de risc asociați cu ateroscleroza menționăm: dislipidemia (modificare, în
exces sau în deficit, a concentrației lipidelor sangvine), diabetul, fumatul, istoricul
familial, stilul de viață sedentar, obezitatea și/sau hipertensiunea.
LDL și HDL sunt complecși lipoproteici care au tendința de a avea un “miez”
care conține un amestec de triacilgliceroli, esteri ai colesterolului și un monostrat format
din fosfolipide, colesterol liber (neesterificat) și proteine specifice (LDL conține
apolipoproteina B-100 sau ApoB-100, iar HDL conține apolipoproteinele ApoA-1,
ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-1, ApoC-3 și ApoE). În funcție de raportul proteine:lipide și
de conținutul de lipide se disting mai multe tipuri de lipoproteine. LDL sau așa-numitul
colesterolul “rău” (eng LDL-Low-density lipoprotein) are un procent mai mare de
colesterol, iar HDL (eng HDL-High-density lipoprotein) un raport proteine:lipide mai
mare și procente mai mici de colesterol și triacil gliceroli. Complexul HDL-ului este

6
 Biochimie - Curs 13 - 2022

asamblat începând cu lipidarea proteinei ApoA-1 care permite acceptarea altor lipide și
transportul colesterolului din țesuturi sau de la alte tipuri de lipoproteine spre ficat. LDL
are funcții similare cu HDL, în sensul că transportă lipidele la celule (nehepatice).
Întrunul din contextele mai sus menționate (vezi factorii de risc ai aterosclerozei) LDL
poate participa la formarea de plăci (și alte toxine pot cauza degradarea pereților arteriali)
și în consecință la obstrucționarea arterelor.

Figura 10. Tipuri de steroli din membranele celulare

Figura 11. Glicozida a ergosterolului

Gruparea –OH din poziţia 3 a sterolului poate forma o legătură O-glicozidică cu gruparea
-OH din poziţia 1 a unei hexoze (de obicei glucoză, Figura 11). Glicozidele steolilor sunt
răspândite în plante sau alge. Mai mult, hidroxilul din poziţia 6 a hexozei respective poate
fi esterificat cu acizi graşi în scopul producerii sterol glicozidelor acilate.

7
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Colesterolul poate fi transformat în acizi biliari

(primari sau conjugaţi cu taurina sau glicina, la
nivelul ficatului, cu ajutorul enzimelor din
peroxizomi), acizi care sunt secretaţi în căile
biliare, unde intră în componenţa bilei (sub forma
de săruri). Emulsifierea grăsimilor este posibilă
prin formarea de micele ce au în componență
alături de acizi biliari și lecitină.
Figura 12. Strucura acidului taurocolic

De exemplu, acidul taurocolic permite absorbţia mai eficientă a colesterolului.

Ergosterolul este un precursor al vitaminei D2.
Această moleculă este întâlnită în plante şi drojdii. În
cazul în care ergosterolul este iradiat cu lumină
ultraviolet (UV) rezultă vitamina D2, prin deschiderea
ciclului B, compus cu proprietăţi antirahitice.
Plantele, drojdiile şi ciupercile conţin şi alţi
steroli. Glucocorticoizii naturali sau sintetici (cortizolul,
corticosterona, dexametazona, betametazona etc) influen-
ţează metabolismul carbohidraţilor, proteinelor şi
lipidelor și implicit o varietate largă de funcţii vitale, Figura 13. Structura cortizolului
incluzând reacţiile inflamatorii şi capacitatea de a face faţă
stresului. Glucocorticoizii sunt sintetizaţi în zona fasciculară a cortexului suprarenal.
Cortizolul are rol în reglarea nivelului glucozei sangvine (stimulează gluconeogeneza)
dar și în procesele antiinflamatorii și imunosupresive (reglează sistemul imunitar) sau
reglarea tensiunii arteriale.
Aldosteronul este un hormon care intră în componența sistemului renina – angiotensina –
aldosteron implicat în homeostazia sodiului și potasiului precum și în menținerea
tensiunii arteriale. Aldosteronul acționează la nivelul tubilor distal și colector ai
nefronului stimulând reabsorbția sodiului și excreția potasiului respectiv a ionilor de
hidrogen.
Acizii nucleici
Variantele structurale ale ADN-ului
ADN-ul este un polimer care are două lanţuri de
deoxinucleotide, molecule care sunt legate prin legături
fosfodiesterice. Cea mai cunoscută formă a ADN-ului este aceea
a B-ADN-ului, care are trăsăturile structurale a ADN-ului
descris de J. Watson şi F. Crick, împreună cu R. Franklin şi
colaboratorii acesteia:
1. Cele două lanţuri antiparalele sunt rotite spre dreapta în
jurul unei axe comune rezultând o structură elicoidală al
cărei diametru este de aproximativ 20 Å.
2. Planele formate de bazele nucleotidice, care formează Figura 14. Interacțiuni între bazele
perechi de legături de hidrogen, sunt aproximativ nucleotidice din lanțurile
ADN-ului dublu-catenar
8
 Biochimie - Curs 13 - 2022

perpendiculare pe axa centrală a helixului. În B-ADN, bazele ocupă ”miezul”

helixului iar resturile de fosfozaharid se regăsesc în afara acestuia, formând adâncituri
majore sau minore. Doar porţiuni mici din perechile de baze sunt expuse spre
exterior.
3. Fiecare pereche de baze are aproximativ aceeaşi înclinaţie, ceea ce conferă o simetrie
moleculei de ADN. Perechile de baze A-T şi G-C (Figura 14) pot fi interschimbabile
fără să afecteze poziţia resturilor de zahar din afara helixului. Guanina formează 3
legături de hidrogen cu citozina, iar adenina 2 legături de hidrogen cu timina. Alte
perechi de baze perturbă semnificativ dispunerea de tip bielicoidal.
4. B-ADN helixul are 10 perechi de baze (eng. “base pairs” = bp) pentru o rotaţie
completă şi pasul de 34 Å.
Flexibilitatea conformaţională a ADN-ului este limitată
Conformaţia unei unităţi de nucleotidă indică prezenţa a 6 unghiuri de torsiune
pentru partea de fosfo-zahar şi un unghi de torsiune atribuit legăturii glicozidice. Rotaţia
în jurul legăturii glicozidice este impiedicată. Rezidurile purinice posedă două
conformaţii, sin şi anti, ultima dintre acestea fiind mai stabilă (Figura 15). În marea majo-
ritate a acizilor nucleici, toate bazele adoptă conformaţia anti. Numai în cazul Z-ADN-
ului apar resturi de purină şi pirimidină a căror conformaţie alternează (anti și sin).
Conformaţiile plic ale ribozei sunt
esenţiale în acizii nucleici, determinând
orientarea relativă a substituienţilor fosfat la
fiecare rest de riboză. În B-ADN
conformaţia este C2’-endo, pe când în A-
ADN conformaţia este C3’-endo. În schimb
în nucleotidele purinice din Z-ADN au
conformaţia de tip 3’-endo iar nucleotidele
pirimidice au conformaţia 2’-endo.

Figura 15. Conformerii sin și anti ai adenozinei

diferă prin rotația în jurul legăturii N-glicozidice

Proprietăţile ADN-ului în soluţie

Moleculele de ADN de diferite dimensiuni pot fi studiate prin diverse metode
fizico-chimice. Dimensiunile genomului bacteriofagilor și virușilor variază de la câteva
mii de baze (kilobaze) la câteva sute de kilobaze. Genomul bacterian poate varia de la 0,5
Mb la 10 Mb. Genomul eucariotelor este divers și variază de la aproximativ 10 Mb în
unele ciuperci la mai mult de 100000 Mb în anumite plante.
Proprietăţile acido-bazice
Grupările fosfat din legăturile diesterice ale ADN-ului, care se repetă periodic în
fiecare nucleotidă, au valori scăzute ale pKa-ului şi din acest motiv sunt ionizate în
condiții de pH care depășesc valoarea 4, fapt care conferă ADN-ului un caracter acid.
Grupările fosfat sunt orientate spre exteriorul dublu-helixului şi pot fi interacţiona cu
moleculele de apă, ioni divalenţi (Ca2+, Mg2+) sau amine policationice (spermidina şi
spermina-sunt asociate cu moleculele de ADN virale sau bacteriene). Stabilitatea

9
 Biochimie - Curs 13 - 2022

legăturilor de hidrogen din perechile de baze din ADN depinde de gradul de ionizare al
grupărilor amino.
Viscozitatea
Rigiditatea şi lungimea apreciabilă a lanţului conferă ADN-ului o viscozitate
apreciabilă. Măsurătorile de viscozitate sunt folosite pentru a urmări gradul de denaturare
al ADN-ului şi implicit gradul de împachetare al duplexului.
Coeficientul de sedimentare
Coeficientul de sedimentare şi masa moleculară a tipurilor de ADN pot fi deter-
minate prin ultracentrifugare. Masa moleculară a ADN-ului poate fi determinată prin
compararea vitezei de sedimentare într-un gradient de densitate de zaharoză cu o probă
de ADN cu dimensiuni şi coeficient de sedimentare determinate în prealabil.
Sedimentarea la echilibru în gradient de CsCl este folosită pentru determinarea
densităţii de plutire a ADN-ului. Moleculele de ADN se concentrează într-o banda stabilă
la nivelul care densitatea de plutire este egală cu densitatea CsCl din acea zonă.
Proteinele prezintă o densitate mai mică față de ADN-ul cromozomial care la rândul său
decât are o densitate mai mică decât ADN-ul dublu-catenar (superîmpachetat). ARN-ul
poate fi diferenţiat de ADN (mono sau bicatenar) prin faptul că primul are o densitate mai
mare. Densitatea de plutire a ADN-ului poate furniza
informaţii referitoare la ponderea perechilor G-C şi
A-T din moleculă. Mai mult, ADN-urile virale
intacte, omogene, prezintă benzi înguste, în timp ce
fragmentele heterogene de ADN din celulele
eucariotelor apar sub forma unor benzi (grupuri de
benzi) mai largi.

Denaturarea și renaturarea
În cazul în care o soluţie care conţine duplex-
ADN-ul este încălzită peste o anumită temperatură,
structura nativă a acestuia este alterată rezultând
separat cele două lanţuri complementare care au
conformaţii aleatorii (Figura 16). Astfel procesul de
denaturare este însoţit de schimbări calitative în Figura 16. Denaturarea (desfacerea)
cazul proprietăţilor fizice ale ADN-ului ADN-ului dublu-catenar în mono-catenar
(modificarea viscozităţii şi creşterea absorbanţei în
UV în cazul formei denaturate). Denaturarea ADN-ului este un fenomen cooperativ în
care alterările dintr-o parte a moleculei destabilizează celelalte legături (dintre cele două
lanţuri rămase). Această denaturare are loc într-un interval îngust de temperatură.
Mijlocul acestui interval este cunoscut sub denumirea de temperatură de topire, Tm (m =
eng. melting-topire). Stabilitatea ADN-ului dublu catenar (ilustrată de Tm) depinde de o
serie de factori: natura solventului, tăria ionică, conţinutul de perechi G-C (care conţin o
legătură de hidrogen suplimentară în comparaţie cu perechea A-T) sau de pH.
În 1960, J. Marmur a arătat faptul că ADN-ul denaturat poate fi renaturat (să
revină la starea iniţială) în condiţiile în care temperatura este menţinută cu 25 mai jos
decât Tm.

10
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Perechile de baze ale ADN-ului

Figura 17. Tipuri de perechi de baze

Interacțiunea între bazele nucleotidelor constituie un factor cheie în cazul

“realipirii” celor două lanţuri din acizii nucleici. În cazul modelului propus de Watson și
Crick aceste perechi de baze se formează între oligonucleotide complementare. Există
însă şi situaţii diferite. De exemplu, perechea de baze A-T poate avea atomul de azot din
poziția 7 (perechea Hoogsteen, Figura 17) drept acceptor şi nu cel din poziția 1 care
corespunde situaţiei clasice (modelului Watson-Crick). Oricum, măsurătorile experimen-
tale au arătat faptul că numai perechile de baze Watson-Crick au o stabilitate mai mare
față de celelalte perechi. Există şi situaţii diferite în care segmentele ce se împachetează
dublu-elicoidal, din diverse ARN-uri, conţin perechi de baze de tipul G-U care au rol în
stabilizarea structurii terţiare a acestora.
Interacţiunile de tip van der Waals
Purinele şi pirimidinele din interiorul structurii dublu elicoidale au tendinţa de a
se orienta într-o manieră paralelă prin intermediul interacţiunilor de tip van der Waals
(interacţiuni electronice de tip -) sau hidrofobe. Aceste interacţiuni contribuie în mod
esenţial la stabilizarea structurii ADN-ului.
Interacţiunile ionice
Interacţiunile electrostatice care au loc între grupările fosfat trebuie considerate,
alături de legăturile de hidrogen şi interacţiunile hidrofobe din acizii nucleici, factori care
contribuie la stabilizarea structurii acizilor nucleici. De exemplu, Tm a duplex-ADNului
creşte dacă concentraţia ionilor de Na+ este mărită. Acest fapt se datorează intercalării
acestor ioni între grupările fosfat. Analog ionii divalenţi, Mg2+, Mn2+ şi Co2+ se leagă
specific de grupările fosfat şi astfel constituie agenţi de protecţie a acizilor nucleici. Ionii
de Mg2+ joacă de asemenea un rol esenţial în stabilizarea structurilor complexe adoptate
de diverse molecule de ARN.

Reacția de polimerizare în lanț (PCR-The polymerase chain reaction)

Geneticienii au înțeles faptul că sunt necesare mai multe componente pentru a
realiza replicarea ADN-ului. În acest scop este nevoie de enzimă denumită ADN
polimeraza și de deoxinucleotide care constituie “cărămizile” de bază ale ADN-ului.
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este o reacție enzimatică de amplificare
mediată de primeri (secvențe scurte de ADN) specifici(e) secvențelor de ADN genomic
sau clonat. Metoda PCR a fost inventată de Kary Mullis în 1983 și implică utilizarea unor
primeri (a căror lungime este de obicei 20-25 pb) și a unei ADN polimeraze termostabile,

11
 Biochimie - Curs 13 - 2022

cele mai utilizate fiind Taq, Pfu sau Pwo polimeraza. ADN-ul matriță conține secvența
țintă, care poate avea de la zeci la zeci de mii de nucleotide lungime. Tehnica PCR
standard realizează amplificarea unei singure secvențe de ADN care are o lungime de cel
puțin 5 kb (5000 de baze). Long PCR este tehnica prin care se pot “amplifica” fragmente
mai lungi de ADN (de până la 40 kb). A treia variantă de PCR, multiplex, este utilizată
pentru amplificarea unor secvențe multiple care au o lungime sub 5 kb. Taq polimeraza
catalizează reacția într-un sistem tampon, în care există un exces de perechi de primeri și
cele patru fosfat-deoxinucleotide (dNTP), generându-se astfel milioane de copii ale
secvenței țintă. PCR poate fi utilizat și pentru amplificarea secvenței de ARN, care
trebuie convertită inițial în ADN de enzima transcriptaza inversă. Spre deosebire de
ADN trebuie luată în considerare instabilitatea și susceptibilitatea ARN-ului la degradare.
ADN-ul utilizat ca matriță pentru PCR poate proveni din diferite surse: sânge
liofilizat, salivă, țesut parafinat sau păr. De asemenea reacția PCR poate fi utilizată pentru
amplificarea ADN-ului din materiale degradate: mumii sau fosile.
Replicarea ADNului in vitro - reactia PCR
Reacția PCR este constituită din serii de trei pași esențiali care definesc un ciclu
PCR: denaturarea ADN-ului matriță dublu catenar, alinierea perechilor de primeri la
matrițele de ADN monocatenar și extinderea enzimatică a primerilor, prin care se produc
copii care servesc drept matrițe în ciclurile ulterioare. ADN-ul matriță este suspendat într-
un amestec alcătuit din apă distilată sterilizată (fără ARN), soluție tampon (ce conține
clorura de magneziu), polimeraza (Taq, Pfu sau Pwo polimeraza respectiv un amestec de
polimeraze) și cele patru dNTP. De asemenea există o pereche de primeri
(oligonucleotide) a căror secvențe sunt complementare cu cele ale ADN-ului care
flanchează regiunea țintă.
Pentru construirea primerilor se iau în considerare următoarele criterii:
- trebuie să aibă un conținut de baze în jur de 50% GC;
- lungimea trebuie sa fie între 15-30 pb;
- cei doi primeri trebuie să nu formeze duplexuri între ei;
- trebuie evitați primerii care conțin bucle;
- capătul 3’ trebuie să prezinte o complementaritate perfectă cu a ADN-ului țintă;
- temperatura de aliniere a primerilor sa fie între 50-64 ºC;
- temperatura la care jumătate din molecule sunt monocatenare și cealaltă jumă-
tate bicatenare este temperatura de topire (Tm). Temperatura de topire poate fi
aproximată după formula:
Tm = 2 • (număr de baze A/T) + 4 • (număr de baze C/G)
Temperatura de aliniere a primerilor este de obicei aleasă cu 5 ºC mai scăzută
decât temperatura de topire a ADN-ului. Din acest motiv este foarte importantă alegerea
temperaturii de topire a celor doi primeri.
Amestecul de reacție este mai întâi încălzit la temperatura de 94 ºC pentru
denaturarea (separarea) celor două catene de ADN (Figura 18) și apoi răcit la o
temperatură optimă care facilitează alinierea primerilor (alipirea acestora la secvența de
ADN).

12
 Biochimie - Curs 13 - 2022

Figura 18. Etapele reacției PCR

Primerii sunt orientați unul în amonte și unul în aval față de regiunea ce urmează
a fi amplificată, ambii cu capătul 3’ spre interiorul secvenței țintă. Poziția relativă a
regiunilor complementare ale acestor primeri determină lungimea secvenței de ADN care
va fi copiată.
În timpul extinderii primerilor ADN polimeraza adaugă progresiv dNTP-urile
complementar cu secvența matriță (de copiat), la capătul 3’ al fiecărui primer, generându-
se asftel o nouă copie. Astfel prin cicluri repetate de răcire și încălzire se poate forma o
cantitate semnificativă de ADN a cărui secvență este identică cu aceea a ADN-ului
matriță. Rezultatul, după 20 de cicluri de amplificare, este producerea a 220 (peste un
milion) copii ale ADN-ului matriță.
Inițial exista un impediment legat de stabilitatea polimerazei care era utilizată la
replicarea ADN-ului. Enzima respectivă se degrada în momentul încălzirii amestecului la
temperatură optimă neceară pentru separara lanțurilor ADN-ului dublu-catenar. Din
fericire, biologii au extras diverse polimeraze din bacterii termofile, care trăiau în medii
la temperaturi extreme. Prin această strategie s-au izolat polimeraze rezistente la
temperaturi mari. Taq polimeraza este o polimerază termostabilă care a fost extrasă din
bacteria Termus acvaticus (bacterie care trăiește în izvoarele calde). Unul dintre
dezavantajele folosirii Taq polimerazei este acela al fidelității scăzute (o eroare de
copiere la aproximativ 9000 de nucleotide), fapt datorat lipsei activității exonucleazice. În

13
 Biochimie - Curs 13 - 2022

schimb Pfu polimeraza, o polimerază termostabilă (enzima care are în componență

tungsten) numită după specia hipertermofilă anaerobă Pyrococcus furiosus (acest
organism se dezvoltă la temperaturi de 100 ºC), posedă și activitate de verificare a
corectitudinii polimerizării realizând astfel o amplificare cu o acuratețe ridicată a
secvenței ADN dorite. Pwo polimeraza a fost izolată din archeobacteria hipertermofilă
Pyrococcus woesei.
Cele aproximativ 30 de cicluri sunt realizate într-un aparat optimizat să oscileze
temperatura pe diferite intervale de timp, numit thermal cycler. Numărul de cicluri PCR
trebuie optimizat în funcție de numărul de copii țintă dorit. Pornindu-se de la o singură
copie, cea mai eficientă reacție de PCR atinge în câteva ore un platou după 40 de cicluri
de amplificare. Acest proces este denumit PCR deoarece în decursul fiecărui ciclu
cantitatea de ADN se dublează. Mărimea fragmentului de ADN copiat rezultat în urma
PCR este controlată prin intermediul unei tehnici de separare numită electroforeză în
geluri de agaroză.
Aplicații ale tehnicii PCR
Pe lângă posibilitatea stabilirii unor relații de rudenie, aplicațiile metodei PCR
sunt diverse:
- în criminalistică;
- manipularea genetică;
- detecția HIV (ADN-ul este izolat din celulele roșii și amplificat cu primeri
corespunzători secvențelor HIV);
- detecția infecțiilor viale (utilizarea RT-PCR pentru SARS-Cov-2 unde RT
reprezintă transcriptaza inversă)
- diagnosticarea prenatală a bolilor genetice.

14