CAPITOLUL XII 12.1 MICROPROPAGAREA SPECIILOR HORTICOLE, ORNAMENTALE I FORESTIERE 12.1.

1 Micropropagarea la crizanteme (Chrisanthemum morifolium)

Introducere Crizantemele (Dendranthema grandiflora Tzelev, sinonim cu Crysanthemum morifolium Robat) fac parte din cea mai rspndit specie floricol cultivat att pentru mpodobirea spaiilor verzi ct i pentru utilizarea lor ca plante ornamentale n ghivece sau flori tiate. Crizantemele, cu originea n Orientul ndeprtat, fac acum parte din culturile cele mai importante n multe ri ale lumii. Majoritatea, din cele cteva sute de cultivare, este propagat comercial prin butire convenional, dar multe dintre cultivare au fost micropropagate cu succes prin tehnica de lstrire adventiv (organogenez), din variate tipuri de esut i prin cultur de calus. Unele protocoale de regenerare pot fi folosite pentru obinerea de plante libere de virusuri (cultura de meristeme) la majoritatea cultivarelor, pentru obinerea unui numr mare de plante n timp scurt la plantele elit, pentru nlturarea mutaiilor induse chimic sau fizic i n transformrile genetice n scopul obinerii unui nou colorit al florii sau pentru inducerea rezistenei la boli. Crizantemele pot fi folosite pentru a demonstra funcionarea mai multor tehnologii i concepte n protocoalele de regenerare bazate pe organogeneza direct. Pregtirea materialului vegetal donor Materialul biologic necesar n realizarea unei culturi de esuturi poate fi achiziionat sub form de butai ce vor fi cultivai n ghivece de plastic de aproximativ 10 cm diametru, pentru nrdcinare, cu cca 3 sptmni nainte de nceperea experimentului. Se recomand luarea n cultur a ct mai multor soiuri pentru a reui observarea diferenelor ce apar ntre genotipuri n ceea ce privete capacitatea de regenerare n cultura in vitro. Condiiile de cretere a plantelor donor prezint o mare importan de aceea se recomand cultivarea acestora fie n camere de cretere fie n sere iluminate cu becuri fluorescente incandescente ntr-un regim de fotoperiodism 195

de 16 ore lumin, la o temperatur de 22-25 oC. n cazul n care plantele sunt cultivate primvara sau toamna se va suplimenta iluminarea pentru a asigura condiii de zi lung, ce vor inhiba nflorirea plantelor. Se recomand prelevarea vrfurilor principale de cretere (folosirea lor ca surs nou de butai) pentru inducerea ramificrii secundare i producerea de frunze tinere. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Pentru realizarea unor rezultate notabile, se recomand selectarea, pentru realizarea explantelor doar a frunzelor tinere, parial dezvoltate, de culoare verde deschis, de 2-5 cm lungime. Se realizeaz sterilizarea frunzelor folosind 0,26% hipoclorit de sodiu, timp de 5-10 minute cu agitare continu, urmat de cltiri repetate n ap distilat steril. Se plaseaz cte o frunzuli cu parte superioar n sus, ntr-o cutie Petri steril i se elimin surplusul de ap prin rsturnarea vasului i apsarea cu finee a frunzuliei. Se poate folosi i hrtie de filtru steril pentru absorbirea surplusului de ap de la suprafaa frunzei. Partea superioar a fruzuliei se poate identifica uor datorit culorii mai nchise i a prezenei periorilor ntr-un numr mare. Se va fasona frunzulia, nlturndu-se marginile acesteia, folosind un bisturiu, izolndu-se fragmente de cca 0,5-1 cm2. Fragmentele rezultate vor fi plasate la suprafaa mediului de cultur cu suprafaa inferioar a frunzei n contact cu mediul. Mediul bazal de cultur este compus din srurile specifice mediul MS (1962), la care se adiioneaz 30 g/l (88mM) zaharoz, 1 g/l (0,55 mM) mioinozitol, 5mg/l (2,9 M) tiamin HCl i agar 8g/l, stabilindu-se un pH de 5,7. Stabilirea pH-ului se realizeaz nainte de adugarea agarului i de autoclavare, reglarea pH-ului fcndu-se, n funcie de caz, cu o baz sau un acid. Dup autoclavare (la 121 oC), timp de 23-30 minute (n funcie de volumul de mediu), mediul de cultur se repartizeaz n vase Petri sterile, n condiii aseptice, la hota cu flux de aer steril. Fitohormonii necesari vor fi adugai, n funcie de tipul de cultur dorit, dup autoclavare. 12.1.2 Micropropagarea la petunie (Petunia hybrida) Petunia hybrida Hort. Vilm-Andr. este petunia comun de grdin. Are un fond genetic complex alctuit din hibrizi provenii din trei sau patru specii de Petunie. Este considerat un cultigen deoarece este rezultatul ameliorrii artificiale i nu hibridrilor slbatice. Petunia este una dintre cele mai populare flori utilizat n organizarea ornamentelor stradale, n grdini sau parcuri. Se nmulete n special prin semine, dar la unele cultivare se poate realiza i nmulirea prin stoloni. Petunia face parte din familia Solanaceae. Multe dintre studiile realizate in vitro au fost efectuate pe specii aparinnd acestei familii, deoarece 196

regenereaz uor n condiii artificiale de cultur. Dintre membrii acestei familii de plante, petunia este cel mai receptiv la culturile in vitro,putnd regenera din antere, protoplati, hipocotile, cotiledoane, fragmente de tulpin, frunze i alte tipuri de esuturi i organe. Petunia este ideal n realizarea de exerciii n scop didactic deoarece rspunde cu uurin la cultura de esuturi, seminele fiind uor de obinut, pstrat i germinat. Lstarii cresc repede i pot fi utilizai ca surse de explante tot timpul anului. Petunia poate regenera in vitro att prin organogenez direct ct i prin organogenez indirect n funcie de balana hormonal utilizat. Organogeneza direct are loc atunci cnd lstarii se formeaz direct pe explantele inoculate pe mediu. Organogeneza indirect implic trecerea prin faza de calus, lstarii regenernd din celule de calus. n ambele cazuri, celulele generatoare de lstari trebuie s se ntoarc n stadiul meristematic. Celulele fiice, ce formeaz un meristem, devin gradat specializate i difereniaz n celule ce vor alctui organele unei noi plante. Balana hormonal influeneaz direcia n care va decurge diferenierea. Celulele specializate sau difereniate trebuie s devin mai puin specializate pentru a forma un meristem. Acest proces este invers procesului de difereniere i poart denumirea de dedifereniere. De aceea, celulele generatoare de lstari trebuie s dediferenieze nainte, pentru a fi capabile s reiniieze un proces regenerativ. Pregtirea materialului vegetal donor Rspunsul n cultura in vitro este genotip dependent, cultivare diferite vor genera rspunsuri diferite i vor avea necesiti variate n ceea ce privete balana hormonal pentru a fi capabile s induc neoformarea de plantule. Totui, marea majoritate a cultivarelor de petunie regenereaz prin formarea de lstari, fie adventivi fie prin lstrire axilar multipl. Se recomand luarea n cultur, n general, a cultivarelor de tipul Gradiflora, deoarece cele de culoare roie sunt recalcitrante la cultura in vitro. Cu aproximativ opt sptmni nainte de iniierea culturii de esuturi, seminele vor fi semnate n sere sau camere de cretere, n pmnt steril sau n perlit, n vase de vegetaie de aproximativ 10 cm n diametru, sau n ghivece dreptunghiulare. Seminele de petunie sunt de dimensiuni mici, de aceea, se recomand semnarea lor mai la suprafa. Se pot face nulee de aproximativ 1 cm adncime i semna la o densitate de 2 sau 3/cm liniar. Se recomand a nu se semna prea des deoarece vor rezulta plantule subiri, firave i greu de separat. Temperatura n camera de cretere trebuie s fie de aproximativ 2124oC, explantele foliare provenite de la plante crescute la temperaturi de 30 oC nu vor rspunde la cultura in vitro. 197

Se recomand executarea periodic de fertilizare cu azot, dup ncolirea seminelor. Irigarea se va face cel mai bine pe baz de capilaritate sau prin sistem de picurare la rdcin. O irigare prea abundent poate duce la contaminri fungice sau bacteriene la iniierea culturilor in vitro. Trebuie avut n vedere realizarea unui control strict asupra rspndirii musculiei albe de ser, care poate determina, de asemenea, infecii fungice sau bacteriene la iniierea culturii in vitro. Se recomand aplicarea de tratamente mpotriva musculiei albe de sere sptmnal sau ori de cte ori este necesar i folosirea, n cultura de celule, a unui echipament adecvat constituit din halate, bonete, mnui. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Recoltarea explantelor foliare se poate realiza pe toat durata formrii frunzelor pn la stadiul de nflorire. Se pot folosi i frunzele tinere de la plante nflorite, existnd ns pericolul contaminrilor fungice i bacteriene atunci cnd se iniiaz cultura de esuturi. Se evit prelevarea explantelor de la plantele crescute n aer liber deoarece acestea pot fi foarte contaminate, iar sterilizarea se execut cu dificultate. Mediul de cultur necesar este alctuit, n general, din elementele minerale ale mediul bazal MS, la care se adaug 3% zaharoz i 0,7 % agar, iar pH-ul mediului trebuie s fie 5,8. Dup autoclavare mediul de cultur se repartizeaz n vasele de cultur, fiecare vas fiind inoculat cu explante foliare. 12.1.3 Micropropagarea la violetele de Parma (Saintpaulia ionantha) Saintpaulia cunoscut cu denumirea popular de violete de Parma sau violete africane, este un gen ce cuprinde ase specii de plante erbacee perene, aparinnd familiei Gesneriaceae, ce provine din Tanzania i Kenya, cu cea mai mare concentraie de specii n munii Nguru din Tanzania. Acest gen se nrudete cel mai bie cu genul Streptocarpus. Numele lor vine de la asemnarea dintre florile acestui gen i cele ale genului Viola, familia Violaceae, adevratele violete (Darbyshire, 2006). Numele genului este dat dup baronul Walter von Saint Paul Illaire (1860-1910), un distins misionar, care a descoperit aceast planta n Tanzania n 1892 i i-a trimis semine tatlui su, un botanist nfocat, care tria n Germania. Genul Saintpaulia i specia S. ionantha, au fost prima dat descrise de J.C.Wendland n 1893. Violetele de Parma sunt plante cu o talie de 6-30 cm, cu frunzele de la rotunde la ovale, cu o lungime ntre 2,5-8,5cm i peiol de 2-10 cm, pubescente i textura crnoas, de culoare verde nchis, prezint de curnd i varieti cu frunze bicolore, verde nchis cu dungi albe, de forme i consistene diferite. Florile cu diametrul de 2-3 cm i o corol cu cinci petale lobate de culoare violet cresc n ciorchini de 3-10 sau chiar mai multe. Culoare florilor speciilor 198

slbatice poate varia de la violet, la purpuriu, albastru deschis, roz sau chiar alb, unele varieti fiind chiar bicolore. Sunt n general plante de interior, crescute n ghivece de dimensiuni mici, dar exist chiar i varieti agtoare, perfecte pentru ghivecele fixate pe ziduri sau perei. Multe dintre speciile i subspeciile genului Saintpaulia sunt pe cale de dispariie datorit reducerii habitatului lor natural n favoarea agriculturii (). Speciile genului Saintpaulia se preteaz cu uurin la multiplicarea in vitro, fiind una dintre plantele exemplu mai ales pentru sistemul de multiplicare prin organogenez direct, i anume, inducerea de muguri adventivi. n cadrul acestui sistem de multiplicare, se induce formarea mugurilor adventivi direct pe explantele inoculate (fragmente de limb foliar, fragmente de peiol, fragmente de tulpin), sau indirect n calusuri. Cea mai folosit n multiplicare este inducerea direct pe explante, deoarece parcurgerea fazei de calus presupune i inducerea variabilitii somaclonale. Pregtirea materialului vegetal donor Tehnica de multiplicare prin inducerea de muguri adventivi presupune parcurgerea mai multor etape astfel: iniierea culturilor, inducerea formrii mugurilor adventivi, creterea lstarilor pe acelai mediu, sau pe un mediu de alungire, nrdcinarea lstarilor pe un mediu cu auxin sau pe un mediu lipsit de fitohormoni. Plantele donor vor fi crescute n sere climatizate, nivelul potrivit al intensitii luminii este cel mai important factor de care trebuie inut cont n ngrijirea violetelor africane. Acestea au nevoie de lumin puternic, dar indirect. Ele cresc excelent i n lumina fluorescent a neonului. Un alt factor important este udatul. Violetele se ud imediat dup ce solul din ghiveci ncepe s se usuce. Acesta nu trebuie lsat s se usuce prea mult, i nici nu se va aduga ap n exces. Pentru a menine umiditatea la un nivel optim, ghivecele pot fi aezate n tvi pe fundul crora se pune un strat subire de pietri. Apa din sol se va scurge n tav, iar stratul de pietri va mpiedica rdcinile s stea direct n ap. Treptat, apa din stratul de pietri se va evapora meninnd astfel constant nivelul de umiditate. Apa de robinet se va ine 24 de ore ntr-un vas deschis, la temperatura camerei, nainte de a fi folosit la udarea plantei. n acest fel apa este adus la temperatura camerei, apa rece fiind duntoare plantelor. De asemenea, nivelul clorului coninut de apa de la robinet se reduce prin evaporare. Se fertilizeaz de dou ori pe lun cu un fertilizant solubil n ap. n comer se gsesc fertilizani speciali pentru aceast specie. Solul trebuie s fie un sol bogat n materie organic, i s asigure un bun drenaj al apei i o bun aerare a rdcinilor. Temperatura ntre 20-28oC este temperatura ideal pentru violetele africane. Se va evita supunerea plantelor la schimbri brute de 199

temperatur, sau la temperaturi extreme, chiar i pentru o perioada scurta de timp. O bun circulaie a aerului n ncperea n care sunt meninute ghivecele va preveni apariia unor boli precum mucegaiurile. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Ca material biologic se utilizeaz fragmente de limb i peiol de Saintpaulia ionantha. Se detaeaz limbul mpreun cu peiolul de pe o plant din ghiveci. Sterilizarea se face astfel: presterilizarea splarea n ap de robinet i imersie n alcool 70o timp de 20 secunde, sterilizarea n hipoclorit de calciu 5% timp de 12 minute i poststerilizarea prin cltiri repetate n ap distilat steril (5 cltiri). Mediul de cultur folosit pentru aceast tehnic de multiplicare este Murashige-Skoog (MS) cu diferite concentraii ale fitohormonilor. n general se urmrete ca raportul citochinin-auxin s fie favorabil citochininelor. n condiii sterile, la hota cu flux de aer steril, se pregtesc materialele necesare i vasele cu mediul de cultur pentru inducerea multiplicrii. ntr-o cutie Petri steril i utiliznd instrumentar steril se scot frunzele, din vasul utilizat la cltire i se detaeaz limbul de peiol. Fragmentarea limbului se face sub forma unor ptrate cu latura de 1 cm, iar peiolul sub forma unor fragmente cu lungimea de 1 cm . Inocularea se face cu partea inferioar pe mediu, n cazul fragmentelor de limb i paralel cu suprafaa mediului n cazul peiolului. Se izoleaz vasele cu parafilm i se incubeaz n camera de cretere n regim de fotoperioad, la 25oC. Apariia mugurilor adventivi, din care se vor forma lstari, se poate observa dup 14-16 zile de la inoculare. Dup 4-6 sptmni de la inoculare, lstarii formai se fragmenteaz, urmnd ca acetia s fie subcultivai fie pe acelai tip de mediu, pentru multiplicarea n continuare, fie pe mediu de cultur MS cu auxin sau fr hormoni, pentru nrdcinare. 12.1.4 Micropropagarea la orhidee (genul Cymbidium) Familia orhideelor este format din aproximativ 30.000 de specii, dar dac se iau n considerare i hibrizii pe care i au i dezvolt cultivatorii din toate colurile lumii, numrul orhideelor probabil c depete 200.000. Orhidee se gsesc pe fiecare continent n afar de Antarctica i exist specii endemice n fiecare col al lumii. Originare din zonele cu clima temperat i tropical din India, Nepal, China, Japonia i pn n Malaiezia i Australia, cymbidium sunt probabil cele mai mult cultivate orhidee; de asemenea, florile lor dureaz cel mai mult. Din cele 40-50 de specii s-au creat sute de hibrizi, cu flori de diferite culori, de la alb, galben i portocaliu, pn la rou, maro i verde; dimensiunile variaz de la 5 pn la 10 cm n diametru. 200

Orhideele Cymbidium apar pentru prima dat n scrieri n China i Japonia, n cntece populare chinezeti compuse nainte de perioada lui Confucius (551-479 Ch.). Prima lucrare scris despre orhidee a fost publicat n China n 1233 dCh i cuprindea descrierile a peste 22 specii de orhidee. Prima descriere sistematic i clasificare formal a genului a fost fcut de Olaf Swartz, n 1799. Prima orhidee cymbidium a fost adus n Anglia din China de ctre James Fothergill, n 1778, iar primul hibrid al acestei specii a fost cultivat n 1889. Numele Cymbidium provine din cuvntul grecesc kymbe, care nseamn barc i e legat de forma florii. Poate prea incredibil, dar nu mai mult de 7 sau 8 specii sunt "responsabile" de 90% din miile de hibrizi cymbidium care exist astzi. n perioada anilor 1930 i 1940, cei mai populari hibrizi erau cei creai n America, pentru ca n ani 1960 s domine cei din Marea Britanie. Cymbidium standard are frunzele lungi, subiri i drepte sau pendulare, de 50 cm sau mai mult n lungime; la hibrizii n miniatur frunzele sunt mai scurte i mai nguste. Florile apar la captul unor tulpini viguroase, fr frunze i multe dureaz pn la 2 luni, fie pe plant, fie ca flori tiate. De cnd Knudson (1946) a pus la punct o metod de cultur in vitro pentru inducerea germinrii seminelor de orhidee, cultura de esuturi in vitro a jucat un rol important i foarte semnificativ n cultivarea, nmulirea, ameliorarea i conservarea speciilor i hibrizilor acestei specii. Iniial, culturile in vitro aveau ca scop obinerea unui grad de germinare mai mare a seminelor ce cdeau din fructele mature ale speciilor sau hibrizilor de orhidee. Totui, pe la mijlocul secolului trecut s-a nceput recoltarea fructelor imature (verzi) i realizarea de culturi aseptice n ideea de a depi unele bariere de incompatibilitate i a produce astfel noi hibrizi. Odat ce Morel (1960) i Wimber (1963) au demonstrat aplicabilitatea culturilor de esuturi in vitro pentru obinerea unei multiplicri clonale rapide la orhidee, aceast tehnologie a nceput s fie aplicat cu succes pe scar industrial pentru a produce orhideele selecionate n scopuri comerciale. Obinerea de cantiti mari de plante de nalt calitate, realizarea de hibrizi noi, multiplicarea i conservarea germoplasmei sunt unele dintre beneficiile derivate din aplicarea acestor tehnici de cultur. Dei se consider c orhideele sunt plante uor de nmulit prin cultura in vitro, datorit numrului mare de lucrri tiinifice publicate pe aceast tem, atta timp ct familia Orchidaceae cuprinde peste 450 de genuri i 15.000 de specii i este extrem de heterozigotic, n urma culturii pe mediu aseptic se poate obine o varietate mare de rspunsuri. Mai mult, atta timp ct de la iniierea culturii de esuturi pn l maturitatea plantei obinute pot trece mai muli ani, datele asupra uniformitii, stabilitii i fidelitii transmiterii n descenden a informaiei genetice sunt foarte rare. 201

Pregtirea materialului vegetal donor Sterilizarea materialului donor se realizeaz n 2 sau 3 pai, folosind fie hipoclorit din comer, fie hipoclorit de sodiu n diferite concentraii (10-20%) pe perioade variabile de timp (15-20 minute) i Tween 20 (2-3 picturi/100ml), un detergent cu rolul permite creterea aderenei agentului de sterilizare la suprafaa materialului biologic. ndeprtarea agentului de sterilizare se face prin cltiri repetate n ap distilat steril. Dac materialul biologic donor este foarte contaminat, lstarii de la care se vor preleva explantele se in sub jet continuu de ap timp de 30 minute pn la 2 ore. Un tratament mai eficient, dar i mai dur, ce ar putea duce la necrozarea unora dintre explante, este imersia lstarilor donori n alcool etilic 70%, timp de 1 minut urmat de cltirea n ap distilat steril nainte de trecerea la sterilizarea propriu-zis cu agentul de sterilizare corespunztor. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Explantele sunt prelevate fie din lstari pornii n vegetaie, fie din inflorescene tinere, fie din frunze sau rdcini. De preferat sunt mugurii axilari i apicali ai lstarilor aflai n vegetaie provenii de la plante sntoase. Mugurii apicali conin meristemul apical plus 3-4 noduri cu frunzele adiacente. Explantele radiculare sunt constituite din 3-4 mm din vrful rdcinii. Se cunosc mai multe medii de cultur bazale utilizate n cultura orhideelor (Arditti, 1977), dar cele mai utilizate sunt mediul bazal Knudson C (Knudson, 1946) i Vacin-Went (Vacin i Went, 1949), ce au incorporat n compoziia mediului i aditivii organici i fitoregulatorii de cretere. Totui, de preferat este utilizarea mediului Vacin-Went la care se poate aduga lapte de cocos. Dac mediul este preparat cu atenie ajustarea pH-ului se va realiza cu uurin, stabilindu-se la valoarea optim de 4,8-5,0. Laptele de cocos (15% v/v) este adugat n mediu atunci cnd acesta este destinat iniierii i multiplicrii orhideelor. Atunci cnd se dorete nrdcinarea explantelor se pot aduga n mediu banane verzi omogenizate (50-100g/l). Zaharoza se adaug n concentraie mic sau deloc n mediile destinate iniierii i multiplicrii monopodiale a orhideelor i adugat n concentraii normale n mediile destinate proliferrii i nrdcinrii lstarilor. n cazul n care laptele de cocos nu este disponibil pentru a fi adugat n mediul de cultur se pot aduga ali fitoregulatori de cretere. Culturile aseptice vor fi incubate n regim de iluminare continu furnizat de lmpi de neon cu lumin rece la o temperatur de aproximativ 2528o. Se poate institui i un regim fotoperiodic de 16 ore lumin. Culturile lichide vor fi plasate fie pe agitatoare verticale, fie pe agitatoare orizontale. 202

Cymbidium face parte din orhideele cu cretere simpodial, cu dou axe de cretere: una orizontal care este nedeterminat i una vertical determinat i care se termin cu inflorescena. La speciile cu cretere simpodial cele mai optime sisteme de cultur in vitro sunt cultura de meristeme i lstrirea axilar multipl. 12.1.5 Micropropagarea la pin (Pinus silvestris L) Suprafeele destinate agriculturii, ct i cele destinate pdurilor, au descrescut rapid n ultimele decenii datorit creterii populaiei pe Terra i industrializrii masive. Aceast depreciere a pdurilor, foarte valoroase, a dus la apariia necesitii rempduririi, mai ales n zonele predispuse eroziunii i alunecrilor de teren, ceea ce implic creterea necesitii produciei de puiei sntoi, rezisteni la boli, ce vor constitui material biologic folosit pentru rempduriri. Gimnospermele, n special genul Pinus, sunt cele mai pretabile pentru renfiinarea zonelor mpdurite, datorit ciclului lor de via ndelungat i a polenizrii alogame, fiind pretabile att n zonele calde, subtropicale, ct i n zonele temperate. De aceea, micropropagarea in vitro a speciilor din genul Pinus au o semnificaie considerabil n obinerea rapid de material semincer sntos. Speciile genului Pinus acoper marea majoritate a zonelor colinare din numeroase ri, reprezentnd baza de cherestea i rin n industria lemnului. Cheresteaua este tot mai mult folosit n industria mobilei, pentru construcia cilor ferate, uilor, ferestrelor i producia de celuloz. Pinus roxburghii, un pin de esen tare i Pinus wallichiana, un pin de esen moale, sunt cele mai rspndite surse de cherestea. Din rinile uleioase ale unor specii din genul Pinus se extrag uleiuri folosite n diferite ramuri ale industriei, iar miezul seminelor unor specii nordice de Pinus sunt comestibile, constituind o surs important de calorii n sezonul rece. S-au realizat multe ncercri pentru micropropagarea speciilor genului Pinus, explantele de le care s-a pornit au fost constituite, n general, din embrioni imaturi, embrioni maturi sau embrioni deja germinai. Pregtirea materialului vegetal donor Materialul biologic poate fi constituit din vrfuri de cretere verzi, foarte tinere sau semine, ce vor constitui sursa de embrioni, imaturi, maturi sau germinai. Pentru sterilizare, vrfurile de cretere sunt imersate n alcool i flambate, urmate de incubare n H2O2 1% la 4oC timp de 24 de ore. Dup realizarea mai multor cltiri n ap distilat steril, vrfurile de cretere vor fi 203

tratate cu miostatin (10.000 uniti/ml), pentru 45 de minute. Se cltesc din nou foarte bine i se imerseaz n soluie de hipoclorit de sodiu 10% timp de 15 minute, urmat de imersie n clorur mercuric 0,1% timp de 5 minute i 2 minute imersie n etanol 70%. Dup cltirea final, n ap distilat steril, rmurelele de pin se decojesc i se fragmenteaz n segmente de 6-8 mm. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Fragmentele de vrfuri de cretere (lstari) se inoculeaz pe mediu MS cu mai multe variante hormonale, deoarece fiecare genotip poate da un rspuns diferit la cultura in vitro. Se recomand realizarea de combinaii ntre o auxin: 2,4D sau ANA i o citochinin: Kin sau BAP. Astfel, pentru obinerea de calus embriogen, fragmentele de lstari vor fi inoculate pe mediu MS cu 2,4D (45M) i Kin (23 M). Calusul va fi subcultivat pe mediu de germinare fr hormoni sau va constitui baza de pornire pentru realizarea de suspensii celulare. Pe aceast variant hormonal rezultatele vor putea fi observate n aproximativ trei sptmni. O alt variant hormonal ce ara putea fi folosit este constituit din ANA (2,5 nM) i BAP (20 M), ce va genera calus ntr-o perioada mai lung de timp. Calusul obinut va putea constitui rezerva de germoplasm, material biologic de pornire n realizarea unor suspensii celulare sau pentru regenerarea de plante noi prin embriogenez somatic sau chiar organogenez somatic, n funcie de rspunsul in vitro al genotipului cultivat. Seminele sunt sterilizate n soluie de hipoclorit de sodiu 10% timp de 15 minute, urmat de tratament cu miostatin (10.000 uniti/ml) i tetraciclin (10mg/ml) timp de 30 de minute cu agitare continu. Apoi sunt imersate n soluie de clorur mercuric 0,1% pentru 5 minute, urmat de imersie n etanol 70% pentru 2 minute. Post-sterilizarea const n efectuarea de cltiri repetate cu ap distilat steril (3-5 ori). Embrionii excizai vor fi inoculai pe mediu bazal MS, n poziie orizontal, mediu mbogit cu lapte de cocos (CM 0,1%), asparagin (650 M) i glutamin (650 M). De asemenea, se pot testa mai multe variante hormonale, n diferite concentraii, indivizi i/sau diferite combinaii. Pornind de la explante embrionare, fragmente cotiledonare sau de hipocotil, se pot obine, pe mediu MS adiionat cu asparagin (650 M), glutamin (650 M), ANA (0,5M), BAP (20 M) i lapte de cocos (1%), att calus din radicel, ct i lstari prin lstrire axilar multipl. Rezultatele vor putea fi observate dup aproximativ patru sptmni de cultur. nainte de autoclavare, se ajusteaz pH-ul mediului la 5,6 cu acid clorhidric sau hidroxid de sodiu, n funcie de caz. Autoclavarea se realizeaz la 121oC, 1atm, timp de 15-20 minute, n funcie de cantitatea de mediu din 204

recipient. Culturile sunt incubate n regim de fotoperiodism de 10 ore lumin (1600 luci) la o temperatur de 252oC i o umiditate relativ de 555%. 12.1.6 Micropropagarea la stejar (Quercus robur) Quercus robur L. este o specie divers, cu multe forme i varieti: dup forma frunzelor (glabra (God) Schur., pendula (Lasch) Schur, etc.); dup forma ghindei (brevipes (Heuff.) Beck, extensa Schur., perrobusta Borg., etc.) i dup atributele coroanei (fastigiata (Lam) Schur., pendula (Loud) DC). Arborele este de tipul I, cu valoare special datorat calitii lemnului, produciei mari i unei regenerri relativ uoare (Doni et al, 2004). Stejarul (Quercus robur), este un arbore din zona temperat, nalt de 15 20 m, cu ramuri puternice, noduroase, coroan larg i bogat. Scoara stejarului este de culoare brun-negricioas, aspr, adnc brzdat, adpostind adesea o micro-faun activ (n special furnici i anumite specii de gndaci). Frunzele sunt lobate, cu 4-8 perechi de lobi de culoare verde nchis. Peiolul este scurt (48 cm). Stejarul nflorete n luna mai. Fructul este achen (ghind). Se ntlnete mai ales la cmpie i n zonele colinare, foarte rar la deal. n afar de pdurile curate de stejar, numite stejrete, stejarul se gsete i n amestec cu alte foioase, n aa-numitele pduri de leau. Are pretenii moderate fa de umezeala din aer i din sol, prefer solurile profunde, permeabile, reavene, dar vegeteaz destul de bine i pe soluri compact argiloase. Suporta bine gerurile. Din punct de vedere ornamental este apreciat datorit formei piramidale a coroanei i a coloritului de toamn a frunzelor - maroniu glbui. Util n aliniamente pe marginea aleilor i drumurilor, poate fi plantat i izolat sau n biogrupe (3 - 5 buc.) n parcuri i grdini. Termenul stejar este probabil de origine tracic. n trecut lingvitii romni i-au atribuit, eronat, origine maghiar sau bulgreasc, ns Dimitrie Cantemir l menioneaz n Descrierea Moldovei ca fiind un cuvnt inexistent n maghiar sau bulgar. Principalele metode de micropropagare a stejarului pornesc de la semine, ceea ce rezult ntr-o surs important de variabilitate, necesar atunci cnd se dorete ameliorarea unei specii. Totui, posibilitile de reproducere generativ sunt limitate de durata lung de via a acestei specii, de necesitatea unei perioade lungi de timp pn la atingerea maturitii plantei, de calitatea i productivitatea sczut a seminelor i de depozitarea dificil a ghindelor. Seminele de stejar prezint diferite grade de recalcitran i pot fi pstrate o scurt perioad de timp datorit predispoziiei lor la deshidratare. n plus, metodele convenionale de nmulire vegetativ a arborilor maturi prin butire prezint dificulti n nrdcinarea lstarilor. Problemele aprute n nmulirea stejarului din material biologic juvenil sau matur ar putea fi rezolvate prin utilizarea tehnicilor in vitro. Micropropagarea in vitro pornind de la muguri dorminzi recoltai din arbori maturi prezint o mare importan mai ales pentru 205

obinerea de puiei n scop comercial, pentru nmulirea clonal a genotipurilor selecionate pentru calitatea lemnului i/sau pentru rezistena sau tolerana la boli i poluare (San-Jos i colab., 1988). Pregtirea materialului vegetal donor Embrionii imaturi sau maturi, ce vor constitui explantele pentru iniierea culturilor in vitro la stejar, se vor exciza din semine de stejar, recoltate nainte de maturizarea acestora, respectiv de cderea ghindelor (Palada-Nicolau, 2001). Ghindele se sterilizeaz prin imersie n alcool etilic 70%, timp de un minut, dup care se imerseaz n hipoclorit de sodiu 4-6% cu adaos de Tween 20 (1-2 picturi la 100ml), timp de 20 minute, procedur urmat de cltiri repetate cu ap distilat steril (5 reprize a cte trei minute fiecare). Dup sterilizare ghindele se vor seciona, n condiii aseptice, la hota cu flux de aer laminar steril, i se vor exciza embrionii ce vor fi inoculai pe medii aseptice. Embriogeneza somatic la stejar poate fi indus i din explante foliare provenite de la lstari epicormici. Pentru obinerea acestor lstari se preleveaz, n luna Martie, ramuri de stejar, de la un arbore matur, i se plaseaz pe un substrat steril, de obicei constituit din sol sau perlit. Segmentele de ramuri vor induce formarea de lstari din mugurii laterali existeni, iar din frunzele acestor lstari se vor fasona explante. Aceste explante, inoculate pe medii de cultur aseptice adiionate cu fitohormoni vor genera formarea de embrioni somatici. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Se pot utiliza ca explante embrioni zigotici imaturi triai pe 5 stadii de dezvoltare. Inducia embriogen are loc, n general, la nivelul cotiledoanelor, pe toat suprafaa acestora, n cazul explantelor reprezentate prin embrioni imaturi n stadiul I, respectiv predominant n zona bazal, la explantele mai avansate. Randamentele medii ale induciei embriogene, pe stadii, pot fi cuprinse ntre 10% i 63 %, cu variaii semnificative n funcie de stadiul de dezvoltare al embrionului zigotic imatur n momentul inoculrii, randamentul induciei scznd de la 65% la stadiul I, la sub 15% la stadiul III i la 0 - 13 % n stadiile IV i V. esuturile embriogene se subcultiv pe mediu P24 cu 0,5 - 0.2 mg/l BAP i pe mediu P24 fr fitohormoni, medii care s-au dovedit propice pentru multiplicarea esutului embriogen n condiiile conservrii capacitii embriogene pe timp ndelungat. Inducia embriogen poate fi predominant direct, realizndu-se mai ales la baza i pe suprafaa cotiledoanelor embrionilor zigotici imaturi. Conform observaiilor microscopice, embriogeneza direct are loc pe baza unor proliferri epiteliale n urma crora se organizeaz nodulii 206

embriogeni, care sunt n realitate embrioni n stadiul globular (Chalupa, 1988). Acetia evolueaz pn n stadiul cotiledonar precoce (cotiledoane translucide foliacee i clorotice) i se multiplic prin embriogenez adventiv repetitiv, formnd colonii de embrioni precotiledonari i cotiledonari, mai mult sau mai puin compacte. Aglomerrile embriogene se subcultiv pe mediu MS1/2 sau P24 cu 0,2 mg/l BAP, iar ntr-o faz mai avansat a stabilizrii, pe mediu fr fitohormoni. n acelai timp cu multiplicarea se va efectua i purificarea mecanic, prin eliminarea calusului neembriogen compact. Culturile embriogene de stejar, se prezint sub form de mici agregate de embrioni cotiledonari n diferite stadii de dezvoltare, n care embrionii sunt mai uor sau mai greu separabili. Pentru realizarea unei culturi permanente de linii embriogene se efectueaz lunar noi subculturi, pe mediu P24 lipsit de fitohormoni. La fiecare subcultur, embrionii somatici cotiledonari de peste 2-3 mm se izoleaz i triaz dup mrimea i consistena cotiledoanelor, cei mai avansai fiind trecui n condiii de maturare. La stejar, conversia embrionilor n plantule are loc cu un randament sczut fata de cel al germinrii. Atunci cnd se iniiaz cultura de embrioni din explante foliare se vor fasona fragmente ptrate cu latura de aproximativ 1 cm ce vor fi plasate pe mediu nutritiv cu faa inferioar la suprafaa mediului. nainte de fasonare i inoculare explantele se sterilizeaz prin imersie n alcool 70o timp de 10 secunde, urmat de imersie n hipoclorit de calciu 5% timp de 10 minute. nlturarea agentului de sterilizare se face prin cltiri repetate n ap distilat steril (5 cltiri). Explantele se vor inocula pe mediu GD (Gupta i Durzan, 1985) cu 10M/l 2,4-D i 2M/l BAP sau GD cu 5M/l ANA i 5M/l BAP. Vasele de cultur vor fi incubate n condiii controlate de temperatur (22-24oC), umiditate (70-75%) i lumin (fotoperioad 16 ore lumin). Iniierea culturilor in vitro din material biologic juvenil permite producerea unui numr mare de plante cu o vitalitate crescut la diverse genotipuri necesare pentru meninerea diversitii genetice n ecosistemele forestiere. Sursele poteniale de explante pentru iniierea unei culturi de esuturi la stejar ar putea fi constituite din embrioni zigotici maturi i imaturi. Culturile de embrioni zigotici reprezint cele mai practice i eficiente tehnici de micropropagare in vitro la stejar. Aceste tehnici permit evitarea avortului embrionilor zigotici rezultai n urma polenizrii libere sau controlate i, de asemenea, induc ieirea lor din starea de laten. 12.1.7 Micropropagarea la arborele de lalea (Liriodendron tulipifera) Arborele de lalea este un arbore originar din zona tropical i subtropical a Americii de Nord, unde reprezint unul dintre cei mai distinctivi 207

i valoroi arbori de esen tare i unde ajunge la 40-50m nlime. La noi n ar este cultivat ca arbore ornamental n parcuri i grdini. Este un arbore nalt, cu tulpina dreapt, cilindrica, bine legat cu scoara gri nchis. Coroana are forma ovoidal, cu frunze n form de lir, mari de 7 - 12 cm lungime au patru lobi dispui simetric, doi cate doi. Pe fa au culoarea verde lucitor, iar pe dos verzi deschis sau verzi albstrui. Toamna se coloreaz n galben - auriu. Periantul de culoare galben-verzuie are forma de lalea sau de crin (din grecescul leirion = crin i dendron = arbore), florile sunt hermafrodite cu gineceul n poziie superioar. nflorete la sfritul lunii mai i n luna iunie. Fructele au forma de conuri alungite. Specia prefer inuturi cu clima moderat. Suport bine gerurile dar, n tineree, este puternic afectat de ngheurile trzii. Este indicat n cultura pe soluri profunde, trofice, afnate, jilave, pe ct posibil cu apa freatic la mic adncime. Nu este rezistent la secete prelungite. Prezint o deosebit valoare ornamental datorita frunzelor sub form de lir, formei i coloritului florilor, i chiar a trunchiului. Este indicat a se folosi n parcuri i grdini, de-a lungul aleilor, pe peluze n plin lumin, izolat, n grupuri, la marginea grupurilor arborescente, cu un aspect ornamental deosebit n amestec cu unele specii de Magnolia. Prezint o rezisten mare la poluarea cu oxidul de sulf. Deoarece mai puin de 10% din seminele de arbore de lalea sunt fertile s-au depus importante eforturi pentru a pune la punct un protocol optim de producere de material clonal, care s constituie materialul semincer n nfiinarea de noi pepiniere. S-au raportat mai multe modaliti de micropropagare la arborele de lalea, cum ar fi microbutirea, cultura de rdcini i lstrirea axilar multipl. Nu s-au obinut rezultate notabile din microbutire dect atunci cnd s-au prelevat vrfuri de cretere de la plante aflate la intrarea n vegetaie. Cele mai mari succese, n micropropagarea arborelui de lalea, s-au obinut atunci cnd s-a indus embriogeneza somatic. Dar, ca la toate speciile lemnoase la care s-a reuit regenerarea in vitro prin embriogeneza somatic, cel mai mare impediment implicat de aceast metod este faptul c iniierea culturilor de esuturi n vederea inducerii embriogenezei somatice la arborele de lalea presupune folosirea embrionilor zigotici imaturi, a cror valoare genetic nu este cunoscut cu exactitate. Totui, chiar i n ciuda impedimentului descris mai sus, acest sistem de cultur este optim pentru arborele de lalea, fiind un important instrument n transformarea genetic prin metoda biolistic sau de a genera protoplati (Rugh i colab, 1998). Micropropagarea arborelui de lalea prin sistemul de embriogenez somatic, presupune trecerea culturilor embriogene printr-o faz intermediar, rar raportat la speciile lemnoase, i anume prin faza de mas preembriogen (Halperin, 1966). Stadiul de mas preembriogen se crede a fi caracterizat de existena unor preembrioni ntr-un stadiu incipient de dezvoltare, i trecerea lor 208

prin cicluri repetitive de proliferare, ceea ce duce la formarea unei mase mari de preembrioni. Aceast proprietate, face ca arborele de lalea s fie pretabil la nmulirea clonal prin sistemul embriogen i la transformarea genetic prin metoda biolistic. Pregtirea materialului vegetal donor Cele mai multe dintre culturile embriogene la speciile lemnoase, pornesc de la esuturi embrionare sau plantule n stadiul incipient de dezvoltare, cu doar dou frunzulie. Unul din factorii ce se dovedesc a fi cei mai importani i critici n iniierea cu succes a culturilor embriogene la multe specii, dar mai ales la speciile lemnoase, este stadiul de dezvoltare al embrionului zigotic sau seminei, atunci cnd se inoculeaz pe mediul de cultur. n majoritatea cazurilor, s-a observat c embrionii imaturi prezint cea mai mare rat de regenerare i de producere a embrionilor somatici comparativ cu embrionii zigotici maturi sau seminele ncolite. Fructele imature de arbore de lalea, de culoare verde-glbuie, se recolteaz la aproximativ opt sptmni de la nflorire. Se taie agregatele semincere n dou, pe lungime. Se izoleaz seminele, care sunt samare i se ndeprteaz aripioarele. Seminele, de la care vor fi excizai embrionii imaturi, n vederea iniierii culturii in vitro, se sterilizeaz prin imersie n alcool 70% timp de 20 secunde urmat de imersie n hipoclorit de sodiu 10% timp de 12-15 minute i apoi de cltiri repetate (3-5 reprize) n ap distilat steril, a cte trei minute fiecare, dup care se imerseaz n acid clorhidric 0,01N timp de 3 minute. Se cltesc din nou n ap distilat steril, trei reprize a cte trei minute fiecare. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Samarele se secioneaz cu ajutorul unui bisturiu ascuit pentru a izola coninutul lor, i anume embrionul i endospermul. Embrionii imaturi mpreun cu endospermul se plaseaz la suprafaa mediului de cultur bazal MS adiionat cu 2mg/l 2,4 D i 0,25mg/l BAP i transferai pe acelai tip de mediu proaspt o dat pe lun. Vasele de cultur vor fi bine izolate la gur i incubate n camerele de cretere, la 25oC, la ntuneric. La sfritul primei luni de subcultur, se observ, la unele explante, apariia unor formaiuni calusare de dimensiuni mici, care de obicei nu sunt morfogenice. Acestea mpreun cu embrionii care le-au generat se vor transfera pe acelai tip de mediu de cultur. La sfritul celei de-a doua luni de cultur, va aprea un ciorchine nodular de celule, de culoare glbuie, care formeaz masele preembrionare. Dac se dorete continuarea proliferrii de celule, masele preembrionare se vor subcultiva pe acelai tip de mediu, iar dac se dorete 209

inducerea formrii embrionilor somatici se vor transfera pe medii cu o concentraie foarte mic de auxin sau chiar fr fitohormoni. Embrionii aflai n stadiul globular pot fi cu uurin identificai datorit aspectului lor neted i lucios, comparativ cu masele preembrionare ce au aspect neregulat, rugos. Pentru germinarea embrionilor somatici i obinerea de plantule, acetia vor fi transferai pe mediul de cultur proaspete, fr hormoni i chiar fr hidrolizatul de cazein. Culturile de embrioni vor fi incubate n condiii controlate, la temperatura de 30oC i fotoperiodism de 16 ore lumin. Rezultatele pot fi cuantificate dup aproximativ dou sptmni, cnd se observ c unii embrioni au format rdcinue i/sau frunzulie. Dup aclimatizare, plantulele crescute n ghivece mici trebuie s produc n medie o frunz pe sptmn i s dezvolte, dup aproximativ ase sptmni, un sistem radicular bogat ramificat, cu rdcini de 5-10cm lungime. 12.1.8 Micropropagarea la cartof (Solanum tuberosum L) Cartoful este una din cele mai importante plante n alimentaia omului i a animalelor, ocupnd locul patru n lume, dup orez, gru i porumb. Este o specie la care metodele biotehnologice au fost aplicate cu succes. Plante libere de boli, somaclone, haploizi i hibrizi somatici, plante rezistente la man, nematozi, tolerante la erbicide, microtuberculi obinui in vitro au ieit din laborator, n cmp i astfel o serie de soiuri de cartof nmulite clonal au fost propagate pe scar larg n diferite ri (Bajaj,1987 ). n consecin, la cartof, tehnologia in vitro, combinat cu practicile tradiionale de producere a tuberculilor, a permis producerea comercial de smn liber de boli (microtuberculi i minituberculi).Eforturile au fost ndreptate i n direcia perfecionrii metodelor in vitro pentru depozitarea pe termen lung a germoplasmei la cartof, prin crioconservare. Manipularea genetic prin culturi de celule i ADN recombinat sunt cteva ci folosite n ameliorarea in vitro a calitilor nutriionale ale tuberculilor de cartof, precum i pentru creterea produciei culturilor de cartof. Micropropagarea cartofului se poate face pe mai multe ci: formarea lstarilor adventivi, lstrirea axilar multipl i embriogeneza somatic. Lstarii adventivi pot fi obinui prin organogenez direct sau indirect, ultimul tip fiind asociat ns cu o instabilitate genetic evident. n cazul cartofului, rata de multiplicare este mai rapid n mediu lichid comparativ cu mediul solid. Microbutaii pot genera rdcini putnd fi plantai n cmp pentru multiplicare. Obinerea de microtuberculi a constituit un aspect cu deosebit rezonan n producerea de material sditor la cartof. Microtuberculii au dimensiuni mici (3-8 mm) i o greutate medie de 0,05-0,15g fapt ce le permite s fie produi n laborator (in vitro) ntr-un numr mare indiferent de sezon; pot fi uor 210

depozitai, mpachetai i expediai (Bajaj, 1987; Chiru i colab, 1997; Chiru, 1998). Cultura in vitro de celule i esuturi, este utilizat n vederea multiplicrii i propagrii unor genotipuri valoroase, pe lng importante avantaje economice, are i o deosebit nsemntate tiinific. Practic ntr-un an se pot obine zeci, sute de mii, chiar milioane de plante, utilizate ca material sditor sntos. La noi n ar preocupri privind micropropagarea in vitro a cartofului se cunosc din anul 1983, cnd Cachi i colab. au nceput devirozarea i multiplicarea unor linii de cartof produse la I.C.P.C. Braov. n lucrarea citat a fost prezentat posibilitatea devirozrii culturilor de cartof pornind de la explante din ochi de cartof, plantate n ghivece. De la plantele de cartof dezvoltate din aceti ochi au fost apoi prelevate meristeme caulinare, apicale i laterale. Cultivarea in vitro a anterelor, respectiv a polenului fenomen numit androgenez, a condus la obinerea de plante haploide la cartof. Plante haploide au fost obinute i prin culturile de ovule sau saci embrionari in vitro, tehnic denumit ginogenez. Practicile moderne de multiplicare in vitro asigur nu numai obinerea n scurt timp a unui numr infinit de plante, ci i stocarea materialului vegetal i conservarea lui pe o durat mai lung sau mai scurt de timp n aa numitele bnci de gene. Problema principal care se ridic n cazul micropropagrii plantelor este aceea a obinerii unor clone identice cu planta mam donatoare, fr alterarea zestrei genetice i a calitii genotipului supus micromultiplicrii pentru ca n final s se nfiineze culturi omogene, de cea mai bun calitate, parametri imposibil de atins prin procedee tradiionale (Cachi, 1987). Pregtirea materialului vegetal donor Principalele tipuri de explante de la care se pornete n iniierea unei culturi de esuturi la cartof sunt constituite de mugurii din tuberculii de cartof sau coli, din care se pot regenera direct lstari sau din care sunt prelevate meristeme, n cazul n care se pornete de la material donor bolnav, reuindu-se astfel s se obin regenerani sntoi. De asemenea, izolarea de meristeme se poate face direct din vrfuri n cretere, cu dezavantajul c sterilizarea acestora se face mai greoi dect n cazul colilor. Pentru nmugurirea cartofului acesta trebuie s treac printr-o perioad de minim 4 sptmni de temperaturi sczute, fapt ce se poate realiza artificial prin inerea acestora la frigider (4oC), la ntuneric, dup care vor porni n vegetaie. O alt metode de stimulare a nmuguririi cartofilor prevede imersia tuberculilor n fitohormoni, din clasa giberelinelor, o perioad de timp determinat experimental. Astfel, tuberculii de cartof se taie n fragmente de 211

20g, deinnd 1-2 ochi. Fragmentele astfel obinute sunt inute ntr-o soluie de GA3 10g/l timp de o or, pentru a scoate mugurii din repausul vegetativ, dup care sunt plantai n vermiculit steril. Lstarii formai din ochi, dup ce ating lungimea de 3 centimetri servesc la prelucrarea de explante meristematice de 0,5 cm. Pregtirea explantelor i a mediului de cultur Ranalli (1997) a raportat o metod tipic de multiplicare a cartofului i anume multiplicarea prin minibutai. Minibutaii sunt fragmente de lstari alctuite dintr-un singur nod, cu lungimi de 5-10 mm. Acetia sunt inoculai pe mediu de cultur solidificat i vor genera din mugurii axilari cte plntu. Plntuele vor fi multiplicate prin fragmentarea lor n segmente de 4 mm incluznd un nod i jumtate din internodurile vecine, i subcultivarea lor nc patru sptmni pe mediu de multiplicare. Rata multiplicrii este de 3-5 ori la fiecare patru sptmni. Mediul bazal pentru cultura fragmentelor uninodale este constituit din sruri MS (Murashige-Skoog, 1962), zaharoz, mioinozitol, tiamin HCl i agar. Fitoregulatorii sunt omii n general deoarece pot genera alte tipuri de esut (calus), iar pH-ul mediului este ajustat la 5,7, dar poate varia ntre 5,2-6,5 conform lui Jones (1988). Lstrirea axilar multipl la cartof este o metod folosit i raportat pentru prima dat de Dodds i colab. (1992). Fragmentele de tulpin de pe care s-au nlturat trei sau patru noduri bazale (deoarece frunzele acestora sunt prea mari) sunt plasate ntr-un vas adnc de 100 ml ce conine 15 ml de mediu de cultur lichid. Dup 2-3 sptmni, n fiecare vas se vor diferenia 60-70 de noduri. Vasele vor fi incubate n condiii controlate de temperatur, lumin i umiditate, pe un agitator la 80 rotaii pe minut. Lstarii generai vor fi fragmentai n segmente ce vor conine 6 noduri fiecare i plasai n vase de plastic cu 50 ml mediu solid urmnd a fi incubai n camera de cretere pe rafturi metalice. Cultura de muguri adventivi se face la cartof pe medii lichide n bioreactoare cu air-lift sau n vase plasate pe un agitator mecanic. Explantele sunt constituite din lstari cu un singur nod provenii de pe plntue generate in vitro n urma culturii de meristeme, care au primit certificarea c sunt libere de viroze. Mediul de cultur folosit este alctuit din macro i microelementele prevzute n reeta mediului MS, adiionat cu vitamine, inhibitori de cretere (etilena) i citochinine, pentru a permite doar proliferarea numrului de lstari i nu creterea acestora. Dup 3-4 sptmni se observ obinerea unei mase de meristeme ce vor avea frunzele i tulpinile mult reduse. Lstarii astfel obinui vor fi fragmentai i trecui n continuare n bioreactor pentru multiplicare sau pe un mediu solid fr citochinine i inhibitori de cretere pentru alungire. Eventual 212

se poate aduga n mediu GA3 (acid giberelic) pentru stimularea alungirii internodurilor. Microtuberculii sunt tuberculi miniaturali produi n cultura in vitro, iar minituberculii sunt tuberculi mici produi ex vitro n condiii controlate din propaguli provenii din cultura in vitro. Dei minituberculii sunt mai mari (10g) dect microtuberculii (0,024g), ambii sunt cu mult mai mici dect materialul semincer clasic ce cntrete ntre 50-70g/tubercul. Microtuberculii se pot dezvolta n vase de cultur pe mugurii minibutailor (Seabrook i colab., 1993), pe lstari (Leclerc, 1994) sau pe muguri adventivi (Ziv i Shemesh, 1996) i pot fi produi pentru o larg palet de cultivare. Cea mai simpl i eficient metod de producere a microtuberculilor a fost descris de Estrada i colaboratorii si n 1986, i consta n cultivarea unor fragmente de tulpin n vase de 250 ml cu 20 ml mediu de cultur lichid. Mediul de cultur conine macroelemente i microelemente MS; 0,4 mg/l tiamin HCl; 2 mg/l pantotenat de Ca; 0,4 mg/l GA3; 0,5 mg/l BAP; 0,01 mg/l ANA; 100 mg/l myo-inositol i 2% zaharoz. Vasele de cultur sunt amplasate pe un agitator la 60 rpm n condiiile unui fotoperiodism de 16 ore lumin. Dup 2-3 sptmni plntuele dezvoltate sunt subcultivate pe un mediu specific pentru inducerea tuberizrii, ce conine pe lng srurile MS i 0,4 mg/l tiamin; 100 mg/l myo-inositol; 5 mg/l BAP; 500 mg/l CCC (clorid clorclorin), 0,7% agar i 8% zaharoz. Culturile vor fi incubate pe rafturi, la ntuneric, la temperatura de 22oC, timp de 40 de zile. Factorii care influeneaz iniierea tuberizrii sunt : genotipul, condiiile de mediu (lumina, temperatura), mediul de cultur, azotul i regulatorii de cretere. Minituberculii sunt tuberculi mici provenii din microtuberculi sau plntue care sunt plantate n densitate crescut pe paturi nutritive n casa de vegetaie, n condiii controlate. Mrimea i numrul minituberculilor depind de soi, condiiile de mediu, anotimp, mediul de cultur, densitatea de plantare i modul de ngrijire. Creterea densitii de plantare duce la creterea numrului de minituberculi pe m2 i la scderea dimensiunii acestora. i nfometrile repetate, dar nedistructive, duc la creterea numrului de minituberculi pe m2, dar scad de asemenea dimensiunile acestora. Astfel, Lommen i Stanik (1992) au raportat c nfometarea n trei reprize duce la o producie de 1800 de minituberculi pe m2, cu o greutate de 1-2 g, iar nenfometarea a dus la obinerea de 350 de minituberculi/m2, dar cu o greutate medie de 5g. n continuare minituberculii vor fi plasai n cmp conform unei scheme de producere de smn, iar factorul major pentru rezistena i performana acestora n noile condiii este mrimea lor. Tuberculii mici au o perioad de 213

laten mai lung, pornind mai trziu n vegetaie, cu lstari subiri i sensibili la factorii de stres i cu rezerve nutritive sczute. Greutatea minim necesar unui minitubercul n cmp este de 0,5 g. Minituberculii joac un rol important n reducerea ciclurilor de producere a materialului semincer la cartof. De exemplu, n Israel, cartoful R&D Ltd, produce material semincer pentru comercializare n doi ani. n primul an plntuele sau microtuberculii cu cte 2 lstari sunt plasai n casa de vegetaie la o densitate de 50-200 indivizi pe metru ptrat, n funcie de cultivar. Plntuele produc ntre 1000-2000 de minituberculi / m2 cu diametrul de 20-40mm, iar microtuberculii produc cu 50% mai mult dect acestea. n anul al doilea, minituberculii sunt plantai n sol sub o plas impermeabil insectelor. Cultura este nfometat pstrat n condiii optime i apoi replantat n cmp n acelai an. Smna pentru comercializare este vndut n al treilea an cu 250-300 dolari pe ton, ceea ce este cu mult sub preul de cost al materialului semincer importat.

214