Bacteriologie

Curs I

Introducere
Bacteriologia a evoluat n legtur cu nevoia medicilor de explica relaia apariiei bacteriilor cu anumite boli.
Astfel s-au aplicat postulatele lui Koch care au stabilit relaia cauz-efect ntre apariia bacteriilor i boli specifice. Astzi majoritatea bolilor bacteriene au fost diagnosticate iar agenii etiologici au fost identificai.

Definiie
Bacteriile sunt organisme unicelulare , fr membran nuclear, metabolic active i care se divid prin diviziune binar. Bacteriile par forme foarte simple de via dar sunt de fapt sofisticate i foarte adaptabile. Bacteriile se multiplic rapid i pot utiliza cantiti mari de hidrocarbonai . Pot fi parazite sau pot tri liber n natur. Bacteriile sunt ubiquitare i au o capacitate remarcabil de adaptare la mediu prin selecia spontan de mutani.

Diferene ntre celula procariot i eucariot

Diferen Peretele bacterian Celula procariot Complex, rezistent ,dur Celula eucariot. Subire, elastic, structura mozaicului fluid

Materialul nuclear

Nedelimitat prin membrana nuclearamai muli cromozomi

Delimitat prin membrana nuclearaun singur cromozom

Citoplasma
Diviziunea

Gel ,dens
Simpl, direct.

Complex.
Complex.

Structura
Morfologia Bacteriile au forme caracteristice (coci, bacili, spiralat) i se vd n grupri specifice (perechi,lanuri, tetrade, ciorchini etc.) Structura celular Procariotele au un nucleoid, o membran citoplasmatic i un perete cu structur specific. Multiplicarea este prin fisiune binar.

Introducere
Toate bacteriile , patogene i saprofite, sunt organisme unicelulare. Majoritatea bacteriilor sunt capabile de existen metabolic i de cretere independente dar speciile Chlamydia i Rickettsia sunt parazite obligatoriu intracelular. Bacteriile sunt celule extrem de mici i se msoar n microni (10-6 m). Ele au o mare variabilitate n dimensiuni ntre Bacillus anthracis (1.0 - 1.3 m X 3 10 m) i celule foarte mici ca Pasteurella tularensis (0.2 X 0.2 - 0.7 m) Bacteriile au un raport suprafa volum foarte mare , de aproximativ 100,000.

Forma i aranjamentul
1. 2. 3. 4. Bacteriile au o form caracteristic. Astfel bacteriile pot avea form: sferic (cocii-sferici sau ovoidali); form de bastona(bacilii); form alungit, filamentoas, ramificat, form spiralat. Aranjamentul celulelor este de asemenea tipic pentru diferitele specii sau grupe bacteriene . Unii coci sau bacili cresc specific n lanuri ( streptococi, streptobacili). Alte bacterii cresc n form de struguri sau de grmezi (stafilococii). Aspectul microscopic este important n clasificare i n diagnostic.

Forma i morfologia bacterian

Imagine

electronomicroscopic a unor coci aezai n

perechi (Neisseria gonorrhoeae). Regiunea nuclear apare mai transparent fiind alctuit din fibrile ADN, apare distribuoia dens a ribozomilor din citoplasm i absena organitelor intracelulare.

Nucleoidul
Celule procariote i celulele eucariote au fost difereniate iniial prin structur. Nucleoidul bacterian este echivalent cu nucleul celulelor eucariote dar este o structur mai simpl , nemrginit de membrana nuclear (vizibil la microscopul electronic). n microscopia optic nucleoidul se poate vizualiza prin coloraia Feulgen care coloreaz AND-ul.

 ADN-ul apare ca o molecul unic, cu greutate molecular de 3 X 109. Molecula de ADN poate avea aproximativ 1 mm lungime . Nucleoidul este alctuit dintr-un singur cromozom. Mecanismul de separare al celor 2 cromozomi fiice urmnd replicrii nu este bine explicat . Oricum cromozomul trebuie s fie permanent ataat la membrana celular n timpul diferitelor stagii ale replicrii.

Citoplasma
Citoplasma este o structur extrem de condensat, n form de gel, fr cureni n interior. Conine o cantitate mare de ARN. Ribozomii sunt prezeni n numr mare n citoplasma bacterian. Sunt clasificai dup constanta de sedimentare la ultracentrifug. Astfel n celulele eucariote sunt ribozomi 80S iar n cele procariote sunt 70S. De exemplu ribozomii Escherichiei coli sunt alctuii din 55 molecule de proteine i 3 molecule de ARNr. Ribozomii bacterieni sunt alctuii din dou uniti disociabile cu greutate de 30S i de 50S. Raportul dintre

ARN i proteine n ribozomi este de 2/1 sau de 2/3.

Procesul de asamblare a ribozomilor i funcia lor sunt sub controlul relaiei proteine ribozomale-ARNr. Proteinele i moleculele de ARNr ocup poziii bine definite pe suprafaa ribozomului dndu-i forma de fotoliu. Printre cele dou uniti ( unitatea 30S fiin ca o halter care se sprijin de fotoliu) se gsete un canal ngust prin care trece ARNm. Unii ribozomi se leag de faa intern a membranei plasmatice. n cursul sintezei proteice ribozomii se aranjeaz n polizomi cu lungimea proporional cu lungimea ARNm .

Membrana citoplasmatic
Membrana citoplasmatic este o structur complex care joac un rol important n fiziologia bacterian. Moleculele de lipoproteine, de glucide , de lipopolizaharide sunt n permanent micare (de 1.000.000 de ori pe secund) ceea ce confer membranei o mare plasticitate.

Membrana citoplasmatic
Modelul de aranjare a moleculelor membranei citoplasmatice este modelul mozaicului fluid descris de Singer i Nicholson n anul 1972. Aceast structur prezint permeabilitate pentru moleculele liposolubile i pentru electrolii. Moleculele lipidice confer o mare permeabilitate la moleculele hidrosolubile.

 Proteinele pot fi transmembranare sau de suprafa. Ca rol proteinele pot fi: Enzime care catalizeaz biosinteza componentelor celulare: Proteine de transport celulare, Proteine cu activitate adenozintrifosfatazic (ATP-aza); Proteine implicate n turnoverul lipidelor i al proteinelor membranare.

Funciile membranei citoplasmatice

Permeabilitate selectiv trec uor anionii (clor Cl-) i moleculele liposolubile i trec greu ionii de Na+ , K+, glucidele i proteinele pentru care sunt necesare sisteme speciale de transport. Membrana citoplasmatic are rolul mitocondriilor din celulele eucariote.

Mezozomii
Mezozomii sunt invaginri ale membranei citoplasmatice care au contact cu genomul bacterian. Sunt mai numeroi la bacteriile Gram pozitive. n mediu hipertonic proemin n spaiul dintre membrana citoplasmatic i peretele celular. n contact cu lizozimul sunt eliberai n mediu ca un ir de mrgele.

Rolul mezozomilor
Rolul mezozomilor este neesenial pentru viabilitate. Mezozomii sunt importani n : Mrirea suprafeei membranei citoplasmatice; n replicare; n sinteza nveliurilor celulare.

Peretele celular bacterian

Peretele bacterian constituie o structur unic n lumea vie deoarece conine o substan complex, peptidoglicanul inexistent n alte structuri vii. Peptidoglicanul este o structur pluristratificat alctuit din lanuri n care alterneaz acidul Nacetil muramic cu N-acetil glucozamina, lanuri legate ntre ele prin structuri tetrapeptidice.

Structura peptidoglicanului

Grosimea peptidoglicanului este diferit ceea ce confer caracterul de Gram pozitiv sau de Gram negativ astfel: bacteriile Gram pozitive au peretele gros de 200-400 nm i lanurile de acizi aminai sunt legate prin multiple legturi peptidice. Peretele bacteriilor Gram negative este subire, de 10-20 nm. i cu foarte puine legturi peptidice.

 Coloraia Gram este coloraia de baz n bacteriologie coloraie care st la baza clasificrii primare a bacteriilor.

Rolul peptidoglicanului
Interfer cu fagocitoza ajutnd aprrii antiinfecioase: are efect pirogen; are rol mitogenic stimulnd mitoza limfocitelor. peptidoglicanul este lipsit de lipide i de proteine; la anumite bacterii ca Nocardia, Corynebacterii se mai gsesc n perete acizi grai cu molecul mare.

Bacteriile Gram pozitive conin i polimeri solubili n ap care se numesc acizi teichoici. Acizii teichoici sunt de trei tipuri: acizi teichoici parietali; acizi teichoici transmembranari sau lipoteichoici care sunt legai de membrana citoplasmatic formnd reea ntre aceasta i peretele celular; acizi teichuronici alctuii din N acetil glucozamina i acid glucuronic.

Rolul acizilor teichoici

meninerea concentraiei ionilor metalici n spaiul periplasmic (ntre membrana citoplasmatic i perete), important pentru activitatea enzimelor; rol arhitectural; determinani n patogenitate; receptori de fagi i de colicine.

Coloraia Gram i diferena ntre bacteriile Gram-pozitive i Gram-negative.

Spaiul periplasmic
Spaiul periplasmic conine enzime hidrolitice importante n scindarea macromoleculelor:proteaze, lipaze, fosfataze, nucleaze, colagenaza, hialuronidaza care sunt i factori de virulen. n acest spiu se mai gsesc proteine care leag penicilina (proteine de legare a penicilinelor). ntre peptidoglican i membrana extern se gsesc molecule de lipoproteine.

Membrana extern
Membrana extern are grosimea de 60-200 angstromi i se poate ndeprta cu detergeni, cu fenol i cu EDTA.
Funcia

Regleaz trecerea moleculelor mai mari de 700 daltoni n celul.

Stratul intern este alctuit din fosfolipide iar cel extern din lipopolizaharide.

 Proteinele sunt n cantitate mai mare dect n membrana citoplasmatic. Proteinele care traverseaz peretele sunt proteinele transmembranare. Proteinele care formeaz pori se numesc porine i permit trecerea moleculelor mai mici de 700 daltoni. Alte proteine sunt proteinele integrale care ajut la meninerea integritii membranei externe.

 Lipopolizaharidul este alctuit din: lipidul A care este hidrofobic i este nglobat n membrana extern; polizaharidul core este un oligozaharid; Antigenul O sau polizaharidul O difer specific dup specia bacterian, dup tip i dup grup. Celulele bacteriene care au polizaharidul scurt sau absent sunt celule rough spre deosebire de cele smooth care l au ntreg.

Lipopolizaharidul

 Lipidul A este esenial pentru viabilitate . Lipopolizaharidul este responsabil pentru activitatea endotoxic i este termostabil. Lipopolizaharidul eliberat n cantitate mare determin moartea pacientului n 1-2 ore prin oc endotoxic. n cantiti mici lipopolizahariduleste activator al mediatorilor inflamaiei determinnd activarea complementului pe calea altern, activarea factorului tumor necrosis eliberarea de prostaglandine i de interleukin 1.

Efectele lipopolizaharidului
este pirogenic, determin rezistena la fagocitoz; crete rezistena la antibiotice; are rol n resorbia osoas.

Spaiul periplasmic
Acest spaiu ofer un avantaj metabolic bacteriilor Gram negative deoarece enzimele rmn localizate aici i pot degrada numeroase substrate. Bacteriile adaptate n mri, ruri, lacuri sunt majoritatea Gram negative. Bacteriile Gram pozitive elibereaz enzimele n mediu i de aceea au nevoie de medii foarte bogate n nutrieni i cu mare densitate bacterian pentru ca produii de digestie s fie accesibili celorlalte celule.

Structurile externe bacteriene

Pe suprafaa bacteriei se pot vedea dou tipuri de structuri externe sub form de apendice: flagelii care sunt organe de locomoie ; pilii sau fimbriile. Flagelii apar att pe Gram-pozitivi ct i pe Gramnegativi. Se gsesc pe numeroase specii de bacili i rar la coci. Pilii apar aproape exclusiv pe bacteriile Gram-negative i , mai rar pe bacteriile Gram-pozitive.

Escherichia coli cu flageli i cu pili (electronomicroscopia)

Flagelii
Flagelii sunt lungi , filamentoi(3- 12 m) cu diametru de 12 - 30 nm. Subunitile flagelului sunt asamblate sub form cilindric. Flagelul este alctuit din trei pri: 1. 1. un filament lung ; 2. structura de prindere a filamentului; 3. corpul bazal care imprim micarea filamentului. Corpul bazal traverseaz membrana extern a bacteriei. Micarea bacteriei se realizeaz prin rotaia corpului bazal n sensul invers acelor de ceasornic.

Flagelii
Abilitatea bacteriilor de a se mica le permite acestora chemotaxia care este micarea ca rspuns la substanele atractive sau respingtoare din mediu. Rspunsul la stimulii chimici implic receptori localizai pe suprafaa celulei sau n spaiul periplasmic. Exist mutani cu motilitate modificat.

 Numrul i distribuia flagelilor de pe suprafaa bacterian sunt caracteristice pentru o anumit specie bacterian. Aranjementul tipic al flagelilor : monotriche V cholerae are un singur fagel la un pol al celulei ; Peritriche cu distribuie de jur mprejurul bacteriei (Proteus vulgaris i E coli); Flagelii peritrichi se pot agrega la captul posterior i propulseaz bacteria ntr-o anumit direcie.

 Chimic flagelii sunt alctuii din proteina numit flagelin. Structura bazal const n numeroase proteine. Mutaiile pot afecta total sau pierderea motilitii. Flagelina este imunogen alctuind un grup de proteine antigenice denumite antigene H, care sunt caracteristice unei anumite specii, unei tulpini. Flagelii pot fi pierdui de pe suprafaa celulei cu pierderea temporar a motilitii fr pierderea viabilitii. Flagelii pot reapare cu recptarea motilitii.

Diferite tipuri de flageli

Pilii

Pilii sau fimbriile sunt termenii care descriu prelungirile subiri, asemntori cu firele de pr , care apar mai ales pe suprafaa bacteriilor Gram-negative . Proteina din pili se numete pilin. Pilii sunt mai rigizi dect flagelii. Unele specii bacteriene ca Shigella i E coli au pilii distribuii profuz pe suprafaa celular aproximativ 200 pe celul. PiliI pot fi de dou tipuri: Scuri, abundeni pilii comuni; pili lungi, rari -sex pilii. Sex pilii pot fi distini prin abilitatea de a fi legai de bacteriofagi specifici (sex pili acioneaz ca receptori specifici pentru aceti bacteriofagi). Sex pilii se ataeaz la bacterii n timpul conjugrii.

 Pilii la multe bacterii enterice confer adezivitatea bacteriilor la suprafaa epiteliilor, a hematiilor i a ciupercilor. Adeziunea are rol important n colonizarea bacterian a suprafeei epiteliilor i este deci considerat un factor de colonizare. Pilii gsii pe E coli au specificitate de zahar fiind inhibat de manoz- bacterii manozsensibile. Alte bacterii piliate ca gonococii sunt adezive i hemaglutinante, dar nu sunt inhibate de manoz. Exist variaii antigenice n pilin ale gonococilor.

Capsula i Loose Slime

Unele bacterii formeaz capsul care constituie nveliul celulei bacteriene i care este alctuit din trun gel vscos. Capsula poate avea 10 m grosime. Unele bacterii au un strat amorf numit slime layer. Streptococcus mutans, bacteria gsit n placa dentar poate s secrete o cantitatea mare de glucani extracelulari mucoizi din zaharoz. Capsulele constituie un determinant important al virulenei.

 Speciile ncapsulai sunt bacterii Gram-pozitive i Gram-negative. Capsulele sunt compuse din polizaharide vscoase cu greutate molecular mare care apar ca un gel gros n exteriorul celulei bacteriene. Capsula bacteriei Bacillus anthracis este neobinuit compus din g-glutamyl polypeptid (protein). Membrana celular este implicat n biosinteza i n asamblarea substanelor capsulare care sunt secretate prin peretele celular sau prin membrana extern. Pierderea prin mutaie a enzimelor implicate n biosinteza polizaharidele rezult n variabilitatea pneumococilor.

 Capsula nu este esenial pentru viabilitate. Viabilitatea nu este afectat de pierderea enzimatic a polizaharidelor capsulare. Funcia exact a capsulei nu este complet neleas. Se tie c ea confer rezisten la fagocitoz i deci ajut bacteriile protejndu-le de mijloacele de aprare ale gazdei la invazie.

Componente intracelulare
n citoplasm exist grenulaii dense legate de ribozomii de tip 70S. Acestea sunt particule alctuite de ribonucleoproteine care au un diametru de 18 nm nu sunt aranjate pe reticulul endoplasmic ca n celulele eucariote. Alte incluzii granulare distribuite n citoplasm sunt particule metabolice de rezerv ca poli -b-hidroxibutirate (PHB), polizaharid i granule de glicogen i polimetafosfat sau granule metacromatice.

Sporii bacterieni
Endosporii sunt formatiuni ale unor celule nalt termosensibile, deshidratate, n repaus metabolic formate intracelular la membrii genului Bacillus i Clostridium. Sporularea este procesul de formare al endosporilor I este o proprietate neobinuit a unor bacterii. Seriile de modificri biochimice i morfologice care apar n timpul sporulrii reprezint un model de difereniere al celulei bacteriene. Procesul care de obicei ncepe n faza staionar a ciclului celular vegetativ este iniiat de depleia nutrienilor (de obicei sursele de carbon sau nitrogen sau amndou). Celula intr ntr-un proces complex de modificri morfologice i biochimice care conduc la formarea endosporilor maturi.

Stadiile sporulrii
Stadiu 0- celulele vegetative cu 2 cromozomi la sfritul creterii exponeniale; Stadiul I- formarea filamentului de cromatin axial i excreia de exoenzime, inclusiv proteaze; Stadiul II- forespore septum formation and segregation of nuclear material into two compartments; Stadiul III- formrii protoplastului sporului ; Stadiul IV- formarea cortexului care confer aspectul refractil al sporului; Stadiul V- formarea nveliurilor sporale ; Stadiul VI-maturizarea sporului care const n modificarea peptidoglicanului, preluarea de acid dipicolinic (structura unic a endosporului) i a calciului, deyvoltarea rezistenei la cldur i la solveni organici; Stadiul VII- maturizarea final i eliberarea endosporilor din celulele mam.

 Endosporii nou-formai apar ca formaiuni rotunde, nalt refractile n interiorul celulelor mam. Unele tulpini produc autolizine care diger pereii i elibereaz endospori liberi. Protoplastul sporal sau core conine un nucleu complet, ribozomi, i componentele consumatoare de energie care sunt incluse ntr-o membran citoplasmatic modificat. Peptidoglicanul din peretele sporului mbrac membrana sporal.

 Prin germinare acest perete va determina peretele celulei vegetative. n jurul peretelui sporal este un cortex subire care conine un tip neobinuit de peptidoglican care este rapid eliberat prin germinare. nveliul sporal conine o protein asemntoare cu keratina care alctuiete exosporul. n timpul maturizrii protoplastul sporal se deshidrateaz i sporul devine refractil i rezistent la temperaturi nalte, la radiaii, la presiuni nalte , la desicaie, la chimicale. Aceste proprieti se corelez cu prezena peptidoglicanului sporal i cu prezena unui larg nivel de dipicolinat de calciu.

 Recent evidence indicated that the spores of Bacillus spharicus were revived which had been preserved in amber for more than 25 million years. Their claims need to be reevaluated. Figure 2-11 illustrates the principal structural features of a typical endospore (Bacillus megaterium) on initiation of the germination process. The thin section of the spore shows the ruptured, thick spore coat and the cortex surrounding the spore protoplast with the germinal cell wall that becomes the vegetative wall on outgrowth.

Microscopia electronic a unei seciuni subiri prin sporul de Bacillus megaterium arat prezena unui nveli sporal gros (SC), germinal groove (G) in the spore coat, stratul cortical extern(OCL) ,cortexul (Cx), straturile germinale celulare (GCW), membrana protoplastului sporal (PM), i regiunile unde nucleoidul (n) este vizibil. (John H Freer, University of Glasgow, Scotland.)