Determinarea vitaminei C din sucurile de fructe prin cromatografia lichid de

nalt performan ( HPLC )

Vitamina C, acidul ascorbic, este un acid organic cu proprieti antioxidante,

implicat ntr-o serie de procese care se desfoar n celulele vii. n organismul
uman vitamina C deine un rol complex i important; protejeaz compuii
biologic activi de degradri oxidative, ntrete sistemul imunitar, stimuleaz
procesele de biosintez a colagenului, hormonilor steroidici i a unor
neurotransmitori. Doza de 10 mg/zi previne avitaminoza C, ns raia zilnic
recomandat pentru un adult este de 60 mg. Lipsa vitaminei C din organism
conduce la scorbut, denumit i boala marinarilor, caracterizat prin gingivite
(gingii cavernoase i inflamate), paradontoze, pierderea dinilor, vase de snge
fragile, neelastice, inflamarea articulaiilor i anemie.Sub denumirea de
vitamina C este, de fapt, cunoscut izomerul levo al acidului ascorbic.
Vitamina C este o substan usor oxidabil, degradarea sa fiind accelerat
de cldur,lumin i de prezena cationilor metalelor grele. Pierderile de acid
ascorbic ce au loc n decursul procedeelor tehnologice ce sunt parte a
procesrii sucurilor de fructe, pot depi 50%. Din acest
motiv,adeseori,fabricanii adaug vitamina C pentru a mbunti valoarea
nutritiv i de a prelungi timpul de via al produselor.Metodele de
determinare a coninutului de acid ascorbic sunt diverse, toate bazndu-se pe
caracterul reductor al analitului. Cele mai cunoscute sunt metodele
titrimetrice bazate pe titrare cu o soluie oxidant (diclorofenol indofenol, iodat
de potasiu sau bromat de potasiu)cromatografice (HPLC), fluorimetrice sau
amperometrice, bazate pe biosenzori.In special,metodele cromatografice sunt
foarte eficiente in determinarea acidului ascorbic prin analiza cantitativa a
materialelor complexe,cum ar fi sucurile de fructe, legume si bauturile.

Prin aceast metod se pot separa,identifica si cuantifica majoritatea acizilor

organici din sucurile naturale de fructe folosind HPLC ,care va identifica
compuii, nu doar cu timpii lor de retenie,ci i cu spectrele lor individuale.
Materiale i metode
Sucul de citrice se centrifugheaz la 3000 de rotaii timp de 10 minute ,iar
supernantantul se dilueaz n raport 1:50 pentru determinarea acidului citric i
n raport 1:5 pentru ali acizi.Diluiile sunt filtrate printr-o membran nainte
de injectare.Se analizeaz 2 eantioane n duplicat.
Se prepar o soluie standard mixt ce conine 1000mg/l acid citric,2000mg/l
acid malic ,300mg/l acid oxalic si acid ascorbic ,700mg/l acid tartric i 400mg/l
acid lactic.Soluia standard si diluiile corespunzatoare sunt preparate cu ap
distilat i sunt pstrate n locuri ntunecoase ,la temperatur joas (+4oC).
Analiza HPLC
Acizii organici din probe sunt separai prin cromatografie cu faz invers ,i
determinai cu ajutorul absorbanei,apoi cuantificai cu graficele de calibrare
externe.Pentru detectarea simultan a 6 probe,detectorul este setat la
lungimea de und =254nm pentru acidul ascorbic i =214nm pentru ali acizi
organici.
Timpii de retenie,gradul de concentraie si limita de detecie pentru
acizi organici standard
Acizi organici
Timp de
Grad de
Limita de
(nm)
retenie(min) cocentraie(mg/l) detecie(mg/l)
Acid oxalic
214
4,122
0,2-300
0,1
Acid tartric
214
4,834
1-700
0,5
Acid malic
214
6,186
20-2000
10
Acid lactic
214
6,890
40-400
20
Acid ascorbic
254
7,353
1-300
0,5
Acid citric
214
12,538
16-1000
8,0
Determinrile se fac la 10oC folosind o faz mobil format din soluie de
fosfat (se dizolv 6,8g dihidrogenofosfat de potasiu n 900ml ap; pH-ul se
ajusteaz cu acid fosforic pn la pH=2,8 apoi se completeaz cu ap pn la

1000 ml),ce se filtreaz printr-o membran de poliamid i este introdus la

vid.Rata de curgere a fazei mobile este de 0,7ml/min pentru toate separrile
cromatografice.Coloana de separare este echilibrat cu faza mobil nainte ca
linia de baz s se stabilizeze.La acest nivel se fac pipetri cu volume de 5 l
pentru fiecare prob preparat sau soluie standard.
Valorile abaterilor standard relative variaz de la 0,154 la 3,18% indicnd
c aceast metod este precis ,cu un grad mare de repetabilitate ,n special
pentru acidul citric,ascorbic,lactic i oxalic .Recuperarea acizilor organici din
sucurile de citrice variaz ntre 95,8 si 102,1% confirmnd precizia de separare
si condiiile de analiz.
Aceast metod contribuie la dezvoltarea procedurii HPLC,fiind rapid i
precis,pentru determinarea cantitativ a acizilor organici din sucurile de
fructe,n condiiile de faz invers.Acizii oxalic,tartric,malic,lactic,citric i
ascorbic sunt determinai simultan i eluate din coloan n timp de 20 de
minute. Avnd n vedere uurina i concizia de pregtire a probei,aceast
metod poate fi considerat eficient,precis i rapid pentru determinarea
acizilor organici.Se mai pot folosi i alte metode de determinare a vitaminei C,
ns au anumite dezavantaje,consum mult timp i au reproductibilitate mai
mic.