Universitatea Tehnic Gheorghe Asachi,

Facultate de Inginerie Chimic i Protecia

Mediului Iai

BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE

Coordonator:

STUDENT:

ef lucrri dr. bioing. Lenua Klotzer

Munteanu Madalina
Grupa 2404

2015-2016
Facultate de Inginerie Chimic i Protecia Mediului

Acidul Glutamic

Coordonator:

STUDENT:

ef lucrri dr. bioing. Lenua Klotzer

Munteanu Madalina

2015-2016
Cuprins
Capitolul I....................................................................................................................................4
Memoriu tehnic........................................................................................................................4
Capitolul 2. Tehnologia de fabricaie..........................................................................................5
2.1 Domeniile de utilizare i proprietaile produsului............................................................5
2.2 Variante tehnologice.........................................................................................................11
2.3 Alegerea variante optime.................................................................................................14
2

2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat........................................................................16

2.5 Materii prime,materii intermediare i materii auxiluare..................................................28
2.6 Mecanismul reaciilor chimice........................................................................................37
2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie...........................................................................38
2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare......................................41
2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului............................................42
2.6.4 Modelul Gaden.........................................................................................................50
2.6.5 Termodinamica proceselor de fermentaie................................................................51
Capitolul 3. Controlul fabricaiei..............................................................................................56
3.1 Controlul, reglarea i automatizarea procesului tehnologic.............................................56
3.1.1 Reglarea automat a temperaturii.............................................................................57
3.1.2 Reglarea automat a pH-ului....................................................................................60
3.1.3Reglarea automat a concentraiei.............................................................................64
3.1.4 Reglarea concentraiei oxigenului............................................................................66
3.1.5 Reglarea nivelului spumei........................................................................................73
3.2 Controlul de calitate.........................................................................................................77
3.2.1 Metode de analiza a materiilor prime si a materialelor intermediare.......................77

Capitolul I
Memoriu tehnic
Aminoacizii sunt combinaii organice care conin n molecul una sau mai multe
grupri amino i carboxilice. Aminoacizii sunt folosii de ctre organism pentru obinerea
proteinelor.

Acidul glutamic (abreviat Glu sau E) este un alfa monoaminoacid dicarboxilic alifatic,
neesenial (deoarece poate fi sintetizat i de ctre organism). Este codificat de codonii
GAA/GAG din lanul peptidic. Are un pH de 4,1.
L-aminoacizii pot fi obinui, industrial, din hidrolizate proteice (ex. L-cistein din
hidrolizat de pr), dar n urma unor procese laborioase i poluante; sinteza chimic e o alt
cale de producere a aminoacizilor, dar n form racemic (rezult ambele forme D,L).
n prezent, majoritatea aminoacizilor se produc prin biosintez cu ajutorul bacteriilor
sau al enzimelor, cu avantajul obinerii selective numai a izomerului asimilabil de ctre
organismul uman: L-aminoacid.
Acidul glutamic a fost descoperit i identificat pentru prima dat n gluten de dr. Karl
Ritthausen (Germania, 1866). n 1883 Schultze i Bosshard i-au descris proprietile, dup ce
l-au separat din sucul de sfecl.
Profesorul Kikunae Ikeda (1864-1936) a ntreprins nc din 1907 cercetri privind
corelaia ntre coninutul n acid glutamic natural al unor produse alimentare japoneze i gustul
specific al acestora. Reueste s identifice prezena unui coninut de peste 1% glutamat n
unele tipuri de combu (condiment utilizat n Japonia). Concomitent vizeaz aspectele practice,
nregistrndu-i descoperirea ca patent industrial (14805 din 1907).
Ikeda fundamenteaz trei aspecte: coninutul natural de acid glutamic din alimente,
determinarea unui gust specific (numit de el umami- dup cuvntul japonez gustos sau
delicios) i stabilirea compusului glutamic cel mai solubil n ap, respectiv cel mai stabil,
anume glutamatul de sodiu.
n 1917, la iniiativa sa, firma Ajinomoto Co. Inc. condus de Saburosuke Suzuki
asimileaz i pune la punct pn n 1920 o producie industrial de glutamat de sodiu de
biosintez obinut prin fermentarea melasei, separat i purificat. Pn n prezent, aceast
companie nc mai produce o treime din cele 1,5 milioane tone ale produciei mondiale de
MSG (glutamat monosodic). n anii 1920 deinea ns monopolul absolut al acestui produs,
care s-a rspndit n perioada interbelic n toat Asia i a devenit un ingredient de baz al
preparatelor culinare japoneze i chinezeti.
Dup cel de-al doilea rzboi mondial MSG este tot mai mult utilizat i n SUA, ca
urmare a rspndirii restaurantelor chinezeti, afluxului de populaie asiatic pe coasta de est i
deprinderilor alimentare ale militarilor americani care i-au efectuat serviciul n Extremul
Orient.

nceput cu acidul L-glutamic, biosinteza microbian de Corynebacterium glutamicum

a realizat, cu mutani ai acestei bacterii, ali aminoacizi importani, ca L-lizin i L-treonin.
n prezent, utiliznd tehnica RMN cu 13C, s-a reuit descifrarea cilor metabolice ale
biosintezei bacteriene, cunoscnd, astfel, punctele cheie asupra crora s-ar interveni prin
recombinare genetic, supraexprimnd genele relevante (inginerie metabolic).
Dezvoltarea n ultimii ani a metodelor de secveniere complet a genomului bacterian a
permis cunoaterea genomului Corynebacterium glutamicum.

Capitolul 2. Tehnologia de fabricaie

2.1 Domeniile de utilizare i proprietaile produsului
Acidul glutamic se utilizeaz n industria alimentar fiind un poteniator de arom
(glutamatul monosodic MSG, sarea acidului glutamic), obinut prin biosintez din materii
prime vegetale sau animale.
La nivel mondial au avut loc nenumrate discuii n contradictoriu cu privire la
efectele consumului de MSG , adugat ca aditiv n diverse alimente. S-a afirmat c acest
adaos, devenit aproape universal mai ales n conservele de carne i pete, sosuri, dressinguri,
n unele condimente complexe ( tip Vegeta, Delikat ), are drept scop s atenueze i s
mascheze gustul natural i adesea mai puin savuros al unor preparate. Aceeiai acuzaie s-a
adus patronilor de restaurante cu profil asiatic care funcioneaz pretutindeni n lume, bnuii
c exagereaz n folosirea MSG.
Profesorul Ikeda a emis ideea c ansamblul de compui glutamici, n cantitate mai
mare sau mai mic, imprim i confer un gust specific distinct alimentelor n care se afl.
Treptat s-a confirmat c acesta este un gust distinct, la fel de relevant precum sunt celelalte
patru gusturi de baz, dulce, srat, amar i acru, fiind considerat n prezent al cincilea gust de
baz. Este totui un gust relativ greu de definit, muli caracterizndu-l prin calificativele bogat,
plin, corpolent, consistent, asociat cu aroma de carne, intensiv, ntr-un cuvnt-delicios
(umami).
Ikeda a fcut o paralel ntre sare, care este produsul specific pentru gustul srat i
glutamatul de sodiu- produsul specific pentru gustul delicios. n prezent s-a stabilit c doar
configuraia L a acidului glutamic liber determin proprietile legate de gust.
5

n urma unor studii aprofundate privind fiziologia i biochimia intim a formrii

gusturilor de baz n cavitatea bucal, continuat prin reflectarea lor la nivel cerebral, s-a
confirmat c gustul umami, alturi de celelalte gusturi de baz, are proprii receptori specifici.
Cercettorii Nirupa Chaudhari and Stephen Roper de la Universitatea din Miami
(1997) i-au bazat cercetrile lor asupra receptorului umami pe un cunoscut receptor proteic
din creier: mGluR4- special pentru glutamat, care joac un rol important ca neuro-transmitor.
ntr-adevr, au reuit s gseasc o protein foarte asemntoare pe limb, cu singura diferen
c este mult mai puin senzitiv dect cea din creier. Ei au numit receptorul taste-mGluR4.
Marea sensibilitate a acestui receptor neural este explicabil, deoarece concentraia
glutamatului n sistemul nervos este mult mai redus dect n cavitatea bucal, atunci cnd
consumm un produs specific mai bogat n glutamai.
Doi oameni de tiin din SUA, dr. Ch. S. Zuker i dr. N. J. P. Ryba, au abordat de
civa ani un studiu mai general, de identificare a receptorilor celulari care permit
recunoaterea gustului la fiinele umane. Zuker a stabilit c aceti receptori pot fi deschii (pot
opera) pe baza anumitor coduri sau chei, fiecare corespunztoare unui anumit gust. mpreun,
cei doi au identificat receptorii pentru gusturile dulce i amar. n continuare, au identificat i
un receptor numit T1 R1+3considerat c este deschis de gustul aminoacizilor.
Gustul amar ne permite s recunoatem eventuale substane toxice. Gustul prea acru ne
pune n gard asupra consumului de fructe nc nemature, necoapte. Gustul srat ne ajut s
recunoatem prezena cationilor de Na+, care prezint o mare importan pentru organism.

Gustul dulce este n mod evident asociat cu senzaia de plcere i cu secreia de

endorfine n creier, situaie care apare i atunci cnd consumm alimente cu gust delicios.
Ambele clase de substane, glucidele solubile i aminoacizii sunt deosebit de importante
pentru metabolism. Bernd Lindemann, un cercettor de la Universitatea Saarland din
Germania consider c gustul umami caracteristic aminoacizilor ne cluzete spre proteine,
care nu au un gust propriu.
Glutamatul se folosete cel mai mult n alimentele fabricate artificial i n
semipreparate gen: supe concentrate, sosuri, condimente, mezeluri, ngheat, budinci. Rolul
lui este de a da impresia creierului c acel aliment este foarte gustos.Acidul glutamic este

prezent n alimente ca:pete,ou,carne i este responsabil pentru cele 5 gusturi principale ale
omului.n Australia glutamatul este interzis, ns este tolerat n Statele Unite. Majoritatea
persoanelor sunt sensibile la glutamat invocnd simptome ca grea, dureri de cap, ameeli,
palpitaii, slbiciune i oboseal. Toate acestea sunt cunoscute sub denumirea generic de
simptomul mncrii chinezeti.
Acidul glutamic este un valoros medicament utilizat n tratamentul unor afectiuni ale
sistemului nervos central. Acidul glutamic este necesar pentru dezvoltarea lactobacililor,
amestecul acestui acid i 'asparagin' nlocuiesc amida nicotinei n dezvoltarea Bacteriei
dysenteriae i celelalte organisme. Acidul glutamic are 10 celule difereniale, acestea activeaz
metoda de 'nvaare' pentru obolani, face parte din reaciile de transaminare. Este benefic n
tratamentul 'petit mal' i atacuri nervoase. Sarea din acidul glutamic este unic, aroma din
carne este perceptibil n 3000 pri higroscopice.
n concluzie acidul glutamic este folosit n industria alimentar i farmaceutic sub
form de sruri de sodiu, pentru aromatizarea supelor concentrate, stimularea secreiei
gastrice, ameliorarea activitii sistemului nervos central i a ficatului cirotic.

Proprieti fizice

Denumire chimic : - IUPAC: -acid 2-aminopentadioic ;

- acid -aminoglutaric;
Denumire commercial: : acid glutamic;
Formula molecular: C5H9NO4 ;
Masa molar:M= 147.13 g mol1 ;
Densitatea:= 1.4601 (20 C);
Punctul de topire: 225-227C;
Constante de disociere : pKa : 2,16

Acidul glutamic,ca toi aminoacizii,este o substan amfoter care dizolvat n ap

poate forma anioni sau cationi alturi de ioni H + sau OH- eliberai simultan.Gruprile
aminice i carboxilice,formeaz ioni bipolari prin neutralizare intern,iar punctul izoelectric
este la pH 3,2.
Conform datelor din literatur, principalele proprieti ale acidului glutamic sunt:

- rotaia specific n ap :

[ ]tD = 11.5;

- solubilitatea n ap( g/100ml ap): 0.864.

Solubilitatea acidului glutamic crete odat cu deplasarea pH-ului n mediu acid sau
bazic;n mediu acid este solubil n ap sub form de clorhidrat,iar n mediu bazic este solubil
sub form de sare.
Solubilitatea n alcool etilic:insolubil n alcool etilic absolut i n eter.
n stare pur acidul glutamic,se prezint sub form de pulbere alb, cristalin, cu gust
acru i fr miros,avnd urmtoarea structur chimic:

HO-CO-CH2-CH2-CH-COOH
NH2

Proprieti chimice

Proprietile chimice ale acidului glutamic:

Glutamina+H2O Glu + NH3

NAcGlu + H2O Glu + Acetat
Acid -cetoglutaric + NADPH + NH4+ Glu + NADP+ + H2O
Acid -cetoglutaric + -amino acid Glu + -oxo-acid
Acid N-formimino-L-glutamic + FH4 Glu + 5-formimino-FH4

unde:

NAcGlu acid N-acetil glutamic (C7N11NO5);

Acetat sarea acidului acetic ([CH3COO]);
Acid -cetoglutaric COOH-C-CH2-CH2-COOH;
Acid N-formimino-L-glutamic (C6H10N2O4);
FH4 acidul folic (C19H19N7O6);

Proprieti biologice

Acidul glutamic (glutamat) este un aminoacid folosit de organism pentru a construi

proteine. Glutamatul este cel mai frecvent excitator (neurotransmitor) n sistemul nervos
central. Are rol n metabolismul celular.

Creierul folosete drept combustibil glucoza. Hipoglicemia (scderea cantitii de

glucoz din snge) duce la utilizarea aminoacizilor ca substraturi energetice alternative. Exit
peste o sut de aminoacizi cerebrali, dintre care doar trei: glutamatul, acidul -aminobutiric
(GABA) i glicina ntrunesc criteriile necesare pentru a fi considerai neurotransmitori.
Glutamatul este principalul neurotransmitor excitator, prevalent la mamifere, n timp ce
GABA i glicina sunt neurotransmitorii inhibitori.
Acidul glutamic are capacitatea de a colecta excesul de amoniac din organism, care
poate inhiba activitatea cerebral, convertindu-l n glutamin. Dat fiind faptul c glutamina
produce o sporire considerabil a nivelului de acid glutamic, un deficit al acesteia poate
determina carena celui de-al dolilea.
Acidul glutamic este un transmitor excitator major de la nivelul creierului. Aproape
toate celulele cerebrale au receptori care i rspund.
Ca neurotransmitor, glutamatul este sintetizat n mitocondria neuronului presinaptic
cu ajutorul glutaminazei mitocondriale din glutamin. Dup sintez, este stocat n vezicule
sinaptice, pentru a fi eliberat n sinaps n timpul neurotransmisiei. Aciunea sinaptic a
glutamatului este oprit prin recaptare, cu ajutorul pompelor transportoare de glutamat, care se
gsesc att presinaptic pe neuron, ct i pe glia vecin. n glie, glutamatul este convertit n
glutamin i la nevoie, neuronul va prelua glutamina de aici i o va reconverti n glutamat.

2.2Variante tehnologice

Obinut n anul 1866 de ctre Ritthansen prin hidroliza glutenului, iar n 1890 Wolff
realizeaz sinteza acidului d,l-glutamic din acid levulinic. Mai trziu(1908), Ikeda obine acid
l-glutamic prin hidroliza la cald a unor alge(laminaria) i constat c acestui acid i se
datoreaz gustul plcut al algei. Aceast observaie a constitiut punctul de plecare al
cercetrilor privind dezvoltarea produciei de acid l-glutamic n Japonia,principala
productoare a acestui acid.
10

Pentru obinerea acidului l-glutamic se folosesc trei grupe de metode :

a)extracia din surse naturale ;
b)sinteze chimice ;
c)biosinteza.
a)Extracia din surse naturale folosete leiile de la fabricile de zahar, deeurile de la
fabricile de amidon din gru sau porumb i deeurile de origine animal ( caseina ), care se
supun hidrolizei n vederea eliberrii acidului glutamic i apoi separarea lui.
Hidroliza acid a proteinelor( caseina, gluten) se realizeaz prin fierbere ndelungat
cu acid sulfuric( H2SO4) sau clorhidric (HCl) urmat de neutralizare cu hidroxid de calciu
Ca(OH)2 pentru ndepartarea acidului sulfuric sub form de sulfat, iar dup filtrarea sulfatului
se ndeparteaz ionii de calciu cu acid oxalic. Soluia apoas se concentreaz la vid, iar dup
rcire cristalizeaz acidul l-glutamic care se purific prin recristalizari repetate.
Un alt procedeu de fabricare care folosete ca materie prim deeurile de la fabricile de
zahr prin hidroliza alcalin duce la obinerea acestui aminoacid. Prin acest procedeu se
fabric n Frana, anual, peste 3000 tone acid glutamic.
b)Urmatoarea metod este cea de obinere prin sintez a acidului l-glutamic (aminarea
acidului -clor-glutaric,adiia esterului acetamidomalonic la acrolein,utilizarea
acrilonitrilului.Prin sintez,plecand de la acrilonitril,s-au obinut,n anul 1963,4800 t/an,iar
1970 12 000 t/an acid l-glutamic.
Schema de principiu a acestui procedeu este:
Acrilonitril CH2=CH-CH

Aer+CH4+NH3

Sinteza oxo

Combustie parial

-cian-OCH-CH2-CH2-CNCNNH4 Cianura de amoniu

propional aldehida
-aminoglu-tarodinitril

CN-CH2-CH2-CH-CN
NH2
d,l-glutamat

11

Hidroliza alcalina
NH3

Acid d,l glutamic cristalizat

n metodele de sintez rezult totdeuna un racemic,iar separarea izomerilor ridic

multe probleme tehnologice care au ca efect scumpirea produsului sintetizat.
c)Procedeul
de
biosintez
folosete
ca
surse
de
carbon:glucoza,zahr,amidon,hidrolizate de amidon,surse de azot( uree sau sruri de amoniu)
i microelemente.Pe aceste medii se cultiv microorganismul Micrococcus glutamicus,
principalul productor al acidului l-glutamic.
Deasemenea s-au studiat i alte surse de carbon: acidul acetic, esteri organici i
hidrocarburi alifatice, la care se adaug surse de azot i sruri minerale,obinndu-se medii de
cultur pe care se cultiv M. glutamicus. Cele mai bune rezultate s-au obinut la utilizarea nparafinelor cu 12-17 atomi de carbon. S-a plecat de la acidul -ceto-glutaric, intermediar n
ciclul Krebs, produs prin conversia zaharului i s-a supus procesului de transaminare. Enzima
care catalizeaz aceastreacie este mult rspndit n esuturile animale, vegetale i
microorganisme [Corneliu Oniscu,1978].
Fermentaia este procesul de cretere a microorganismelor pe medii de cultur,cu
scopul de a biosintetiza diveri produi .
Adoptarea unui anumit procedeu de fermentaie este condiionat de asigurarea celor
mai bune condiii de dezvoltare a microorganismelor,fr a fi neglijate caracteristicile tipurilor
de microorganisme cultivate (aerobe sau anaerobe,cultivabile n sistem septic sau aseptic).
Procedeele de fermentaie pot fi clasificate n funcie de:
1. modul de realizare a culturilor microbiene:
-culturi n suprafa
-culturi n profunzime
2. necesarul de oxigen:
-sisteme de fermentaie aerobe
-sisteme de fermentaie anaerobe
3. modul de funcionare a instalaiei de fermantaie:

12

-fermentaii discontinue
-fermentaii continue.
1) Procedeul culturii n suprafa a fost folosit la nceputul fabricrii pe scar
industrial a produciei de antibiotice.El s-a realizat prin cultivarea microorganismelor la
suprafaa unui mediu nutritiv lichid cu grosimea stratului de 1-2 cm ntr-un mare numr de
aparate cu mrimi i forme diferite.Procedeul are productivitate mic,motiv pentru care cultura
n suprafa a fost abandonat n practica industrial[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaiile n
suprafa se practic mai rar i,de obicei,pentru microorganisme anaerobe[Corneliu Oniscu i
Dan Cacaval,2002].
Procedeul culturii n profunzime const n cultivarea microorganismelor n
fermentatoare din oel V2A,n care mediul supus unei aeratii i agitri continue.n aceste
condiii,procedeul culturii n profunzime ofer o serie de avantaje, fa de cultura n
suprafa,printre care : randament mai mare,produs omogen,economie de spaiu,economie de
munc[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaia n profunzime se utilizeaz n majoritatea
proceselor de cretere a ,microorganismelor.Industrial,acest tip de fermentaie poate fi realizat
prin procedee de fermentaie discontinu i procedee de fermentaie continu[Corneliu Oniscu
i Dan Cacaval,2002].
2) Fermentaia discontinu, este ntalnit n literatura de specialitate i sub denumirea
de sistem de cultivare batch,se caracterizeaz prin aceea c microorganismele parcurg ntrun singur bioreactor toate etapele de dezvoltare ,dup care procesul se reia de la capt.Acest
mod de operare conduce la consumuri sporite de utiliti,deoarece de fiecare dat este necesar
stabilirea ntregii nstalaii.
Fermentaia continu ofer o serie de avantaje comparative cu procedeul discontinuu:

utilizarea bioreactoarelor de capacitate mai redus

realizarea mai eficient a proceselor de transfer de mas,cldur,impuls
productivitate sporit
epuizare mai avansat a componentelor mediului de cultur.

Procesul de fermentaie continu poate fi realizat ntr-un bioreactor sau ntr-o baterie de
bioreactoare,cu un debit constant(viteza de diluie constant) ,caz n care acest sistem mai este

13

ntalnit n literatura sub denumireacultivare continu tip turbidistat sau chemostat n funcie
de stadiul de dezvoltare al microorganismului[Corneliu Oniscu i Dan Cacaval,2002l].

2.3 Alegerea variante optime

Se alege procedeul discontinuu de fermentaie n profunzime deoarece prezint
urmtoarele avantaje:
-costuri reduse;
-flexibilitate ridicat;
-un pericol de contaminare al culturii redus;
-volumul bioreactorului relativ mare ofer posibilitatea obinerii unor randamente ridicate;
-puritatea produsului finit ct i activitatea biologic ridicat.
Comparativ cu celelalte procedee cel mai economic procedeu de obinere a acidului lglutamic este procedeul de biosintez care permite obinerea produsului la un pre de cost mult
mai mic fiind deosebit de rentabil.
Producia acidului l-glutamic prin procedeul de biosintez a crescut mereu, ajungnd n
anul 1966 s reprezinte 84% din producia total,iar n anul 1970 peste 88 %.Odat cu
creterea acestei producii au sczut costurile acidului l-glutamic cu peste 60 % fa de anul
1952 considerat ca baz.
Dintre cele dou procedee care au fost propuse plecnd de la
mecanismuldebiosintez ,fermentaia direct este aplicat la scar industrial,iar mediul de
cultur utilizat trebuie s conin surse de carbon,surse de azot,sruri minerale,factori de
cretere.Randamentele obinute n procesele de fermentaie direct variaz ntre 24 si 54% fa
de coninutul de zahr,iar concenraia final a acidului l-glutamic n biomas este cuprins
ntre 5 i 80 g/l ,funcie de compoziia mediului de cultur utilizat i parametrii procesului de
biosintez.
Deasemenea sursele de azot necesare n procesul de fermentaie(etap de obinere a
acidului glutamic) sunt asigurate prin adugarea de uree i sulfat de amoniu.Utilizarea numai a
sulfatului de amoniu are un efect nefavorabil i se manifest prin productivitate mic n
acid.Folosirea sulfatului de amoniu sau a amoniacului ca agent de corectare a pH-ului la
14

valoarea 7,6-8,5 ,pH optim pentru fermentaia acidului l-glutamic ,conduce la randamente mai
mici.Folosind ureea ca sursa de azot i ca agent de corectare a pH-ului se obin randamente
mari n acid l-glutamic. Creterea se explic prin faptul c ureea este descompus uor, n
prezena bacteriilor , n CO2 i NH3 care sunt utilizate apoi n formarea moleculei de acid lglutamic.
Celelalte dou metode nu sunt economice deoarece prima metod(extracia din surse
naturale ) prezint un randament sczut(se consum 12 t de gluten din gru sau 18 t gluten din
soia pentru 1 t acid) utilizeaz intalaii mari care fac acest procedeu scump i puin utilizat,cea
de-a doua metod pare a fi cea mai economic ntruct folosete ca materie prim
acrilonitrilul.
Pe plan mondial se produc, prin cele trei metode,peste 100 000 t/an acid l-glutamic ,din
care 65 800 t/an se produc n Japonia[Corneliu Oniscu,1978].

15

2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat

Schema tehnologic de obinere a acidului glutamic

16

Glucoz Extract deporumb

Uree

Fosfai

Sulfai Ap

Mediu de cultur

Sterilizarea mediului de cultur

Aer

Inocul
Micrococcus glutamicus Inocularea mediului de cultur
H2SO4

Sterilizare aer

Fermentaia

Aer steril

Filtrare biomas

Concentrare

Substan tensioactiv

Ap
NaOH

Cristalizare

Crbune activ

Biomas celular

Ap

HCl

Centrifugare primar

Soluie impur

Dizolvare

Crbune activ

Filtrare

Reziduu

Cristalizare avansat
Ap

Splare
Uscare
Ambalare

17

Acid glutamic, pulbere pur

Ap evaporat

*Pregtirea mediului de cultur i selecionarea microorganismelor

Mediile de cultur sunt formate din soluii apoase care conin componentele necesare
creterii microorganismelor i elaborrii produselor dorite pentru metabolismul celulei, si
anume:
-surse de carbon;
-azot;
-substane minerale;
-factori de cretere;
-la o concentraie a substanelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare;
-cu valori de pH optime creterii i multiplicrii microorganismelor de cultivat.
Mediu de cultur standardizat, special pentru sinteza acidului glutamic, format din :
-glucoz 10-12%;
-extract de porumb 0,3% ca substan uscat;
-uree 2-3%;
-fosfat mono- i bipotasic cte 0,1 respectiv 0,15%;
-sulfat de Mg 0,05%;
-ap 84,5-87,55%.
Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea i conservarea microorganismelor
sau pentru obinerea prin cultivare a produselor de biosintez microbian. Mediile pot fi
procurate de la firme productoare sau pot fi preparate n laborator.
Cultura microorganismelor este utilizat pentru a crete numrul de celule care se
dorete a fi studiate. Microorganismele sunt adugate n mediul de cultur care conine
nutrieni pentru cretere.
Cultura este incubat una sau mai multe zile, la temperatura optim a fiecrui
organism. n multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plci cu agar. Microorganismele

18

se multiplic formnd colonii. O colonie crete n locul n care o singur celul a fost
inoculat. O colonie este ca o clon. Ea poate fi pur dac nu exist n jurul ei alte tipuri de
microorganisme n colonii care o pot contamina.
n funcie de natura i sursa componentelor care intr n alctuirea lor ,mediile de
cultur sunt:sintetice,semisintetice si naturale.
Mediile de cultur selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziie chimic
bine definit, care permit dezvoltarea unui numr restrns de microorganisme sau chiar a unei
specii. Aceste medii conin pe lng substane nutritive i inhibitori ai altor microorganisme
nsoitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se dorete a fi selecionat.
n prezent, n locul glucozei tehnice se folosete melasa ca surs de carbon sau un
amestec deglucoz i zaharoz, care dau rezultate mai bune dect glucoza pur. Aceasta se
datoreaz prezenei n melas a acizilor organici.
Pentru sinteza acidului L-glutamic se vor utiliza bacterii aparinnd genului
Brevibacterium lactofermentum.
*Sterilizarea mediului de cultur
Procesele de cretere a biomasei microbiene impun, n marea lor majoritate, absena
total a sporilor de microorganisme strine, provenite din ap, aer sau materii prime, care s-ar
putea dezvolta n faza de fermentaie, infectnd cultura unic a microorganismului util.
Aceast cerin tehnologic se poate realiza prin sterilizare i, mai rar, prin pasteurizare.
Sterilizarea este,procesul prin care are loc distrugerea sau ndeprtarea
microorganismelor patogene sau apatogene (att a formelor vegetative, ct i a sporilor) din
substane, preparate, spaii nchise, obiecte[Corneliu Oniscu i Dan Cacaval2002]..
Sterilizarea termic prezint o serie de inconveniente generate n special, de reaciile
secundare de degradare care au loc n timpul procesului de sterilizare:
- denaturarea proteinelor i inactivarea lor;
- denaturarea vitaminelor i a unor factori de cretere;

19

- supranclziri care iniiaz reacii de oxidare a fenolilor i a acidului ascorbic, de

polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidrailor de carbon i brunificare a
mediului.
De asemenea, n timpul sterilizrii termice, se produc reacii de condensare a gruprilor
aldehidice, din zaharuri reductoare, cu gruprile aminice libere, din aminoacizi sau proteine,
cu formare de produi asemntori bazelor Schiff (reacia Maillard), produi toxici pentru
majoritatea microorganismelor. Pentru a fi evitat apariia acestor compui, este recomandat
sterilizarea separat a hidrailor de carbon i a compuilor cu azot.
*Sterilizarea la 120C
Sterilizarea direct n fermentator ,prin procedeu discontinuu la 120C, necesit un
timp mai mare,iar degradarea mediului este mai avansat.
Pentru sterilizarea unor cantiti mari de medii de cultur se recomand utilizarea
proceselor continue de sterilizare care prezint o serie de avantaje,printre care:
-conservarea mai bun a proprietilor nutritive ale mediului,ca rezultat al expunerii limitate la
temperaturi ridicate;
-controlul superior al calitii;
-utilizarea mai raional i nivelarea consumului de abur;
-productivitate i eficacitate sporit;
-control automat.
Realizarea n condiii optime a procesului de sterilizare prin procedeu continuu impune
un control riguros al spumrii mediului i o vascozitate mic a acestuia.
Pentru sterilizarea continu a mediilor de cultur se folosec instalaii industriale care
lucreaz la 120C instalaii care lucreaz la temperaturi mai mari ( 140C ),dar care permit o
rcire rapid mediului suprainclzit.

20

Fig.2.4.2 Instalaia de sterilizare la 120C

1-coloan de sterilizare; 2-menintor; 3-rcitor eav n teav

Instalaia pentru sterilizarea continu a mediului de cultur la 120C ,este compus din
trei pari distincte: coloana de sterilizare,mentinator si racitor.
Coloana de sterilizare 1 este format din dou evi concentrice: prin eava interioar
circul aburul de 5 ata,iar prin spaiul inelar circulmediul supus sterilizrii.n coloana de
sterilizare are loc nclzirea mediului pn la 120C,dup care acesta este trecut prin
menintorul 2 i rcitorul eav n eav 3,pentru desvrirea procesului de sterilizare i
rcire pn la 35-40C.
Din diagrama timp-temperatur pentru sterilizarea continu la 120C rezult c
nclzirea mediului cu abur direct de 5 ata n coloana de sterilizare se face n 4-5 s,iar timpul
de meninere (de 15-20 min) permite o distrugere a tuturor microorgamismelor patogene
capabile de multiplicare n condiiile din fermentator.n acest procedeu ,contribuia perioadei
de nclzire i rcire fiind mai mic (5-6 %) dect n sterilizarea discontinu ,se poate
considera c procesul de sterilizare are loc numai n menintor.

21

Fig.2.4.3 Diagrama timp-timp temperatur pentru sterilizarea continu la 120C

*Sterilizarea aerului
Sterilizarea aerului tehnologic necesar n fermentaia aerob constitue una din
problemele de importan major n industria biochimic,de rezolvarea creia depinde buna
desfurare a procesului de biosinteza.Dificultile de sterilizare a aerului sunt generate de
varietatea mare de microorganisme coninute (bacterii,spori bacterieni,fungi,virui), de
rezistena lor la temperaturi uscatei de limitele largi ale dimensiunilor acestora.
Pentru sterilizarea aerului au fost propuse urmatoarele metode:
-sterilizarea termica
-sterilizarea cu raze ionizate sau ultra-violete
-sterilizare cu ageni chimici
-sterilizare prin filtare.
La sterilizarea aerului prin utilizarea procesului termic se cer temperaturi ridicate
deoarece microorganismele au rezisten mare la temperaturi uscate.Astfel ,dupa Decker,sporii
din aer sunt distrui n 24 s la 218-220C.Aceast temperatur poate fi obinut fie prin
nclzirea aerului ntr- un schimbtor de caldur,fie prin comprimarea aerului n compresor
adiabatic.

22

Sterilizarea aerului prin metoda filtrrii se realizeaz pe filtre mecanice prevzute cu

un strat de material fibros.La nceput s-au folosit fibre din bumbc,dar,odat cu dezvoltarea
produciei industriale de antibiotice,fibrele de bumbac au fost nlocuite cu fibre de sticl.

Fig.2.4.4 Filtru cu fibre de sticl pentru sterilizarea aerlui

Pentru sterilizarea aerului prin filtrare, n principiu, exist trei tipuri de filtre cu
aplicabilitate practic. Filtrul cu fibre de sticl este alctuit dintr-un strat de material filtrant
fixat ntre dou site, susinute de dou plci perforate (diametrul perforaiilor este de 0,7 0,8
cm). Filtrul este prevazut cu manta de ncalzire, care permite uscarea materilului filtrant
sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru, indicat pentru industria de biosintez, ofer
posibilitatea sterilizarii unor debite ridicate de aer, realizarea unui grad avansat de purificare i
durata ndelungat de funcionare. Dezavantajele filtrului cu fibre sunt ;operaii complicate la
schimbarea fibrelor de sticl (durata 2,5 3 ore), manipularea neplacut a fibrelor de sticl i
anularea efectului de sterilizare dup umezirea materialului filtrant fibros.

23

Studiind procesul de purificare a aerului de microorganisme,prin filtrare pe fibre de

sticl,Gaden i Humphrey au stabilit eficacitatea separrii sporilor de Bacillus subtilisfuncie
de viteza aerului,iar Aiba a msurat distribuia microorganismului Serroria marcescens.
Cea mai larg utilizare n industria de sintez microbiologic o are procedeul de
strerilizare a aerulului bazat pe principiul combinat cu efectul termic.
Dup acest procedeu,aerul tehnologic,supus procesului de sterilizare,trece prin filtru cu
saci pentru separarea particulelor solide,apoi este nclzit,n schimbator de cldur sau n
compressor,la 150-160C.Aerul nclzit este trecut n continuare printr-un rcitor de
aer,separator de picturi,filtrul principal cu material fibros (prima treapta de filtrare),filtrul
individual cu material fibros (treapta a doua de purificare),dup care ptrunde n fermentator.
Schema de principiu a liniei de purificare si sterilizare a aerului tehnologic este redat
n figura 2.4.5

Fig.2.4.5Schema de purificare i sterilizare a aerului

1-filtru; 2-compresor;3-rcitor;4-separator picturi;5-filtru principal;6-filtru individual;7fermentator.

Conform acestei scheme, aerul, separat de impuriti n filtrul (1), trece prin
compresorul (2), unde este comprimat adiabatic la 3 - 3,5 at, temperatura crescnd la 150 160C. Dup rcire n (3), aerul este introdus n separatorul de picturi (4), filtrul principal cu

24

material fibros (5) (prima treapt de sterilizare), filtrul individual cu material fibros (a doua
treapt de sterilizare), dup care ptrunde n fermentator.
Rcirea aerului n rcitorul (3) se face pn la apariia condensului, iar, dup separarea
lui, aerul saturat se prenclzete cu aer fierbinte pn cnd temperatura de ieire din filtrul
individual (6) depete cu cel puin 12C temperatura punctului de rou. Stabilirea
parametrilor de funcionare ai instalaiei de sterilizare se face numai n funcie de parametrii
termodinamici ai aerului.
Pentru explicarea mecanismului de sterilizare a aerului prin filtrare pe material fibros
i stabilirea ecuaiilor de proiectare a filtrelor,este necesar s se cunoasc modelul de curgere
a aerului n jurul unei fibre cilindrice i modul de separerea particulelor solide.

Fig.2.4.6 Modelul de curgere a aerului prin filtru cu matrial fibros

Modelul curgerii aerului prin filtru cu material fibros se analizeaz n urmtoarele
ipoteze:1) fibra individual este perpendicular pe direcia de curgere;2) curgerea aerului este
laminar;3) particulele ce se separ au form sferic[Corneliu Oniscu,1978].
Dup sterilizare mediul de cultur este supus rcirii n vederea inoculrii cu bacteriile
productoare de acid glutamic. Rcirea mediului se face pn la temperatura de 29-31 0C,
temperatura optim la care are loc i nsmnarea.
Procesul de inoculare are loc n inoculator, durata acestui proces fiind de 10-15h.
Mediul de cultur se inoculeaz ntr-un raport de 5-10% inocul fa de cantitatea mediului.

25

n cursul desfurrii procesului, temperatura se menine la 30 0C, cu o bun aerare, iar

pH-ul se menine ntre 6,0-7,5 cu NH4OH.

* Fermentaia
Bioreactorul pentru producerea acidului glutamic este de tipul, acelai cu inoculatorul.
Fermentaia are loc n dou etape: n prima etap are loc multiplicarea
microorganismului i dureaz ntre 18 i 24 ore, n inoculator; iar n cea dea doua etap are loc
acumularea acidului L-glutamic i are loc n intermediar. Durata fazei finale este de 12-16 ore,
procesul fiind ncheiat n 30-40 ore.
n ambele faze fermentaia se consider terminat atunci cnd coninutul de zahr este
consumat pn la aproximativ 0,8-0,9% din valoarea iniial. pH-ul se menine constant la
valoarea de 7,5-8,5, iar temperatura trebuie s fie de 29-310C.
Aeraia bun reprezint un factor foarte important n desfurarea procesului cu
randament de transformare ridicat. Debitul de aer steril administrat este de aproximativ 1 litru
aer/litru mediu de cultur/minut, sub o intens agitare.
Procesele industriale de fermentaie sunt, aproape n totalitate, procese aerobe i, n
marea lor majoritate, aseptice. Necesarul orar de aer steril variaz ntre 60 i 120 m 3 aer/m3
mediu de cultur. n sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificulti generate, pe de o
parte, de varietatea microorganismelor prezente (virui, bacterii, spori bacterieni, fungi), iar pe
de alt parte, de rezistena lor la temperaturi uscate.
*Filtrarea biomasei
n procesul de biosintez ,procesul de sterilizare a masei celulare este legat ,n
majoritatea cazurilor ,de dificulti tehnologice considerabile,datorit naturii miceliului care
poate fi fibros ,mucilaginos sau sub form de past.Alegerea utilajului pentru filtare este
determinat de urmtorii factori :caracterul suspensiei,productivitate,rezultatele cerute i
materialul de construcie.

26

Fig 2.4.7 Filtru rotativ cu strat adjucvant

1-tambur; 2-capul distribuitorului; 3-cuit micrometric; 4-buncr; 5-cuv suspensie; 6-duz de
splare; 7-strat depus; 8-strat filtrant; I-zona filtrrii; II-IV-zone de uscare; III-zon de
splare;V-zon de ndepartare a stratului depus.
Amestecul obinut n urma fermentrii trebuie filtrat pentru recuperarea produsului
important- acidul glutamic i ndeprtarea biomasei.
*Concentrarea soluiei
Lichidul filtrat ajunge n evaporator, unde se concentreaz, n vedereaeliminrii apei,
sub vid. Temperatura la care are loc procesul este de 50-550C, iar pH-ul se menine la valoarea
de 6,5. Procesul este terminat cnd se atinge o densitate a mediului de cultur de 1,20 g/cm 3, n
urma acestuia rezult o soluie concentrat de acid glutamic. Apa evaporat este preluat de un
condensator i rcit.
*Cristalizarea soluiei
Soluia concentrat ajunge n cristalizator, unde se aciduleaz cu HCl, pn la punctul
izoelectric al acidului glutamic i se adaug o substan tensioactiv care favorizeaz
cristalizarea. Apoi soluia se rcete lent la 10-120C.
*Filtrarea cristalelor de acid
Masa cristalin obinut se filtreaz pe centrifug i se ndeprteaz soluia impur. n
urma cristalizrii i filtrrii acidul glutamic, sub form de cristale, nu are puritatea necesar
utilizrii n scop farmaceutic sau alimentar. De aceea cristalele obinute sunt supuse unor noi
metode de purificare.
27

*Dizolvarea cristalelor i refiltrarea acestora

Cristalele obinute se dizolv n ap, se adaug o soluie de NaOH pn la pH de 6,5 i
crbune activ. Soluia se nclzete ulerior la 70 0C. Masa cristalin purificat se filtreaz pe
filtru de pres. Soluia purificat rezultat se trimite n cristalizator.
*Recristalizarea, filtarea i splarea noilor cristale de acid
Soluia purificat este acidulat pn la pH de 3,2 (punctul izoelectric al acidul
glutamic) i se rcete la 10-120C timp de 24 h.
Cristalele de acid L-glutamic pur se separ prin centrifugare i se spal cu ap rece,
pentru ndeprtarea total a ionilor de Cl-.
*Uscarea i ambalarea
Cristalele pure de acid gluamic, fiind ude, trebuiesc uscate foarte bine, apa trebuia
ndeprtat n totalitate. Uscarea se poate face n usctor dulap sau usctor n pat fluidizat.
Temperatura aerului la intrarea n usctor este cuprins ntre 100 i1050C [Corneliu Oniscu ,
1978].
2.5 Materii prime,materii intermediare i materii auxiluare
Materiile prime care sunt introduse n procesul tehnologic sunt:

Glucoza este o sursa excelent de carbon i energie ,foarte mult utilizat pentru
stimularea creterii microbiene,uneori constituind chiar precursorul n biosintez (obinerea
glicozidelor ,a macrolidelor i glicoproteinelor) [ Dan Cacaval i Corneliu Oniscu,2002].
Aspect : este o substan solid, cristalizat, incolor i solubil n ap. Are un gust
dulce. Punctul su de topire este foarte ridicat, deoarece ntre numeroasele sale gruprihidroxil
se formeaz multe legturi de hidrogen. Cnd sunt nclzite, toate monozaharidele (nu numai
glucoza) se descompun nainte de a se topi, n carbon i ap, reacie numit carbonizare.
Glucoza are 75% din puterea de ndulcire a fructozei (care este luat ca unitate)
[https://ro.wikipedia.org/wiki/Glucoz%C4%83].

28

Extract de porumb
Se obine din apele de nmuiere a cerealelor (mai ales porumb) din procesul de obinere
a amidonului industrial i a fungilor de porumb, prin concentrare la cald, filtrare i sterilizare
cu bioxid de sulf. Este o surs foarte echilibrat de C,N,S, sruri minerale.
Utilizarea sa a produs o spectaculoas mrire de randament n biosinteza penicilinei
(1943) i s-a impus apoi n ntreaga industrie de biosintez, ca ingredient principal al mediilor
de cultur. Este un lichid vscos, brun, cu un coninut de circa 4% azot aminic, corespunde
unei cantiti de 40-42% proteine, format din 25% alanin, arginin i acid glutamic, fiecare
cu cte 8%, leucin 6%, fenil-alanina 2%, prolina 5%, izoleucina, valina si treonina cate 3,5%
metionina si cistina cate 1%.
Mai conine 15-30% acid lactic, 3% fosfor, 1% calciu i 15% potasiu, vitaminele B 2,
B6, biotina, gume polizaharidice.
Prezint aspect lichid cremos de culoare galben nchis.Mirosul este caracteristic unei
fermentaii lactice. Sedimentarea are loc dup 24 ore ntr-un cilindru de 100 ml de 100 %.n
frotiu colorat prezint o mas bacterian tipic bacililor lactici,n proporie de peste 90
%.Substana uscat este de minim 50 %.Extractul de porumb prezint un pH de 3,54.Coninutul n acid lactic este de minim 20 g la 100g substan uscat.Cantitatea de zahr
coninut este de maxim 2,5 %.

Uree
Ureea este acel compusul organic cu formula molecular CO(NH2)2. De fap ureea este,
diamida acidului carbonic, deci o amid. Se numete aa deoarece se obine din acidul
carbonic (sifon), printr-o dubl reacie a acidului cu amoniacul.
Aspect:este o substan solid, cristalizat, solubil n H2O. Chimic vorbind, ea se
comport ca amidele.Ureea prezint culoare alb avnd :umiditate maxim: 0,2 % i masa
molecular relativ: 60,05. Se folosete, de obicei, ca ngrmnt agricol, datorit
coninutului ridicat de N, n industria medicamentelor i la obinerea de produi
macromoleculari de policondensare cu aldehida formic [https://ro.wikipedia.org/wiki/Uree].

29

Micrococcus glutamicus-face parte din categoria bacteriilor.

Bacteriile sunt organisme unicelulare cu o structur complex care au un metobolism
propriu datorit unui aparat enzimatic complex ce le asigur desfurarea proceselor vitale.
Structura celulei bacteriene
Celula bacterian este o entitate morfologic i funcional echivalent cu celulele
organismelor superioare, cu o structur complex format din urmatoarele componente, de la
exterior catre interior, lund ca reper peretele celular:
Structura extraparietal format din: capsula; cilii sau flagelii; aparatul fimbrial i pilii
de sex.
Peretele celular.
Structura intraparietal compus din: membrana citoplasmatic, mezozomii,
citoplasma, aparatul nuclear, incluziunile, ribozomii, vacuolele, sporul bacterian.
Capsula este o secreie care apare la unele bacterii, ce se fixeaz la exteriorul celulei i
constituie un nveli n jurul acesteia. n funcie de raportul fa de celula bacterian capsula
este de mai multe feluri:
-microcapsula, cu grosimea fin de 0,2 mm, ce se pune n eviden prin metode imunologice;
-capsula propriu-zis, cu grosimea cuprins intre 0,2-2 mm;
-stratul mucos caracterizat prin prezena unei mase amorfe neorganizate n jurul celulei;
-zooglea ce se prezint ca un strat mucos neorganizat care nglobeaz mai multe celule
microbiene.
Compoziia chimic a capsulei difer n funcie de specia bacterian la care apare i de
condiiile de mediu, fiind format din 98 % ap, ali constituieni ca polizaharidele i
polipeptide.
Funciile biologice ale capsulei sunt urmatoarele:
- funcia de protecie mpotriva fagocitelor la bacteriile patogene;

30

- funcia de virulen;
- funcia de protecie mpotriva desicaiei.
Cilii sau flagelii
Cilii sau flagelii sunt formaiuni filamentoase, cilindrice, lungi, subiri, situate la
suprafaa celulei bacteriene i reprezint organite de micare ale acesteia. Prezena cililor este
caracteristic numai anumitor specii de bacterii, mobile.
Numrul cililor este variabil, funcie de specie, de la unu pana la o suta.
n funcie de inseria pe corpul bacteriei cilii pot avea urmatoarele poziii:
- monotriha, un cil la un singur pol;
- amfitricha, cu cate un cil la ambii poli ai celulei;
- peritricha, cu cili dispui n jurul bacteriei;
- lophotricha, cu cili dispui la un pol sub forma de mnunchi.
Cilii sunt organite lungi de 16-18 mm i subiri, cu diametrul de 0,01-0,02 mm pe toata
lungimea, de obicei ondulai. Implantarea lor se face n citoplasma printr-un corp bazal situat
ntre peretele celular i membrana citoplasmatica.
La bacteriile Gram-pozitive corpusculul bazal este format din doudiscuri (inele),
angrenate mpreun sub forma butonilor de manseta.
Lungimea cililor depaeste pe cea a celulei, n mod excepional pn la de 10 ori. Cu
ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa linear sau se pot rostogoli. Viteza de naintare este
mare, parcurgnd ntr-o secund o distan de la 10 pn la 40 ori mai mare dect diametrul
longitudinal al bacteriei.
Aparatul fimbrial. Fimbriile sunt formatiuni filamentoase prezente pe suprafaa
bacteriilor imobile sau mobile, n numar mare, de ordinul sutelor (100-400). Ele au o poziie
radial i sunt mai scurte ca cilii; nu servesc la micare ci au rol de fixare pe diferite substrate
solide sau pe hematii, pe care le aglutineaz.
Fimbriile sunt de natura intracelulara deoarece dup ndeprtarea peretelui celular,
rmn fixate pe protoplati.
31

Pilii sunt, dupa Ottow, apendice filamentoase care au un canal prin care se face
transferul cromozomului bacterian de la celula mascula (F+) la celula femela (F-), fiind
denumite si 'pili de sex'.
Peretele celular
Este invizibil sau foarte greu vizibil la microscopul fotonic i reprezint aproximativ
20 % din greutatea uscat a celulei si 25 % din volumul ei.
Peretele celular are rol:
- de sustinere mecanica;
- asigura individualitatea morfologica;
- ofera protectie fata de socul osmotic;
- participa la procesul de diviziune celulara;
- contine receptori de virus;
- mediaza schimbul de substante cu mediu.
Peretele celular este absent la micoplasmatale.
Membrana citoplasmatica, acopera citoplasma bacteriilor si o separa de fata interna a
peretelui celular. Are o grosime de 7,5 nm si este constituita din doua straturi fosfolipidice.
Analiza chimica a membranei evidentiaza trei tipuri de molecule: lipide, proteine si
glucide. Proteinele reprezinta peste 50 % din total.
Membrana citoplasmatica este o bariera osmotica de permeabilitate care regleaza
patrunderea in celula si eliminarea selectiva a diferitelor substante.
Ea mentine in celula o concentratie ridicata de macromolecule, molecule mici si chiar
ioni impedicandu-le difuzarea in mediu desi concentratia extracelulara este mai mica. Contine
permeazele care asigura transportul activ in interiorul celulei a unor substante organice polare
din mediu.
Membrana citoplasmatica are rol in cresterea si diviziunea celulara; la nivelul sau ia
nastere semnalul care declanseaza initierea replicarii cromozomului bacterian.

32

In sfarsit, membrana citoplasmatica este suportul enzimelor care participa la sinteza

ATP (la eucariote aceste enzime se afla in mitocondrii).
Mezozomii sunt formatiuni care deriva din membrana citoplasmatica sub forma unor
invaginari, legate de ADN celular. Aceste organite celulare joaca un rol important in
diviziunea nucleului si in formarea septului care separa cele doua celule fiice.
La bacteriile purpurii mezozomii contin pigmenti clorofilieni.
La bacteriile fixatoare de N2, nitrogenaza care este inhibata de O2, este protejata de
mezozomi.
La bacteriile nitrificatoare numeroasele invaginari ale membranei citoplasmatice
maresc suprafata de schimb enzimatic.
Citoplasma, este un sistem coloidal constituit din saruri minerale, compusi solubili de
natura lipoproteica, nucleoproteine, lipide si apa. Are un pH cuprins intre 7-7,2.
Citoplasma poate fi caracterizata ca un complex de stari fizice intr-o continua
transformare, in functie de starea fiziologica si varsta celulei.
Ribozomii sunt formatiuni citoplasmatice, sferice. O celula bacteriana contine in
medie 18.000 ribozomi de tip 70 S, cu un diametru de 10-30 nm. Fiecare ribozom se disociaza
in doua subunitati, 30 S si 50 S. Fiecare subunitate 50 S este legata de o subunitate 30 S prin
intermediul legaturilor ARN - proteina si proteina-proteina.
Ribozomii 70 S joaca un rol precis in cursul traducerii lanturilor de ARN in proteine.
Materialul nuclear ('nucleul') este constituit dintr-un cromozom format de o bucla de
ADN aflat in suspensie, in citoplasma. Lungimea acestuia este mare, ajungand
la Escherichia coli la 1 mm, ceea ce implica o rasucire foarte accentuata.
Plasmidele sunt considerate material genetic extracromozomial, fiind independente de
nucleu.
Plasmidele nu sunt indispensabile pentru viata celulara dar pot aduce un avantaj
selectiv. Ele poarta informatia pentru degradarea unor substraturi si pentru rezistenta la
antibiotice.

33

Replicarea plasmidelor se produce in doua momente diferite: atunci cand celula se

divide si atunci cand se produce procesul de conjugare.
Bacteriile pot contine mai multe plasmide. Escherichia coli, de exemplu, poseda pe
cromozom 1 sau 2 plasmide conjugate si 10-15 plasmide neconjugate.
Vacuolele sunt formatiuni sferice care apar in citoplasma in faza de crestere activa a
celulelor bacteriene. In interiorul lor se gaseste apa sau gaz.
Cele cu apa au rol in mentinerea presiunii osmotice in raport cu mediul extern, iar cele
cu gaz au rol de flotatie.
Incluziunile sunt formatiuni inerte care apar in citoplasma la sfarsitul periodei
exponentiale de crestere a celulei. Ele pot fi formate din glicogen, amidon, carbonat de calciu
si fosfat anorganic.
Sporul bacterian este o formatiune care deriva din celula vegetativa a bacteriilor, in
anumite conditii de viata. Sporul este o forma de conservare a speciei la conditiile
nefavorabile de mediu si concentreaza intr-un volum redus toate componentele esentiale ale
celulei din care provine.
Practic toate microorganismele produc acid glutamic, dar puine n cantiti suficient
de mari i n condiii selective. Mai productive sunt Brevibacterium amynophylum, diverse
varieti de Micrococcus glutamicus i Carynebacteryum glutamicum, dar i Esteria Coli,
Bacillus subtilis.
Cultivarea Micrococcus glutamicus pe un mediu de glucoz 10% necesit o
concentraie optim de biotin de 2,53%.
Mrirea i reducerea acestei concentraii face ca raportul ntre cantitatea de aminoacizi
coninui intra i extra celular s varieze de la 12 la 0,3.
Pe medii naturale srace n biotin cantitatea de aminoacizi trecui n mediu este i de
200 de ori mai mare dect cele bogate n aceast vitamin.
Componentele naturale i vegetale ale mediilor de cultur conin mari cantiti de
biotin. Se impune folosirea unui mediu de cultur sintetic i folosirea inhibitorului natural al
biotinei-alcoolul palmitic.

34

MICROCOCCUS GLUTAMICUS

Sruri minerale
KH2 P04-solubil n ap, insolubil n acool.
(NH4)2 S04-se prezint sub form de cristale de culoare alb-glbuie pn la portocaliu.
ZnCl2-este o sare a zincului cu acidului clorhidric cu formula chimic ZnCl2. Substana este
incolor sau alb i este foarte solubil n ap.Totodat, ea este higroscopic, i
delicvescent.Prezint masa molar: 136,315 g/mol i densitate: 2,91 g/cm.
Acidul sulfuric
Acidul sulfuric (H2SO4) este un lichid vscos i incolor ce se solidific la o temperatur
de 3 C atunci cnd este de concentraie 100%. n rest, punctul de ngheare depinde de
concentraie: la 93% acesta este de -32 C, la 78% este -38 C i la 65% este de -64 C. Acidul
sulfuric tehnic poate avea adesea o culoare maronie datorat impuritilor organice. nclzit
deasupra punctului de fierbere de 279,6 C, acidul sulfuric se vaporizeaz, iar n forma acesta
de vapori exist trioxid de sulf n exces. La o temperatur de 338 C, vaporii au un coninut de
98,3% acid i corespund unui amestec azeotropic de ap i acid sulfuric. nclzit mai mult, la
450 C, acidul sulfuric se disociaz n ap i trioxid de sulf complet.Cldura specific a
soluiilor apoase de acid sulfuric scade odat cu creterea coninutului de mare de acid i se
mrete odat cu ridicarea temperaturii. Vscozitatea acidului este de 24,6
mPaS[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_sulfuric].

35

Acidul sulfuric se utilizeaz dup terminarea fermentaiei,biomasa este acidulat cu

acid sulfuric la un pH de 6,5 adugndu-se crbune activ i un adjucvant pentru mrirea
vitezei de filtrare[Corneliu Oniscu,1978].

Carbunele activ este folosit ca material de umplutur pentru a reine mai uor
catalizatorul de filtrare.Se obine din mangal sau turb prin tratarea la cald cu vapori de ap
sau rumegus de lemn prin impregnare cu ZnCl 2 sau H2 P04 si calcinare ulterioara [Corneliu
Oniscu,1978].
Acidul clorhidric
Acidul clorhidric este un gaz incolor, cu miros puternic, iritant. Densitatea sa relativ
este de 1,12601 i greutatea unui litru de 1,6394 g. Gazul fumeg la aer cu formare de picturi
hidratate de HCl. Rcit la 10 C i la o presiune de 40 atm se condenseaz sub forma unui
lichid incolor. Punctul de fierbere este de -83,7 C, iar cel de topire este de -112 C.
n stare solid se prezint ca o mas alb cristalin. Cristalizeaz ntr-o reea cubic
molecular. Temperatura i presiunea critic au valorile 51,46 C i, respectiv, 81,6 atm. n
stare lichid nu conduce curentul electric[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_clorhidric].
Solutia care este trecut n cristalizator se aciduleaz cu HCl pn la punctul izoelectic
al acidului L-glutamic ,apoi se adaug o substan tensioactiv ce are rolul de a favoriza
cristalizarea[Corneliu Oniscu,1978].
NaOH
Hidroxidul de sodiu, cunoscut i drept sod caustic sau leie, are formula
chimic NaOH. Ca form de agregare este un corp solid, higroscopic, de culoare alb.Este un
puternic elctrolit favoriznd electroliza apei.Se dizolv n substanele polare degajndu-se
cldur de diluare.Neutralizeaz acizii formnd srurile corespunztoare radicalului nemetalic
i ap.Proprieti:masa molar 39,997 g/mol, densitate 2,130 g/cm3, punct de topire 322C,
punct de fierbere 1.388C.Masa cristalin care se obine se filtreaz pe centrifug ,dup care se
dizolv n ap ,se adaug o soluie de NaOH pn la pH 6,5 i carbune activ[Corneliu
Oniscu 1978].

36

2.6 Mecanismul reaciilor chimice

Pentru elucidarea mecanismului de biosintez a acidului l-glutamic s-a plecat de la ceto-glutaric ,intermediar n ciclul Krebs ,produs prin conversia zahrului n proporie de 5060 % i s-a supus procesului de transaminare.
Enzima care catalizeaz aceast recie (transaminoza) este mult rspndit n esuturile
animale, vegetale i microorganism.Procesul de transaminare poate fi reprezentat astfel:

HOCO-CHl-2Transaminaza
glutamica
NH3

HOCO-CH2-CH2-C-COOH

NH3

O
HOCO-CH2-CH2-CH-COOH
NH2

Dehidrataza lglutamica

Acidul glutamic este unul dintre cei mai importani donori de grupe aminice n
procesul de transaminare la nivel celular, favoriznd apariia altor aminoacizi.
n mecanismul de biosintez rolul biotinei este stabilit i const n orietarea
metabolismului microorganismelor M.glutamicus pe calea acumulrii anormale a acidului
glutamic, favoriznd deci creterea randamentului n faza de biosintez.
Plecnd de la mecanismul de biosintez au fost propuse dou procedee de biosintez:
1) procedeul ntr-un singur stadiu, n care acidulglutamic este produs direct n biomas
de ctre un singur tip de microorganism.
2) procedeul n doua stadii, n care se obine mai nti acidul -ceto-glutaric care este
mai apoi tramsformat n acid glutamic, fie cu ajutorul altui microorganism, fie prin metode
enzimatice[ Cornelui Oniscu,1978].

2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie

37

Studiul mecanismului reaciilor enzimatice, a proceselor metabolice i a vitezei de

trasformare a substratului n produs se face prin metoda cinetic. Metod reprezint singura
posibilitate de studio a proceselor enzimatice, deoarece numrul de enzime pure separate pn
n present este redus.
n tratarea problemelor de cinetic enzimatic privind viteza de formare a produsului
sau de cretere a masei celulare, se vor folosi definiiile date de Gaden pentru viteza de
fermentaie ,vitez volumetric i vitez specific
Gaden defineteviteza de fermentaie ca fiind variaia momentan a concentraiei
produsului, a intensitii respiraiei sau a concentraiei masei celulare, iar viteza volumetric
este definit prin unitatea de produs obinut,cantitatea de zahr utilizat,cantitatea de celule
produsesau prin consumul de oxigen, toate fiind raportate la litru mediu de cultur i la or.
Viteza specific se definete prin raportul dintre viteza volumetric i densitatea
bacterian i se exprim n grame de produs obinut pe or i gram mas celular.
Procesele metabolice ce au loc n interiorul celulelor vii sunt reaciifizico-chimice
foarte complexe care se petrec cu viteze mari i sunt catalizate de enzime.Gaden definete
fermentaia ca reprezentnd reaciile chimice catalizate de sisteme enzimatice care, la rndul
lor, sunt produse de ctre microorganisme n timpul creterii.
Enzimele sunt macromolecule organice care catalizeaz procesele biochimice.Din
punct de vedere structural, enzimele sunt compui de natur heteroproteic cu sensibilitate
deosebit la toi factorii care afecteaz proteinele.
Activitatea enzimelor este influenat de temperatur (intervalul optim de temperatur
este ntre 10 i 70C ),Ph, presiune osmotic, concentraia substratului, concentraia produilor
rezultai n reacie.Activitatea enzimatic este inhibat de anumii ageni specifici printre
care:sulfamide,antibiotice,narcitice,colorani,H2O,CO2,dezinfectante.
Substana asupra creia se exercit reaciile chimice, datorit aciunii enzimelor, se
numete substrat.Prezena enzimelor permite transformarea substratului la temperatura
normal a materiei vii, oferind n acest fel energia necesar desfurrii procesului de
biosintez.
Funciunea esenial a enzimelor const n accelerarea vitezei reaciilor metabolice la
temperatura normal a organismelor.Avnd activitate catalitic foarte mare,enzimele reduc

38

considerabil barierele de potenial ale reaciilor de transformare a substratului i faciliteaz n

acest fel deplasarea echilibrului spre formarea de produs.
Mecanismul prin care enzimele transform substratul n produs poate fi explicat prin
teoria strii de tranziie.Aceast teorie presupune c substratul se combin cu enzime formnd
un complex activat, instabil, care se descompune apoi n produs i enzim.Enzima eliberat
este utilizat ntr-un nou proces de transformare a substratului dup schema :
k2

k+1
E+S

E+S

P+E

k-1
n care: E-este enzima liber;
E-S*-complexul activat enzim-substrat;
S-substrat;
P-produs;
k+1-constanta de vitez la formarea produsului;
k-1-constanta de vitez la formarea enzimei i a substratului din complexul enzim-substrat;
k2-constanta de vitez la formarea produsului din complexul enzim-substrat.
Procesul de cretere a microorganismelor se urmrete prin determinarea masei
celulare sau a densitii celulare i prin determinarea numrului de microorganisme sau a
concentraiei celulare.Msurarea creterii se face prin metoda turbidimetric sau cu analizor
continuu infrarou (prin determinarea CO2 din gazele care prsesc cultura aerat).
n practic, este foarte comod s se urmreasc ciclul de cretere prin determinarea
numrului de miroorganisme sau a acumulrii acestora n timp.Dac se reprezint grafic
creterea n timp a numrului de microorganisme se obin curbe,alura acestora fiind
influenat de metoda de msurare utilizat.

39

Fig. 2.6.1.1Curba de cretere a microorganismelor

Curba de cretere a microorganismelor cuprinde mai multe faze corespunztoare
diferitelor viteze de cretere din ciclu.Astfel , dup Stell, curba de cretere cuprinde patru
faze , i anume:faza de inoculare sau de adaptare la mediu (de la a la b), faza creterii
logaritmice a numrului de microorganisme (de la b la c), faza creterii ncetinite (de la c la d )
i faza de descretere a numrului de microorganisme (de la d la e ).Dup Monod, curba de
cretere cuprinde urmtoarele faze: faza lag sau faza creterii staionare, faza de cretere
accelerat, faza de cretere logaritmic sau faza exponenial, faza de retardare, faza
staionar, faza distruciei accelerate a microorganismelor prin liz i faza distruciei
logaritmice.
Faza lag corespunde perioadei de timp n care are loc aclimatizarea microorganismelor
la noile condiii oferite de cultivarea la scar industrial.Durata fazei lag este determinat de
compoziia mediului folosit pentru cultivare la scar industrial i de specia
microorganismului.Dup perioada de aclimatizare urmeaz o accelerare a creterii,
caracterizat prin faptul c multiplele reacii ale metabolismului microorganismelor se
defsoar cu vitez ridicat.n faza creterii logaritmice are loc un intens proces de diviziune
celular,iar numrul microorganismelor viabile n aceast faz este de peste 99 %. Creterea
logaritmic se caracterizeaz i printr-un consum intens al elementelor nutitive din mediu.Pe
msur ce mediul se epuizeaz , viteza procesului de cretere ncepe s scad, iar acest
fenomen este tradus, pe curba propus de Monod, prin apariia fazei de retardare.Aceast etap
se caracterizeaz prin acumularea de produi metabolici, scderea vitezei de cretere a
biomasei i a viabilitii microorgamismelor.Urmeaz o perioad relativ scurt n care
40

populaia microbian pare s rmn constant, dup care apare o pronunat tendin de
reducere a viabilitii, etap care corespunde fazelor morii accelerate i a morii
logaritmice[Corneliu Oniscu i Dan Cacaval,2002].

2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare

Cinetica proceselor de biosintez poate fi studiat i sub aspectul creterii masei

celulare funcie de concentraia substratului. Astfel, Monod, analizand procesul de cretere
bacterian n corelatie cu variaia concentraiei unui singur substrat, a stabilit pentru faza de
crestere logaritmic a masei celulare urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice:
=

maxC S
K S +C S

(1)

viteza specific de cretere a masei celulare cnd substratul este limitat;

max

-viteza maxim de cretere a masei celulare cnd substratul nu este limitat;

KS-constanta de saturatie (corespunde concentraiei substratului la care viteza specific de

cretere este jumtate din viteza maxim).
Dependena dintre viteza specific de cretere a masei celulare i concentraia
substratului limitativ este redata n figura, din care se constat c viteza specific de cretere
tinde asimptotic ctre valoarea maxim.

41

Figura 2.6.2.1 Dependena dintre viteza specific de cretere i concentraia substratului

limitativ
Substratul limitativ poate fi surs de carbon i energie, un aminoacid essential,
oxigenul, fosforul sau azotul anorganic.
innd cont de faptul c viteza specific de cretere este definit prin relaia:
1
dC x
Cx
=
d

(2)

i combinnd aceast relaie cu expresia de mai sus , se obine ecuaia de cretere a

masei celulare n funcie de concentraia substratului limitativ, CS :
dC x maxC s
C
=
d
K s +C s * x

(3)

Ultima relaie este cunoscut n literatura de specialitate sub denumirea de ecuaia

Monod.
Prezint omare importan, pentru industrie faptul c primele dou faze din modelul
Monod, respectiv prima faz din modelul Stell, s dureze puin.n acest scop, se recomand
folosirea unei culturi care crete activ, folosirea n inocul a unui mediu de aceeai compoziie
cu cel folosit n industrie i utilizarea de inocule mari[Corneliu Oniscu i Dan
Cacaval,2002].

2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului

Michaelis i Menten dezvolt modelul cinetic al vitezei de formare a produsului n

funcie de concentraia substratului i a enzimei.Reacia dintre enzim i substrat se desfoar
42

n dou etape.n prima etap, viteza de reacie este dependent direct cantitatea de substrat, iar
n a doua, n care are loc formarea produsului i eliberarea enzimei, care este capabil s reia
+1
ciclul descris de sistemul de reacie,viteza kdepinde
de concentraia complexului enzimsubstrat:
E+S

E-S
k-1
k2

E-S

P+E

Viteza de formare n procesul enzimatic descries de sistemul de mai sus este:

Vp

dCp
=k 2C c (4)
d

Pentru determinarea concentraiei complexului enzim-substrat,Cc, se utilizeaz

expresia vitezei de formare a acestuia, pentru cazul n care CS >>CE:

dCc
=k +1( C E Cc )C sk 1Cc k 2C c
d

(5)

n regim staionar , concentraia complexului nu variaz n timp, iar expresia anterioar

devine:
k +1( C EC c )C s k 1C c k 2C c =0
Prin explicitarea ecuaiei de mai sus funcie de CC , se obine:

43

(6)

C c=

C EC s
k 1 +k 2
+C s
k +1

(7)

Combinnd ultimele dou ecuaii obinem:

v p=

n care : V

d CP
k C C
V Cs
=k 2C c = 2 E s =
d
k 1 +k 2
k
+C s K s + 2 +C s
k +1
k +1

k 2C E

(9)

viteza maxim de formare a produsului i corespunde stadiului

n care ntreaga cantitate de enzim formeaz complexul enzim-substrat

Ks=

k1
k +1 -constanta de echilibru la disocierea complexului enzim- substrat

K M =K s +

k2
k +1

-constanta Michaelis-Menten.

Constanta KM este egala cu constanta de echilibru Ks numai atunci cnd k2<<k+1.Cu

ct valoarea lui KM este mai mic, cu att este mai mare afinitatea enzimei pentru
substrat.Introducnd constanta KM n ultima ecuaie se obine:
v p=

d C p VC S
=
d
K M +C S

(10)

Aceast ecuaie este denumit ecuaia Michaelis-Menten i descrie viteza de formare a

produsului ntr-un proces enzimatic, reprentnd modelul ideal pentru viteza proceselor
enzimatice n regim staionar, lipsite de procese secundare de inhibiie.
Ecuaia Michaelis-Menten a fost stabilit n ipoteza c Cs>>CE .Creterea concentraiei
enzimei n mediul de fermentaie peste o anumit limit atrage dup sine anularea acestei
ipoteze i, n consecin, viteza reciei enzimatice nu va mai fi direct proporional cu
concentraia enzimei.

44

KM
Fig. 2.6.3.1Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten
Din reprezentarea grafic se observ c KM este acea valoare a concentraiei
substratului CS pentru care reacia pornete cu jumtate din viteza maxim ,V.
Pentru determinarea constantei KM i a vitezei maxime V, se utilizeaz metodele de
liniarizare. Una dintre acestea este metoda Lineweaver-Burk, care folosete inversul ecuatiei
(10):
1 KM
=
vp V

1 1
+
* CS V

(11)

Prin reprezentarea grafic a ecuaiei (11) n coordinatele

1
v p i

1
Cs

se obine dia-

grama Lineweaver-Burk (figura 2.6.3.1 ), care permite determinarea constantelor V i KM n

funcie de variaia concentraiei substratului i de valorile experimentale ale vitezei de formare
a produsului.

45

Figura 2.6.3.1.2 Reprezentarea grafic a ecuaiei Lineweaver-Burk.

n literartura de specialitate se ntlnesc i alte reprezentri ale ecuaiei MichaelisMenten. Astfel, Eadie-Hofsee obin prin mprirea ecuaiei (10) la Cs:
v

p=

V
KM
+1
Cs

sau

v p=V K

Mv p
Cs

(12)

Reprezentarea grafic a acestei ecuaii n coordinate VP i

VP
CS

este o dreapt,

redat n figura 2.6.3.1.3

Figura 2.6.3.1.4 Reprezentarea grafic a vitezei reaciei enzimatice dup metoda EadieHofsee.
O alt reprezentare a ecuaieie Michaelis-Menten a fost propus de Woolf. Autorul
pornete de la ecuaia Lineweaver-Burk pe care o nmulete cu C S,obinnd ecuaia (13),
redat n figura 2.6.3.1.4
Cs K M 1
=
+ C s
vp V V

(13)

46

Figura 2.6.3.1.5 Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten dup metoda lui Woolf.
Modelul Michaelis-Menten a fost conceput ca un model ideal i descrie viteza de
formare a produselor n procese de fermentatie perfecte. ns, acest model, care abordeaz
cinetica enzimatic n regim staionar, poate fi extins i la procesele n care, alturi de
transformarea enzimatic a substratului n produs, intervin reacii de inhibiie competitiv sau
necompetitiv a enzimelor. Prezena inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare
a degradrii mediului nutritiv n timpul sterilizrii, a unor reacii secundare i nu numai.
Principalele tipuri de inhibiii ntlnite curent n procesele fermentative sunt:
- inhibiia competitiv;
- inhibiia necompetitiv;
- inhibiie de substrat;
- inhibiie de produs.
Procesul de transformare enzimatic a substratului n produs nsoit de inhibiie
competitive este descries prin reaciile:

(14)
Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatic nsoit de inhibiie
competitiv este faptul c enzima pus n libertate prin disocierea complexului enziminhibitor, E-I, si pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului n
produs.

47

Viteza de formare a produsului este proporional cu concentraia complexului enzimsubstrat, de aceea este necesar cunoaterea valorii acesteia, n regim staionar. n acest scop,
se scriu constantele de echilibru, pentru situaia n care :
C

(C cC C c )C s

s=
K

(15)

EC cC
C I

K I =

(16)

unde: CI - concentraia inhibitorului;

CD- concentraia complexului enzim-inhibitor.
Se reduce termenul CD din ecuaiile (15) i (16) i se expliciteaz n funcie de Cc,
obinndu-se:
C

C=

CE C s K I
KI Ks + Ks C +K
I

IC
s

(17)

Ecuaia vitezei de formare a produsului devenind:

v

p=k 2 C c =

k 2 C E C K I
V Cs
=
Ks KI +K C Cs K
K
s

I +K

M + C s+

KI

C I

(18)

n care: KM=KS deoarece k2<<k+1

Ecuaia (18) descrie viteza de formare a produsului ntr-un proces de fermentaie
nsoit de inhibiie competitiva enzimei. Diferena dintre aceast ecuaie i ecuaia
48

KM
(
)C I datorat efectului
Michaelis- const n prezena la numitor a termenului
KI
generat de inhibitor. n concluzie, viteza de formare a produsului fiind invers
proporional cu concentraia inhibitorului, se impune ca la sterilizarea mediului s se
evite, pe ct posibil, degradarea acestuia, degradare care conduce la apariia
inhibitorilor. De asemenea, trebuiesc evitate toate reaciile chimice generatoare de
inhibitori enzimatici n procesul de fermentaie.

Figura 2.6.3.1.6 Reprezentarea grafic a vitezei reaciei enzimatice nsoit de inhibiie

competitiv dup metoda Lineweaver-Burk.
Determinarea constantelor KI,KM,V se face prin aplicarea metodei Lineweaver-Burk. n acest
scop, se scrie inversul ecuatiei (18):
C
1
1 KM
1
=
(1+ I )
+
(19)
V
vp V
KI CS

i se reprezint grafic n coordonatele

1
vp

1
i C s

( figura 2.6.7), valorile constantelor

calculndu-se din panta dreptei obinute i din intersecia cu ordonata.

n cazul n care inhibitorul nu acioneaz competitiv, afinitatea enzimei pentru substrat sau
inhibitor rmne neschimbat, indifferent dac enzima este liber sau fix n complex.
Reaciile care au loc n sistemul cu inhibiie necompetitiv sunt:

49

Pentru cazul n care Cs>>CE i CI>>CD*CF constantele de echilibru ale sistemului (18) se
calculeaz cu expresiile urmatoare:
EC C C D C F
C C s

K s=

(19),

D C F
EC c C
C C I
(20),

K I =

KI=

Cc CI
CF

(21),
K

s=

C D C s
CF

(22)

n care : CF- concentraia complexului enzim-substrat-inhibitor.

Admindu-se c KS=KS i KI=KI prin combinarea ecuaiilor anterioare se obine
concentraia complexului enzim-substrat:
K
( s+C s )(K I + C I )
C Cs K I
C c= E

(23)

50

Iar ecuaia vitezei de formare a produsului devine:

K
k 2 C E C K I

p=k 2 Cc =

V Cs

( s+ Cs )( K I +C I )=

(24)

( K M + Cs ) 1+ K I

v
n care: KM=KS deoarece k2<<k+1.
Din ecuaia (24) rezult cviteza de formare a produsului ntr-un proces de fermentaie
nsoit de inhibiie necompetitiv este mai mic dect viteza procesului far inhibiie (ecuaia
Michaelis-Menten) i a procesului de fermentaie nsoit de inhibiie competitiv (ecuatia 25).
Aplicndu-se i acestei expresii metoda de liniarizare Lineweaver-Burk, se obine
ecuaia unei drepte:
KM 1 1
+
V
CS V
1
=
vp

CI
(1+
)
)
KI

(25)

Iar prin reprezentarea n coordonatele

1
V p i

1
Cs

se obine figura 2.6.7, care

permite determinarea constantelor cu ajutorul pantei i a interseciei cu ordonata.

Figura 2.6.3.1.7 Reprezentarea grafic a vitezei reaciei enzimatice nsoit de inhibiie

necompetitiv dup metoda Lineweaver-Burk.

51

2.6.4 Modelul Gaden

n funcie de modelul de formare a produsului, au fost propuse diferite criterii

de clasificare a proceselor debiosintez. Astfel, Deindoerfer a realizat, pe baza datelor din
literatur, o clasificare cinetic, n funcie de tipul reaciilor care descriu procesul: reacii
simple, reacii simultane, consecutive, n trepte i complexe.

Figura 2.6.4.1Tipuri de fermentatie dupa Gaden (

formarea produsului;
consum de substrat;
crestere masa celulara).

n acest cadru, Gaden a clasificat procesele de fermentaie n funcie de corelaia dintre

formarea produsului iconsumul substratului in trei tipuri:
- (figura a )a.formarea produsului este raportat direct la substratul utilizat;
- (figura b )b.formarea produsului este raportat indirect la substratul utilizat ;
-(figura c ) c.formarea produsului nu are aparent legtur cu substratul utilizat .

52

Analiznd diagramele din figura 2.6.8, se constat c n tipul a de fermentaie produsul

se formeaz n paralel cu creterea microorganismelor, respectiv viteza de formare a
produsului variaz liniar cu viteza de cretere a masei celulare pe parcursul fermentaiei.
Tipul c indic faptul c formarea produsului are loc dup ncetarea creterii biomasei i
consumul total al substratului (fermentaia penicilinelor, streptomicinei, tetraciclinei ). Tipul b
este intermediar i se poate exemplifica prin fermentaia lactic[Corneliu Oniscu i Dan
Cacaval, 2002].
2.6.5 Termodinamica proceselor de fermentaie

Procesul de fermentaie se ncadreaz, din punct de vedere termodinamic, n categoria

sistemelor termodinamice deschise, sisteme specifice organismelor vii, caracterizate prin
schimb de energie i de materie cu mediul nconjurator, pe care l transform. Sistemelor
deschise le este specific faptul c ele nu sunt n echilibru cu mediul lor. Organismele vii se
afl, de obicei, ntr-o stare staionar, care reprezint condiia de baz a sistemelor deschise, i
n care viteza transferului de materie i energie din mediu n sistem este compensat total de
viteza transferului de materie i energie din sistem n afara lui.
Faptul c celula este un sistem deschis, care nu se afl in echilibru cu mediul su, un
mecanism care capteaz energie liber din mediu, producndu-i simultan o cretere oarecare a
gradului de dezordine, adic a entropiei, face parte din logica molecular a strii vii.
Sursa de energie a sistemelor termodinamice deschise o reprezint hidraii de carbon,
lipidele, alcoolii, proteinele etc, care prin combustie chimic elibereaza o mare cantitate de
energie. O parte din aceasta energie se elimina din sistem, iar o parte este inmagazinata de
sistem in compusi organici macroenergetici, dintre care se remarca acidul adenozintrifosforic
(ATP), compus care asigura, practic, rezerva energetica a celulei. Din structura ATP-ului,
prezentata mai jos, rezulta ca legaturile dintre gruparile fosfat adiacente din ATP si ADP
(acidul adenozindifosforic) sant legaturi de tip anhidrida, notate cu ~, in timp ce legatura
dintre acidul fosforic si riboza din AMP (acidul adenozinmonofosforic) este o legatura
esterica, notata cu linie dreapta.
n acest context, trebuie subliniat faptul c energia liber standard de hidroliz a
legaturilor tip anhidrideste mult mai mare comparativ cu cea a legturilor esterice. Dei ATPul conine dou legturi macroenergice (~), n reaciile enzimatice intervine, de obicei, numai

53

fosfatul terminal. De asemenea, este necesar de precizat c ATP-ul nu este numai un rezervor
de energie chimic, ci este n primul rnd, un transmitor de energie chimic n celulele v
transportnd energia sa la alte molecule, acest compus pierde gruparea fosfat terminal,
trecnd n ADP, care, la rndul su, poate accepta energie chimic i reface ATP-ul, primind o
grupare fosfat.

Prin reunirea acestor observaii, ca i a multor altora, s-a constatat c ATP-ul

funcioneaz ciclic ca transportor de energie chimic de la reaciile de ardere, care furnizeaz
energia chimic, la diferitele procese celulare care necesit un consum energetic.

Figura 2.6.5.1 Ciclul ATP ADP i modalitile de utilizare a energiei eliberate de ATP

54

S-a evideniat experimental c, indiferent de natura substratului limitativ considerat ca

surs de energie sau molecule combustibil (excepiile fiind foarte rare), raportul dintre
cantitatea n grame a celulelor microbiene obinute n stare uscat i numrul de molecule de
ATP sintetizate este aproximativ constant i are valoarea de 10,5. De asemenea, s-a demonstrat
c n procesul de cultivare a bacteriilor n condiii aerobe 605% din cantitatea de carbon din
mediu este asimilat de celule i numai 405% este oxidat la CO 2. Din punct de vedere
energetic, circa 62% din energia liber de oxidare a substartului reprezint energia liber de
ardere a componentelor masei bacteriene, astfel ncat Hc=22KJ/g s.u. (masa bacteriana).
Dac substratul furnizor de energie este glucoza, care se consum ntr-un proces de
fermentaie aerob prin catabolism, atunci se formeaz, conform reaciei de mai jos, 38 moli
ATP, care pot nmagazina 1159 kJ din cei 2870 obinui prin combustia unui mol de glucoza:
Glucoza + 6O2 6CO2 + 6H2O + 38 moli ATP
Pentru alte sisteme de fermentatie sau alte substraturi utilizate, numarul de moli de ATP
formai este diferit, dup cum rezult din tabelul :

Tabel 2.21.Numrul de molecule de ATP formate n procesele de fermentaie

aerob si anaerob cu diverse substraturi.
Substrat

Conditii de fermentatie

Moli ATP/moli
substrat

Glucoza

Aeroba

38

Anaeroba (cu formare de formiat+acetat)

Anaeroba (cu formare de etanol+CO2)

Aeroba

30

Anaeroba (cu formare de formiat+acetat)

Piruvat

55

Palmitat (C16)

Anaeroba (cu formare de etanol+CO2)

Aeroba

130

Moleculele de ATP i ADP fiind puternic ionizate, datorit faptului c pH-ul lichidului
intracelular are valoarea 7, formeaz n prezea ionilor de Mg 2+ (aflat n cantitate ridicat n
lichidul intracelular) compleci de tipul celui prezentat mai jos, compleci care constituie, de
altfel, chiar forma activ a ATP-ului:

Mg ATP2Pentru analiza termodinamic a sistemelor biochimice i a reaciilor pe care le induce

ATP-ul, este necesar s se precizeze cteva convenii, i anume:
a) n sistem apos diluat n care apa apare ca produs sau reactant, activitatea sa
termodinamic (sau concentratia) se stabilete arbitrar la valoarea 1, dei concentraia molar a
apei este 55,5 M;
b) n energetica biochimic, starea de referin este pH = 7,0 i nu pH = 0
(corespunzatoare unei concentraii de ioni de hidrogen de 1,0 M), cum se consider n
termodinamica chimic;
c) variaia energiei libere standard la pH = 7,0 si 25C se noteaz cu G o iar cea de la
pH = 0 cu Go
d) deoarece la pH = 7,0 starea standard este un amestec de forme ionizate i neionizate,
rezult c valorile lui Go depind de valoarea pH-ului, care influenteaz direct raportul dintre
formele ionizate i neionizate ale reactanilor sau produilor de reaie[Corneliu Oniscu i Dan
Cacaval,2002].

56

2.6.6 Calculul efectului termic total al procesului biotehnologic

Capitolul 3. Controlul fabricaiei

3.1 Controlul, reglarea i automatizarea procesului tehnologic

Obiectivul conducerii automate a unui fermentator este realizarea i meninerea

condiiilor favorabile pentru viaa i producerea microorganismelor: temperatur, presiune,
pH, concentraia diferitelor substane chimice.
Principalii parametri reglai n proces sunt:

temperatura, cu precizie ridicat, la o valoare ntre 25 i 30C ; bucla de temperatur

TRC folosete, ca mrime de execuie, debitul de agent termic vehiculat prin mantaua
reactorului;
presiunea ,cu bucla PIC ce manipuleaz debitul de evacuare a gazelor;
pH-ul, un parametru ce are puternic influen asupra desfurrii procesului de

fermentaie, cu bucla pHRC, n care parametrul de reglare este debitul uneia dintre
sunstanele chimice adugate (acid sau baz) ; pentru msurarea pH-ului, electrodul
de pH se monteaz, de preferin, exterior reactorului, ntr-o celul plasat pe o
conduct de recirculare. n acest fel, calibrarea i ntreinerea electrodului n condiiile
asigurrii sterilitii mediului msurat sunt mai uor de realizat.
concentraia oxigenului dizolvat, cu bucla de reglare ARC-O2 n care se manipuleaz

debitul de aer steril introdus n fermentator ; msurarea acestui parametru se poate face
prin msurarea presiunii pariale cu un traductor galvanic de oxigen dizolvat sau cu un
analizor polarografic,steril cu abur;
nivelul, cu bucla de reglare LICA, n special pentru prevenirea formrii spumei; ca
mrime de execuie se folosete debitul de agent antispumant (ulei) ,sterilizat n
prealabil, care se injecteaz n fermentator. Pentru diminuarea nivelului de spum
reactorul este prevzut i cu dispozitive de distrugere mecanic a spumei.

Alturi de reglrile de mai sus cu aparate prevzute,cele mai multe, i cu funciuni de

indicare, nregistrare i alarmare, pentru monitorizarea procesului de fermentaie se msoar

57

i\sau se nregistreaz, cu aparatur n flux sau prin analiza n laborator a probelor prelevate,
unii dintre urmatorii parametri tehnologici:

compoziia gazelor evacuate n O2,CO2,NH3, (uneori) cu analizoare de gaze sau cu

spectrometre de mas;
compoziia mediului de fermentare n gazele dizolvate (O 2,CO2,CH4 ) i n compuii

volatili ca metanol, etanol, butanol i aceton prin spectrometrie de mas;

concentraia n celule a masei de reacie, cu sensori fotoelectrici de turbiditate;

meninerea densitii populaiei este realizat prin manipularea debitului de nutrient

introdus n fermentator.
debitul i presiunea aerului sterilizat la intrare, a aburului de nclzire, a fluxului de
gaze evacuate, debitul de chimicale pentru corectarea pH-ului i a turaiei agitatorului
(cu alarmare pentru cazurile critice).

Figura 3.1.0 Schema de automatizare a unui fermentator cu funcionare discontinu

SA-alarma viteza
FI-indicator de debit
58

LICA-indicator control i alarma pentru nivel

pHRC-regulator de pH
TRC-regulator de temperatur
AR-ntregistrator de comportare a CO2 i O2
ARC-nregistrare i controlul concentraiei

3.1.1 Reglarea automat a temperaturii

n procesele din industria chimic, cldura este transferat prin radiaie, prin
amestecarea fluidelor reci i calde sau, cel mai frecvent, prin conducie prin pereii utilajelor.
Variabila manipulat este, de regul, debitul de agent termic.
Pentru schimbtoarele de cldur montate orizontal se recomand plasarea ventilului
de reglare pe conducta de alimentare cu abur (figura 3.1.1 ), iar pentru cele montate vertical,
pe conducta de evacuare a condensului (figura 3.1.2 ).
n primul caz, (figura 3.1.1) la o micorare a temperaturii lichidului nclzit, sub
valoarea de referin, regulatorul comand creterea debitului de abur. Aceast cretere
conduce la ridicarea rapid a presiunii n spaiul de abur i, ca urmare, la o mrire a
temperaturii de condensare i la un transfer de cldur mai intens ctre lichidul tehnologic.
n al doilea caz (figura 3.1.2), dac temperatura lichidului nclzit depete referinta,
regulatorul comand nchiderea parial a ventilului de reglare de pe conducta de condens. n
consecina, crete nivelul condensului, acesta acoperind o suprafaa mai mare a tuburilor
nclzitoare.

59

2
1
1

Figura 3.1.1

Figura 3.1.2

1-schimbtor de cldur
2-ventil de reglare
3-bucla de reglare temperatur TC
Deoarece timpul de retenie a condensului este apreciabil, rspunsul sistemului de
reglare este mai lent decat al celui din primul caz.
Dac reglarea automata temperaturii trebuie realizat rapid i schimbatorul de
caldureste supradimensionat, se recomand utilizarea schemei din figura 3.1.3. Aici 10%
pn la 30% din fluxul de lichid tehnologic este trimis pe o cale ocolitoare i amestecat, la
ieire, cu lichidul nclzit.
1

Figura 3.1.3
1-schimbtor de cldur

60

2-ventil de reglare
3-bucla de reglare temperature TC
Stabilizarea temperaturii n vaporizatoare folosete o schem de reglare n cascad:
temperatura (bucla supraordonat)-debit (bucla subordonat) ca in figura 3.1.4.Bucla de debit
stabilizeaz debitul de abur (la valoarea de referin dat de regulatorul de temperatur) nainte
ca abaterea acestui debit (ca perturbaie pentru vaporizator) s influeneze temperatura care
este parametrul reglat principal.
4
3
2

Figura 3.1.4
1-vaporizator
2-ventil de reglare
3-bucla de reglare debit FC
4-bucla de reglare temperature TC
Sisteme de reglare evoluat (mai ales n cascad) sunt curent utilizate i pentru
stabilizarea temperaturii n reactoare chimice.

61

3.1.2 Reglarea automat a pH-ului

Pentru obinerea pH-ului dorit al unei soluii se recurge la adugarea, n aceasta, ca

medii de reglare, a unor reactivi sub forma altor soluii de acizi sau baze, substane
pulverizante (CaCO3, CaO), substante gazoase (CO2, SO2, NH3 ) sau a unor soluii tampon sau
ageni de precipitare.
Sistemele de reglare pentru pH pot fi mparite n 2 categorii, dup scopul urmrit:
1.
reglarea pH-ului este o aciune suplimentar, avnd scop realizarea unei condiii
necesare pentru buna desfurare a procesului; un exemplu bun l constituie procesul de
fermentaie discontinuu unde, datorit unui timp ndelungat de staionare a masei de reacie n
reactor i a consumului lent de reactive adugat pentru stabilizarea pH-ului, reglarea este
destul de uor de ndeplinit i un regulator simplu, bipozitional, d satisfacie.
2.
stabilizarea pH-ului n reactoarele de neutralizare n care se amestec soluia
principal cu un reactiv, cu scopul de a se realiza un anumit pH; exemplul cel mai des ntlnit
este cel al tratrii continue al unor soluii sau al neutralizrii produselor reziduale.
Reglarea automat a pH-ului este afectat de o serie de dificulti specifice, dintre care
remarcm:
a. spre deosebire de reglarea altor parametri (nivel, debit, presiune ), unde se folosete
un singur mediu de reglare, n cazul stabilizrii pH-ului la o anumit valoare vor fi necesare,
uneori, 2 medii de reglare diferite ; este cazul, de pild, al neutralizrii unor ape reziduale, al
cror pH se poate abate n ambele sensuri, n raport cu valoarea prescris care, de regul, este
6-7; o atare situaie poate fi rezolvat adugnd fie reactive acid, fie reactive basic n funcie
de sensul n care se abate, iniial, pH-ul.
b. precizia cu care se poate reglat pH-ul este dependent de valoarea de
referint (figura 3.1.5 ), de faptul dac mediul reglat este puternic sau slab acid sau basic (fig
3.1.5 ), de valoarea abaterii primare i, binenteles, de precizia cu care se adaug reactivul de
neutralizare, n cm3 [reactiv/l soluie], la aceeasi valoare prescris.
Pentru a ne explica aceasta comportare, s plecam de la forma tipic, neliniar, a
curbelor de titrare care are aspectul unui S.

62

n figura 3.1.5 observm c, datorit acestui aspect, cu ct este mai departat de

valoarea pH=7, cu att crete precizia de reglare; astfel, dac referina este (pH) r1 (punctual 1),
plasata n apropierea punctului de echivalen, la o imprecizie de adugare a reactivului de +/(V), abaterea valorii reglate de la cea de referin este evident mai mare dect abaterea
corespunzatoare referinei (pH)r2 (punctual 2), pentru aceeai imprecizie de adugare a
reactivului.

Figura 3.1.5
3. existena, n bucl, a unor ntrzieri (timp mort i ntrzieri de capacitate)
apreciabile.
ntrzierea pur este dat, n principal, de timpul necesar transmiterii semnalului de la
punctul de adugare a reactivului de neutralizare (punctual A) pn la punctul de msurare
(punctual B ). Apropierea celor 2 puncte, ca n schema de reglare din figura3.1.6, n scopul
reducerii timpului mort, este limitat de necesitatea de a asigura un timp de reacie suficient de
lung.

63

1
2

Figura 3.1.6
1-bucla de reglare pH
2-ventil de reglare
A-punct de adugare a reactivului de neutralizare
B-punct de msurare
ntrzierea de capacitate este introdus att de traductorul de pH ct, mai ales, de
capacitatea rezervorului tampon de amestec, impus de acea necesitate de a asigura timpul de
reacie, ca n schema de reglare din figura 3.1.7.

Figura 3.1.7
1-rezervor tampon de amestec
2-bucla de reglare pH

64

3-ventil de reglare
Dac timpul de reacie este tr [s] atunci volumul rezervorului tampon, Vr [m3], se
calculeaz cu relatia :
Vr=F tr
unde : F[m3/s] - este debitul de soluie ce ntr n vas.
Mrind volumul vasului tampon atenum oscilaiile pH-ului soluiei reglate, avnd ca
rezultat creterea preciziei de reglare; n acelai timp, ns, crete ntrzierea de capacitate
introdus de rezervor n bucla de reglare, ceea ce mrete dificultatea reglrii;
O calitate bun a reglrii pH-ului este condiionat de o bun amestecare a soluiei
cu reactivul de neutralizare i, n fine, de o curire periodic a electrodului de masur a pHului.
Schema de reglare din figura 3.1.8 este utilizabil, ndeosebi, n situaiile n care
debitul soluiei al crei pH trebuie stabilizat este constant i reacia de neutralizare este rapid.
Dac reacia de neutralizare este lent i este nsoit de variaii mari de debit ale
mediului reglat se utilizeaz schema de reglare n cascad.
Ambele regulatoare ale cascadei sunt regulatoare de pH; cel din bucla supraordonat,
pHC-1, careeste informat asupra valorii msurate la punctual final, B, furnizeaz referina
celui din bucla subordonat, pHC-2, care stabilizeaz pH-ul n punctual A, imediat dup
ieirea din vasul tampon.
4

Figura 3.1.8
65

1-vas tampon
2-bucla de reglare pH 2
3-bucla de reglare pH 1
4-ventil de reglare
Pentru cazuri mai dificile, cum sunt cele ntlnite n neutralizarea apelor reziduale al
cror pH se poate abate n ambele sensuri, ceea ce impune utilizarea a 2 medii de reglare
diferite se poate folosi schema de reglare din figura 3.1.8 , o combinaie de reglare n cascada
cu o reglare cu divizarea comenzii.
Regulatorul supraordonat pHC-1, informat asupra pH-ului n punctual final B,
comand debitul de reactiv bazic, ca variabil manipulat i, n acelai timp, furnizeaz
referin pentru regulatorul subordonat pHC-2 care stabilizeaz pH-ul n punctul intermediar
A. Regulatorul subordonat va comanda, n regim de divizare, dou mrimi de execuiedebitele celor 2 reactivi disponibili.
3.1.3Reglarea automat a concentraiei

Reglarea automat a concentraiei n reactoare este realizat de cele mai multe ori
indirect, stabiliznd direct ali parametri care influeneaz defurarea procesului de reacie:
temperatura, debitele de reactani, timpii de staionare n reactor.Deseori nici nu este nevoie de
o reglare a concentraiei n reactor deoarece se urmrete obinerea conversiei maxime
posibile.
Reglarea automat direct a concentraiei este justificat n cazurile n care viteza de
reacie fluctueaz, datorit modificrii activitii catalizatorului, a temperaturii sau a puritii
fluxurilor de alimentare i abaterile concentraiei produsului au efecte economice
semnificative.De exemplu, concentraia unui produs poate trece printr-un maximum dup care,
creterea conversiei reactanilor duce la descompunerea acestuia ntr-o serie de produse
secundare. n acest caz, reactorul trebuie automatizat avnd ca scop obinerea unei concentraii
optime a produsului care, n mod obinuit, poate fi mai mic dect valoarea maxim.
Utilizarea schemelor de reglare bazate pe msurarea automat a concentraiei este,
nc, puin practicat deoarece:
66

analizoarele automate au, de regul, un domeniu limitat de aplicare; ele pot analiza

numai concentraia ntr-un anumit component pe cand aparatele care msoar

temperaturi, debite, presiuni, funcioneaz indiferent de natura mediului masurat;
analizoarele introduc n bucla de reglare ntrzieri mari de transport (timpi necesari

pentru prelevarea probei, analiza ei i comunicarea rezultatului), chiar dac sunt

montate n flux i nelineariti;
de regul, analizoarele sunt aparate puin robuste cu fiabilitate redus i ntreinere
pretenioas.

Se prefer reglarea concentraiei msurnd ali parametri care descriu, cu aproximaie,

compoziia sau gradul de conversie: densitatea, indicele de refracie, vscozitatea.
Mai des ntlnim reglarea concentratiei amestecurilor de lichide sau de gaze.Dm in figura
3.1.9 schema stabilizrii concentraiei soluiei la iesirea dintr-un amestecator de lichide i n
figura 3.1.10 schema reglrii concentraiei produsului unui amestecator de gaze.
4
3

1
2

Figura 3.1.9
1-amestector de lichide
2-bucla de reglare a concentraiei
3-ventil de reglare
4-bucla de reglare debit

67

n figura 3.1.9 msurarea concentraiei se realizeaz cu un analizor ca aparat de msur

pe ramura de reacie a buclei 1, montat n flux pe o cale ocolitoare variabila manipulat este
debitul de concentrare la intrarea n amestector.
1

Figura 3.1.10
1-ventil de reglare
2-bucla de reglare concentraie AC
3-bucla de reglare debit FC
n figura 3.1.10 se folosete drept aparat de masur un analizor de compoziie a
amestecurilor de gaze analizor specific tipurilor de componente care se amestec montat,
deasemenea, pe o derivaie a conductei de ieire a produsului; variabila manipulat n bucla I
este debitul unuia dintre componeni (gaz A).
n ambele situaii, stabilizarea concentraiei este uurat adugnd, la buclele I, circuite
de stabilizare ale debitelor componentelor care nu sunt mrimi de execuie (diluant, respective
gaz B, buclele II); n acest fel se elimin fluctuaiile de debit ale acestor componente, fluctuaii
care se manifest ca perturbaii pentru sistem.

3.1.4 Reglarea concentraiei oxigenului

n cazul msurtorilor de oxigen dizolvat n lichide biologice ale diferitelor procese

biochimice industriale, moleculele sau monomoleculele deranjeaz msurtorile de oxigen ce
utilizeaz senzori cu membrane permeabile pentru oxigen sau senzori galvanici pentru
68

determinarea oxigenului n flux (figura3.1.11) . Aceti senzori de lucru ai celulei izolai de

mediul de msurat prin intermediul unei membrane din material plastic careeste permeabil
pentru oxigen i impermeabil pentru marea majoritate a substanelor care ar putea fi reduse la
catod odat cu oxigenul.

1.-catod
2.-anod
3.-membrana
4.-electrolit
5-proba
Figura 3.1.11 Aparat pentru determinarea oxigenului dizolvat

Membrana ntins la partea inferioar a senzorului reine un film de elecrolit la

suprafaa catodului.
Senzorii galvanici pentru determinarea oxigenului dizolvat sunt diferii de cei
amperometrici prin faptul c nu necesit o surs extern de voltaj (figura 3.1.11). n acest caz
diferena de potenial necesar, se asigur prin alegerea convenabil a anodului i a
electrolitului, astfel nct, dup scurtcircuitarea electrozilor s se produc o electroliz intern,
este necesar ca tensiunea generat prin dizolvarea anodului s fie suficient pentru reducerea
spontan a oxigenului la suprafaa catodului.
Ca anozi se folosesc metale mai active, cum ar fi: Zn, Cd, Pb, iar catozii se constituiesc
din metale mobile cum ar fi: Pt, Au, Ag. Astfel, pentru un senzor galvanic cu catod de argint i
anod din plumb, reaciile electrochimice care au loc pe electrozi sunt date de ecuatiile:

69

Catod: O2 + 2H2O + 4e 4HO

Anod: 2Pb 2Pb2+ + 4e
Iar n soluia de electrolit se produce reacia secundar:
2Pb + 4HO 2Pb (OH)2
Reacia global a senzorului se obine prin nsumarea reaciilor de mai sus:
O2 + 2Pb + 2H2O 2Pb (OH)2

1.-catod; 2.- anod; 3.-oxigen dizolvat; 4.-electrolit;

5.-ampermetru sensibil
Figura 3.1.12 Principiul de realizare al unui senzor galvanic pentru oxigen
n cazul senzorilor galvanici, se observ c electrolitul nu particip la reaciile
electrolitice, n schimb suprafaa anodului oxideaz treptat. Variaia senzorului depinde astfel
de suprafaa disponibila anodului.
ntruct nu exist o surs extern de voltaj pentru producerea reducerii electrolitice a
oxigenului din soluie, senzorii galvanici sunt mai simpli n construcie comparativ cu cei
amperometrici.
n general, senzorii amperometrici sau galvanici pentru determinarea oxigenului,
prezint un curent rezidual de baza mai mare dect n cazul celulelor polarografice cu electrod
de Hg. Aceasta se datoreaz depunerii sau desprinderii a diferii compusi (ex: oxizi) , pe sau de
pe suprafaa electrozilor. Din aceste considerente, pentru obinerea unor rezultate

70

reproductibile, se impune un pretratament chimic sau mecanic al electrozilor naintea utilizrii

acestora. De asemenea sunt necesare recalibrri periodice ale celulelor respective.
Pe baza principiilor de funcionare ale senzorilor pentru oxigen acoperii cu membrane,
s-au realizat i comercializat cteva tipuri constructive mai importante.
Unul din acesti senzori este senzorul Clark.
Senzorul Clark, a crei reprezentare schematiceste redat n figura 3.1.13, este realizat
dintr-un catod de platin sub forma unui disc plat i o incint cu electrolit (soluie KCl), n
care se gsete imersat anodul din argint. Membrana, din teflon, cu o grosime de 25m, se
ntinde la partea inferioa a senzorului prin intermediul unui inel din cauciuc, reinnd astfel
ntre aceasta i catod un film de electrolit furnizat din rezervorul cu electrolit al senzorului.
Senzorii de acest tip prezint adesea, la nceputul perioadei de lucru, o variaie a
curentului de difuzie. Aceste variaii n funcionare se datoresc depozitrii n timp a AgCl pe
suprafaa anodului, depunerii de argint pe suprafaa catodului, sau reducerii pn la eliminarea
total a clorului din electrolit. Curnd ns din timp n timp electrozii, schimbnd electrolitul
i nlocuind periodic membrana, senzorul poate funciona timp ndelungat. Evident, dup
fiecare condiionare n acest fel a
senzorului,
se
impune
o
recalibrare a msurtorilor.
1.-catod
2.-anod
3.-electrolit
4.-membrana
5.-corpul senzorului
6.-inel de cauciuc
Figura 3.1.13 Reprezentarea schematic a unui senzor pentru oxigen tip Clark
Prin utilizarea corect a unui senzor de tip Clark cu membran din teflon, cu o grosime
de 25m, aproximativ 95% din semnalul analitic n regim staionar se obine n 15 20
secunde.

71

Acest senzor prezint ns un rspuns histerezis; rspunsul este mai rapid pentru
msurtori ale unor concentraii cresctoare fa de msurtori ale unor concentraii
descresctoare n oxigen (figura 3.1.14). Aceast comportare, care const n stabilizarea mai
nceat a rspunsului senzorului la efectuarea msurtorilor unor soluii cu un coninut mai
mic de oxigen fa de proba precedent, a fost explicat prin difuzia lateral a O 2, ctre
rezervorul de electrolit, care este foarte aproape de catod. Pentru eliminarea acestui fenomen
au fost realizai o serie de senzori cu cantiti mici de electrolit n rezervor, sau prin localizarea
rezervorului ntr-o poziie mai departat de catod.

Figura 3.1.14 Rspunsul histerezis al unui senzor O2

1).

concentraii cresctoare

2). concentraii descresctoare

Reglarea automat a nivelului

Schemele de reglare a nivelului, precum i tipul de regulator utilizat, depind de:

1. obiectivul urmrit prin reglarea automat:
a) pentru meninerea, cu precizie ridicat, a unui nivel constant (n reactoare,
tamburele cazanelor de abur) se va folosi un regulator PI;
b) pentru reglarea nivelului n limite largi (vase tampon, rezervoare de depozitare,
rezervoare de decantare din instalaiile de tratare a apelor uzate) se utilizeaz regulatoare P,
montate ca n figura 3.1.15.

72

1-vas tampon
2-ventil de reglare
3-bucla de reglare nivel LC
Figura.3.1.15
Aici, nivelul va fi meninut ntre limitele date de poziiile A i B; n aceste cazuri, mai
important dect stabilizarea nivelului este stabilizarea debitului de ieire din rezervoare;
2. mrimea manipulat disponibil: debitul fluxului de intrare, Fi,sau debitul fluxului
de iesire, Fe,din rezervor.
Alegerea variabilei manipulate este dictate de poziia rezervorului n schema
tehnologic din care face parte. Astfel, dac principala perturbaie apare pe calea de evacuare a
lichidului (rezervor intermediar care alimenteaz alte utilaje), ventilul de reglare se plaseaz
pe conducta de intrare (fig. 3.1.16) i invers, dac variaia debitului de intrare este perturbaia
major (rezervoare de depozitare, rezervoare tampon n coloane de distilare, reactoare cu
amestec) variabila manipulat va fi debitul de evacuare (fig. 3.1.17).

1
3

Figura 3.1.16

Figura 3.1.17

1-vas tampon

73

2-bucla de reglare nivel LC

3-ventil de reglare

La scderea nivelului sub valoarea de referin, de pild, regulatorul va comanda

deschiderea, n plus, a ventilului de reglare (fig.nr.3.1.16) sau nchiderea lui (fig.nr.3.1.17)
pn la anularea abaterii.
3.presiunea din rezervor.
n cazul unui rezervor nchis, cu seciune transversal mare i cu suprapresiune
depind considerabil presiunea hidrostatic, variaii ale suprapresiunii vor induce abateri
relative mici ale nivelului dar modificri nseminate ale debitului de ieire.

1
2
3

Figura 3.1.18
1-vas tampon
2-bucla de reglare nivel LC
3-ventil de reglare
Pentru aceste situaii se recomand reglarea nivelului cu SRA evaluate, n cascad i
nivel-debit ca n figura 3.1.18.
Dac perturbaia este modificarea debitului Fi, atunci abaterea nivelului este eliminat
prin aciunea cascadei nivel-debit dac perturbaia este variaia suprapresiunii, atunci bucla
de debit reacioneaz rapid, modificnd debitul Fe, nainte ca perturbaia s provoace abateri
semnificative ale nivelului;

74

4. tipul de proces-cu autostabilizare (rezervoare deschise cu evacuare liber sub

influena presiunii hidrostatice) sau fr autostabilizare (rezervoare cu evacuare forat
asigurat de o pomp cu debit constant sau rezervoare nchise cu suprapresiune) nu
modificschemele de reglare i este luat n considerare doar la alegerea regulatorului i la
acordarea acestuia.
3.1.5 Reglarea nivelului spumei
Aeraia i agitarea intern necesar a se efectua n procesele biochimice industriale, are
ca efect formarea de spume, uneori deosebit de abundente.
n orice biosintez industrialeste absolut necesar efectuarea unui control al formrii
spumei pe toat durata desfurrii procesului.
Operaiile de control i reglare sunt efectuate automat sau continuu pe toat durata
procesului biochimic respectiv.
Aceast problem este rezolvat relativ simplu prin cuplarea controlului analitic al
formrii spumei, cu introducerea n bioreactor a agenilor de antispumare cu o viteza care
trebuie s depind de nivelul spumei. Senzorii sau electrozii de contact reprezint cea mai
simpl soluie pentru controlul formrii spumei.
Aceste sisteme (figura3.1.18) sunt constituite din dou fire metalice fixate ntr-un corp
izolant a cror capete sunt plasate la o foarte mic distant unul de altul (asemanator brejiilor
de la automobile).
Acest tip de senzor se plaseaz la o anumit nlime deasupra mediului lichid din
interiorul bioreactorului.
Prin ajungerea spumei la extremitile capetelor neizolate ale firelor metalice, se
realizeaz practic un contact electric cu apariia unui semnal analitic, care dup o prealabil
amplificare poate declana un sistem de avertizare optic (un bec luminos), acustic (o sonerie
sau siren) sau ambele. Simultan, semnalul dat poate aciona sprgtorul mecanic de spumsau
dupun anumit interval de timp sistemul de adugare a agentului antispumare.

75

1.- nivelul lichidului mediu de cultura;2.- spuma;3.- corpul senzorului;4.- sursa electric;5.avertizor optic;6.- avertizor acustic
Figura 3.1.19 Principiul constructiv al unui senzor de contact pentru controlul formrii spumei
n cazul sistemelor de contact, de control al formrii spumei, au fost descrise i
dispozitive bazate pe utilizarea unor electrozi capacitivi acoperii cu teflon.
La toate aceste sisteme cu electrozi de contact, dup scderea nivelului spumei, prin
acionarea mecanic, fizic sau chimic, se produce implicit deschiderea circuitului electric i
ntreruperea sistemelor de combatere a formrii spumei. n acest mod, ori de cte ori are loc o
cretere a nivelului spumei peste o anumit limit la care este plasat senzorul, are loc
declanarea sistemelor de avertizare i combatere a spumei, iar dup scderea nivelului
spumei, sunt deconectate sistemele respective (figura 3.1.20).

Figura 3.1. 20. Reprezentarea schematic a unui sistem automat de control al formrii
spumei i reglare automat a antispumanilor
76

1.-senzor
2.-spuma
3.-lichid
4.-sistem de amplificare
5.-electrovalva
6.- rezervor de lichid antispumant
7.-sisteme de egalizare a presiunii

Bazat pe utilizarea electrozilor de contact au fost realizate i sisteme de control

automat al formrii spumei i conectare gradat a diferitelor dispozitive de combatere a
formrii spumei. Un asemenea sistem, utilizabil n procese de culturi microbiene, se prezint
sub forma unei scheme bloc, n figura 3.1.21.

Figura 3.1.21 Schema unei instalaii de control al formrii spumei

1 bioreactor; 2 senzor de contact; 3 blocul de control; 4 dispozitiv de conectare
a sistemului mecanic de spargere a spumei; 5, 6 sisteme finale de introducere a
antispumanilor; 7, 8, 9 declanatoare ale dispozitivelor de combatere a formrii spumei; 10,

77

11 dispozitive de prevenire a conectrii simultane a tuturor sistemelor de reglare i

combatere a formrii spumei;12, 13 circuite logice; 14, 15 rezervoare cu antispumani

Cnd n bioreactorul 1 spuma ajunge la nivelul senzorului 2, apare un semnal care

ajunge apoi la blocul de control 3, care pune n funciune dispozitivul 7, ce controleaz primul
mecanism de spargere a spumei 4 (de exemplu un disc rotitor rapid). Dac formarea spumei la
nivelul senzorului 2 se ntrerupe, atunci elementele finale de combatere chimic a spumei 5 i
6, nu se comut. Dac sistemul mecanic 4 nu reuete s opreasc formarea spumei sau spuma
se formeaz din nou, atunci prin linia ulterioar 10, semnalul de ieire ajunge la circuitul logic
12 (de tip AND), cnd se conecteaz cu senzorul 2, cea de a dou linie de combatere a formrii
spumei, prin intermediul dispozitivului 8. Se activeaz (prin furnizarea unui impuls la o valva
solenoid) dispozitivul auxiliar 5, de introducere a unor antispumani din rezervorul 14. Dac
i acest caz combaterea spumei nu este eficient, astfel nct nivelul acesteia s scad la o
poziie sub senzorul 2, se activeaz ntr-un mod similar sistemul final de reglare 6, care
ntroduce n bioreactor un antispumant de mai mare eficien. Dispozitivele 10 i 11 are rolul
de a preveni conectarea simultan a tuturor sistemelor finale de reglare i combatere a formrii
spumei, atunci cnd spuma intr n contact cu senzorul 2. De asemenea, dispozitivul este
prevzut i cu un sistem pentru ntreruperea ansamblului 7, dup un anumit interval de timp (5
sau 30 minute) dup care revine la poziia iniial. Prile operatorii ale sistemelor mecanice
de distrugere a spumei, pot fi bineneles diferite [tefan Ungureanu i Corneliu
Pertril,2001].

78

3.2 Controlul de calitate

3.2.1 Metode de analiza a materiilor prime
Reactivii folosii pentru analiza trebuie s fie de calitatea pentru analiza sau de
calitate echivalent. Apa trebuie s fie distilat.
Examenul organoleptic
Examenul organoleptic se face asupra probei aduse la temperatura de 20oC.
Pentru verificarea aspectului, culorii i a corpurilor strine, o parte
din proba de glucoza lichid se ntroduce ntr-un vas de sticl incolorsi a materialelor
intermediare

Glucoza
cu diametrul de 7-12 cm, iar proba de glucoz solid se secioneaz cu un cuit n
buci de cca. 250 g. Verificrile respective se fac la lumina natural a zilei sau la o surs de
lumina, pe fondul unei hrtii albe.
Gustul si mirosul se apreciaza asupra probei respective prin degustare si mirosire.
Determinarea culorii glucozei
Principiul metodei: se adaug soluia de iod 0,1 n n ap, n condiii determinate, pn
se obine o culoare identic cu cea a glucozei lichide de analizat.
Mod de lucru: ntr-un pahar de laborator se introduc 100 ml din proba de glucoz
lichid. ntr-un alt pahar identic se introduc 100 ml ap, n care se adaug cu ajutorul unei
biurete, pictur cu pictur, soluie de iod, pn cnd coloraia din cele dou pahare este
identic. Compararea se face la volume egale de lichid. Coloraia celor dou pahare se
constat cu ochiul liber la lumina zilei, pe fondul unei hrtii albe.
Exprimarea rezultatelor:Culoarea se exprim prin volumul soluiei de iod 0,1 n
folosit pentru egalarea culorii, n ml.
Determinarea aciditatii

79

Principiul metodei:proba de analizat, dizolvat n ap, se titreaz cu hidroxid de

sodiu, soluie 0,1 n n prezen de fenolftalein soluie 1% n alcool etilic 70% vol.
Mod de lucru: se msoar cu pipeta 100 ml din soluia de lucru obinut anterior i se
introduc ntr-o capsul de porelan. Se titreaz cu soluie de hidroxid de sodiu n prezen
fenolftaleinei, pn la apariia coloraiei roz, care persist timp de 1 minut. Se executn
paralel dou determinri din aceeai soluie de lucru.
Calcul: aciditatea se exprim n grade de aciditate. 1 grad de aciditate reprezint
volumul n ml de solutie de NaOH n, necesar pentru neutralizarea acizilor liberi din 100 g
produs. Aciditatea se calculeaza cu relatia:
Aciditate

V 2 0,1
V
100= ,[grade ]
40
2

unde : V- volumul soluiei de NaOH 0,1 n, folosit la titrare,ml.

Determinarea umiditii
Determinarea umiditii se face prin: metoda picnometric, obligatorie n caz de
litigiu i metoda refractometric, rapid.
Metoda picnometrica
Principiul metodei: se determin cu ajutorul picnometrului densitatea soluiei de
glucoz de 20 g/100 ml i n funcie de aceasta se stabilete coninutul de substant uscat i
respectiv de umiditate.
Mod de lucru: se umple picnometrul cu soluie de lucru obinut anterior i se ine n
termostat 30 min la temperatura de 20 C.Se determin densitatea relativ conform STAS
184/2-71, iar din tabel se deduce coninutul n substan uscat, corespunzator densitii
relative determinate.
Calculul : %s.u.= 100-Su
n care s.u. reprezint coninutul de substan uscat , n % citit n tabelul din anexa A.
Metoda refractometrica

80

Principiul metodei: se citete la refractometru coninutul de substan uscat solubil

(exprimat n zaharoz) din soluia de glucoz cu concentraia de 20 g/100 ml i n funcie de
acesta se stabilete coninutul de substana uscat i respectiv de umiditate.
Mod de lucru: pe prisma fixa a refractometrului se picur cu ajutorul unei baghete 2
sau 3 picturi din soluia de lucru obinut anterior i se nchid prismele imediat. Se deplaseaz
ocularul pn la suprapunerea reperului cu linia de separare a celor dou cmpuri. Apoi se
citete direct coninutul de substana uscat a substanei de lucru. Se efectueaz dou
determinri din soluia de lucru.
Calcul .continutul de substan uscat al probei de analizat, exprimat n %, se calculeaz cu
relaia:
% s.u

c V
100
m100

n care: c- coninutul de substan uscat citit la refractometru. %.

v- volumul soluiei obinute, ml.
m- masa probei de analizat luate pentru pregtirea soluiei de lucru. G.
Determinarea continutului de dextroza
Principiul metodei: se reduce la cald o soluie alcalin de sare cupric, cu ajutorul
zaharurilor reductoare din proba de analizat. Oxidul cupros rezultat din reacie se titreaz
indirect cu soluie de tiosulfat de sodiu (metoda Luff-Sghoorl).
Mod de lucru: ntr-un balon cotat de 1000 ml se introduc circa 5 g glucoz sau circa 3
g glucoz solid, se dizolv prin agitare cu apa i se aduce la semn cu ap. ntr-un vas
Erlenmeyer de 200-300 ml se introduc 25 ml soluie cupric i 25 ml din soluia de
analizat obinut anterior, msurai cu pipeta, peste care se adaug cteva bucele de
piatr ponce. Vasul se ataeaz la un refrigerent cu reflux, se aeaz pe o sit de azbest
avnd o deschidere cu diametrul de 6,5 cm i se aduce la fierbere n 2-3 minute, dup
care se menine n fierbere moderat exact 10 minute. Se rcete imediat la temperatura
camerei.
Se adaug soluia de KI, apoi 25 ml acid sulfuric n proporii mici pentru a evita
spumarea, dar ct mai repede posibil i agitnd continuu. Se titreaz cu soluie de tiosulfat de
81

sodiu pn la culoarea slab glbuie, se adaug pn la 2-3 ml soluie de amidon i se continu

titrarea pn la dispariia culorii violet.
Se execut o determinare martor cu aceeai reactivi, nlocuind cei 25 ml de soluie de
analizat cu ap. Se efectueaz dou determinri din aceeai prob.
Calculul : Coninutul de dextroz, exprimat n % i raportat la s.u., se calculeaz cu
formula:
%dextroza

c 40
100

100
m1000 100U

n care: c- cantitatea de dextroza, mg;

m- masa probei luat pentru determinare, %;
U- coninutul de umiditate a probei, %.
Extractul de porumb
Metoda de analiza a aminoacizilor
aminoacizii, n prezena ninhidrinei, formeaz un compus albastru violet, care
prezint un maxim de absorbie la 570 nm sau prin descompunere enzimatic ionii de amoniu
formai pot fi dozai spectrofotometric, permind dozarea direct a azotului din aminoacizi
(metode spectrofotometrice).
Cromatografia cu gradient de pH st la baza funcionrii unor analizoare automate
pentru aminoacizi (figura 3.2.1).

82

Figura 3.2.1 Principiul constructiv al unui analizor de aminoacizi cu eluie n gradient

de pH
1 coloana cromatografic termostat;
2 rezervor cu soluie tampon de pH;
3 soluie cu reactiv de culoare pentru determinarea spectrofotometrica a
aminoacizilor (ninhidrina);
4 camera de amestecare;
5 serpentina pentru rcire;
6 spectrofotometru ;
7 nregistrator;
8 pompe;
9 proba de analizat.
Aceste analizoare folosesc n general separarea pe o coloan cromatografic
termostatat (1) umplut cu schimbtori de ioni, iar eluarea se face cu soluie tampon (2), cu
diferite valori ale pH ului, dup un program prestabilit obinerea unui gradient de pH cu
rezoluie maxima, ntr-un timp minim.
83

Detecia se efectueazspectrofotometric, pe baza reaciei de culoare pe care o dau

aminoacizii eluai de pe coloana, cu ninhidrina.

Absoria optic a compusului dorit se msoar la 440 i 570 nm cu un spectrofotometru

cu dublu fascicul (6), iar semnalul analitic obinut care e direct proporional cu concentraiile
diferiilor aminoacizi din proba de analizat, se nregistreaz grafic cu ajutorul unui
nregistrator.

84