TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

8. Analiza chimică calitativă a produselor vegetale

Examenul chimic calitativ al compușilor extrași cu solvenți

8.1. Generalități

Stabilirea compoziției chimice a unei specii vegetale se poate realiza cu ajutorul analizei
chimice calitative, utilizând extracția cu diferiți solvenți.
Separarea principalelor grupe de compuși naturali (principii active) se realizează cu
ajutorul extracției succesive și selective a materialului vegetal cu solvenți de polarități diferite.
Primele extracții ale produsului vegetal se realizează cu un solvent nepolar (eter etilic, eter de
petrol, benzen, hexan, cloroform), apoi cu un solvent polar (etanol, metanol) și în final cu apă.
Astfel în urma extracțiilor se obțin următoarele extracte:
A. Extractul eteric – conține compușii lipofili
B. Extractul alcoolic
conțin compușii chimici hidrofili
C. Extractul apos

Pentru identificarea compușilor chimici din cele 3 extracte obținute, acestea sunt analizate
separat, folosind metode corespunzătoare proprietăților fizico-chimice ale fiecărui grup de
compuși naturali.

8.2. Obținerea extractelor

8.2.1. Obținerea extractului eteric

10-20 g produs vegetal (proaspăt sau uscat) fin mărunțit se extrag cu eter etilic într-un
aparat cu extracție continuă (tip Soxhlet) sau prin agitare mecanică sau manuală, în repetate
rânduri, la temperatura ambientă, până când soluția eterică nu mai lasă reziduu le evaporare.
Extractele eterice obținute sunt reunite, filtrate și concentrate la 50 mL cu ajutorul unui
rotaevaporator. Acest extract conține compușii chimici liposolubili (uleiuri volatile, substanțe
grase, steroli, triterpene, carotenoide, acizi grași, alcaloizi baze, agliconi, cumarine, clorofilă).

8.2.2. Obținerea extractului alcoolic

Produsul vegetal rămas de la extracția cu eter, se aduce într-un vas conic de capacitate
potrivită sau într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent. Se adaugă 100-150 ml alcool se
montează refrigerentul și se realizează extracția la cald pe baie de apă timp de 20 – 40 minute. În

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

cazul în care este necesar extracția se repetă. extractul alcoolic se filtrează prin hârtie. Produsul
vegetal se spală cu cantități mici de alcool cald și se filtrează prin același filtru.
Extractul alcoolic obținut se concentrează la 50 mL. Acesta poate conține grupe importante
de compuși naturali cum ar fi: polifenoli, aminoacizi, glicozide polifenolice (flavonoide,
cumarine), sterolice sau triterpenice.

8.2.3. Obținerea extractului apos

Produsul vegetal rămas de la extracția cu alcool este uscat și apoi supus extracției cu 50-
100 mL apă distilată la cald, timp de 15-20 minute. Extractul astfel obținut se filtrează și se
concentrează la 50 mL.
Clasele de compuși chimici care pot fi extrase din produsele vegetale cu ajutorul apei sunt:
glucide (oze și polioze), glicozide (heterozide), taninuri, substanțe proteice, alcaloizi săruri etc. în
general în cazul în care extracția cu alcool a fost totală, în extractul apos nu mai pot fi identificați
acești compuși chimici.
Extracția cu apă este preferată în cazul produselor verzi datorită faptului că această nu
extrage clorofila.
Această serie de extracții poate fi reprezentată schematic astfel:

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

10-20 g produs vegetal

Extracție cu eter

Filtrare

Produs vegetal Extract eteric

Uscare Reacții de
identificare a
compușilor naturali
Extracție cu alcool

Filtrare

Produs vegetal Extract alcoolic

Uscare Reacții de
identificare a
compușilor naturali
Extracție cu apă

Filtrare

Produs Extract apos

vegetal
epuizat
Reacții de
identificare a
compușilor naturali

Figura 8.1. Schema de separare a compușilor naturali dintr-un produs vegetal

8.3. Identificarea compușilor naturali extrași

În continuare sunt prezentate schematic reacțiile de identificare ce pot fi realizate pe

fiecare extract în parte (Figura 8.2. a-c ).

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

Figura 8.2. a

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

Figura 8.2. b

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

c.

Figura 8.2. identificarea compușilor naturali din extractul eteric (a), alcoolic (b) și apos (c)

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

Materiale necesare:
- Apă distilată
- Acid acetic
- n-butanol
- Na2SO4 anhidru
- NaOH 0,5 N
- H2SO4 conc
- HCl conc. și 2%
- Anhidridă acetică
- Cloroform
- n-hexan
- Acetonă
- Acetonitril
- Etanol
- soluție acetonică de ninhidrină 1 %
- șpan de magneziu
- plăcuțe cromatografice
- Reactivul Mayer: 1,35 g HgCl2 se dizolvă în 60 mL apă, după care se adaugă 5 g KI
dizolvată în 10 mL apă și se completează la 100 mL.
- Reactivul Bertrand: 5 g acid silicowolframic (H4[Si(W₃O₁₀)₄]) se dizolvă în 80 mL apă,
după care se adaugă 0,1 mL HCl 10 % și se completează cu apă până la 100 mL
- Reactivul Carr-Price: 27 g SbCl3 se dizolvă în 100 mL CHCl3 prin încălzire la
40-50 °C, după care se adaugă 5-10 g Na2SO4 anhidru și se lasă în repaus 20 min agitând din
când în când. Soluția se utilizează proaspăt preparată.
- Reactivul Styassny: HCl conc : aldehida formică 1:2
- Reactiv Fehlin I și II
- MeOH
- Sticlărie de laborator
- Plită electrică

8.3.1. Examenul chimic calitativ al extractului eteric

8.3.1.1. Identificarea uleiurilor volatile
Se distila la sec 20 mL extract eteric. Prezența uleiul volatil este evidențiată de obținerea
unui reziduu cu miros plăcut, aromat. Extragerea uleiului volatil se realizează prin extracții repetate
cu volume mici de alcool. Fracțiunile alcoolice astfel obținute se concentrează.
Pentru confirmarea prezenței uleiurilor volatile, 10-50 g produs vegetal uscat și mărunțit
se supun antrenării cu vapori de apă sau distilării cu apă într-un aparat Neo Clevenger. Uleiul
volatil astfel obținut poate fi caracterizat organoleptic (aspect, culoare, miros) și fizico-chimic
(densitate, indice de refracție, compoziție chimică).

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

În cazul produselor vegetale cu conținut ridicat de uleiuri volatile se recomandă realizarea

extracției atât din materialul proaspăt recoltat cât și din cel uscat, pentru a putea compara calitatea
și randamentul uleiului în funcție de natura materialului.
Determinările calitative și cantitative ale constituenților uleiurilor volatile se pot utiliza
diferite metode cromatografice (CSS, HPLC și GC – metoda cea se pretează cel mai bine analizei
uleiurilor volatile).

8.3.1.2. Identificarea substanțelor grase

Substanțele grase se găsesc în reziduul extractului eteric după extracția uleiului volatil cu
etanol.
Mod de lucru
Reziduul se tratează cu 10 mL soluție alcoolică de NaOH 0,5 N și se fierbe la reflux pe
baia de apă până ce la suprafață nu se mai observă picături de ulei (1-2 ore). Se distilă alcoolul, iar
reziduul se dizolvă în 15-20 mL apă distilată fierbinte, după care se aduce într-o pâlnie de separare.
Balonul se spală de mai multe ori cu cantități mici de apă distilată fierbinte care se aduc în aceeași
pâlnie de separare. După răcire balonul se spală de două ori cu eter. Soluțiile eterice se aduc în
pâlnia de separare peste soluția apoasă răcită și se agită pentru extracția compușilor
insaponificabili. Extracția se repetă de două ori cu câte 8 mL eter. Extratele eterice reunite se
deshidratează cu Na2SO4 anhidru. În extractul eteric astfel obținut se pot identifica: steroli,
triterpene și carotenoide.
În pâlnia de separare rămâne soluția apoasă alcalină care conține sărurile de potasiu ale
acizilor grași superiori, flavonelor și antrachinonelor (ultimele două componente pot colora soluția
în galben respectiv, în roșu).

8.3.1.3. Identificarea acizilor grași

Soluția apoasă alcalină din pâlnia de separare se tratează cu HCl concentrat până la pH 3-
4. Soluția devine opalescentă datorită acizilor grași, aceștia extrăgându-se cu eter etilic sau eter de
petrol (3 x 25 mL). Extractele eterice reunite se deshidratează cu Na2SO4 anhidru. Obținerea unui
reziduu onctuos prin concentrarea extractului eteric (distilare) denotă prezența acizilor grași.
Identificarea acestor acizi poate fi realizată cu ajutorul cromatografiei planare (pe hârtie sau în
strat subțire).

8.3.1.4. Identificarea acizilor rezinici

Dacă prin acidularea soluției apoase alcaline care a fost epuizată de substanțe
insaponificabile apare un precipitat, o mică porțiune din acesta de dizolvă în 10 mL eter de petrol
și se verifică prezența acizilor rezinici. Soluția eterică se agită într-o eprubetă cu 5 mL soluție
acetat de cupru 1%. Dacă sunt prezenți acizii rezinici, stratul eteric se colorează în albastru-verde
până la albastru, datorită rezinaților de cupru.

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

8.3.1.5. Identificarea alcaloizilor baze

10 mL extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baie de apă. Reziduul astfel obținut se
dizolvă la cald (pe baie de apă), în 1,5 mL HCl 2%, prin amestecare cu o baghetă de sticlă. Soluția
decantată sau filtrată se împarte în mod egal în două eprubete. Una din probe se folosește ca martor,
iar în cea de a doua se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer. Dacă acesta din urmă dă un precipitat
evident de culoare alb-gălbuie înseamnă că alcaloizii sunt prezenți. Aceleași rezultate de obțin și
dacă la identificare se utilizează reactivul Bertrand.
8.3.1.6. Identificarea agliconilor flavonici
3-5 mL extract eteric se evaporă într-o capsulă pe baie de apă. Reziduul astfel obținut se
dizolvă la cald (pe baie de apă), în 1-2 mL metanol. Soluția de culoare galbenă se aduce într-o
eprubetă, se adaugă 2-3 bucăți de șpan de magneziu și 10 picături de HCl concentrat. Apariția unei
colorații roșii-portocalii indică prezența agliconilor flavonici. Această reacție poartă numele de
reacția Shibata sau reacția cianidolului.

8.3.1.6. Identificarea sterolilor și triterpenelor

3-10 mL extract eteric deshidratat se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (sub nișă).
Reziduul rezultat se dizolvă în 0,5 mL cloroform, apoi se adaugă 0,5 mL anhidridă acetică. Soluția
rezultată se trece într-o eprubetă uscată, după care cu ajutorul unei pipete Pasteur se adaugă pe
fundul eprubetei 1-2 mL H2SO4 concentrat. Prezența sterolilor/ tritrpenelor este evidențiată de
apariția unui inel roșu-brun sau violet în zona de contact a celor două lichide, iar stratul superior
se colorează (după 5-10 min) în verde- albastru sau violet (reacția Liebermann-Burchard).
Dacă prin dizolvarea reziduului în cloroform și anhidridă acetică se obține o soluție de
culoare verde (datorată clorofilei), aceasta se împarte în două eprubete: una din eprubete servește
la realizarea reacției, iar cea de a doua ca martor de culoare.

8.3.1.7. Identificarea carotenoidelor

3-10 mL extract eteric deshidratat se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (sub nișă).
Reziduul rezultat se tratează cu 2-3 picături de reactiv Carr-Price. Pigmenții carotenoidici dau cu
acest reactiv o colorație albastră care trece în roșu.
Identificarea carotenoidelor se poate realiza și cu ajutorul H2SO4 conc, caz în care acestea
dau o colorație albastră intens sau verde-albastru.
Carotenoidele pot fi identificate și cu ajutorul CSS putând fi utilizată atât cromatografia în
fază normală cât și cea în fază inversă (Figura 8.3).

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

Figura 8.3. Separarea compușilor dintr-un extract prin cromatografie pe strat subțire în fază
normală (a) și fază inversă (b) (imagine preluată din Sjursnes et al.)

Pentru realizarea separării cromatografice se utilizează plăcuțe cromatografice di silice și

silice-RP18 pentru faza normală, respectiv faza inversă. Cu ajutorul unui capilar se realizează pe
linia de start a fiecărei plăcuțe câte un spot din extractul eteric și câte un spot dintr-o soluție de β
caroten (standard). Eluenții pentru cele două tipuri de CSS sunt compuse din:
- n-hexan : acetonă 7:3 v/v pentru faza normală
- n-hexan : acetonitril: etanol 15:35:50 v/v sau n-hexan : acetonă: etanol 2:3:5 v/v pentru
faza inversă.

8.3.1.8. Identificarea emodolilor

3 mL extract eteric se aduc într-o eprubetă, se adaugă 1 mL NaOH 10 % și se agită. Dacă
soluția se colorează în roșu-vișiniu sunt prezenți derivații antrachinonici (emodoli) liberi sub formă
oxidată. Reacția de identificare poartă denumirea de reacția Borntranger).
Identificarea diverșilor derivați antrachininici se poate realiza prin cromatografie pe hârtie.

8.3.1.9. Identificarea cumarinelor

3 mL extract eteric se evaporă într-o capsulă de porțelan pe baie de apă. Reziduul rezultat se
dizolvă în 2 mL apă distilată fierbinte. După răcire, soluția se împarte în 2 eprubete: una dintre ele
servește drept martor iar în cea de a II-a se adaugă 0,5 mL amoniac 10 %. Ambele eprubete se
examinează în lumină UV. Apariția unei fluorescențe (albastră-verzuie / violetă) mai intensă în
proba alcalinizată confirmă prezența cumarinelor.

8.3.2. Examenul chimic calitativ al extractului alcoolic

8.3.2.1. Identificarea taninurilor

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

Într-o eprubetă se diluează 1 mL extract alcoolic cu 2 mL apă distilată și se adaugă 2-3

picături de FeCl3 1 % diluată 1/10. Apariția unei colorații albastre-negricioase indică prezența
taninurilor galice sau pirogalice, iar o colorație verde-închisă indică prezența taninurilor catechice.
În cazul prezenței unui amestec de taninuri se recurge la separarea lor cu ajutorul
reactivului Styassny astfel: 10 mL extract apos se fierb la reflux cu 3 mL reactiv timp de 30 min.
în aceste condiții taninurile catehice se condensează, se depun sub forma unui precipitat roșu care
se separă prin filtrare. Filtratul se neutralizează cu acetat de sodiu in exces, după care se tratează
cu soluție FeCl3 diluată (2-3 pic), apariția unei colorații albastre confirmă prezența taninurilor
catehice.

8.3.2.2. Identificarea compușilor reducători

Într-o eprubetă se diluează 1 mL extract alcoolic cu 2 mL apă distilată, se adaugă 1 mL
soluție Fehling (I și II) și se încălzește la fierbere în flacăra unui bec de gaz. Formarea pe fundul
eprubetei a unui precipitat roșu-cărămiziu indică prezența compușilor reducători.

8.3.2.3. Identificarea alcaloizilor săruri

15 mL extract alcoolic se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (sau nisip). Reziduul se
dizolvă în 5-10 mL HCl 2 %, prin amestecare cu o baghetă de sticlă, la cald. Soluția acidă decantată
sau filtrată se aduce într-o pâlnie de separare și se adaugă amoniac concentrat (pH 8-10). Soluția
alcalină se extrage cu eter sau cloroform (de 3 ori câte 8 mL).
Extractul eteric sau cloroformic spălat cu apă distilată (în pâlnia de separare) se separă, se
anhidrizează (cu Na2SO4) și se evaporă într-o capsulă pe baie de apă (sub nișă). Reziduul se dizolvă
în 1,5 mL HCl 2 %, soluția acidă se împarte în volume egale în două eprubete (volume egale). Una
din eprubete se folosește ca martor, iar în cea de a II-a se adaugă 2-3 picături de reactiv Mayer.
Apariția unui precipitat alb-gălbui în cea din urmă denotă prezența alcaloizilor în extract.

8.3.2.4. Identificarea aminoacizilor

5 mL extract alcoolic se evaporă la sec într-o capsulă. Reziduul se reia cu 1,5 mL apă la
cald, se filtrează prinzând filtratul într-o eprubetă în care se adaugă 10 picături soluție acetonică
de ninhidrină 1 %. Eprubeta se încălzește la fierbere, pe baie de apă, timp de 10-25 min. apariția
unei culori albastre-violet sau violet indică prezența aminoacizilor. Identificarea aminoacizilor
prezenți în probă se poate realiza prin CSS sau HPLC.
În cazul CSS se pot utiliza plăcuțe silicagel ca suport pentru separare și un eluent compus
din n-butanol : acid acetic : apă 4:1:5 v/v. Eluentul trebuie introdus în tancul cromatografic cu cel
puțin 30 min înaintea realizării separării. Plăcuța se scoate după ce eluentul a atins linia de finiș și
se usucă la aer sau în etuvă.
Identificarea spoturilor fluorescente se realizează prin examinarea cromatogramei în UV
la lungimi de undă diferite λ = 254 nm și λ = 365 nm. Vizualizarea spoturilor incolore și

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

nefluorescente se realizează prin pulverizarea cromatogramei cu o soluție de ninhidrină. În

prezența acestui compus, aminoacizii dau o reacție de culoare caracteristică.
Pentru identificarea aminoacizilor din probe se calculează Rf – urile fiecărui spot și se
compară cu Rf-urile standard găsite în literatură. De asemenea se ține seama de culoare, forma și
intensitatea spoturilor obținute. În tabelul de mai jos sunt prezentate valorile Rf-urilor câtorva
aminoacizi:
Tabelul 8.1. Rf-ul unor aminoacizi separați în sistemul plăcuțe silicagel-eluent n-
butanol : acid acetic : apă 4:1:5 v/v
Aminoacid Rf Aminoacid Rf
Cisteina 0,07 Triptofan 0,50
Cistina 0,08 Metionina 0,55
Lizina 0,14 Valina 0,60
Taurina 0,19 Fenilalanina 0,68
Histamina 0,22 Izoleucina 0,72
Treonina 0,35 Leucina 0,73
Tirozina 0,45

8.3.3. Examenul chimic calitativ al extractului alcoolic hidrolizat

Într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent se aduc 25 mL extract alcoolic și 15 mL

HCl 10 % și se fierb la reflux timp de 30 min. Alcoolul se distilă într-un aparat adecvat iar soluția
apoasă acidă (deseori opalescentă) se aduce într-o pâlnie de separare unde este supusă extracției
repetate cu eter (3 x 15 mL). Extractul eteric de deshidratează cu NaSO4.

8.3.3.1. Identificarea atocianozidelor

Pentru această identificare se utilizează soluția apoasă acidă rămasă în urma extracțiilor cu
eter. În cazul în care această soluție are culoarea roșie, care la prin neutralizare (pH 7) trece în
violet iar prin alcalinizare în albastru sau verde, atunci în soluție sunt prezente antocianozide.

8.3.3.2. Identificarea atracenozidelor

Într-o eprubetă se adaugă 1 mL amoniac 25 % peste 3 mL extract eteric și se agită.
Colorarea soluției în roșu-vișiniu, denotă prezența emodolilor, aceștia fiind agliconii
antracenozidelor.

8.3.3.3. Identificarea cumrinelor

Vezi punctul 8.3.1.9.

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

8.3.4. Examenul chimic calitativ al extractului apos

8.3.4.1. Identificarea uronidelor (mucilagii, pectine, gume)

Într-o eprubetă peste 10 mL alcool sau acetonă se toarnă în fir subțire 2 mL extract apos.
Dacă se obține un precipitat floconos, acesta se separă prin filtrare, se spală cu alcool sau acetonă
și se colorează cu un reactiv specific (de ex: albastru de toluidină, hematoxilină). Prezența
mucilagiilor este indicată de colorarea în violet sau albastru a precipitatului obținut.

8.3.4.2. Identificarea compușilor reducători

Vezi punctul 8.3.2.2.

8.3.4.3. Identificarea unor oze și polioze

Se evaporă 2 mL extract apos într-o capsulă de porțelan, iar reziduul se tratează cu 2-3 pic
de H2SO4 conc. Se lasă în repaus 3-4 min, după care se adaugă 3-4 pic de soluție saturată de timol,
în prezența ozelor și poliozelor se observă o colorație roșie.
Pentru identificarea amidonului se poate utiliza o soluție de Lugol (1-3 pic) ce se adaugă
peste 1 mL extract apos. Colorarea soluției în albastru denotă prezența amidonului.

8.3.4.4. Identificarea saponinelor

i. Pentru identificarea saponinelor cu ajutorul reacției Lieberman –Buchard se realizează
experimentul după modul operator descris la punctul 8.3.1.6.
ii. La identificarea saponinelor poate fi utilizat și testul de spumă. Pentru acesta peste 1 mL
extract apos se adaugă 9 mL apă, 4 mL se toarnă într-o eprubetă cu dop și se agită energic timp de
15 sec. Prezența saponinelor este evidențiată de formarea unei coloane de spumă cu înălțimea de
minim 1 cm, ce persistă cel puțin 15 min.
iii. Identificarea saponinelor poate fi realizată și cu ajutorul cromatografiei. CSS este
metoda cromatografică preferată datorită rapidității, consumului mic de solvenți și senzitivității
ridicate a metodei.
Plăcuțele de silicagel sunt cele mai utilizate ca fază staționară, iar ca faza mobilă literatura
oferă mai multe alternative, dintre care:
- cloroform : acid acetic glacial : metanol : apă 60 : 32 : 12 : 8;
- cloroform : metanol : apă 70 : 44 : 10;
- acetat de etil : acid formic : acid acetic glacial : apă 100 : 11 : 11 : 26.
Pentru revelarea spoturilor saponinelor există, de asemenea, mai multe soluții:
- reactivul Liebermann-Burchard () urmat de încălzirea plăcuței timp de 5 min într-un
cuptor la 1000 °C;
- soluție etanolică de H2SO4 10 %
- p-anisaldehida – H2SO4

Indrumar de laborator
 TAMPU RALUCA IOANA – Valorificarea produselor vegetale

8.3.4.5. Identificarea taninurilor

Peste 1 mL extract apos se adaugă 1-2 picături de clorură ferică 1 % diluată 1/10. În
prezența taninurilor galice se obține o colorație albastră în timp ce taninurile catehice dau o
colorație verde închis. În cazul prezenței unui amestec de taninuri se folosește reactivul Styassny
pentru separarea lor (vezi paragraf 8.3.2.1.).

8.3.4.6. Identificarea alcaloizilor săruri

15 mL extract apos se aduc la pH = 8 – 10 cu soluție de amoniac 10 %, după care se extrag
cu 15 mL cloroform sau eter de 3 ori (într-o pâlnie de separare). În continuare se urmează același
protocol ca în cazul extractului alcoolic (vezi paragraf 8.3.2.3.)

8.3.4.7. Reacții efectuate în extractul apos hidrolizat

Se procedează după tehnicile de lucru descrise la extractul alcoolic atât pentru realizarea
hidrolizei extractului cât și pentru identificarea: antracenozidelor, cumarinelor, glucozidelor
sterolice și terpenice, flavonozidelor și antracenozidelor. Reacțiile se efectuează în cazul în care
nu au fost pozitive în extractul alcoolic.

Indrumar de laborator