LP

Explorarea fibrinolizei și a trombozei

Activatorii și inhibitorii coagulării

I. Inhibitorii procesului de coagulare

- Antitrombina
- Proteina C
- Proteina S
- Inhibitorul căii factorului tisular
 Acționează prin mecanisme diferite
 Scăderea nivelelor plasmatice ale inhibitorilor procesului de coagulareși existența unor structuri
disfuncționale ale acestora determină apariția stărilor de hipercoagulabilitate
1. Antitrombina
• Este un anticoagulant natural ce inhibă factorii coagulării FII, FXa și mai puțin FXIa și FIXa, formând
complexe cu aceștia
• Viteza cu care se formează aceste complexe este crescută sub efectul heparinei și al moleculelor cu
acțiune heparin-like de pe suprafața celulelor endoteliale
• Prin capacitatea de a crește activitatea antitrombinei, heparina funcționează ca un anticoagulant
puternic
• Deficiența de antitrombină conduce la un status hipercoagulant și risc crescut de boală
tromboembolică
• Deficiența dobândită este mult mai frecvent întâlnită comparativ cu deficiența ereditară de
antitrombină
Testele pentru dozarea antitrombinei plasmatice pot fi:
1. funcționale (calitative) – principiul se bazează pe inhibarea FIIa sau FXa de către antitrombină în
prezența heparinei
- măsurarea efectului anti-FIIa sau anti-FXa al antitrombinei se realizaeză în general utilizând teste
cromogene
- plasma este incubată cu un exces de FIIa sau FXa și cu heparină, formând complexul antitrombină-
trombină-heparină
- FIIa sau Fxa rezidual se măsoară folosind un substrat cromogenic prin spectrofotometrie
- activitatea FIIa sau Fxa rezidual este invers proporțională cu activitatea antitrombinei
2. imunologice (cantitative) – folosesc anticorpi împotriva antitrombinei
 DEFICIT DE ANTITROMBINA

Test funcțional

+ - Alte cauze

Test imunologic

Deficit cantitativ Deficit caliativ

(tip I) (tip II)
Scăderea activității antitrombinei poate fi întâlnită în:
- deficit genetic – prevalența acestei deficiențe în populația generală este foarte mică, fiind mai mare
la pacienții cu istoric de tromboze venoase (1-4%)
- scăderea sintezei hepatice – ex boli hepatice grave
- consumul crescut de AT – ex tromboză venoasă, CID
Creșterea activității antitrombinei poate fi întâlnită în:
- consumul unor medicamente – ex anticoagulante
2. Proteina C
 Proteina C este o glicoproteină sintetizată în ficat printr-un mecanism dependent de vitamina K, care
circulă în plasmă și are rol anticoagulant.
 Proteina C este transformată în enzimă activă de către trombină, după fixarea trombinei la nivelul
unei proteine endoteliale (trombomodulină).
 Proteina C activată inactivează consecutiv factorii plasmatici V și VIII.
 Funcția inhibitoare a proteinei C este amplificată de proteina S.
 Deficiența de proteina C conduce la un status hipercoagulant și risc de tromboză venoasă
 Deficiența dobândită este mult mai frecventă comparativ cu deficiența ereditară de antitrombină și
creste riscul de tromboza de 7 ori
 Nivelele Proteinei C sunt scăzute de catre WARFARINA (Coumadin)

Dozarea proteinei C plasmatice se face utilizând teste:

I. Funcționale
- nu există o metodă care să investigheze toate aspectele funcţionale ale
moleculei de proteină C
- metodele funcţionale disponibile sunt reprezentate de metode cronometrice şi
metode cromogenice
- metoda cronometrică măsoară capacitatea anticoagulantă a proteinei C activate asupra
factorului Va şi factorului VIIIa
- metoda cromogenică evaluzează activitatea proteinei C cu ajutorul unui substrat specific
și poate să nu detecteze deficitul calitativ al PC (tip II)
- este necesară corelarea rezultatelor obţinute prin cele doua metode
- în cazul în care ambele metode funcționale evidenţiază concentraţii scăzute ale PC, înseamnă că
există un defect de eliberare a peptidei de activare sau o anomalie a situsului activ, care nu poate
cliva nici factorul Va, nici factorul VIIIa, nici peptide sintetice
- dacă numai metoda cronometrică evidentiază concentraţii scăzute, înseamnă că există un defect de
interacţiune cu fosfolipidele, ionii de calciu şi PS

II. Teste imunologice

- detectează deficitul cantitativ de PC
 Activitatea scăzută a PC poate fi întâlnită în:
- Deficitul congenital – heterozigoții au nivelele PC de aprox 35-65% din valoarea normală
și un risc relativ de tromboză de 7; homozigoții au risc crescut de deces la scurt timp după
naștere prin CID sau purpura fulminans
- Scăderea sintezei hepatice – PC este una dintre primele proteine care scad în insuficiența
hepatică, are t1/2=6-8h
- Consum crescut – CID, tromboza
- Deficit de vitamină K sau tratament cu warfarină
- Distrugere imunologică - prezența de autoanticorpi

3. Proteina S
Proteina S este o glicoproteină dependentă de vitamina K, sintetizată în ficat, celulele
endoteliale și megakariocite.
 PS este un cofactor necesar pentru activitatea anticoagulantă a PC.
 Proteina C cu proteina S ca și cofactor degradează parțial factorii V și VIII.
 Doar 40% din cantitatea de PS este liberă, având rolurile menționate, restul de 60% se află
legată de C4b-binding protein.
Metoda funcțională:
- măsoară capacitatea proteinei S de a servi drept cofactor al proteinei C de a degrada
factorii V și VIII și de a prelungi APTT/PT
- se realizează de prima intenție
Metoda imunologică:
- ELISA
- Doua tehnici:
 Proteina S totala
 Proteina S libera

Situații care se pot asocia cu scăderea activității PS:

- Alterarea funcției de sinteză a ficatului
- Deficit de vitamină K sau tratament cu warfarină
- Consum – ex în CID
- Creșterea procentului de PS legata în reacțiile da fază acută, datorită creșterii C4b-binding protein,
ramânând astfel o cantitate mai redusă de PS liberă, activă
- Pierdere de PS – ex în sdr nefrotic

Deficitele ereditare de proteina S:

• 0,7% în populația generală
• Heterozigoți:
• Activitate a proteinei S de 20-60%
• Tromboze cu debut intre 10 si 50 ani
• Homozigoți:
• In perioada neonatala – purpura fulminans sau CID
3. Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
 Activitatea anticoagulantă a proteinei C implică degradarea proteolitică a factorilor V și VIII la nivelul
unor reziduuri specifice arg, cu inactivarea acestora
 Factorul V Leiden este o mutație punctiformă G1691A (Arg506Glu)
 Apare la 5% din populația caucaziană
 Mai exista alte doua mutații activatoare ale factorului V, cauzatoare de rezistență la proteina C
Metoda funcțională:
- Proba e diluată 1:5 cu plasma deficientă în factor V
- Se efectuează APTT pe proba diluată înainte și după adăugarea de PCA
- PCA prelungește APTT de doua ori la indivizii normali și < 2 la pacienții cu Factor V Leiden
- Specificitate 100%, sensibilitate 100%
Metoda PCR:
- Se extrage ADN-ul din proba nediluată, necentrifugată
- Se determină prezența mutației prin tehnici ca PCR-RFLP, TaqMan, etc.
- Singura care poate determina homo- sau heterozigoția

Echilibrul hemostază-fibrinoliză
Fibrinoliza
• Fibrinoliza fiziologică este procesul de
dezagragare și dizolvare a cheagurilor
sanguine, ce permite reluarea circulației
sanguine după repararea leziunii
vasculare, sub acțiunea enzimei plasmină
sau fibrinolizină.
• Activitatea sistemului fibrinolitic este
reglată de factori activatori și de factori
inhibitori.
• Cei mai importanți activatori ai sistemului
fibrinolitic sunt: tPA (activatorul tisular al
plasminogenului), FXIIa, UK (urokinaza,
activatorul urinar al plasminogenului,
uPA).
• Alți activatori sunt: activatorul sanguin al plasminogenului, streptokinaza, fibrina, trombina.
- tPA este eliberat din celulele endoteliale şi transformă plasminogenul (fixat pe suprafaţa
cheagului de fibrină) în plasmină.
- Plasmina degradează polimerul de fibrină în fragmente cu greutate moleculară mică (produşi
de degradare a fibrinei).
- Produşii de degradare a fibrinei (PDF) sunt îndepărtaţi din circulaţie de sistemul monocito-
macrofagic.
- Plasmina circulantă este inactivată de alfa 2 inhibitorul plasminic.
- Celulele endoteliale eliberează un inhibitor al activatorului tisular al plasminogenului.
Fibrinoliza fiziologică
- este un proces declanşat de coagularea fiziologică
- strict localizat la nivelul dopului fibrino-plachetar
- are ca scop repermeabilizarea vaselor de sânge după repararea peretelui vascular
Fibrinoliza patologică
- este declanşată în condiţiile creşterii nivelului de activatori ai fibrinolizei sau scăderii nivelului de
inhibitori ai fibrinolizei
- se caracterizează prin prezenţa plasminei libere circulante
- determină apariţia unui sindrom proteolitic complex, explicat prin acţiunea plasminei libere asupra
unor structuri diverse, diferite de trombii fibrinoşi
 II. Explorarea fibrinolizei
1. Plasminogenul
• Precursorul plasminei ce distruge trombii de fibrin. Plasminogenul e activat de tPA sau uPA
• Plasmina degradează fibrinogenul și fibrin si inactivează factorii Va și VIIIa
• Deficiența ereditară este rară predispunând la tromboză
• Valori normale: 75 – 130 %;
6 – 14 g/dl.
Metoda funcțională:
- Se adauga streptokinaza + substrat cromogenic;
Metoda imunologică:
- Radial imunodiffusion assay
- Determina cantitatea de plasminogen.
Deficiența dobândită:
• Terapie trombolitica
• Disfuncție hepatică
• Consum (CID)
Deficiența ereditară:
• Rară
• Deficitul sever e asociat cu conjunctivitis lignosa:
- conjunctivită pseudomembranoasă caracterizată prin depozite masive de fibrină
- depozitele de fibrină se datorează absenței sau scăderii CL fibrinei de către plasminogen
2. Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1 (PAI – 1)
• PAI-1 inhibă activatorul tisular al plasminogenului, t-PA
• Nivele crescute de PAI-1 sunt asociate cu tromboza arteriala datorată inhibării fibrinolizei
• Deficitul de PAI-1 se asociază cu sindromul hemoragipar datorită fibrinolizei excesive
• Valori normale: 4 – 40 ng/ml (metada imunologică)
0 – 12 unitati/ml (metoda funcțională)
• PAI-1 prezintă ritm circadian.
Metoda funcțională:
- Plasma este adaugată unei cantități cunoscute de urokinaza
- PAI-1 din plasma pacientului leaga urokinaza
- restul de urokinază este inact prin adaugare de plasminogen, care va fi transformat inplasmină
- plasmina clivează un substrat cromogenic – spectrofotometrie.
Metoda imunologică: cu anticorpi specifici
• Este un reactant de fază acută
• Sinteza lui e stimulată de nivelele de insulină sau glucoză
• Crește dupa evenimente trombotice și în sarcină
• Nu este un test de rutină în clinica medicală
3. Antiplasmina
• Plasmina mediază fibrinoliza și antiplasmina inhibă plasmina
• Factorul XIII activat leagă antiplasmnia la fibrină, protejând-o de fibrinoliză
• Antiplasmina se leagă și de plasminogen si îl poate împiedica să se lege la fibrină
• Determinarea antiplasminei nu se face de rutină
• Valori normale: 48 – 80 mg/dl (metada imunologică);
80 – 130% (metoda funcțională).
Metoda funcțională:
- plasmina în exces este adaugata peste plasmă
- excesul cliveaza un substr cromogenic, eliberându-l și putând fi detectat prin spectrofotometrie
Metoda imunologică: Folosește anticorpi specifici anti-antiplasmină
Deficit dobândit de antiplasmină: - Disfuncție hepatică Deficit ereditar de antiplasmină: - Cantitativ – tip I
- Terapie trombolitică - Calitativ – tip II
- Consum (CID)
4. D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei
• Fibrinoliza este mediată de plasmină
• Plasmina degradează :
- trombii de fibrină la D-dimeri și produși de degradare ai fibrinei (PDF)
- Fibrinogenul intact generând produși de degradare ai fibrinogenului (PDF)
• Prezența D-dimerilor indică – fibrina s-a format și a fost degradată
• Prezența PDF indică – fibrina/fibrinogen sunt degradate
• : D-dimeri < 0,5 micrograme/ml
PDF < 5 micrograme/ml
• Metodologie:
- Latex aglutinare – semicantitativă și cantitativă
- ELISA - cantitativă
- SimpliRed (sange integral) - semicantitativă
• Nu se folosește de rutină pentru monitorizarea terapiei trombolitice
Exemple de situații în care D-dimerii și PDF pot fi pozitive:
- CID
- Tromboza venoasă
- Infarct miocardic
- Disfuncție hepatică (scade clearence-ul hepatic)
- Postoperator
- Sângerare semnificativă
- Cancer (grad scazut de CID cronic)

5.Timpul de liză a cheagului de euglobuline (TLCE)

• TLCE este cea mai rapidă metodă de investigare a fibrinolizei
• are avantajul că poate fi efectuată şi pe sânge heparinizat
• este un test global, care măsoara acţiunea activatorilor plasminogenului şi plasminei
• Valori normale ale TLCE: liza cheagului euglobulinic se realizează în aproximativ 3 ore
• Valori scăzute ale TLCE apar în hiperfibrinoliză (când cantitatea de tPA circulant este crescută)
• euglobulinele sunt proteine insolubile în apa pură dar care devin solubile în apă în prezenţa
electroliţilor
• pentru obţinerea precipitatului de euglobuline, este necesară diluţia şi apoi acidifierea plasmei cu
acid acetic
• precipitatul de euglobuline rezultat conţine numai factori de coagulare (V, VII, VIII, IX), plasminogen,
fibrinogen, tPA şi uPA
• inhibitorii activatorilor plasminei rămân în soluţia supernatantă, care se îndepărtează, asigurâd în
felul acesta o specificitate mult mai mare testului

Panelul de hipercoagulare
• Rezistența la proteina C activată și mutația factorului V Leiden
• Antitrombina
• Antiplasmina
• Proteina C
• Proteina S
• Plasminogen
• Inhibitorul activatorului plasminogenului – 1
• Teste de agregare plachetară
• Timp de trombină
• Timp de reptilază
• Anticorpi antifosfolipidici
• Mutatia G20210A a protrombinei
Exemple de cauze ereditare de hipercoagulabiliate

Boala Prevalența în populația generala Prevalența în populația cu TV

Deficienta de antitrombina 0,17 1-5

Deficienta de proteina C 0,14 – 0,5 3-9
Deficienta de proteina S 0,7 2-8
Protrombina G20210A 2 6
Hiperhomocisteinemie (inhibă 5-10 10-25
anticoagularea, stimulează
activarea și agreagarea
plachetară, toxicitate directă
asupra celulelor endoteliale)
Factor V Leiden 5 (Caucazieni) 20-50

Cauze dobândite de hipercoagulabilitate – anticorpii antifosfolipidici

• Sindromul antifosfolipidic – afecțiune autoimună caracterizată prin prezența anticorpilor
antifosfolipidici, trombozelor arteriale și/sau venoase și a pierderilor de sarcină repetate
• Anticorpii antifosfolipidici au semnificație clinică numai în prezența sdr fosfolipidic (sindrom primar
sau asociat altor boli autoimune)
• Anticorpii antifosfolipidici cuprind: anticoagulantul lupic, anticorpii anticardiolipidici și anticorpii
cardiolipidici care recunosc molecule țintă specifice (beta 2 glicoproteina I, protrombina, proteina C,
proteina S, etc)
• Mecanismul exact prin care aceşti anticorpi determină apariţia trombozei nu este cunoscut; câteva
ipoteze sunt propuse – activarea plachetelor, activarea celulelor endoteliale şi interacţiunea cu
beta2 glicoproteina I ( proteina serică care leagă fosfolipidele anionice de la suprafaţa celulelor
endoteliale şi are efect anticoagulant).
Anticorpi anti-cardiolpina:
• - se determină prin metoda ELISA
• - reacționează încrucișat cu antigenele din sifilis
Lupusul anticoagulant:
• - pare să se lege de fosfolipide, împiedicând acțiunea acestora de cofactor în cascada coagulării
• - două teste screening + test mixing (daca e +) + teste de confirmare (cu exces de fosfolipide)
• - dacă LA este prezent testele de coagulare ramân prelungite dupa efectuarea mixingului

TESTE SCREENING

alungit normal

STUDII DE MIXING

nemodificat scurtare Identificarea deficitului de factor de coagulare

TESTE DE CONFIRMARE (cu fosfolipide in exces)

Scurtarea timpului de coagulare

Panelul CID
• CID acut:
- Cresterea D-dimeri, PDF
- Prelungirea APTT (50% din cazuri) și PT (70% din cazuri)
- Scăderea fibrinogenului (50% din cazuri)
- Scăderea numărului de plachete
• CID cronic:
- Creșterea fibrinogenului si plachetelor
- Scurtarea PT și APTT
- Cresterea D-dimeri, PDF
CID
 este o situaţie patologică de etiologie multifactorială, secundară altei afecţiuni (sepsis, complicaţii
obstetricale, traumatisme, arsuri, intevenţii chirurgicale, incompatibilitate de grup sangvin, boli
hepatice, neopasme etc.)
 se produce o activare intravasculară accelerată, difuză şi neadecvată a coagulării
 consumul excesiv de factori de coagulare şi trombocite, concomitent cu o generare masivă
intravasculară de fibrină, vor conduce la apariţia simultană atât de tromboze, cât şi de hemoragii (clinic
se constată hemoragii cu cheaguri).
 cauza CID o reprezintă afectarea severă a microvascularizaţiei (apariţia unei electro-negativităţi la
suprafaţa endoteliului în teritorii vasculare întinse), care poate conduce la disfuncţie multiplă de organ
 lezarea endotelială sau tisulară determină activarea masivă a factorilor de coagulare şi consumul
excesiv al acestora, astfel încât, se ajunge la un deficit de factori
 în timpul acestui proces, trombina şi plasmina (enzime proteolitice) sunt actívate
 trombina amplifică procesul de coagulare şi poate induce tromboze, iniţial la nivelul vaselor mici şi
ulterior şi în vasele mari
 mecansmul reglator al cascadei coagulării reprezentat de TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor), AT-III
şi PCA (proteină C activ) fiind deficitar, se formează cant mari de fibrină, cu apariţia obstrucţiilor vasc