Explorarea fibrinolizei i a

trombozei
Lucrare practic

Cuprins
I. Explorarea inhibitorilor procesului de coagulare
Antitrombina
Proteina C
Proteina S
Rezistena la proteina C activat i mutaia factorului V Leiden
II. Explorarea fibrinolizei
Plasminogenul
Inhibitorul activatorului plasminogenului 1
Antiplasmina
D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei
Timpul de liz a cheagului de euglobuline
Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Panelul CID

Activatorii i inhibitorii coagulrii

I. Inhibitorii procesului de coagulare

-

Antitrombina
Proteina C
Proteina S
Inhibitorul cii factorului tisular

Acioneaz prin mecanisme diferite

Scderea nivelelor plasmatice ale inhibitorilor
procesului de coagularei existena unor structuri
disfuncionale ale acestora determin apariia
strilor de hipercoagulabilitate

I. Inhibitorii procesului de coagulare

1. Antitrombina
Este un anticoagulant natural ce inhib factorii coagulrii FII, FXa i
mai puin FXIa i FIXa, formnd complexe cu acetia
Viteza cu care se formeaz aceste complexe este crescut sub efectul
heparinei i al moleculelor cu aciune heparin-like de pe suprafaa
celulelor endoteliale

I. Inhibitorii procesului de coagulare

1. Antitrombina
Prin capacitatea de a crete activitatea antitrombinei, heparina
funcioneaz ca un anticoagulant puternic
Deficiena de antitrombin conduce la un status hipercoagulant i risc
crescut de boal tromboembolic
Deficiena dobndit este mult mai frecvent ntlnit comparativ cu
deficiena ereditar de antitrombin

I. Inhibitorii procesului de coagulare

1. Antitrombina
Testele pentru dozarea antitrombinei plasmatice pot fi:
1. funcionale (calitative) principiul se bazeaz pe inhibarea FIIa sau FXa
de ctre antitrombin n prezena heparinei
- msurarea efectului anti-FIIa sau anti-FXa al antitrombinei se realizaez n
general utiliznd teste cromogene
- plasma este incubat cu un exces de FIIa sau FXa i cu heparin, formnd
complexul antitrombin-trombin-heparin
- FIIa sau Fxa rezidual se msoar folosind un substrat cromogenic prin
spectrofotometrie
- activitatea FIIa sau Fxa rezidual este invers proporional cu activitatea
antitrombinei
2. imunologice (cantitative) folosesc anticorpi mpotriva antitrombinei

ANTITROMBINA
DEFICIT DE ANTITROMBINA

Test funcional

Test imunologic
Deficit cantitativ
(tip I)

Deficit caliativ

(tip II)

Alte cauze

I. Inhibitorii procesului de coagulare

1. Antitrombina
Scderea activitii antitrombinei poate fi ntlnit n:
- deficit genetic prevalena acestei deficiene n populaia general
este foarte mic, fiind mai mare la pacienii cu istoric de tromboze
venoase (1-4%)
- scderea sintezei hepatice ex boli hepatice grave
- consumul crescut de AT ex tromboz venoas, CID
Creterea activitii antitrombinei poate fi ntlnit n:
- consumul unor medicamente ex anticoagulante

I. Inhibitorii procesului de coagulare

2. Proteina C
Proteina C este o glicoprotein sintetizat n ficat printr-un
mecanism dependent de vitamina K, care circul n plasm i are
rol anticoagulant.
Proteina C este transformat n enzim activ de ctre trombin,
dup fixarea trombinei la nivelul unei proteine endoteliale
(trombomodulin).
Proteina C activat inactiveaz consecutiv factorii plasmatici V i
VIII.

Funcia inhibitoare a proteinei C este amplificat de proteina S.

I. Inhibitorii procesului de coagulare

2. Proteina C

Deficiena de proteina C conduce la un status hipercoagulant i risc

de tromboz venoas
Deficiena dobndit este mult mai frecvent comparativ cu
deficiena ereditar de antitrombin i creste riscul de tromboza de 7
ori
Nivelele Proteinei C sunt sczute de catre WARFARINA (Coumadin)

I. Inhibitorii procesului de coagulare

2. Proteina C
Dozarea proteinei C plasmatice se face utiliznd teste:
I. Funcionale
- nu exist o metod care s investigheze toate aspectele funcionale ale
moleculei de protein C
- metodele funcionale disponibile sunt reprezentate de metode cronometrice i
metode cromogenice
- metoda cronometric msoar capacitatea anticoagulant a proteinei C activate asupra
factorului Va i factorului VIIIa
- metoda cromogenic evaluzeaz activitatea proteinei C cu ajutorul unui substrat specific
i poate s nu detecteze deficitul calitativ al PC (tip II)
- este necesar corelarea rezultatelor obinute prin cele doua metode

I. Inhibitorii procesului de coagulare

2. Proteina C
I.

Teste funcionale

n cazul n care ambele metode funcionale evideniaz concentraii sczute ale PC,
nseamn c exist un defect de eliberare a peptidei de activare sau o anomalie a situsului
activ, care nu poate cliva nici factorul Va, nici factorul VIIIa, nici peptide sintetice
dac numai metoda cronometric evidentiaz concentraii sczute, nseamn c exist
un defect de interaciune cu fosfolipidele, ionii de calciu i PS
II. Teste imunologice
detecteaz deficitul cantitativ de PC

I. Inhibitorii procesului de coagulare

2. Proteina C
Activitatea sczut a PC poate fi ntlnit n:
- Deficitul congenital heterozigoii au nivelele PC de aprox 35-65% din valoarea normal
i un risc relativ de tromboz de 7; homozigoii au risc crescut de deces la scurt timp dup
natere prin CID sau purpura fulminans
- Scderea sintezei hepatice PC este una dintre primele proteine care scad n insuficiena
hepatic, are t1/2=6-8h
- Consum crescut CID, tromboza
- Deficit de vitamin K sau tratament cu warfarin
- Distrugere imunologic - prezena de autoanticorpi

I. Inhibitorii procesului de coagulare

3. Proteina S
Proteina S este o glicoprotein dependent de
vitamina K, sintetizat n ficat, celulele
endoteliale i megakariocite.
PS este un cofactor necesar pentru activitatea
anticoagulant a PC.
Proteina C cu proteina S ca i cofactor
degradeaz parial factorii V i VIII.
Doar 40% din cantitatea de PS este liber,
avnd rolurile menionate, restul de 60% se afl
legat de C4b-binding protein.

I. Inhibitorii procesului de coagulare

3. Proteina S
Metoda funcional:
msoar capacitatea proteinei S de a servi drept cofactor al proteinei C de a
degrada factorii V i VIII i de a prelungi APTT/PT
se realizeaz de prima intenie

Metoda imunologic:
ELISA
Doua tehnici:

Proteina S totala
Proteina S libera

I. Inhibitorii procesului de coagulare

3. Proteina S
Situaii care se pot asocia cu scderea activitii PS:
- Alterarea funciei de sintez a ficatului
- Deficit de vitamin K sau tratament cu warfarin
- Consum ex n CID
- Creterea procentului de PS legata n reaciile da faz acut, datorit
creterii C4b-binding protein, ramnnd astfel o cantitate mai redus
de PS liber, activ
- Pierdere de PS ex n sdr nefrotic

I. Inhibitorii procesului de coagulare

3. Proteina S
Deficitele ereditare de proteina S:
0,7% n populaia general
Heterozigoi:
Activitate a proteinei S de 20-60%
Tromboze cu debut intre 10 si 50 ani
Homozigoi:
In perioada neonatala purpura fulminans sau CID

I. Inhibitorii procesului de coagulare

4. Rezistena la proteina C activat i mutaia
factorului V Leiden
Activitatea anticoagulant a proteinei C implic degradarea
proteolitic a factorilor V i VIII la nivelul unor reziduuri specifice arg,
cu inactivarea acestora
Factorul V Leiden este o mutaie punctiform G1691A (Arg506Glu)

Apare la 5% din populaia caucazian

Mai exista alte doua mutaii activatoare ale factorului V, cauzatoare
de rezisten la proteina C

I. Inhibitorii procesului de coagulare

4. Rezistena la proteina C activat i mutaia
factorului V Leiden
Metoda funcional:
Proba e diluat 1:5 cu plasma deficient n factor V
Se efectueaz APTT pe proba diluat nainte i dup adugarea de PCA
PCA prelungete APTT de doua ori la indivizii normali i < 2 la pacienii cu
Factor V Leiden
Specificitate 100%, sensibilitate 100%

Metoda PCR:
Se extrage ADN-ul din proba nediluat, necentrifugat
Se determin prezena mutaiei prin tehnici ca PCR-RFLP, TaqMan, etc.
Singura care poate determina homo- sau heterozigoia

Echilibrul hemostaz-fibrinoliz

Fibrinoliza
Fibrinoliza fiziologic este procesul de dezagragare i dizolvare a
cheagurilor sanguine, ce permite reluarea circulaiei sanguine dup
repararea leziunii vasculare, sub aciunea enzimei plasmin sau
fibrinolizin.
Activitatea sistemului fibrinolitic este reglat de factori activatori i de
factori inhibitori.
Cei mai importani activatori ai sistemului fibrinolitic sunt: tPA (activatorul
tisular al plasminogenului), FXIIa, UK (urokinaza, activatorul urinar al
plasminogenului, uPA).
Ali activatori sunt: activatorul sanguin al
plasminogenului, streptokinaza, fibrina, trombina.

Fibrinoliza
tPA este eliberat din celulele endoteliale i transform plasminogenul
(fixat pe suprafaa cheagului de fibrin) n plasmin.
Plasmina degradeaz polimerul de fibrin n fragmente cu greutate
molecular mic (produi de degradare a fibrinei).
Produii de degradare a fibrinei (PDF) sunt ndeprtai din circulaie
de sistemul monocito-macrofagic.
Plasmina circulant este inactivat de alfa 2 inhibitorul plasminic.
Celulele endoteliale elibereaz un inhibitor al
activatorului tisular al plasminogenului.

Fibrinoliza
Fibrinoliza fiziologic
- este un proces declanat de coagularea fiziologic
- strict localizat la nivelul dopului fibrino-plachetar
- are ca scop repermeabilizarea vaselor de snge dup repararea peretelui
vascular
Fibrinoliza patologic
- este declanat n condiiile creterii nivelului de activatori ai fibrinolizei
sau scderii nivelului de inhibitori ai fibrinolizei
- se caracterizeaz prin prezena plasminei libere circulante
- determin apariia unui sindrom proteolitic complex, explicat prin aciunea
plasminei libere asupra unor structuri diverse, diferite de trombii fibrinoi

II. Explorarea fibrinolizei

1. Plasminogenul
Precursorul plasminei ce distruge trombii de fibrina
Plasminogenul e activat de tPA sau uPA
Plasmina degradeaz fibrinogenul i fibrina
Plasmina inactiveaz factorii Va i VIIIa
Deficiena ereditar este rar predispunnd la tromboz
Valori normale:
75 130 %;
6 14 g/dl.

II. Explorarea fibrinolizei

1. Plasminogenul
Metodologie:
Metoda funcional:
Se adauga streptokinaza + substrat cromogenic;

Metoda imunologic:
Radial imunodiffusion assay
Determina cantitatea de plasminogen.

II. Explorarea fibrinolizei

1. Plasminogenul
Deficiena dobndit:
Terapie trombolitica
Disfuncie hepatic
Consum (CID)

Deficiena ereditar:
Rar
Deficitul sever e asociat cu conjunctivitis lignosa:

conjunctivit pseudomembranoas caracterizat prin depozite

masive de fibrin
depozitele de fibrin se datoreaz absenei sau scderii
clearence-ului fibrinei de ctre plasminogen

II. Explorarea fibrinolizei

2. Inhibitorul activatorului plasminogenului 1
(PAI 1)
PAI-1 inhib activatorul tisular al plasminogenului, t-PA
Nivele crescute de PAI-1 sunt asociate cu tromboza arteriala datorat
inhibrii fibrinolizei
Deficitul de PAI-1 se asociaz cu sindromul hemoragipar datorit fibrinolizei
excesive
Valori normale:

4 40 ng/ml (metada imunologic)

0 12 unitati/ml (metoda funcional)
PAI-1 prezint ritm circadian.

II. Explorarea fibrinolizei

2. Inhibitorul activatorului plasminogenului 1
(PAI 1)
Metoda funcional:
Plasma este adaugat unei cantiti cunoscute de urokinaza
PAI-1 din plasma pacientului leaga urokinaza
restul de urokinaz este inactivat prin adaugare de plasminogen, care va fi
transformat in plasmin
plasmina cliveaz un substrat cromogenic spectrofotometrie.

Metoda imunologic:
Anticorpi specifici

II. Explorarea fibrinolizei

2. Inhibitorul activatorului plasminogenului 1
(PAI 1)
Este un reactant de faz acut

Sinteza lui e stimulat de nivelele de insulin sau glucoz

Crete dupa evenimente trombotice i n sarcin
Nu este un test de rutin n clinica medical

II. Explorarea fibrinolizei

3. Antiplasmina
Plasmina mediaz fibrinoliza i antiplasmina inhib plasmina
Factorul XIII activat leag antiplasmnia la fibrin, protejnd-o de
fibrinoliz
Antiplasmina se leag i de plasminogen si l poate mpiedica s se
lege la fibrin
Determinarea antiplasminei nu se face de rutin
Valori normale:
48 80 mg/dl (metada imunologic);
80 130% (metoda funcional).

II. Explorarea fibrinolizei

3. Antiplasmina
Metoda funcional:
plasmina n exces este adaugata peste plasm
excesul cliveaza un substrat cromogenic, eliberndu-l i
putnd fi detectat prin spectrofotometrie

Metoda imunologic:
Folosete anticorpi specifici anti-antiplasmin

II. Explorarea fibrinolizei

3. Antiplasmina
Deficit dobndit de antiplasmin:
Disfuncie hepatic
Terapie trombolitic
Consum (CID)

Deficit ereditar de antiplasmin:

Cantitativ tip I
Calitativ tip II

II. Explorarea fibrinolizei

4. D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei
Fibrinoliza este mediat de plasmin

Plasmina degradeaz :

trombii de fibrin la D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei (PDF)

Fibrinogenul intact genernd produi de degradare ai fibrinogenului (PDF)

Prezena D-dimerilor indic fibrina s-a format i a fost degradat

Prezena PDF indic fibrina/fibrinogen sunt degradate
Valori normale:

D-dimeri < 0,5 micrograme/ml

PDF < 5 micrograme/ml

II. Explorarea fibrinolizei

4. D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei

II. Explorarea fibrinolizei

4. D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei
Metodologie:
Latex aglutinare semicantitativ i cantitativ
ELISA - cantitativ
SimpliRed (sange integral) - semicantitativ

Nu se folosete de rutin pentru monitorizarea terapiei trombolitice

II. Explorarea fibrinolizei

4. D-dimeri i produi de degradare ai fibrinei
Exemple de situaii n care D-dimerii i PDF pot fi pozitive:

CID
Tromboza venoas
Infarct miocardic
Disfuncie hepatic (scade clearence-ul hepatic)
Postoperator
Sngerare semnificativ
Cancer (grad scazut de CID cronic)

II. Explorarea fibrinolizei

5. Timpul de liz a cheagului de euglobuline
(TLCE)
TLCE este cea mai rapid metod de investigare a fibrinolizei

are avantajul c poate fi efectuat i pe snge heparinizat

este un test global, care msoara aciunea activatorilor plasminogenului
i plasminei

Valori normale ale TLCE: liza cheagului euglobulinic se realizeaz n

aproximativ 3 ore
Valori sczute ale TLCE apar n hiperfibrinoliz (cnd cantitatea de tPA
circulant este crescut)

II. Explorarea fibrinolizei

5. Timpul de liz a cheagului de euglobuline
(TLCE)
Metoda :
euglobulinele sunt proteine insolubile n apa pur dar care devin solubile n
ap n prezena electroliilor
pentru obinerea precipitatului de euglobuline, este necesar diluia i apoi
acidifierea plasmei cu acid acetic

precipitatul de euglobuline rezultat conine numai factori de coagulare (V, VII,

VIII, IX), plasminogen, fibrinogen, tPA i uPA
inhibitorii activatorilor plasminei rmn n soluia supernatant, care se
ndeprteaz, asigurd n felul acesta o specificitate mult mai mare testului

Exemple practice
Panelul de hipercoagulare

Rezistena la proteina C activat i mutaia factorului V Leiden

Antitrombina
Antiplasmina
Proteina C
Proteina S
Plasminogen
Inhibitorul activatorului plasminogenului 1
Teste de agregare plachetar
Timp de trombin
Timp de reptilaz
Anticorpi antifosfolipidici
Mutatia G20210A a protrombinei

Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Exemple de cauze ereditare de
hipercoagulabiliate
Boala
Prevalena n populaia Prevalena n populaia
generala

cu TV

Deficienta de
antitrombina

0,17

1-5

Deficienta de proteina C

0,14 0,5

3-9

Deficienta de proteina S

0,7

2-8

Protrombina G20210A

Hiperhomocisteinemie
(inhib anticoagularea,
stimuleaz activarea i
agreagarea plachetar,
toxicitate direct asupra
celulelor endoteliale)

5-10

10-25

Factor V Leiden

5 (Caucazieni)

20-50

Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobndite de hipercoagulabilitate anticorpii
antifosfolipidici
Sindromul antifosfolipidic afeciune autoimun caracterizat prin
prezena anticorpilor antifosfolipidici, trombozelor arteriale i/sau venoase
i a pierderilor de sarcin repetate
Anticorpii antifosfolipidici au semnificaie clinic numai n prezena sdr
fosfolipidic (sindrom primar sau asociat altor boli autoimune)
Anticorpii antifosfolipidici cuprind: anticoagulantul lupic, anticorpii
anticardiolipidici i anticorpii cardiolipidici care recunosc molecule int
specifice (beta 2 glicoproteina I, protrombina, proteina C, proteina S, etc)

Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobndite de hipercoagulabilitate anticorpii
antifosfolipidici
Mecanismul exact prin care aceti anticorpi determin apariia
trombozei nu este cunoscut; cteva ipoteze sunt propuse
activarea plachetelor, activarea celulelor endoteliale i interaciunea
cu beta2 glicoproteina I ( proteina seric care leag fosfolipidele
anionice de la suprafaa celulelor endoteliale i are efect
anticoagulant).
Anticorpi anti-cardiolpina:
- se determin prin metoda ELISA
- reacioneaz ncruciat cu antigenele din sifilis

Exemple practice
Panelul de hipercoagulare
Cauze dobndite de hipercoagulabilitate anticorpii
antifosfolipidici
Lupusul anticoagulant:

- pare s se lege de fosfolipide, mpiedicnd aciunea acestora de

cofactor n cascada coagulrii
- dou teste screening + test mixing (daca e +) + teste de
confirmare (cu exces de fosfolipide)
- dac LA este prezent testele de coagulare ramn prelungite
dupa efectuarea mixingului

Anticorpi antifosfolipidici
TESTE SCREENING

alungit

normal

STUDII DE MIXING

nemodificat

TESTE DE CONFIRMARE (cu

fosfolipide in exces)
Scurtarea timpului de
coagulare

scurtare

Identificarea deficitului de
factor de coagulare

Exemple practice
Panelul CID
Timpul de tromboplastin parial activat (APTT)
Timpul de protrombin (PT)
Hemograma complet
D-dimeri
Produi de degradare ai fibrinei/fibrinogenului (PDF)
Fibrinogen

Exemple practice
Panelul CID
CID acut:

Cresterea D-dimeri, PDF

Prelungirea APTT (50% din cazuri) i PT (70% din cazuri)
Scderea fibrinogenului (50% din cazuri)
Scderea numrului de plachete

CID cronic:
Creterea fibrinogenului si plachetelor
Scurtarea PT i APTT
Cresterea D-dimeri, PDF

Exemple practice
Panelul CID
CID este o situaie patologic de etiologie multifactorial, secundar altei
afeciuni (sepsis, complicaii obstetricale, traumatisme, arsuri, intevenii
chirurgicale, incompatibilitate de grup sangvin, boli hepatice, neopasme etc.)
se produce o activare intravascular accelerat, difuz i neadecvat a
coagulrii
consumul excesiv de factori de coagulare i trombocite, concomitent cu o
generare masiv intravascular de fibrin, vor conduce la apariia simultan
att de tromboze, ct i de hemoragii (clinic se constat hemoragii cu
cheaguri).

Exemple practice
Panelul CID
cauza CID o reprezint afectarea sever a microvascularizaiei (apariia unei
electro-negativiti la suprafaa endoteliului n teritorii vasculare ntinse), care
poate conduce la disfuncie multipl de organ
lezarea endotelial sau tisular determin activarea masiv a factorilor de
coagulare i consumul excesiv al acestora, astfel nct, se ajunge la un deficit
de factori
n timpul acestui proces, trombina i plasmina (enzime proteolitice) sunt
actvate
trombina amplific procesul de coagulare i poate induce tromboze, iniial la
nivelul vaselor mici i ulterior i n vasele mari
mecansmul reglator al cascadei coagulrii reprezentat de TFPI (Tissue Factor
Pathway Inhibitor), AT-III i PCA (protein C activat) fiind deficitar, se
formeaz cantiti mari de fibrin, cu apariia obstruciilor vasculare

Exemple practice

O pacient n vrst de 56 ani investigat pentru carcinom vezical este internat

la chirurgie. Un screening preoperator al coagulrii deceleaz:
PT = 14s
APTT = 76s
Nr trombocite = 180.000/L

VN lab: 11-14s
23-35s
150.000-400.000/L

Ce informaii sunt importante pentru continuarea investigaiilor?

Exemple practice

Ce informaii sunt importante pentru continuarea investigaiilor?

- Istoric de sngerri neag

- Expunere la heparin posibil n cadrul investigaiilor invazive efectuate
anterior pentru tumora vezical
- Istoric de tromboze - neag
Ce teste ai solicita pentru a stabili dac exist un deficit al factorilor coagulrii
sau prezena unui inhibitor al coagulrii?

Exemple practice

Ce teste ai solicita pentru a stabili dac exist un deficit al factorilor coagulrii

sau prezena unui inhibitor al coagulrii?
Mixing studies 50:50 plasma pacientei i plasm normal indic valoarea
prelungit a APTT cauza alungirii APTT nu este deficitul factorilor coagulrii
Ce test este util pentru a diferenia dac APTT este prelungit datorit posibilei
expuneri anterioare la heparin sau prezenei unui anticoagulant circulant?

Exemple practice

Ce test este util pentru a diferenia dac APTT este prelungit datorit posibilei
expuneri anterioare la heparin sau prezenei unui anticoagulant circulant?
Timpul de reptilaz este prelungit.
Alternativ se putea aduga un neutralizant al heparinei i repeta APTT.

n cazul pacientei, dup adugarea unui exces de fosfolipide la testul screening

iniial s-a obinut scurtarea APTT, idenitifcnd prezena anticoagulantului lupic.
Operaia s-a efectuat utiliznd utiliznd profilactic heparin cu greutate molecular
mic.

Bibliografie
Daniela A. Ion. Fiziopatologie lucrri practice pentru studeni. Editura
didactic i pedagogic 2007
Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis.
Hematol Oncol Clin North Am 2007;21:1-11.
O'ShaughneSNVS D, Makris M, Lillicrap D. Practical hemostasis and
thrombosis. Blackwell Publishing 2006.
Porth CM. Essentials of pathophysiology (ed 5). Lippincott Williams &
Wilkins 2011
Daniela Filipescu. Hemostaza normal i patologic. SRATI 2010
http://practicalhaemostasis.com/Data%20Interpretation/Data%20Questio
ns/data_interpretation_screening_tests.html